Summary
टिक hemolymph का विश्लेषण कैसे कुछ रोगजनकों रोग के कारण और कैसे ticks immunologically इस संक्रमण के लिए प्रतिक्रिया के बारे में जानकारी का एक महत्वपूर्ण स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है । वर्तमान अध्ययन यह दर्शाता है कि फफूंद के प्रवर्त को कैसे अभिगृहीत किया जा सके और राइपिसेफैलस माइक्रोप्लस एवरगेड मादा से रक्तलसीका एकत्रित करें ।
Abstract
Ticks बाध्य hematभक्षी ectoparasites और Rhipicephalus microplus पशु चिकित्सा में बहुत महत्व है क्योंकि यह एनीमिया, वजन घटाने, ' जानवरों के चमड़े का मूल्यह्रास का कारण बनता है और भी कई रोगजनकों के एक सदिश के रूप में कार्य कर सकते हैं । इन परजीवी को नियंत्रित करने के लिए अत्यधिक लागत के कारण, रासायनिक acaricides के अनुचित उपयोग की वजह से पर्यावरण को नुकसान, और पारंपरिक परजीवी के खिलाफ वृद्धि हुई प्रतिरोध, ticks के वैकल्पिक नियंत्रण के उपयोग के द्वारा, उदाहरण के लिए, एंटोमोपैथोजेनिक कवक एक दिलचस्प दृष्टिकोण माना गया है । फिर भी, कुछ अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि कैसे टिक प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए इन entomopathogens से लड़ने के लिए कार्य करता है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल engorged महिलाओं में कीट और दो तकनीकों hemolymph संग्रह और hemolymph संचयन के लिए इस्तेमाल किया में entomopathogen के लिए इस्तेमाल किया दो तरीकों को दर्शाता है । टांग निवेशन पर रोगजनकों के टिकटिक महिला के शरीर में टीका स्कूटम और घुटने के बीच टीका के विपरीत महिलाओं के जीवविज्ञान के मापदंडों के मूल्यांकन की अनुमति देता है, जो अक्सर gené's अंग को नुकसान. पृष्ठीय रक्तलसीका संग्रह में पैरों के माध्यम से संग्रह की तुलना में अधिक मात्रा में वसूली हुई । टिकटिक hemolymph संग्रह और प्रसंस्करण की कुछ सीमाएं शामिल हैं) hemolymph व्यवधान की उच्च दर, द्वितीय) बाधित midgut के साथ रक्तलसीका संदूषण, और iii) कम hemolymph मात्रा वसूली. जब रक्तलसीका पैर काटने के माध्यम से एकत्र किया जाता है, हेलिम्पीएच पैर खोलने पर जमा करने के लिए समय लगता है, थक्के प्रक्रिया पक्ष । इसके अलावा, कम hemocytes पृष्ठीय संग्रह की तुलना में पैर के माध्यम से संग्रह में प्राप्त कर रहे हैं, भले ही पहली विधि का प्रदर्शन किया जा करने के लिए आसान माना जाता है । एंटोमोपैथोजेनिक एजेंटों द्वारा मध्यस्थता ticks में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए उनके रोगजनन अनावरण और टिक नियंत्रण के लिए नए लक्ष्यों को विकसित करने में मदद करता है । यहाँ वर्णित टीका प्रक्रियाओं बहुत कम तकनीकी संसाधनों की आवश्यकता है और न केवल रोगजनक सूक्ष्मजीवों के लिए ticks का पर्दाफाश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसी प्रकार, टिक hemolymph का संग्रह कई शारीरिक अध्ययन के लिए पहला कदम का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ।
Introduction
पशु टिक, राइपिसेफेलस माइक्रोप्लस, एक हेमेटोफेगस ectoparasite उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में पशुधन पर एक भारी नकारात्मक प्रभाव के साथ है । इस टिक के रोगजनक एजेंटों के वेक्टर जैसे babesia बोविस, babesia बिजेमिना, और एनाप्लाज्मा marginale कि, प्रत्यक्ष hemofeeding नुकसान के साथ संयुक्त, दूध और मांस उत्पादन को कम कर सकते हैं, एनीमिया और अंत में मौत का कारण । इस ectoparasite की वजह से नुकसान ब्राजील1में ३,२४०,०००,००० डॉलर सालाना में अनुमान लगाया गया । टिकाऊ तरीकों की मांग कर रहे है और एंटोमोपैथोजेनिक एजेंटों का उपयोग एक आशाजनक विकल्प के लिए रासायनिक acaricides का उपयोग कम माना जाता है2,3,4।
मेटार्ज़ियम एसपीपी के रूप में entomopathogenic कवक, ticks सहित आर्थ्रोपोड के प्राकृतिक दुश्मन हैं, और कुछ आइसोलेट्स biocontrollers के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । ये रोगजनक सक्रिय रूप से क्यूटिकल के माध्यम से मेजबान को संक्रमित करते हैं और उनके शरीर को2,5,6उपनिवेश करते हैं । के रूप में संक्रमण विकसित, सेलुलर और humoral प्रतिक्रियाओं टिक प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं । टिक hemolymph का विश्लेषण रोगजनकों7,8के साथ चुनौतीपूर्ण के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में रिपोर्ट की है ।
आर्थ्रोपोड्स ' प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया humoral और सेलुलर प्रतिक्रियाओं में विभाजित है । ह्यूरल प्रतिक्रिया hemocytes के माध्यम से किया जाता है और रोगाणुरोधी प्रोटीन/पेप्टाइड्स, जबकि सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का उत्पादन हेमग्लूटानेशन प्रक्रियाओं और निर्माण शामिल है । इन कोशिकाओं को सभी आर्थ्रोपोड से रक्तलसीका में मौजूद हैं और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया9से जुड़े अध्ययनों में एक अर्थपूर्ण भूमिका विकसित करने के लिए सूचित कर रहे हैं, के रूप में यह सीधे फैगोसाइसिस और encapsulation प्रक्रियाओं से संबंधित है. तदनुसार, hemocytes के बारे में अध्ययन मौत मार्ग की जांच करने के लिए और इस तरह के autophagy, apoptosis, और परिगलन के रूप में प्रक्रियाओं को समझने में मदद कर सकते हैं । Bivalves के रूप में कुछ अकटेरूरों में, hemocytes संग्रह सेल व्यवधान की तरह सीमाओं का सामना करना पड़ता है, कम hemocytes मात्रा प्राप्त की, और बरामद कोशिकाओं की कम एकाग्रता10. बहुत बार, लागू पद्धति पर निर्भर करता है, कोशिकाओं की कम एकाग्रता प्राप्त की है, सीधे कोशिकाओं परिमाणीकरण और विश्लेषण पर असर.
Hemocytes में परिसंचारी hemocytes की संख्या अलग आर्थ्रोपोड के बीच चर रहा है और यह एक ही प्रजातियों में सेक्स, उंर के रूप में विभिंन शारीरिक चरणों के कारण बदल सकते हैं, और आर्थ्रोपॉड के विकास के चरण11। Hemocytes भी कुछ अंगों का पालन पाया जा सकता है और सिर्फ संक्रमण की प्रक्रिया के बाद11संचलन में जारी किया । फिर भी, सबसे अध्ययन कीड़े का उपयोग की सूचना दी, जबकि ticks कम उनके शरीर विज्ञान और विकृति के बारे में पता लगाया रहना । रोगज़नक़ टीका के बावजूद और ticks में हेलिम्पीएच संग्रह कम इस्तेमाल किया तकनीकों रहे हैं, मानक तरीकों की स्थापना और अधिक सटीक अध्ययन के विकास में मदद करता है ।
वर्तमान अध्ययन के उद्देश्य के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों की तुलना करने के लिए था hemolymph संग्रह और रोगजनकों के टीका में R. microplus ticks, hemolymph अधिग्रहण और hemolymph एकाग्रता में प्रभावकारिता का मूल्यांकन.
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Protocol
वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त Ticks एक कृत्रिम कॉलोनी, रियो डी जनेरियो के संघीय ग्रामीण विश्वविद्यालय में mantained द्वारा प्राप्त किया गया था, जो तरीकों कशेरुकी जानवरों (CEUA-IV/UFRRJ #037/२०१४) के उपयोग के लिए आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. टिक engorged महिलाओं
- टिक इकट्ठा करने के बाद, नल के पानी का उपयोग कर engorged महिलाओं धोने और उन्हें ०.५% (v/v) सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के लिए एक ५०० मिलीलीटर ग्लास बीकर प्राप्तकर्ता में 3 मिनट के लिए, क्युटिकल स्वच्छता के लिए (चित्रा 1), तो सभी महिलाओं के बाँझ कागज तौलिए का उपयोग कर सूखी (आंकड़ा 2).
- महिलाओं को सजातीय भारित समूहों में विभाजित करें (प्रत्येक 20 महिलाओं के साथ): किसी भी उपचार के बिना एक समूह, एक नियंत्रण समूह ०.१% पॉलीऑक्सीइथीलीन sorbitan मोनोओलिएट जलीय समाधान के 5 μl के साथ inoculated (v/v), और एक संक्रमित समूह 5 μl के साथ १.० x 10 में inoculated 7 ब्लाकोस्पोन्स एमएल-1।
नोट: केवल अनुपचारित ticks मात्रा और hemocyte एकाग्रता के लिए इस्तेमाल किया गया । प्रत्येक समूह की तीन प्रतिकृति निष्पादित की गई ।
2. स्कूटम और कैपिलम के बीच रोगज़नक़ों का टीका
नोटः वर्तमान अध्ययन में एक उदाहरण के तौर पर कीटनोपेथीजेनिक फंगल सस्पेंशन का इस्तेमाल किया गया ।
- ०.१% पॉलीऑक्सीइथीलीन sorbitan मोनोओलेएट जलीय घोल (v/v) के 1 मिलीलीटर में कवक ब्लाकोस्पोस निलंबित और १.० एक्स 107 ब्लाकोस्पोज़ एमएल-1के अंतिम एकाग्रता को समायोजित । एक प्लास्टिक पैराफिन फिल्म की सतह के लिए निलंबन 5 μL मेटाहिलियम ब्लास्टोस्पोरों (चित्रा 3) के एक aliquot जोड़ें ।
नोट: एक Neubauer कक्ष का उपयोग कर Metarhizium ब्लास्टोस्पोर्स निलंबन समायोजित किया गया था। टीका प्रक्रिया की गति के लिए, कई बुलबुले प्लास्टिक पैराफिन फिल्म सतह, प्रत्येक बुलबुला 5 μL करने के लिए इसी के लिए जोड़ा जा सकता है । - एक 1 मिलीलीटर अल्ट्रा ठीक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें और एक ०.३ मिमी सुई निलंबन खींचने के लिए और यह टिक में टीका लगाना. यह प्रयोग करने से पहले सिरिंज के सभी हवा बाहर ले याद रखें ।
- 5 μL फंगल निलंबन स्कूटम और कैपिलम के बीच टिक महिला में टीका लगाना । नियंत्रण समूह से महिलाओं को ०.१% पॉलीऑक्सीइथीलीन sorbitan मोनोओलिएट जलीय घोल (v/v) बिना कवक के साथ 5 μl के साथ inoculate ।
नोट: रक्तलसीका की एक छोटी मात्रा सुई प्रविष्टि के बाद फोरमेन पर मौजूद हो सकता है । वायु को टीका न लगाने के लिए सावधान रहें ।
3. पैर की जांघ और टिक महिला के शरीर के बीच कीट-अणुजनित कवक का टीका
- फंगल निलंबन के साथ महिलाओं inoculate (१.० x 107 ब्लास्टोस्पोज़ एमएल-1पर 5 μl) पैर टिर्की और महिला के शरीर के बीच, एक 1 मिलीलीटर अल्ट्रा ठीक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर एक ०.३ mm सुई करने के लिए युग्मित । महिलाओं को नियंत्रण समूह से ०.१% पॉलीऑक्सीइथीलीन sorbitan मोनोओलिएट जलीय घोल (v/v) के 5 μl के साथ टीका लगाना ।
नोट: जब पैर टिर्की और टिक महिला के शरीर के बीच metarhizium ब्लाकोस्पोन्स टीका किया जाता है, रक्तलसीका की एक छोटी मात्रा सुई प्रविष्टि के बाद टिर्की पर मौजूद हो सकता है. वायु को टीका न लगाने के लिए सावधान रहें ।
4. पृष्ठीय रक्तलसीका संग्रह
- एक पंखों वाला आसव सेट के रबर भाग का उपयोग करें, एक ०.३ मिमी केशिका ट्यूब, और एक फिल्टर टिप hemolymph संग्रह करने के लिए ।
- महिला पृष्ठीय क्यूटिकल एक ०.३ मिमी सुई का उपयोग कर बाधित ।
- व्यवधान के बाद, टिक शरीर के पूर्वकाल भाग पर कोमल दबाव लागू होते हैं । एक लगभग पारदर्शी व्यवधान साइट से बाहर खींच तरल का निरीक्षण करें । एक पंखों वाला आसव सेट के रबर हिस्सा करने के लिए युग्मित फिल्टर टिप के माध्यम से तरल चूसने से रक्तलसीका इकट्ठा, और एक ०.३ मिमी केशिका ट्यूब.
नोट: अपने स्थिरीकरण के दौरान शायद ही टिक शरीर प्रेस नहीं है क्योंकि यह midgut को बाधित और हीमोलिम्फ दूषित हो सकता है । कोमल दबाव संक्रमण के बिना तरल पदार्थ को निष्कासित कर सकते है जब तक रुको ।
5. टिकटिक पैर से hemolymph संग्रह
- टिक स्थिर, कैंची की एक जोड़ी के साथ एक सामने पैर का एक टुकड़ा काट ।
नोट: एक या एक से अधिक पैरों को काटा जा सकता है, साथ ही, एक ही पैर एक से अधिक बार काटा जा सकता है । - टिक के पीछे के शरीर के हिस्से पर कोमल दबाव लगाएं । एक पारदर्शी तरल बुलबुला है कि कटौती साइट पर पता चलता है और यह केशिका ट्यूब के साथ इकट्ठा, के रूप में कदम ४.३ में वर्णित का निरीक्षण करें ।
नोट: अपने स्थिरीकरण के दौरान शायद ही टिक शरीर प्रेस नहीं है क्योंकि यह midgut को बाधित और हीमोलिम्फ दूषित हो सकता है । कोमल दबाव संक्रमण के बिना तरल पदार्थ को निष्कासित कर सकते है जब तक रुको ।
6. हीमोलिम्फ प्रसंस्करण
- Hemolymph संग्रह के बाद, यह १.५ मिलीलीटर जिसे माइक्रोटयूबुल्स में जमा पहले 30 μl प्रोटीज कॉकटेल और ८२ μl खारा बफर के साथ भरा । हीलिम्पीएच संग्रह भर में बर्फ पर जिसे माइक्रोटयूबुल्स रखें ।
- अपकेंद्रित्र नमूने (५०० एक्स जी 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए) । Hemलसीका अपकेंद्रण के बाद हेमोसाइट्स की एक नरम गोली का गठन किया जाएगा ।
नोट: रक्तलसीका मात्रा के लिए, microtube के अंदर कुल मात्रा की गणना और प्रोटीज कॉकटेल और नमकीन बफर की मात्रा को डिस्काउंटिंग द्वारा प्राप्त hemolymph खंड quantification । - ध्यान से supernatant (सेल मुक्त hemolymph) को दूर । धीरे में कोशिकाओं को फिर से निलंबित, उदाहरण के लिए, Leibovitz एल-15 पीएच 7.0-7.2 के लिए समायोजित संस्कृति । एक Neubauer चैंबर में फिर से निलंबित hemocytes के 10 μL रखकर hemocytes मात्रा ।
7. hemocyte नमूना स्लाइड तैयारी
- एक जोड़ी कैंची से टिक के फ्रंट लेग को काटें ।
- टिक के पीछे के शरीर के हिस्से पर कोमल दबाव लगाएं । एक पारदर्शी तरल बुलबुला है कि कटौती साइट पर पता चलता है निरीक्षण करें ।
- सीधे साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर हेलिम्पीएच बूँदें लागू करें, उसके बाद, कोशिकाओं को दाग करने के लिए विनियोजित तरीकों का उपयोग करें ।
- Giemsa का उपयोग कर hemocytes दाग, हवा-सूखी 30 मिनट के लिए स्लाइड पर रक्तलसीका, यह 3 मिनट के लिए मेथनॉल के साथ कमरे के तापमान पर ठीक है, और Giemsa समाधान में दाग (Sorensen बफर समाधान के 1:9 अनुपात, ७.२ पीएच) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए । डाई की अधिकता को दूर करने के लिए बहते पानी से स्लाइडों को धोएं, स्लाइड को हवा-सूखी करें और 400x पर एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में कोशिकाओं का मूल्यांकन करे ।
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Representative Results
यह आलेख टीका और रक्तलसीका संग्रह के लिए ticks पर लागू तरीकों दृष्टिकोण । पैर जांघ और टिक महिला के शरीर के बीच टीका के बाद, कुछ तरल पदार्थ (hemolymph) प्रक्रिया के दौरान स्रावित किया जा सकता है; हालांकि, यह ध्यान रखें कि जब टीका समाप्त हो गया है, कोई तरल या ऊतकों सुई टिप या टीका साइट पर मौजूद थे, यह सुनिश्चित करना है कि कवक निलंबन पूरी तरह से टीका लगाया गया था महत्वपूर्ण है । जब टीका प्रक्रिया सही ढंग से किया गया था, सुई प्रविष्टि के कारण नहीं टिक महिलाओं की मौत. दूसरी ओर, कीट के लगभग ४८ ज कीटनोथायोजेनिक कवक के टीका लगाने के बाद मर गया । पैर की जांघ और टिक महिला के शरीर के बीच टीका, मिडगट और मैलपिगयन ट्यूब्यूल्स जैसे टिकटिक अंगों को नुकसान पहुंचा सकता है, जबकि स्कूटम और कैपिलम के बीच टीका लगाने के दौरान जीन के अंग को नुकसान हो सकता है ।
पृष्ठीय रक्तलसीका संग्रह के दौरान सुई द्वारा जब टिक मिडगट बाधित होता है, तो प्राप्त द्रव लाल होता है, रंगहीन नहीं । यह एक ग़लत रक्तलसीका संग्रह को इंगित करता है । इन मामलों में, के बाद से यह आंतों की सामग्री के साथ दूषित है रक्तलसीका छोड़ दिया जाएगा ।
सही hemolymph संग्रह ठीक से प्रयोग आचरण और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । जब hemolymph काट टिक पैर से एकत्र (n = 20 homogenously तौलने ticks), मात्रा प्राप्त कुल hemolymph से कम था पृष्ठीय संग्रह (n = 20 homogenously तौला) (चित्रा 4) से प्राप्त की । यह सुझाव दिया है कि, प्रत्येक बूंद की कम मात्रा के कारण है कि कट पैर से बाहर खींचती है, hemolymph थक्का अक्सर रक्तलसीका संग्रह की इस प्रक्रिया के दौरान उपस्थित किया जा सकता है । यह नकारात्मक hemocytes अधिग्रहण और वर्गीकरण में हस्तक्षेप कर सकते है (चित्रा 5 और चित्रा 6) । हेलिम्फेज की उच्च मात्रा की उपलब्धि के बावजूद, पृष्ठीय संग्रह को अधिक कठिन माना जाता है ।
चित्रा 1 : Ticks ' क्यूटिकल हाइजीनेलाइजेशन। रिपिसिफैलस माइक्रोप्लस पूरी तरह से engorged महिलाओं नल का पानी का उपयोग कर धोया और ०.५% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान में डूबे थे (v ५००/ इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : Ticks ' क्यूटिकल सुखाने। रिपिसिफैलस माइक्रोप्लस पूरी तरह से engorged महिलाओं बाँझ कागज तौलिए का उपयोग कर सूख रहे थे । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : मेटाहाइमीनियम ब्लाकोस्पोरों । टिकटिक टीका में प्रयुक् त फंगल प्रोपल् स स्केल पट्टी = ५० μm इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 : प्रतिनिधि hemolymph मात्रा प्रत्येक collecton विधि के साथ प्राप्त प्रदर्शन ग्राफ। रिपिसेफैलस माइक्रोप्लस रक्तलसीका आयतन पृष्ठीय या लेग संग्रह के बाद प्राप्त होता है । प्रत्येक विधि के लिए 20 समरूप तौलनी के एक पूल का उपयोग किया गया । इन ticks पहले inoculated नहीं थे । माध्य मान एक ही अक्षर के लिए अनुगमन किए गए मानक विचलन सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद प्रसरण (ANOVA) परीक्षण (P ≥ ०.०५) से भिन्न नहीं होते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 : Hemocytes एकाग्रता प्रत्येक hemocytes संग्रह विधि के साथ प्राप्तकी । राइपिसेफैलस माइक्रोप्लस hemocytes एकाग्रता के बाद प्राप्त किया है Leibovitz एल में resuspension-15 पृष्ठीय या पैर संग्रह के बाद संस्कृति मध्यम । माध्य मान एक ही अक्षर के लिए बाद में मानक विचलन सांख्यिकीय Kruskal-Wallis परीक्षण (पी ≥ ०.०५) के बाद अलग नहीं है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6 : में पाया Hemocytes राइपिफैलस माइक्रोप्लस हीमोलिम्फ स्मिअर। आर माइक्रोप्लस hemocytes Giemsa द्वारा दाग रहे थे । काले तीर टिक hemolymph में विभिंन कोशिकाओं से संकेत मिलता है । स्केल पट्टी = १०० μm इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
रोगजनकों का टीका उपयोगी है जब अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक आर्थ्रोपॉड मॉडल में सूक्ष्मजीवों के vivo में कार्रवाई की जांच करना है क्योंकि यह आश्वस्त करता है कि रोगज़नक़ मेजबान के अंदर है । इस तकनीक को आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) जैसे अणुओं को टीका करने के लिए भी लागू किया जा सकता है । स्कूटम और कैपिलम के बीच टीका लगाना आसान माना जाता है, लेकिन अक्सर नुकसान है gené's अंग, अंडे व्यवहार्यता12,13आई । Gené's अंग शारीरिक रूप से capitum के पूर्वकाल भाग के करीब स्थित है, और यह टिक अंडनिक्षेपण14के लिए एक महत्वपूर्ण अंग है । तदनुसार, पैर टिर्की और महिला के शरीर के बीच टीका अधिक उपयुक्त है अगर अध्ययन महिलाओं के जैविक मानकों के अवलोकन की आवश्यकता के बाद से gené's अंग घायल नहीं होगा. पैर जांघ और टिक के शरीर के बीच टीका विधि के बावजूद अधिक कठिन माना जाता है और आसानी से नुकसान या टिक आंतरिक अंगों को बेनकाब, जैसे midgut और माल्पिगयन tubules, जब यह अच्छी तरह से प्रदर्शन किया है, यह इन अंगों को बाधित नहीं करेगा.
रक्तलसीका विश्लेषण आर्थ्रोपॉड प्रतिरक्षा प्रणाली को समझने के साथ-साथ रोगजनन को समझने के लिए आवश्यक है15,16. तदनुसार टिक hemolymph टिक फिजियोलॉजी अनावरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, टिक infectivity आश्वासन, टिक-रोगज़नक़ बातचीत समझ, और सेलुलर और humoral प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं9,17,18।
पैर काटने के माध्यम से टिकटिक hemolymph संग्रह कई अध्ययनों में सूचित है19,20,21. इस विधि के बावजूद कोई या बहुत कम रक्तलसीका संदूषण के साथ सरल किया जा रहा है, यह अध्ययन है कि hemolymph या hemolymph की बड़ी मात्रा की उच्च सांद्रता की आवश्यकता के लिए उत्पादक काउंटर माना जाता है । दूसरी ओर, engorged महिलाओं के पृष्ठीय क्षेत्र के माध्यम से हेलिम्पीएच संग्रह का सही निष्पादन आंत लगभग पूरे टिक शरीर में रह रहे हैं और सुई के साथ यह टूटना hemolymph संदूषण का कारण बनता है के बाद से प्राप्त करने के लिए आसान नहीं है । आंत में व्यवधान के कारण संदूषण भी देखा जा सकता है जब टिक स्वाभाविक रूप से hemoparasites के उच्च भार से संक्रमित है (अर्थात, Babesia spp.), या कीट के अंतिम चरणों में मौत की प्रक्रिया entomopathogens के कारण8. इन मामलों में, hemolymph के बाद से hemolymph और प्लाज्मा विश्लेषण को प्रभावित किया जा सकता है खारिज कर दिया जाएगा ।
Hemolymph संचयन के लिए hemolymph नमूनों की केंद्रापसारक गति भी महत्वपूर्ण है और सीधे hemolymph एकाग्रता को प्रभावित, के बाद से उच्च रिश्तेदार केंद्राचयी क्षेत्र (आरसीएफ) गति के लिए योगदान: मैं) सेल गोली के लिए निलंबित करने के लिए मुश्किल, द्वितीय) कोशिकाओं व्यवधान, और iii) hemocytes degranulation । आदर्श सेल गोली एक नरम गोली resuspend करने के लिए आसान है । इस कारण से, 4 ° c8 पर तीन मिनट के लिए ५०० x g पर अपकेंद्रण का उपयोग किया गया था । वर्तमान अध्ययन में, हेमोसाइट्स को संस्कृति माध्यम में और फास्फेट-बफर लवणीय (पीबीएस) में नहीं रखा गया था क्योंकि संस्कृति माध्यम बेहतर सेल व्यवहार्यता का समर्थन करता है ।
यहाँ प्रस्तुत किए गए तरीकों का सामना कर सकते हैं जब ticks या अपोषित वयस्कों के immatures चरणों (लार्वा और अप्सरा) के लिए लागू किया जाता है । सुई का आकार अपरिपक्व चरणों और संभवतः असिंचित वयस्क ticks नुकसान होगा क्योंकि टीका विधि, उदाहरण के लिए, केवल वयस्क engorged महिलाओं के लिए लागू किया जाता है । इन अवस्थाओं को टीका करने के लिए एक माइक्रोइंजेक्टर का प्रयोग किया जाएगा । इसी तरह, पृष्ठीय क्षेत्र के माध्यम से हेलिम्पीएच संग्रह अधिक प्रभावी है जब engorged ticks के लिए आवेदन किया है, जबकि पैरों को काटने से hemolymph संग्रह अफेड वयस्क ticks या अपरिपक्व चरणों के साथ अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है । बावजूद इसके, यहां हमारा लक्ष्य ऐसे तरीकों को दिखाना था, जिनके लिए बहुत कम तकनीकी संसाधनों की जरूरत होती है । इसके अलावा, अपकेंद्रण तकनीक कम केंद्रायन बल पर प्रदर्शन किया है क्योंकि उच्च शक्ति या विस्तारित स्पिन समय कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है ।
यहाँ बताई गई विधियों का अध्ययन करने के लिए दिशा-निर्देशों के रूप में उपयोग किया जा सकता है जिसमें कीट-जन्जन के चिचड़ी और रक्तलसीका/रक्तकोशिका संचयन में टीका शामिल है । तकनीक यहां प्रस्तुत बहुत कम तकनीकी संसाधनों की आवश्यकता होती है और टिक फिजियोलॉजी, विकृति विज्ञान के बारे में अध्ययन के लिए शास्त्रीय कदम हैं, और टिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन भाग में ब्राजील, वित्त कोड 001 से Coordenacão de Aperfeiçoamento डी Pessoal डी Nível सुपीरियर (CAPES) द्वारा वित्त पोषित किया गया । CAPES A.F. Marciano के लिए पीएचडी छात्रवृत्ति प्रदान की है । हम जे Fiorotti के लिए पीएचडी छात्रवृत्ति प्रदान करने के लिए ब्राजील के राष्ट्रीय वैज्ञानिक और तकनीकी विकास परिषद (CNPq) का शुक्रिया अदा करते हैं । यह शोध भी रियो डी जनेरियो (FAPERJ) और CNPq. V.R.E.P. Bittencourt के राज्य के अनुसंधान के लिए कार्लोस Chagas Filho फाउंडेशन के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है एक CNPq शोधकर्ता है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).
- Gene, J. Mémoires de l'Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L.
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Biology of ticks. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
