Summary
Analys av Tick hemolymfa utgör en viktig källa till information om hur vissa patogener orsaka sjukdom och hur fästingar immunologiskt reagera på denna infektion. Den nuvarande studien visar hur man Inokulera svamp diasporer och samla hemolymfa från rhipicephalus MicroPlus svullna Honor.
Abstract
Fästingar är obligate hematophagous ektoparasiter och Rhipicephalus MicroPlus har stor betydelse inom veterinär medicinen eftersom det orsakar anemi, viktminskning, avskrivning av djurens läder och även kan fungera som en vektor av flera patogener. På grund av de orimliga kostnaderna för att kontrol lera dessa parasiter, skador på miljön som orsakats av olämplig användning av kemiska akaricider, och det ökade motståndet mot traditionella parasiticider, alternativ kontroll av fästingar, genom användning av Entomopathogenic svampar, till exempel, har ansetts vara en intressant metod. Ändå har få studier visat hur Tick immun systemet agerar för att bekämpa dessa entomopathogens. Därför visar detta protokoll två metoder som används för entomopathogen inympning i svullna honor och två tekniker som används för hemolymfa insamling och hemocyter skörd. Inympning av patogener vid benet insättning i fäs tingen kvinnlig kropp tillåter utvärdering av Honor biologiska parametrar till skillnad från inympning mellan skölden och capitulum, som ofta skadar genés orgel. Dorsal hemolymfa insamling gav en högre volym återhämtning än insamling genom benen. Vissa begränsningar av Tick hemolymfa insamling och bearbetning inkluderar i) höga hemocyter störningar, II) hemolymfa förorening med störd midgut, och III) låg hemolymfa volym återhämtning. När hemolymfa samlas in genom benet styckning, den hemolymfa tar tid att ackumuleras vid ben öppningen, gynnar Koagulations processen. Dessutom erhålls färre hemocyter i samlingen genom benet jämfört med rygg kollektionen, även om den första metoden anses lättare att utföra. Förstå immun svaret i fästingar medierade av Entomopathogenic agenter hjälper till att avslöja deras patogenes och utveckla nya mål för Tick kontroll. De inympningsprocesser som beskrivs här kräver mycket låga tekniska resurser och kan användas inte bara för att exponera fästingar för patogena mikroorganismer. Likaså kan insamlingen av fästing hemolymfa representera det första steget för många fysiologiska studier.
Introduction
Boskapen fästing, Rhipicephalus MicroPlus, är en hematophagus Ektoparasit med en enorm negativ inverkan på boskap i tropiska områden. Denna fästing är vektorn av patogena ämnen såsom Babesia bovis, Babesia bigemina, och Anaplasma marginale som i kombination med direkt hemofeeding skador, kan minska mjölk och kött produktion, orsaka anemi och slutligen död. Förluster orsakade av denna Ektoparasit uppskattades i 3 240 000 000 dollar årligen i Brasilien1. Hållbara metoder krävs och användningen av Entomopathogenic agenter anses vara ett lovande alternativ för att minska användningen av kemiska akaricider2,3,4.
Entomopathogenic svampar, såsom Metarhizium spp., är naturliga fiender av leddjur inklusive fästingar, och vissa isolat kan användas som biocontrollers. Dessa patogener infektera aktivt värden genom nagelbanden och kolonisera sin kropp2,5,6. När infektionen utvecklas, cellulära och humorala svar förmedlas av fästing immun systemet. Analys av Tick hemolymfa rapporteras som ett användbart verktyg för att utvärdera immun svar efter utmanande med patogener7,8.
Leddjur immun svar är uppdelad i humorala och cellulära svar. Den humorala reaktionen involverar hemagglutinationshämmande processer och produktion av antimikrobiella proteiner/peptider, medan cellulär immun svar utförs genom hemocyter. Dessa celler är närvarande i hemolymfa från alla leddjur och rapporteras att utveckla en uttrycksfull roll i studier med medfödda immun svar9, eftersom det är direkt relaterat till fagocytos och inkapsling processer. Följaktligen, studier om hemocyter kan bidra till att undersöka död väg och förstå processer såsom autophagy, apoptos, och nekros. I vissa ryggradslösa djur som biventiler, hemocyter samling ansikten begränsningar som cell störningar, låg hemolymfa volym erhålls, och låg koncentration av återvunna celler10. Mycket ofta, beroende på tillämpad metod, erhålls minskad koncentration av celler, vilket direkt påverkar cellernas kvantifiering och analys.
Antalet hemocyter som cirkulerar i hemolymfa varierar mellan olika leddjur och det kan förändras i samma art på grund av olika fysiologiska stadier såsom kön, ålder, och artropod utvecklingsstadium11. Hemocyter kan också hittas följs vissa organ och släppas ut i omlopp strax efter infektionen process11. Ändå, de flesta studier rapporterade använda insekter, medan fästingar förbli mindre utforskade om deras fysiologi och patologi. Trots patogen inympning och hemolymfa insamling i fästingar är mindre använda tekniker, upprättande av standard metoder hjälper utvecklingen av mer exakta studier.
Syftet med den här studien var att jämföra de mest använda metoderna för hemolymfa insamling och inympning av patogener i R. MicroPlus fästingar, utvärdera effekten i hemolymfa förvärv och hemocyter koncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fästingar som användes i den här studien erhölls från en konstgjord koloni, som manades på federal Rural University of Rio de Janeiro, vilka metoder har godkänts av etik kommittén för användning av ryggradsdjur (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Tick svullna Honor
- Efter fästing insamling, tvätta svullna Honor med kran vatten och sänk dem i 0,5% (v/v) natriumhypoklorit lösning för 3 min i en 500 mL glas bägare mottagare, för nagelband hygien (figur 1), sedan torka alla Honor med sterila pappers hand dukar (figur och 2).
- Fördela honor i homogena viktade grupper (med 20 Honor vardera): en grupp utan behandling, en kontroll grupp inokulerad med 5 μL 0,1% polyoxietylensorbitanmonooleatvattenlösning (v/v) och en infekterad grupp inokulerad med 5 μL vid 1,0 x 10 7 blastospores ml-1.
Anmärkning: endast obehandlade fästingar användes för volym-och hemocytkoncentration. Tre replikat av varje grupp utfördes.
2. patogener ympning mellan skölden och capitulum
Anmärkning: i den här studien användes entomopathogena svamp SUS pensioner som exempel.
- Suspendera svampblastosporer i 1 mL 0,1% polyoxietylensorbitanmonooleatvattenlösning (v/v) och justera till en slutlig koncentration av 1,0 x 107 Blastospores ml-1. Tillsätt en alikvot av 5 μL Metarhizium blastospores (figur 3) SUS pension till ytan av en plast paraffin film.
Anmärkning: Metarhizium blastospores SUS pension justerades med hjälp av en Neubauers kammare. För att påskynda inympningen processen kan flera bubblor läggas till plast paraffin film ytan, varje bubbla motsvarande 5 μL. - Använd en 1 mL Ultra-fin insulin spruta och en 0,3 mm nål för att dra SUS pensionen och Inokulera den i fäs tingen. Kom ihåg att ta ut all luft ur sprutan innan du använder den.
- Inokulera 5 μl svamp SUS pension i fäs tingen hona mellan skölden och capitulum. Inokulera Honor från kontroll gruppen med 5 μL 0,1% polyoxietylensorbitanmonooleatvattenlösning (v/v) utan svamp.
Obs: en liten volym av hemolymfa kan vara närvarande på foramen efter nålen insättning. Var noga med att inte Inokulera luft.
3. inympning av entomopathogena svampar mellan benet lår och fäs tingen kvinnans kropp
- Inokulera Honor med svamp SUS pension (5 μL vid 1,0 x 107 blastospores ml-1) mellan benet Tigh och kvinnans kropp, med hjälp av en 1 ml Ultra-fin insulin spruta kopplad till en 0,3 mm nål. Inokulera Honor från kontroll gruppen med 5 μL 0,1% polyoxietylensorbitanmonooleatvattenlösning (v/v).
Anmärkning: när Metarhizium blastospores ympning utförs mellan benet Tigh och fäs tingen kvinnans kropp, en liten volym av hemolymfa kan vara närvarande på Tigh efter nålen insättning. Var noga med att inte Inokulera luft.
4. dorsal hemolymfa samling
- Använd gummi delen av ett bevingat Infusionsset, ett 0,3 mm kapillärrör och en filtrerad spets för att utföra hemolymfa samlingen.
- Störa den kvinnliga dorsala nagelbanden med en 0,3 mm nål.
- Efter avbrott, tillämpa lätt tryck på den främre delen av fäs tingen kroppen. Observera en nästan genomskinlig vätska dra ut ur störnings området. Samla in hemolymfa genom att suga vätskan genom filter spetsen kopplad till gummi delen av en bevingad Infusionsset, och en 0,3 mm kapillärrör.
Obs: Tryck inte på fäs tingen kropp knappast under dess immobilisering eftersom detta kan störa midgut och förorena hemolymfa. Vänta tills lätt tryck kan utvisa vätskan utan kontaminering.
5. hemolymfa samling från fäs tingen benet
- Immobilisera fäs tingen, skär en bit av ett fram ben med ett par sax.
Obs: ett eller flera ben kan klippas, liksom, samma ben kan skäras mer än en gång. - Applicera skonsamt tryck på fäs tingen bakre kropps del. Observera en transparent vätske bubbla som dyker upp på den skurna platsen och samla den med kapillärröret, som beskrivs i steg 4,3.
Obs: Tryck inte på fäs tingen kropp knappast under dess immobilisering eftersom detta kan störa midgut och förorena hemolymfa. Vänta tills lätt tryck kan utvisa vätskan utan kontaminering.
6. hemolymfa behandling
- Efter hemolymfa samling, deponera den i 1,5 mL mikrorör tidigare fylld med 30 μL proteashämmare cocktail och 82 μL saltlösning buffert. Håll mikrorören på isen i hela hemolymfa samlingen.
- Centrifugera proverna (500 x g i 3 min vid 4 ° c). En mjuk pellet av hemocyter kommer att bildas efter hemolymfcentrifugering.
Anmärkning: för hemolymfa kvantifiering, kvantifiera hemolymfa volym erhålls genom att räkna den totala volymen inuti microtub och diskontera volymen av proteas cocktail och saltlösning buffert. - Ta försiktigt bort supernatanten (cell fritt hemolymfa). Försiktigt resuspendera cellerna i, till exempel, Leibovitz s L-15 kultur anpassas till pH 7.0-7.2. Kvantifiera hemocyter genom att placera 10 μL återsuspenderade hemocyter i en Neubauer-kammare.
7. förberedelse av hemocytprovtagning
- Skär fäs tingen fram benet med ett par sax.
- Applicera skonsamt tryck på fäs tingen bakre kropps del. Observera en transparent vätske bubbla som dyker upp på snitt platsen.
- Applicera hemolymfa droppar direkt på ren Mikroskop dia bilder, efter det, använda tillägna metoder för att färga cellerna.
- För att färga hemocyter med hjälp av Giemsa, lufttorka hemolymfen på bilden i 30 min, fixera den vid rums temperatur med metanol för 3 min, och fläcken i Giemsa lösning (1:9 förhållandet mellan sorensens buffertlösning, pH 7,2) i 30 min vid rums temperatur. Tvätta glasen med rinnande vatten för att ta bort överskottet av färg ämne, lufttorka bilden och utvärdera cellerna vid 400x i ett optiskt Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna artikel närmar sig inympning och hemolymfa insamlings metoder tillämpas på fästingar. Efter inympningen mellan benet lår och fäs tingen kvinnans kropp, kan en del vätska (hemolymfa) utsöndras under processen; Det är dock viktigt att notera att när inympningen är avslutad, ingen vätska eller vävnader fanns i nålspetsen eller på inokuleringsstället, se till att svamp SUS pensionen var helt inokuleras. När inympningprocessen utfördes korrekt, inte nålen insättning inte orsaka Tick Honor ' död. Å andra sidan, fästingar dog cirka 48 h efter inympning av Entomopathogenic svampen. Inympning mellan benet lår och kryssa kvinnans kropp kan skada Tick praktikant organ såsom midgut och malpighian tubuli, medan skador på genen orgel kan inträffa under inympning mellan skölden och capitulum.
När fäs tingen midgut störs av nålen under dorsala hemolymfa samling, vätskan erhålls är röd, inte färglös. Detta indikerar en felaktig hemolymfinsamling. I dessa fall skall hemolymfa kasseras eftersom det är förorenat med tarm innehåll.
Rätt hemolymfa insamling är avgörande för att korrekt genomföra experiment och få tillförlitliga resultat. När hemolymfa samlades in från klippta fäs ting ben (n = 20 fästingar som var homogent vägda), var den erhållna volymen lägre än den totala hemolymfa som erhölls från rygg samlingen (n = 20 fästingar homogent vägda) (figur 4). Det föreslås att, på grund av den låga volymen av varje droppe som drar ur den skära benet, hemolymfa koagulering kan vara ofta närvarande under denna process av hemolymfa samling. Detta kan inverka negativt på hemocyternas förvärv och klassificering (figur 5 och figur 6). Trots den högre volym prestation av hemolymfa, den dorsala samlingen anses svårare att utföra.
Figur 1 : Fästingar nagelbands hygienisering. Rhipicephalus MicroPlus helt svullna Honor tvättades med kran vatten och nedsänkt i 0,5% natriumhypokloritlösning (v/v) för 3 min i en 500 ml glas bägare mottagare. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Fästingar " nagelbanden torkar. Rhipicephalus MicroPlus helt svullna Honor torkades med sterila pappers hand dukar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Auktor och blastosporer. Svamp propaluges används i Tick inympning. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativ graf som visar hemolymfvolym som erhålls med varje avhemligade-metod. Rhipicephalus MicroPlus hemolymfa volym erhålls efter rygg eller ben samling. För varje metod användes en pool med 20 homogent vägda fästingar. Dessa fästingar var inte tidigare inokulerade. Medelvärden ± standard avvikelsen som följs för samma bokstav skiljer sig inte statistiskt efter analys av varians (ANOVA) test (P ≥ 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Hemocyter koncentration erhålls med varje hemolymfa insamlings metod. Koncentrationen av Rhipicephalus MicroPlus hemocyter erhållen efter resuspension i Leibovitz ' s L-15 odlings substrat efter rygg-eller ben samling. Medelvärden ± standard avvikelsen som följs för samma bokstav skiljer sig inte statistiskt efter Kruskal-Wallis-testet (P ≥ 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Hemocyter som finns i Auktor hemolymfa utstryk. R. MicroPlus hemocyter färgas av Giemsa. Svarta pilar visar de olika cellerna i fäs tingen hemolymfa. Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inympning av patogener är användbart när studien syftar till att undersöka in vivo åtgärder av mikroorganismer i experimentella leddjur modeller eftersom det försäkrar att patogenen är inne i värden. Tekniken kan också användas för att vaccinera molekyler som RNA-interferens (RNAi). Ympning mellan skölden och capitulum anses lättare att utföra men ofta skadar genés organ, försämrar äggen livs kraft12,13. Genés orgel är anatomiskt placerad nära den främre delen av capitum, och det är ett viktigt organ för Tick Oviposition14. Därför är inympning mellan benet Tigh och kvinnans kropp lämpligare om studien kräver observation av honans biologiska parametrar eftersom Genés organ inte kommer att skadas. Trots inympningmetoden mellan benet lår och fäs tingen kropp anses svårare och lätt skada eller exponera fäs tingen inre organ, såsom midgut och Malpighian tubuli, när det är väl utfört, kommer det inte störa dessa organ.
Hemolymfanalys är avgörande för att förstå den leddjur immun systemet samt att förstå patogenes15,16. Därför Tick hemolymfa kan användas för att avslöja Tick fysiologi, försäkra Tick smittsamhet, förstå Tick-patogen interaktioner, och den cellulära och humorala immun svar9,17,18.
Tick hemolymfa insamling genom benet styckning redovisas i flera studier19,20,21. Trots denna metod är enkel med ingen eller mycket låg hemolymfa förorening, det anses kontra produktivt för studier som kräver höga koncentrationer av hemocyter eller stora volymer av hemolymfa. Å andra sidan, det korrekta utförandet av hemolymfa insamling genom den dorsala regionen svullna Honor är inte lätt att uppnå eftersom tarmen upptar nästan hela fäs tingen kroppen och spricker den med nålen orsakar hemolymfa förorening. Kontaminering på grund av tarm störningar kan också observeras när fäs tingen är naturligt infekterad med hög belastning av hemoparasiter (dvs Babesia spp.), eller i de sista stegen i döds processen orsakad av entomopathogens8. I dessa fall ska hemolymfa kasseras eftersom hemocyter och plasma analyser kan påverkas.
Centrifugeringshastigheten av hemolymfa prover för hemocyter skörd är också viktigt och direkt påverka hemocyter koncentrationen, eftersom höga relativa centrifugalfält (RCF) hastigheter bidra till: i) cellpellet svårt att återuppstå, II) celler störningar, och III) hemocyter degranulering. Den idealiska cellpelleten är en mjuk pellet som är lätt att omsuspendera. Av denna anledning användes centrifugering vid 500 x g i tre minuter vid 4 ° c8 . I denna studie, hemocyter var resuspenderade i ett odlings substrat och inte i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eftersom odlings mediet stöder bättre cell livs kraft.
De metoder som presenteras här kan möta begränsningar när de tillämpas på subadulta stadier (larv och nymf) av fästingar eller omatad vuxna. Inympningmetoden, till exempel, är endast tillämpas för vuxna svullna Honor eftersom nålen storleken kommer att skada omogna stadier och möjligen obematade vuxna fästingar. För att Inokulera dessa stadier ska en mikroinjektor användas. Likaså är hemolymfa insamling genom den dorsala regionen mer effektiv när den appliceras på svullna fästingar, medan hemolymfa insamling genom att skära benen kan användas i studier med omatad vuxna fästingar eller omogna stadier. Trots detta var vårt mål här att Visa metoder som kräver mycket låga tekniska resurser. Dessutom måste centrifugeringsteknik utföras vid låg centrifugeringskraft eftersom hög kraft eller förlängd rotations tid kan skada cellerna.
De metoder som redovisas här kan användas som rikt linjer för studier med inympning av entomopathogener i fästingar och hemolymfa/hemocyter skörd. De tekniker som presenteras här kräver mycket låga tekniska resurser och är klassiska steg för studier om Tick fysiologi, patologi, och Tick ' s immun svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie finansierades delvis av Coordenacão de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES) från Brasilien, ekonomi kod 001. CAPES gav doktors stipendium för AF Marciano. Vi tackar nationella rådet för vetenskaplig och teknisk utveckling (CNPq) i Brasilien för att ge Ph.D. stipendium för J. Fiorotti. Denna forskning stöddes också av bidrag av Carlos Chagas Filho stiftelsen för forskning i delstaten Rio de Janeiro (FAPERJ) och CNPq. V.R.E.P. Bittencourt är en CNPq forskare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).
- Gene, J. Mémoires de l'Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L.
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Biology of ticks. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
