Summary
우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2'-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.
Abstract
차세대 염기서열 분석(NGS)에 의한 소형 RNA(sRNA)에 대한 연구는 도서관 준비 중 편향문제에 의해 도전받고 있습니다. 식물 microRNAs (miRNAs)와 같은 sRNA의 몇몇 모형은 그들의 3' 말단 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 (2'-OMe) 수정을 전송합니다. 이 수정은 3'어댑터 결찰을 억제하기 때문에 또 다른 어려움을 추가합니다. 이전에는 'TruSeq(TS)' 프로토콜의 수정된 버전이 편향이 적고 2'-OMe RNA의 검출이 개선되었다는 것을 입증했습니다. 여기서는 전체적인 성능을 가장 잘 보여준 프로토콜 'TS5'를 자세히 설명합니다. TS5는 TS 키트의 홈메이드 시약 또는 시약을 사용하여 동일한 성능으로 따를 수 있습니다.
Introduction
작은 RNA (sRNA)는 생물 학적 과정의 다양성의 제어에 관여1. 진핵 조절 sRNA는 전형적으로 20 와 30 nt 크기 사이; 3개의 중요한 모형은 microRNAs (miRNA), piwi 상호 작용하는 RNA (piRNA) 및 작은 간섭 RNA (siRNA)입니다. 비정상적인 miRNA 발현 수준은 다양한 질병2에서연루되어 왔다. 이것은 건강과 질병에 있는 miRNAs의 중요성 및 일반적으로 sRNAs를 검출하기 위하여 정확하고 정량적인 연구 공구를 위한 필요함을 강조합니다.
차세대 염기서열 분석(NGS)은 sRNA를 연구하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 정량적 PCR 또는 마이크로어레이 기술(qPCR)과 같은 다른 접근법과 비교하여 NGS의 주요 장점은 sRNA 서열에 대한 사전 지식이 필요하지 않으며 따라서 새로운 RNA를 발견하는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 배경 신호 및 채도 효과. 또한, 단일 뉴클레오티드 차이를 검출할 수 있으며 마이크로어레이보다 처리량이 더 높습니다. 그러나 NGS에는 몇 가지 단점이 있습니다. 시퀀싱 실행 비용은 상대적으로 높게 유지되며 시퀀싱을 위해 샘플을 라이브러리로 변환하는 데 필요한 다단계 프로세스가 편향을 유발할 수 있습니다. 전형적인 sRNA 라이브러리 제제 공정에서, 3' 어댑터는 ATP가 없는 경우 RNA 리가제 2(RNL2) 및 프리아베닐화된 3' 어댑터의 잘린 버전을 사용하여sRNA(종종 총 RNA로부터 겔 정제)로 먼저 결찰된다. 이는 sRNA 어댑터 결찰의 효율을 증가시키고 sRNA 순환화 또는 연결화와 같은 측 반응의 형성을 감소시킨다. 이어서, 5' 어댑터는 RNA 리가제 1(RNL1)에 의해 결찰되고, 이어서 역전사(RT) 및 PCR 증폭이 뒤따른다. 이러한 모든 단계는 바이어스3,4를도입 할 수 있습니다 . 따라서 판독값은 인공적인 방법 종속 발현 패턴으로 이어지는 실제 sRNA 발현 수준을 반영하지 않을 수 있습니다. 특정 sRNA는 라이브러리에서 과대 또는 과소 표현될 수 있으며, 강하게 과소 대표되는 sRNA는 탐지를 벗어날 수 있습니다. 상황은 특히 식물 miRNAs, 곤충 및 식물의 siRNAs, 곤충, 선충 및 포유동물의 piRNAs, 있는 3' 말단 뉴클레오티드가 2'-O-Methyl(2'-OMe) 변형1을갖는다. 이 수정은 3' 어댑터 결찰5를강력하게 억제하여 이러한 유형의 RNA에 대한 라이브러리 준비를 어려운 작업으로 만듭니다.
이전 작업은 어댑터 결찰이 RNA 서열 /구조 효과6,7,8,9,10,11로인해 심각한 편향을 도입한다는 것을 입증했다. 역전사 및 PCR과 같은 어댑터 결찰의 하류 단계는 바이어스6,11,12에크게 기여하지 않는다. 결찰 편향은 주어진 서열을 가진 어댑터 분자가 반응 혼합물에서 sRNA 분자와 상호 작용하여 공동 접기를 형성할 것이고, 이는 결찰에 대해 유리하거나 불리한 구성으로 이어질 수 있다는사실(도 2)에기인한다. Sorefan 등의 데이터는 RNL1이 단일 가닥 컨텍스트를 선호하는 반면 RNL2는 결찰을 위한 이중 가닥을 선호한다는 것을 시사합니다. 어댑터/sRNA 코폴드 구조가 특정 어댑터 및 sRNA 서열에 의해 결정된다는 사실은 특정 sRNA가 지정된 어댑터 세트와 과대 또는 과소 대표되는 이유를 설명합니다. 또한 일련의 sRNA 라이브러리를 비교할 때 동일한 어댑터 서열을 사용해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 실제로, 상이한 바코드 서열의 도입에 의해 어댑터를 변경하면 시퀀싱 라이브러리9,13에서miRNA 프로파일이 변경되는 것이 관찰되었다.
결찰 접합 부근의 어댑터 서열의 무작위화는 이러한 바이어스를 감소시킬 가능성이 높습니다. Sorefan 및 동료7그들의 사지에 4 개의 무작위 뉴클레오티드를 가진 어댑터를 사용, 지정된 "고화질" (HD) 어댑터, 이러한 어댑터의 사용은 더 나은 진정한 sRNA 발현 수준을 반영하는 라이브러리로 이어질 것으로 나타났다. 보다 최근의 작업은 이러한 관찰을 확인하고 무작위 영역이 결찰접합부(11)에인접할 필요가 없다는 것을 밝혔다. 이 새로운 유형의 어댑터는 "MidRand" 어댑터로 명명되었습니다. 이러한 결과는 향상된 어댑터 설계가 바이어스를 줄일 수 있음을 보여줍니다.
어댑터를 수정하는 대신 반응 조건의 최적화를 통해 바이어스를 억제할 수 있습니다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 결찰효율(14)을증가시키는 것으로 알려진 거대 분자 우향제로서, 바이어스15,16을현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 여러 가지 "낮은 바이어스" 키트가 시장에 나타났습니다. 여기에는 고전적인 어댑터 또는 HD 어댑터와 함께 결찰 반응에서 PEG를 사용하는 키트가 포함됩니다. 다른 키트는 결찰을 완전히 피하고 3' 폴리아데닐레이션 및 템플릿 스위칭을 3' 및 5' 어댑터 추가용으로 각각12개사용합니다. 또 다른 전략에서, 3' 어댑터 결찰은 순환 화 단계 뒤에, 따라서 5' 어댑터결찰(17)을생략한다.
이전 연구에서는 가능한 가장 낮은 수준의 바이어스와 2'-OMe RNA12의최상의 검출을 갖춘 sRNA 라이브러리 준비 프로토콜을 검색했습니다. 우리는 표준 프로토콜 (TS)보다 2'-OMe RNA의 더 나은 검출을 했다 위에서 언급 한 '낮은 바이어스' 키트의 일부를 테스트. 그러나 놀랍게도, 수정시 (무작위 어댑터의 사용, 결찰 반응에서 PEG 및 정제에 의한 초과 3' 어댑터의 제거) 후자는 2'-OMe RNA의 검출을 위한 다른 프로토콜을 능가하였다. 여기서는 2'-OMe RNA의 전체 검출이 가장 좋은 TS 프로토콜인 'TS5'를 기반으로 하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 TS 키트의 시약과 'Nf' 키트의 시약을 사용하거나, 동일한 성능으로 집에서 만든 시약을 사용하여 비용을 절감할 수 있습니다. 우리는 또한 총 RNA에서 sRNA의 정제 및 preadenylated 3' 어댑터의 제조를 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 작은 RNA의 격리
- 페놀 계 시약 또는 다른 방법을 사용하여 총 RNA를 추출합니다. RNA가 좋은 품질인지 확인합니다.
- 200 V에서 15 분 동안 15 % TBE 우레아 젤 (재료 표참조)을 미리 실행하십시오.
- 겔이 사전 실행되는 동안, 5-15 μL 부피의 포름아미드 로딩 염료(재료 표참조; 95% 탈이온화된 포르마미드, 0.025% 브로모페놀 블루, 0.025% 자일렌 시안올, 5 mM EDTA pH 8)를 20μg의 PC에서 혼합한다. 마찬가지로, 작은 RNA 사다리의 10 μL (200 ng)를동일한 부피의 포름아미드 로딩 염료와 혼합하십시오. 가열 된 뚜껑이있는 열사이클러에서 65 °C에서 5 분 동안 인큐베이션 한 다음 튜브를 얼음에 즉시 놓습니다.
- 사다리와 샘플을 적어도 하나의 레인으로 동일한 겔에 적재하고 브로모페놀 블루(진한 청색)가 겔 길이의 약 2/3(약 40분)까지 200V에서 실행한다.
- 다음과 같이 젤에서 RNA를 용해하는 시스템을 준비하십시오 : 21 게이지 바늘로 뉴클레아제없는 0.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브의 바닥에 구멍을 뚫습니다. 천공 된 0.5 mL 튜브를 뉴클레아제없는 둥근 바닥 2 mL 마이크로 원심 분리튜브에 놓습니다.
- 겔을 제거하고, 실온에서 3 μL 핵산 겔 얼룩(10,000 x 농축물; 물질 표참조)을 30 mL 물에서 10-15분 동안 배양한다.
- '다크 리더' 트랜스 일루미너이터에서 젤을 보고(RNA를 손상시킬 수 있으므로 UV를 피하는 것이 좋습니다) 17 nt와 29 nt 사다리 대역 사이의 샘플 RNA를 잘라냅니다. 겔 조각을 1.5단계에서 0.5 mL 튜브로 옮김.
- 2 분 동안 최대 속도로 마이크로 원심 분리기에서 2 mL 튜브에 0.5 mL 튜브를 원심 분리. 지금 비어 있어야 0.5 mL 튜브를 제거합니다.
- 분쇄된 겔을 함유하는 2 mL 튜브에 300 μL의 뉴클레아제 프리 0.3 M NaCl을 넣고 실온에서 또는 4°C에서 하룻밤(16시간)에서 적어도 2시간 동안 회전한다.
- 분쇄된 젤 조각의 현탁액을 스핀 컬럼(재료 표참조)과 원심분리기를 마이크로 원심분리기에서 최대 속도로 2분 동안 옮니다.
- 글리코겐 1 μL(20 μg/μL)과 실온 100% 에탄올 950 μL을 추가합니다. -80°C에서 30분 이상 배양한다.
- 4 °C에서 마이크로 원심 분리기에서 최대 속도로 20 분 동안 원심 분리기. 상급을 제거하고 800 μL의 차가운 80 % 에탄올로 펠릿을 씻으십시오. 원심분리기를 4°C에서 5분 간 다시 제거하고 모든 상급체를 조심스럽게 제거합니다. 뉴클레아제 자유물 15 μL에서 RNA 펠릿을 다시 중단시다. 전형적으로, 작은 RNA의 ~5-20 ng는 입력 총 RNA의 양에 따라 회복되어야 한다(입력 총 RNA의 1 μg 당 작은 RNA의 ~1 ng).
- 권장 추가 단계: 회수된 sRNA의 양 및 품질을 확인한다(예를 들어, 작은 RNA 키트를 사용하여 모세관 겔 전기동공에 의한; 재료표참조).
2. 사전 3' HD 어댑터 준비
참고: 3' HD 어댑터의 사전 조정은 첸 외18에의해 설명된 프로토콜과 유사한 방식으로 수행되었다. 미리 입력된 어댑터는 직접 주문할 수 있지만(/5rApp/ 수정), 이것은 매우 비쌉입니다.
- 주문 5' 인산화, 3' 차단 3' HD 어댑터 올리고뉴클레오티드. 시퀀스 및 수정사항은 표 1을 참조하십시오. 참고로 '3AmMO'는 3' 아미노 수정기 그룹이며, 대부분의 공급업체는 이러한 수정을 통해 올리고뉴클레오티드를 생산할 수 있습니다. 뉴클레아제 자유물에 100 μM으로 희석한다.
- 다음 시약을 포함하는 100 μL 반응을 설정합니다: 올리고 10 μL (100 μM), T4 RNA 리가제 완충제 10 μL (10x), ATP의 10 μL (10 mM), 40 μL 의 50% PEG8000, 5 μL의 T4 RNA 리가제 1 (50 단위), 25μass. 20 °C에서 하룻밤 배양.
- 에탄올 침전후 프리아베닐화된 올리고뉴클레오티드의 고전적인 페놀-클로로폼 추출을 수행한다. 산 (pH 4.5) 페놀 : 클로로 포름과 와류의 100 μL을 추가합니다. 실온에서 최대 속도로 5분 동안 회전합니다. 상층의 90 μL을 신중하게 새로운 튜브로 옮기고; 10 μL의 3 M 아세테이트 pH 5.2, 초순수 글리코겐 1 μL 및 차가운 100 % 에탄올 250 μL을 추가하십시오.
- -20°C에서 30분 이상 원심분리기를 4°C 최대 속도로 30분 간 유지합니다. 상급체를 제거하고 펠릿을 500 μL 차가운 80 % 에탄올로 한 번 씻으십시오. 페놀-클로로폼 추출 및 에탄올 침전의 대안으로서, 뉴클레오티드 제거 키트를 사용할 수 있다(재료 표참조). 25 μL 의 물에 다시 일시 중단하십시오.
- 단일 가닥 DNA의 특정 검출을 위한 키트를 사용하여 어댑터의 농도를 측정합니다(재료 표참조). 80 ng/μL (10 μM)로 희석하십시오.
- 권장 추가 단계: 15% TBE-우레아젤(재료표)에1μL의 1μL을 처리되지 않은 올리고뉴클레오티드와 함께 이동하여 프리아데닐레이션의 효능을 확인하였다. 미리 처리된 어댑터는 처리되지 않은 올리고뉴클레오티드보다 약간 느리게 이동해야 합니다. 원하는 경우, 미리 된 어댑터는 겔 정제 될 수있다; 위에서 설명한 대로 진행하십시오(단계 1.2-1.12).
3. 도서관 준비 - 프로토콜 TS5
참고: 우리는 우리가 이전에설명한 수정된 TS 프로토콜 'TS5'를 여기에서 제시하고 키트에서 시약 또는 자가 제공된 시약으로 수행될 수 있습니다. 우리는 다른 프로토콜, 'TS7'와 유사하거나 약간 더 나은 결과를 얻은 것을 주목해야한다. 그러나 TS7에서는 어댑터 디이머를 제거하기가 더 어렵습니다. 따라서 TS5를 자세히 설명하는 것이 바람직하지만 TS7은 어댑터를 교체하기만 하면 됩니다. TS7의 경우 'MRL(MidRand-Like)' 어댑터 시퀀스를사용합니다(표 1). 여기서 임의화된 영역은 어댑터 중간에 있습니다. 역전사 및 PCR을 위한 프라이머는 5' 어댑터에서 무작위 영역의 3' 어댑터 및 업스트림에서 무작위 화된 영역의 하류로 혼성화될 것이다. 시퀀싱은 5' 어댑터에서 첫 번째 무작위 뉴클레오티드로부터 시작됩니다.
- 3' 어댑터 결찰.
- 0.2 mL 마이크로 원심분리튜브에 1 μL의 사전 3' HD 어댑터(10 μM)와 정제된 소형 RNA 1μL(~0.1-1 μM)을 결합합니다. 열 사이클러에서 72 °C에서 2 분 동안 인큐베이션 한 다음 얼음에 직접 넣습니다.
- 4 μL의 50 % PEG 8000 (점성 용액; 파이펫 천천히), RNA 리가제 완충액 1 μL (10x), H2O 1 μL, T4 RNA 리가제2 트렌차, RNase 억제제 1 μL을 추가합니다. 16 °C에서 하룻밤 배양.
- 슬리지 없는 3' 어댑터 제거
- 10 μL의 뉴클레아제없는 물을 넣고 잘 섞습니다. Nf키트(재료 표)에서3 M NaOAc pH 5.2 또는 '어댑터 고갈 솔루션'의 6 μL을 넣고 잘 섞습니다. 40 μL의 자기 정제 비드(재료 표)와이소 프로판올 60 μL을 넣고 잘 섞습니다. 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 용액이 투명해질 때까지 샘플을 마그네틱 랙에 넣습니다. 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
- 갓 준비한 80% 에탄올 180 μL을 첨가합니다. ~ 30 s에 대 한 배양, 다음 제거. 신선하게 준비된 80% 에탄올을 사용하고 장시간 80% 에탄올로 배양하지 않도록 주의하십시오.
- 튜브를 잠시 회전시키고 우물 바닥에 수집되었을 수 있는 잔류 액체를 제거합니다. 구슬을 2분 동안 건조시키자, 10 mM Tris pH 8의 22 μL에서 재중단하거나 Nf 키트에서 재서스펜션 버퍼로 재정지합니다. 2 분 동안 배양 한 다음 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자화하십시오.
- Nf키트(재료 표)에서3M NaOAc pH 5.2 또는 '어댑터 고갈 솔루션'의 6μL을 새 튜브에 추가합니다. 이전 단계에서 상급물의 20 μL을 이 새로운 튜브로 옮기고 파이펫팅하여 혼합합니다. 자기 비드 40 μL과 100 % 이소 프로판올 60 μL을 추가하고 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 5 분 동안 배양하십시오.
- 용액이 선명해 질 때까지 샘플을 자화한 다음 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
- 갓 준비한 80% 에탄올 180 μL을 첨가합니다. ~ 30 s에 대 한 배양, 다음 제거. T에케 케어는 신선하게 제조된 80% 에탄올을 사용하고 장시간 80% 에탄올로 배양하지 않는다.
- 튜브를 잠시 회전시키고 우물 바닥에 수집되었을 수 있는 잔류 액체를 제거합니다. 구슬을 2 분 동안 건조시키고 뉴클레아제없는 물 10 μL에서 다시 일시 중단하십시오. 2 분 동안 배양 한 다음 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자화하십시오.
- 상급의 9 μL을 새 튜브로 옮김. T4 RNA 리가제 완충제(10x)와 물 1 μL을 1 μL 더 넣습니다. 또는 TS 키트에서 2 μL의 리가아제 버퍼를 추가합니다.
- 5' 어댑터 결찰.
- 5' HD 어댑터 1 μL(10 μM; 표 1) 가열 된 뚜껑이있는 열 사이클러에서 200 μL PCR 튜브에. 70 °C에서 2 분 동안 인큐베이션 한 다음 튜브를 얼음에 직접 넣습니다.
- 1 0 mM ATP의 1 μL 및 T4 RNA 리가제 1의 1 μL을 추가합니다. 부드럽게 파이펫팅하여 잘 섞으세요. 3.2.9 단계에서 3'결개 된 RNA에이 혼합물의 3 μL을 추가하고 파이펫팅으로 혼합하십시오. 28 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 역전사(RT)
- 새로운 200 μL PCR 튜브에 3' 및 5' 어댑터 결찰 RNA의 6 μL을 전송합니다 (필요한 경우 나중에 사용하기 위해 나머지 ~ 8 μL을 -80 °C에서 유지하십시오). RT 프라이머 1 μL추가 (10 μM; 표 1) 파이펫팅으로 혼합합니다. 70 °C에서 2 분 동안 인큐베이션 한 다음 튜브를 얼음에 직접 넣습니다.
- RT에 대한 다음 시약을 추가: 5x 제1 스트랜드 완충제 의 2 μL, 0.5 μL 의 12.5 mM dNTP 혼합, 100 mM DTT의 1 μL, RNase 억제제의 1 μL, 및 역전사의 1 μL(재료표). 50 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- PCR 증폭
- RT 반응 혼합물의 12.5 μL에 다음 시약을 첨가: PCR 폴리머라제 완충제 10 μL, 범용 P5 프라이머 2 μL (10 μM; 표 1),P7-인덱스 프라이머의 2 μL(10 μM; 표 1),1 μL 의 12.5 mM dNTP, 0.5 μL의 DNA 폴리머라제(재료 표),및 22 μL의 물. 사용 될 때까지 얼음에 반응을 유지합니다.
- 다음 PCR 프로그램을 실행: 30s에 대한 98 °C, 11 사이클 (10 s의 경우 98 °C, 30 s의 경우 60 °C, 15 s의 경우 72 °C) 및 72 °C10 분 동안 10 분 동안 반응을 유지하십시오.
참고: PCR 사이클 의 수에 관한: 우리는 일반적으로 수행 11 사이클, 하지만이 사용자에 의해 최적화 되어야 한다. 가능한 최소한의 PCR 주기를 수행하십시오.
- 젤 정제
- PCR 제품의 5, 10 및 20 μL을 기본 6% TBE 젤(재료 표참조)과 적절한 사다리(재료 표참조)로 실행합니다. 145 V에서 약 1 시간 동안 젤을 실행하십시오 (브로모페놀 블루가 바닥에 도달 할 때까지 이 염료는 65 bp 위치에서 이동합니다).
- 겔을 제거하고, 10-15분 동안 물에 핵산 겔 얼룩(물질 표참조)으로 배양한다.
- "다크 리더" 트랜스 일루미너레이터에서 젤을 보고(RNA를 손상시킬 수 있으므로 UV를 피하는 것이 좋습니다) 라이브러리 밴드를 150 bp로 잘라내고, 1.5단계에서 설명한 바와 같이 겔로부터 RNA를 용해시키고 겔 조각을 0.5 mL 튜브로 옮기는 시스템을 준비한다.
- 2 분 동안 최대 속도로 마이크로 원심 분리기. 지금 비어 있어야 0.5 mL 튜브를 제거합니다.
- 분쇄된 겔을 함유한 2 mL 튜브에 300 μL의 뉴클레아제 없는 물을 넣고 실온에서 또는 4°C에서 하룻밤 동안 적어도 2시간 동안 회전합니다.
- 분쇄된 젤 조각의 현탁액을 최대 속도로 2분 동안 스핀 컬럼과 원심분리기로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 합니다.
- 글리코겐 1 μL(20 μg/μL), 3M NaOAc 30 μL, 얼음 차가운 100% 에탄올 975μL을 첨가합니다. 4 °C에서 최대 속도로 20 분 동안 원심 분리기.
- 10 mM Tris pH8의 20 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 농도 측정에 1 μL, 품질 관리를 위해 1 μL을 사용합니다.
4. 데이터 분석
참고: 아래에 설명된 데이터 분석 절차는 Linux 운영 체제 우분투 16.04 LTS를 기반으로 합니다.
- 원시 시퀀스 파일 처리
- 시퀀싱 실행 중에 생성된 FASTQ 시퀀스 파일을 다운로드합니다. 필요한 경우 bcl2fastq2(버전 V2.2.18.12; 다음 링크에서 설명서를 다운로드할 수 있음)http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html)로 다중화를 수행합니다.
다음 명령을 사용합니다.
nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq--runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --바코드-불일치 1 --집계 된 타일 AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16 - Cutadapt19 버전 1.15를 사용하여 어댑터 시퀀스를 제거합니다. 매뉴얼은 여기에서 다운로드 할 수 있습니다 : https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
다음 명령을 사용합니다.
통로_to_컷적응/ cutadapt -tGGAATCTCGGGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-트림 10 -o 출력_File_Read1_cutadapt.fastq.gz 입력_File_Read1.fastq.gz
명령의 서열은 4개의 랜덤 뉴클레오티드가 없는 3' HD 어댑터에 해당합니다. 따라서 이 단계에서는 제거되지 않습니다. - 시퀀싱 판독에서 말단 무작위 뉴클레오티드의 제거를 위해 seqtk(https://github.com/lh3/seqtk)를 사용한다. 다음 명령(굵게 표시된 변수 이름)을 사용합니다.
seqtk 트림 fq -b 4 -e 4 출력_파일_Read1_컷적응 .fastq > 출력_파일_읽기1 _트리밍 .fastq - 10 nt보다 짧은 시퀀스를 삭제하려면 다음 awk 명령을 사용합니다.
awk 'BEGIN {FS = "\t"; OFS = "\n"} {헤더 = $0; getline seq ; getline qseq ; getline qseq ; if (length(seq) > 10) {인쇄 헤더, seq, qheader, qseq}' Output_File_Read1_trimmed.fastq > Length_Filtered.fastq .fastq
- 시퀀싱 실행 중에 생성된 FASTQ 시퀀스 파일을 다운로드합니다. 필요한 경우 bcl2fastq2(버전 V2.2.18.12; 다음 링크에서 설명서를 다운로드할 수 있음)http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html)로 다중화를 수행합니다.
- 트리밍된 시퀀스 매핑
- miRBase에서 연구의 유기체에 해당하는 데이터베이스를 다운로드하려면 다음과 같이 합니다. http://www.mirbase.org/ftp.shtml 가서 'mature.fa' 파일을 다운로드합니다. 서열은 RNA 표기으로 표시됩니다. U 잔류물을 T로 바꾸면 다음 명령이 있습니다.
sed -i '/^>/! s/U/T/g' 성숙.fa
참고 : 이것은 다양한 유기체에서 유래 하는 miRBase의 모든 miRNAs의 전체 목록을 얻을 것 이다. - 다음 명령을 사용하여 관심 있는 유기체의 miRNA 서열을 선택합니다.
awk 'name_of_the_organism{인쇄; nr[NR+1]; 다음}; NR 의 nr' mature.fa > 성숙한_name_of_the_organism_mirs.fa - Bowtie220(버전 2.3.0)을 사용하여 위에서 만든 파일에 읽기를 매핑하여 불일치를 방지합니다. 먼저 다음 명령을 통해 파일에 대한 인덱스를 작성합니다.
bowtie2-build 성숙한_name_of_the_organism_mirs.fa 성숙한_name_of_the_organism_mirs - 순서 를 데이터베이스에 정렬하여 읽기가 불일치 없이 데이터베이스의 miRNA에 전적으로 매핑되도록 합니다. 이를 위해 다음 도구를 사용하십시오.
bowtie2 -N 0 -L 10 --점수-분 C,0,0 --엔드-투-엔드-엔드-엔드-엔드-엔드-엔드-엔드-엔드-투-엔드--엔드-투-엔드--시간-x 성숙한_name_of_the_organism_mirs-U Length_Filtered.fastq-S 길이_Filtered_ALIGNMENT.sam
참고: --점수-분 C,0,0 은 정렬이 불일치없이 되도록 합니다. 도구의 다양한 매개 변수에 대한 설명은 다음 웹 사이트를 방문하십시오 http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - 정렬되지 않은 읽기를 삭제하려면 다음 명령을 사용합니다.
samtools 보기 -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam
참고: 이러한 단계의 결과로 miRNA에 해당하는 정렬된 읽기를 얻었습니다.
- miRBase에서 연구의 유기체에 해당하는 데이터베이스를 다운로드하려면 다음과 같이 합니다. http://www.mirbase.org/ftp.shtml 가서 'mature.fa' 파일을 다운로드합니다. 서열은 RNA 표기으로 표시됩니다. U 잔류물을 T로 바꾸면 다음 명령이 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
임계 단계는 시작 총 RNA 물질의 작은 RNA 분획의분리(도 3)및 원하는 최종 라이브러리 생성물(도4)이다. 두 단계 모두 폴리아크릴아미드 겔 정제를 포함; 작은 RNA는 15% TBE 우레아 젤에서 분리되고, 최종 라이브러리는 6% 네이티브 TBE 겔로부터 분리된다. 젤로부터 분리된 작은 RNA는 작은 RNA 모세관 전기영동칩(물자표; 그림 3 B).이것은 사용자가 회복된 작은 RNA의 양과 제제에서 miRNA의 비율을 추정할 수 있게 한다.
최종 라이브러리 제품의 겔 정제는 원하는 라이브러리에 가깝게 이동하는 다수의 추가 제품이 형성됨에 따라 섬세한 단계이다. 이 어댑터 디이머와 같은 다른 종으로 라이브러리를 오염 하는 위험을 증가 시킬 것 이다 젤을 과부하 하지 않는 것이 중요 하다. 일례로(도4)PCR 증폭 라이브러리(B. napus RNA로부터)의 양이 증가하여 겔에 적재되었고 예상 크기(150 bp)에 해당하는 제품을 잘라냈다(그림4A). 용출 후, 정제된 라이브러리를 모세관 겔 전기영동 칩상에서 확인하였다; 예상된 150 bp 생성물 이외에, 130 bp 종의 증가 비율, 어댑터 디머에 대응하는 PCR 생성물의 증가양이 로드됨에 따라 관찰되었다(도4B,C).
우리는 프로토콜 TS5키트의 시약과 마찬가지로 집에서 만든 시약과 유사하게 수행되는지 테스트했습니다. 이를 위해, 우리는 합성 작은 RNA 1-6의 혼합에서 라이브러리를 준비, 또는 2'-OMe 수정없이 각각 의 존재, 우리의 이전 연구에서 수행된 바와 같이12. 그림 5는 이전에 획득한 이러한 RNA 각각에 상응하는 판독의 비율을 나타내며, TS 및 Nf 키트 또는 다른 공급업체로부터 의 시약을 사용하여 만들어진 새로운 라이브러리를 가지고 있다. 볼 수 있듯이, 매우 유사한 결과를 얻었다.
도 6은 2'-OMe 변형된 miRNA, 및 변형되지 않은 인간 miRNA의식물(A. 탈리아나 및 B. napus)miRNAs의 검출을 위한 표준 TS 프로토콜과 프로토콜 TS5의 성능을 비교한 것을 나타낸다. 우리는 또한 인간 샘플에서 변형 된 piRNAs, 2'-OMe의 검출을 테스트했습니다. 알 수 있듯이, TS5는 2'-OMe RNA의 검출을 위해 TS보다 훨씬 더 잘 수행하지만 수정되지 않은 RNA는 수행하지 않습니다. 그러나 수정되지 않은 sRNA의 경우 더 많은 수의 RNA가 검색되지 않더라도 얻은 판독 번호는 낮은 바이어스 수준으로 인해 TS보다 TS5를 사용하여 진정한 표현 수준을 더 잘 반영할 수 있습니다.
그림 1 . 일루미나 시퀀싱을 위한 sRNA 라이브러리 준비 워크플로우의 개략적 표현. 첫째, sRNA는 겔 정제 단계에 의해 단리된다. 여기서, miRNAs의 크기 범위는 표시되지만 관심 있는 RNA에 따라 다른 크기 범위를 선택할 수 있습니다. 품질 관리(QC) 단계는 그 후 단리된 sRNA의 품질 및 양을 확인하기 위해 수행된다. 라이브러리 준비 동안, 미리 된 (App) 3' 어댑터는 먼저 sRNA에 결찰된다. 그런 다음 5' 어댑터가 결찰됩니다. 이어서 역전사는 3' 어댑터에 상보적인 프라이머를 사용하여 수행되고, 그 다음에 PCR 증폭이 수행되고, 그 동안 일루미나 P5, P7 및 인덱스('In') 서열이 추가된다. 생성된 라이브러리는 겔 정제되고, 그 다음에 품질 관리 단계가 뒤따른다. 그런 다음 라이브러리가 순서를 바릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 . 서열 의존적 어댑터-sRNA 공동 접기로 인한 바이어스. 어댑터 결찰 혼합물에서 어댑터는 어댑터 및 sRNA의 서열에 의존하는 방식으로 sRNA와 결합됩니다. 따라서, 상이한 sRNAs(예시 a, b 및 c; 녹색의 다른 음영으로 표시됨)는 주어진 어댑터와 다르게 접을 것이다(3' 어댑터는 빨간색으로 표시되고 5' 어댑터는 파란색으로 표시됨). 검은 색 화살표는 결찰 접합을 나타냅니다. 이것은 결찰에 대한 유리한 또는 불리한 맥락으로 이어질 수 있습니다. RNL2가 이중 연선 환경을 선호하는 것으로 나타나면, 3' 결찰은 RNA c에 대한 것보다 RNA a 및 b에 대해 더 효율적일 것으로 예상된다. RNL1이 결찰 접합부 주위의 단일 연선 영역에 대한 선호도를 갖는 경우, 5' 어댑터 결찰은 RNA a에 대해 가장 효율적일 수 있으며, 그 다음에 b와 c. 함께 sRNA a, 중간의 과대 표현을 초래할 수 있습니다. RNA b의 표현및 최종 라이브러리에서 RNA c의 과소 표현, 3개의 RNA가 원래 RNA 견본에서 동등한 양으로 존재하는 경우에. 비슷한 방식으로 어댑터 시퀀스를 변경할 때(예: 다른 바코드를 추가하여) 주어진 sRNA가 다르게 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 . 작은 RNA와 품질 관리의 격리. (A). 브라시카 나푸스 총 RNA(10 μg)를 15% TBE 우레아 분해 폴리아크릴아미드 겔에 전기 동극 분리. 작은 RNA 사다리(재료 표 참조)를 분자 크기 마커로 함께 이동하였다. 이동 후 겔을 염색하고 RNA를 트랜스 일루미너레이터상에서 시각화시켰다. 17 내지 29개의 뉴클레오티드 영역을 잘라내고(적색 직사각형으로 표시) RNA를 용출하였다. (B). 정제된 RNA의 품질은 모세관 겔 전기동에 의해 확인되었다. 이 분석은 샘플에서 miRNA의 비율에 대한 정보를 제공합니다 (이 경우 93 %). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 . B. 나푸스 소형 RNA 라이브러리의 겔 정제는 TS5 및 품질 관리에 따라 제조되었다. (A). B. 나푸스 작은 RNA로부터 PCR 증폭 라이브러리의 양을 증가시켜 6% 네이티브 TBE 겔에 적재하였다; 2.5 μL (a), 5 μL (b), 10 μL (c) 또는 20 μL (d) PCR 제품. 50 bp 사다리가 나란히 마이그레이션되었습니다. 예상된 150 pb 위치에서 이동하는 PCR 제품은 분리(빨간 직사각형)되었고, DNA를 용출하고 정제하였다. (B). 정제 된 라이브러리의 품질 관리; 젤 표현. (C). 동일한 분석의 일렉트로로그램 표현. 볼 수 있듯이, 150 pb 제품은 더 많은 양의 PCR 제품이 겔에서 마이그레이션됨에 따라 어댑터 디이머(~130bp)로 점점 더 오염되고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 . 프로토콜 TS5는 TS 및 Nf 키트의 시약 또는 다른 공급업체의 시약과 유사하게 수행됩니다. 프로토콜 TS5를 사용하여 RNA(OMe)1-6에 해당하는 원시 판독총 수(트리밍 전)의 백분율을 나타내는 히스토그램은 TS 및 Nf 키트(파란색 막대) 또는 다른 공급업체의 시약(주황색 막대)의 시약과 함께 진행됩니다. 비교를 위해 이전 연구의 결과는 회색 막대로 표시됩니다. RNA1-6(총 RNA)또는 RNA-OMe1-6(총 RNA-OMe)에해당하는 판독의 총 개수는 또한 도시된다. 도시된 것은 적어도 두 개의 독립적인 실험의 평균 값이다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 일부는 Dard-Dascot 외, 201812에서수정되었습니다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 . 프로토콜 TS5의 miRNA 검출과 고전적인 TS 방법의 비교. (A). miRBase에서 A. 탈리아나, B. 나푸스 또는 H. 사피엔스 miRNAs에 매핑하는 읽기의 비율이 결정되었습니다. 우리는 또한 piRNA 검출을 위한 piRBase에 인간 적인 도서관의 판독을 매핑했습니다. A.탈리아나 및 B.napus miRNAs, 뿐만 아니라 인간 piRNAs는 인간 miRNAs와 는 대조적으로 2'-OMe 수정된다는 것을 유의하십시오. 표시된 값은 두 개 이상의 독립적인 실험의 평균 값이며 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (B). 식별된 miRNAs(또는 piRNAs)의 수입니다. 우리는 프로토콜 TS 또는 TS5로 확인된 다른 종에서 알려진 miRNAs의 수를 결정했습니다. A. 탈리아나, B. 나푸스 또는 H. 사피엔스의경우 427, 92 및 2588 miRNAs가 각각 miRBase에 등록되었습니다. TS 또는 TS5 라이브러리에서 050만 개의 읽기가 miRbase의 B. napus miRNAs에 매핑되었고, 1백만 개의 판독이 A. 탈리아나 또는 인간 데이터베이스에 매핑되었습니다. 표시된 값은 오차 막대로 표시되는 표준 편차가 있는 두 개 이상의 독립적인 실험의 평균 값입니다. 이 수치는 Dard-Dascot 외, 201812에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 올리고뉴클레오티드 | 5' 수정 | 3' 수정 | 시퀀스 5'에서 3'까지 | 정화 | |||||
| 5' HD(TS5) 어댑터 | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNrNrN (이 올리고는 DNA RNA 키메라; 3' 말단 nts는 RNA입니다) | Hplc | ||||||
| 3' HD(TS5) 어댑터 | 인산 염 | 3AmMO | [포스]rNrNrNRNTGTGTCTGCCAAGG[3AaMO] (이 올리고는 DNA RNA 키메라; 4 개의 5' 말단 nts는 RNA입니다) | Hplc | |||||
| 5' MRL(TS7) 어댑터 | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNNNNrArCrGrArArArC (이 올리고는 DNA RNA 키메라; 일곱 3'말단 nts는 RNA입니다) | Hplc | ||||||
| 3' MRL(TS7) 어댑터 | 포스파트 | 3AmMO | [포스] GTATCGNNNNNNNTGTCGG[3암모] | Hplc | |||||
| RT 프라이머 | GCCTTGGCACCC가가아테카 | Hplc | |||||||
| 범용 P5 프라이머 | 아타그그그카카가가CTACACGTTCAGAGTACAGTCCGA | Hplc | |||||||
| P7 인덱스 프라이머 | CAAGGAAGAGACACACGAGATNNNNNNNNgGACTGGTTTTGGCACGAGAATTCCA (NNNNN = 인덱스) | Hplc | |||||||
| 인덱스 1: CGTGAT | |||||||||
| 인덱스 2: ACATCG | |||||||||
| 인덱스 3: GCCTAA | |||||||||
| 인덱스 4: TGGTCA | |||||||||
| 색인 5: 선인장 | |||||||||
| 인덱스 6: ATTGGC | |||||||||
| 인덱스 7: 가트CtG | |||||||||
| 인덱스 8: TCAAGT | |||||||||
| 인덱스 9: CTGATC | |||||||||
| 색인 10: AAGCTA | |||||||||
| 인덱스 11: GTAGCC | |||||||||
| 인덱스 12: TACAAG | |||||||||
표 1. 이 프로토콜과 함께 사용되는 올리고뉴클레오티드.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
작은 RNA 라이브러리 제제는 주로 어댑터 결찰 단계 동안 도입된 바이어스로 인해 여전히 도전적이다. 식물 miRNAs, 곤충의 piRNA, 선충 및 포유동물의 piRNA, 곤충 및 식물의 작은 간섭 RNA(siRNA)와 같은 3' 말단에서 2'-OMe 변형을 가진 RNA는 2'-OMe 변형이 3' 적응기 결찰을 억제하기 때문에 연구하기가 특히 어렵습니다. sRNA 라이브러리 준비 프로토콜을 개선하기 위해 문헌에서 다수의 솔루션이 제안되었지만, 대부분의 시판되는 키트는 여전히 심각한 편견을 가진 고전적인 TS 프로토콜을 기반으로 합니다. 몇 가지 '낮은 바이어스' 키트가 존재하지만, 결찰 반응에서 무작위 어댑터 및 PEG가 있는 Nf 키트를 포함하고, 어댑터 결찰을 모두 피하는 몇 가지 키트가 최근에 나타났다12. 우리는 Nf가 표준 TS 프로토콜보다 더 많은 상이한 miRNA를 검출한다고 이전에 보고했지만, 프로토콜 'S'(어댑터 결찰 없이)는 부작용12의유의한 형성으로 인해 상대적으로 저조한 수행을 수행하였다. 놀랍게도, 수정시 TS 프로토콜은 다른 프로토콜보다 2'-OMe sRNA의 더 민감한 검출을 가졌지만 정상 sRNA는 그렇지 않았습니다. 우리는 어댑터가 그들의 사지에서 무작위로 되는 TS5 프로토콜을 상세히 설명하기 위하여 여기에서 선택했습니다, PEG는 결찰 반응에서 이용되고 초과 3' 어댑터는 구슬에 정제에 의해 제거됩니다. MRL 어댑터를 사용하는 다른 프로토콜(TS7)이 TS5 프로토콜보다 약간 더 잘 수행될 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 그러나 둘 사이에는 사소한 차이점만 있고 TS7을 사용하면 원하는 라이브러리 제품을 어댑터 디이머와 분리하기가 더 어렵기 때문에 TS5 프로토콜을 자세히 설명하는 것이 좋습니다. 그러나 원하는 경우 사용자는 TS7 어댑터로 TS5 어댑터를 교체할 수 있습니다. 이 제품은 ~150bp가 아닌 ~170bp의 최종 라이브러리 제품으로 이어지는 약간 더 길다는 점에 유의하십시오.
'홈메이드' 재료로 프로토콜 TS5 또는 TS7을 수행할 수 있으므로 비용을 대폭 절감할 수 있습니다. 그러나, 집에서 만든 재료와 품질 측면에서 더 큰 가변성이있을 수 있습니다; 특히 집에서 만든 사전 adenylated 3'어댑터는 사전 adenylation의 다양한 효능으로 인해 다양한 품질이 달라질 수 있습니다. 따라서 큰 주식을 준비하는 것이 좋습니다 및 새로운 주식이 준비되는 경우, 이전과 성능을 비교. 대조군 RNA 샘플은 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 프로토콜의 단점은 상대적으로 강한 부형 생성물 형성 및 이들 제품으로부터 원하는 라이브러리를 분리하는 어려움이다. 정화를 위해 아크릴아미드 젤을 과부하시키지 않도록 주의해야 합니다. 최근에는, 변형된 어댑터가 크게 감소된 경향을 가지는다이머(21)를형성하도록 개발되었다. 5' 어댑터의 3' 끝에 있는 2'-OMe 수정은 3' 어댑터의 5' 말단에서 메틸포스포네이트 수정과 결합되어 어댑터 다이머를 효율적으로 억제합니다. 본 명세서에서 이러한 수정된 어댑터를 시험하는 것은 흥미로를 것이다.
프로토콜 TS5의 겔 정제 단계는 상대적으로 노동 집약적이다. 수정된 어댑터를 효율적으로 사용하면 어댑터 디이머의 형성이 감소하는 경우 최종 라이브러리의 겔 정제가 더 이상 필요하지 않을 수 있습니다. 또한, 작은 RNA를 분리하는 겔 정제 단계의 대안으로서(1단계), 작은 RNA를 풍부하게 하는 자기 비드를 이용한 전략이 존재한다(https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). 우리는이 방법을 스스로 사용하지 는 않았지만 테스트 할 가치가 있으며 잘 작동하면 프로토콜을 크게 단순화 할 수 있습니다.
결론적으로, 프로토콜 TS5는 더 향상될 수 있는 동안, 2'OMe sRNA의 검출을 위해, 적어도 우리의 이전 비교 분석에서 시험된 그, 상업적으로 유효한 키트 보다는 더 나은 수행합니다. 그것은 상당한 비용 절감을 허용, 집에서 만든 재료를 사용하여 따를 수 있습니다. 편의를 위해 TS 및 Nf 키트의 시약을 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 과학 연구를위한 국립 센터에 의해 지원되었다 (CNRS), 프랑스 대안 에너지 및 원자력 위원회 (CEA) 파리 수드 대학. 이 연구를 위한 모든 라이브러리 준비, 일루미나 시퀀싱 및 생물 정보학 분석은 I2BC 차세대 염기서열 분석(NGS) 시설에서 수행되었습니다. I2BC NGS 시설의 구성원은 원고와 유용한 제안의 비판적 독서에 대한 인정된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
