Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من RNAs 2'-O-Methyl

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/60056
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute for Integrative Biology of the Cell, UMR9198, CNRS CEA Univ Paris-Sud, Université Paris-Saclay

Summary

نقدم بروتوكول تعويض مكتبة RNA صغيرة مفصلة مع تحيز أقل من الأساليب القياسية وزيادة الحساسية لRNAs 2'-O-methyl. ويمكن اتباع هذا البروتوكول باستخدام الكواشف محلية الصنع لتوفير التكلفة أو استخدام مجموعات للراحة.

Abstract

وتتحدى قضايا التحيز أثناء إعداد المكتبة دراسة التقارير RNSالصغيرة (sRNAs) من قبل الجيل التالي من التسلسل. عدة أنواع من الحمض النووي الريبي مثل microRNAs النباتية (miRNAs) تحمل تعديل 2'-O-ميثيل (2'-OMe) في النيوكليوتيد اتّحدى 3. يضيف هذا التعديل صعوبة أخرى لأنه يمنع ربط المحول 3'. لقد أثبتنا في السابق أن الإصدارات المعدلة من بروتوكول 'TruSeq (TS)' لها تحيز أقل وأحدث تية محسنة لـ RNAs 2'-OMe. هنا نقوم بوصف بالتفصيل بروتوكول 'TS5'، الذي أظهر أفضل أداء عام. TS5 يمكن اتباعها إما باستخدام الكواشف محلية الصنع أو الكواشف من مجموعة TS، مع أداء متساو.

Introduction

وتشارك التقييمات RNSالصغيرة (sRNAs) في مراقبة تنوع العمليات البيولوجية1. عادة ما يتراوح حجم الـ sRNAs التنظيمية Eukaryotic بين 20 و30 nt؛ الأنواع الرئيسية الثلاثة هي microRNAs (ميرنا)، RNAs piwi التفاعل (بيرنا) وRNAs التدخل الصغيرة (siRNA). وقد تورطت مستويات التعبير ميرنا Aberrant في مجموعة متنوعة من الأمراض2. وهذا يؤكد أهمية miRNAs في الصحة والمرض والحاجة إلى أدوات بحث دقيقة وكمية للكشف عن sRNAs بشكل عام.

الجيل التالي من التسلسل (NGS) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لدراسة sRNAs. المزايا الرئيسية للـ NGS بالمقارنة مع النُهج الأخرى، مثل تقنيات PCR الكمية أو المصفوفة الدقيقة (qPCR)، هي أنها لا تحتاج إلى معرفة مسبقة بتسلسلات الحمض النووي الريبي، وبالتالي يمكن استخدامها لاكتشاف RNAs جديدة، وبالإضافة إلى ذلك فإنه يعاني من أقل من إشارة الخلفية وتأثيرات التشبع. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن الكشف عن الاختلافات النيوكليوتيد واحد ولها الإنتاجية أعلى من المصفوفات الدقيقة. ومع ذلك، فإن المنظمات غير الحكومية لديها أيضا بعض العيوب؛ تظل تكلفة تشغيل التسلسل مرتفعة نسبياً وقد تؤدي عملية الخطوات المتعددة المطلوبة لتحويل عينة إلى مكتبة للتسلسل إلى تحيزات. في عملية إعداد مكتبة sRNA نموذجية، يتم ربط محول 3 ' أولاً إلى sRNA (غالباً ما يتم تنقية هلام من إجمالي RNA) باستخدام نسخة مقتطعة من RNA ligase 2 (RNL2) ومحول preadenylated 3 ' (الشكل 1) في غياب ATP. وهذا يزيد من كفاءة الربط محول sRNA ويقلل من تشكيل ردود الفعل الجانبية مثل التعميم sRNA أو التعام. في وقت لاحق، يتم ربط محول 5 'بواسطة RNA ligase 1 (RNL1)، تليها النسخ العكسي (RT) وتضخيم PCR. كل هذه الخطوات قد إدخال التحيز3،4. وبالتالي، قد لا تعكس أرقام القراءة مستويات التعبير sRNA الفعلية مما يؤدي إلى أنماط التعبير الاصطناعية المعتمدة على الأسلوب. قد تكون sRNAs محددة إما ممثلة تمثيلاً زائداً أو ناقصاً في مكتبة، وقد تهرب sRNAs الممثلة تمثيلاً ناقصاً بشدة من الكشف. الوضع معقد بشكل خاص مع الميرنات النباتية، سيرنا في الحشرات والنباتات، وpiRNAs في الحشرات، الديدان الخيطية والثدييات، والتي النيوكليوتيد الطرفية 3 لديها 2'-O-ميثيل (2'-OMe) تعديل1. هذا التعديل يمنع بشدة 3 'ربط محول5،مما يجعل إعداد المكتبة لهذه الأنواع من RNA مهمة صعبة.

العمل السابق أظهر أن ربط محول يدخل التحيز خطيرة،وذلك بسبب آثار تسلسل RNA / هيكل6،7،8،9،10،11. خطوات المصب من ربط محول مثل النسخ العكسي وPCRلا تسهم بشكل كبير في التحيز6،11،12. التحيز الربط من المرجح يرجع ذلك إلى حقيقة أن جزيئات محول مع تسلسل معين سوف تتفاعل مع جزيئات sRNA في خليط التفاعل لتشكيل طيات مشتركة، التي قد تؤدي إما إلى تكوينات مواتية أو غير مواتية للربط(الشكل 2). وتشير البيانات الواردة من Sorefan وآخرون7 إلى أن RNL1 يفضل سياق واحد تقطعت بهم السبل، في حين أن RNL2 يفضل حبلا مزدوجة للربط. حقيقة أن يتم تحديد بنيات المحول/sRNA القابلة للطي بواسطة المحول المحدد وتسلسلات sRNA يفسر لماذا sRNA معينة هي الإفراط أو التمثيل الناقص مع مجموعة محول معينة. من المهم أيضاً ملاحظة أنه ضمن سلسلة من مكتبات sRNA لمقارنتها، يجب استخدام نفس تسلسلات المحول. في الواقع، وقد لوحظ سابقا أن تغيير المحولات عن طريق إدخال تسلسل الباركود مختلفة يغير ملامح ميرنا في تسلسل المكتبات9،13.

من المحتمل أن يؤدي عشوائية تسلسلات المحول بالقرب من تقاطع الربط إلى تقليل هذه التحيزات. Sorefan وزملاؤه7 تستخدم محولات مع 4 النيوكليوتيدات العشوائية في أطرافها، وعينت "عالية الوضوح" (HD) محولات، وأظهرت أن استخدام هذه المحولات يؤدي إلى المكتبات التي تعكس بشكل أفضل مستويات التعبير sRNA صحيح. وأكد عمل أحدث هذه الملاحظات وكشف أن المنطقة العشوائية لا تحتاج إلى أن تكون مجاورة لتقاطع الربط11. تم تسمية هذا النوع الجديد من المحولات محولات "MidRand". معاً، توضح هذه النتائج أن تصميم المحول المحسّن يمكن أن يقلل من التحيز.

بدلاً من تعديل المحولات، يمكن منع التحيز من خلال تحسين ظروف رد الفعل. البولي ايثيلين غليكول (PEG)، وهو عامل الازدحام الجزيئي الكلي المعروف لزيادة كفاءة الربط14، وقد ثبت للحد بشكل كبير من التحيز15،16. واستنادا إلى هذه النتائج، ظهرت عدة مجموعات "التحيز المنخفض" في السوق. وتشمل هذه المجموعات التي تستخدم PEG في ردود الفعل الربط، إما في تركيبة مع محولات الكلاسيكية أو محولات HD. مجموعات أخرى تجنب الربط تماما، واستخدام 3 'polyadenylation والتبديل قالب ل3 'و 5' إضافة محول، على التوالي12. في استراتيجية أخرى، يتبع ربط محول 3 'خطوة التعميم، وبالتالي حذف 5 ' ربط محول17.

في دراسة سابقة، بحثنا عن بروتوكول إعداد مكتبة sRNA مع أدنى مستويات ممكنة من التحيز وأفضل الكشف عن 2'-OMe RNAs12. اختبرنا بعض مجموعات "التحيز المنخفض" المذكورة أعلاه، والتي كان الكشف عن هادىر 2'-OMe RNAs أفضل من البروتوكول القياسي (TS). ولكن من المستغرب، على تعديل (استخدام محولات معشاة، PEG في ردود الفعل الربط وإزالة محول الزائدة 3 'عن طريق تنقية) هذا الأخير تفوق البروتوكولات الأخرى للكشف عن RNAs 2'-OMe. هنا، ونحن نصف بالتفصيل بروتوكول يستند إلى بروتوكول TS، 'TS5'، الذي كان أفضل الكشف العام من RNAs 2'-OMe. ويمكن اتباع البروتوكول باستخدام الكواشف من مجموعة TS وكاشف واحد من مجموعة 'Nf' أو، لتوفير المال، وذلك باستخدام الكواشف محلية الصنع، مع أداء متساو. كما نقدم بروتوكول مفصل لتنقية sRNA من الجيش الملكي النيبالي الكلي وإعداد محول 3 'preadenylated.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- عزل التقييمات RNAs الصغيرة

  1. استخراج الجيش الملكي النيبالي باستخدام الكواشف القائمة على الفينول أو أي طريقة أخرى. تحقق مما إذا كان الحمض النووي الريبي من نوعية جيدة.
  2. قبل تشغيل هلام TBE-اليوريا 15٪ (انظر جدول المواد)لمدة 15 دقيقة في 200 V.
  3. في حين أن الجل هو قبل تشغيل, مزيج 5-20 ميكروغرام من إجمالي RNA في حجم 5-15 درجة مئوية مع حجم متساو من صبغ تحميل formamide (انظر جدول المواد; 95% منزوع الأيونات formamide, 0.025% بروموفينول الأزرق, 0.025% xylene سيانول, 5 MM EDTA pH 8) في أنبوب PCR 200 درجة مئوية. وبالمثل، مزيج 10 درجة مئوية (200 نانوغرام) من سلم الحمض النووي الريبي الصغير (انظر جدول المواد)مع حجم متساو من صبغة التحميل فورماميد. حضانة لمدة 5 دقائق في 65 درجة مئوية في دراجة حرارية مع غطاء ساخن، ثم وضع الأنابيب على الفور على الجليد.
  4. تحميل سلم والعينة على نفس هلام مع حارة واحدة على الأقل بينهما وتشغيل في 200 V حتى الأزرق بروموفينول (الأزرق الداكن) قد هاجر حوالي ثلثي طول هلام (حوالي 40 دقيقة).
  5. إعداد نظام لelute الحمض النووي الريبي من هلام على النحو التالي: ثقب الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الصغيرة خالية من nuclease 0.5 مل مع إبرة قياس 21. ضع أنبوب 0.5 مل المثقوب في أنبوب الطرد المركزي الصغير 2 مل خالية من النوكليس.
  6. إزالة هلام، واحتضان في درجة حرارة الغرفة مع 3 ميكروغرام هلام حمض نووي وصمة عار (10،000 × التركيز؛ انظر جدول المواد)في 30 مل من الماء لمدة 10-15 دقيقة.
  7. عرض هلام على 'قارئ الظلام' عبر المضيء (فمن المستحسن بشدة لتجنب الأشعة فوق البنفسجية لأن هذا قد يضر الحمض النووي الريبي) وقطع الحمض النووي الريبي عينة بين 17 NT و 29 NT سلم العصابات. نقل قطعة هلام إلى أنبوب 0.5 مل من الخطوة 1.5.
  8. طرد مركزي أنبوب 0.5 مل في أنبوب 2 مل في جهاز طرد مركزي صغير في السرعة القصوى لمدة 2 دقيقة.
  9. إضافة 300 درجة مئوية من nuclease خالية 0.3 M NaCl إلى أنبوب 2 مل التي تحتوي على هلام سحقت وتناوب لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (16 ساعة).
  10. نقل تعليق قطع هلام سحقت إلى عمود تدور (انظر جدول المواد)والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في السرعة القصوى في جهاز طرد مركزي صغير.
  11. إضافة 1 μL (20 ميكروغرام / ميكرولتر) من الجليكوجين (انظر جدول المواد)و 950 درجة مئوية من درجة حرارة الغرفة 100٪ الإيثانول. حضانة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة عند -80 درجة مئوية.
  12. الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في السرعة القصوى في جهاز طرد مركزي صغير عند 4 درجة مئوية. إزالة supernatant، وغسل بيليه مع 800 درجة مئوية من البرد 80٪ الإيثانول. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، وإزالة بعناية كل supernatant. إعادة تعليق الحمض النووي الريبي بيليه في 15 ميكرولتر من المياه الخالية من nuclease. عادة، ~ 5-20 نانوغرام من الحمض النووي الريبي الصغيرة ينبغي استردادها، اعتمادا على كمية المدخلات مجموع RNA (~ 1 نانوغرام من RNA الصغيرة لكل 1 ميكروغرام من المدخلات مجموع RNA).
  13. الخطوة الإضافية الموصى بها: التحقق من كمية ونوعية sRNA المستردة (على سبيل المثال، عن طريق الكهربائي هلام الشعرية باستخدام مجموعة RNA صغيرة؛ انظر جدول المواد).

2. إعداد preadenylated 3 'HD محول

ملاحظة: تم preadenylation من محول HD 3 'بطريقة مماثلة للبروتوكول الذي وصفه تشن وآخرون18. لاحظ أنه يمكن طلب محول preadenylated مباشرة (/5rApp/ تعديل)، ولكن هذا مكلف جدا.

  1. ترتيب 5 'فوسفوريلاتيد، 3' منعت 3 'HD محول oligonucleotide. انظر الجدول 1 للاطلاع على التسلسل والتعديلات. لاحظ أن '3AmMO' هو 3 ' مجموعة المعدل الأميني، يمكن لمعظم الموردين إنتاج oligonucleotide مع هذا التعديل. تمييع في المياه الخالية من النوكل إلى 100 درجة مئوية.
  2. إعداد رد فعل 100 ميكرولتر يحتوي على الكواشف التالية: 10 ميكرولتر من القلة (100 درجة مئوية)، 10 ميكرولتر من T4 RNA ligase العازلة (10X)، 10 ميكرولتر من ATP (10 MM)، 40 ميكرولتر من 50٪ PEG8000، 5 ميكرولتر من T4 RNA ligase 1 (50 وحدة)، 25 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل. الحضانة بين عشية وضحاها عند 20 درجة مئوية.
  3. إجراء استخراج الفينول الكلوروفورم الكلاسيكية من oligonucleotide preadenylated تليها هطول الأمطار الإيثانول. إضافة 100 ميكرولتر من الحمض (درجة الحموضة 4.5) الفينول: الكلوروفورم والدوامة. تدور لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، والسرعة القصوى. نقل بعناية 90 درجة مئوية من المرحلة العليا إلى أنبوب جديد. إضافة 10 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم درجة الحموضة 5.2، 1 درجة مئوية من الجليكوجين فائقة النقاء و 250 درجة مئوية من الإيثانول البارد 100٪.
  4. يُحفظ عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. إزالة supernatant، وغسل بيليه مرة واحدة مع 500 درجة مئوية الباردة 80٪ الإيثانول. كبديل لاستخراج الفينول كلوروفورم وهطول الأمطار الإيثانول، يمكن استخدام مجموعة إزالة النيوكليوتيد (انظر جدول المواد). إعادة تعليق في الماء 25 ميكرولتر.
  5. قياس تركيز المحول باستخدام مجموعة للكشف محددة من الحمض النووي الذي تقطعت به السبل واحدة (انظر جدول المواد). تمييع إلى 80 نانوغرام / ميكرولتر (10 درجة مئوية).
  6. الخطوة الإضافية الموصى بها: تحقق من فعالية preadenylation عن طريق ترحيل 1 ميكرولتر من 10 م محول على هلام TBE-اليوريا 15٪(جدول المواد)جنبا إلى جنب مع oligonucleotide غير المعالجة. يجب أن يهاجر المحول preadenylated أبطأ قليلاً من oligonucleotide غير المعالجة. إذا رغبت في ذلك، يمكن أن يكون محول preadenylated هلام تنقية. المضي قدما على النحو المبين أعلاه (الخطوات 1-2-1-12).

3. إعداد المكتبة - بروتوكول TS5

ملاحظة: نقدم هنا بروتوكول TS المعدل 'TS5' الذي وصفناهسابقا12 ويمكن أن يتم إما مع الكواشف من مجموعة أو مع الكواشف المقدمة ذاتيا. وتجدر الإشارة إلى أننا حصلنا على نتائج مماثلة أو حتى أفضل قليلا مع بروتوكول مختلف، 'TS7'. ومع ذلك، مع TS7 من الصعب القضاء على وحدات الديمتر. لذلك فضلنا وصف TS5 بالتفصيل، ولكن TS7 يمكن أن يتبع ببساطة استبدال المحولات. بالنسبة لـ TS7، استخدم تسلسلات المحول 'MidRand-like (MRL)'(الجدول 1). لاحظ أن المناطق العشوائية هنا في منتصف المحولات. سوف التمهيديات للنسخ العكسي وPCR التهجين إلى تسلسل المصب من المنطقة المعشاة في محول 3 'والمنبع من المنطقة العشوائية في محول 5'. سيبدأ التسلسل من أول نيوكليوتيد معشاة في المحول 5'.

  1. 3 ' ربط محول.
    1. الجمع بين 1 ميكرولتر من محول HD 3 'preadenylated 3 ' (10 درجة مئوية) مع 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الصغير النقي (~ 0.1-1 درجة مئوية) في أنبوب الطرد المركزي الصغير 0.2 مل. حضانة لمدة 2 دقيقة في 72 درجة مئوية في دورة الحرارية، ثم وضع مباشرة على الجليد.
    2. إضافة 4 ميكرولتر من 50٪ PEG 8000 (محلول لزج؛ pipet ببطء)، 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الرباطي العازلة (10X)، 1 ميكرولتر من H2O، 1 ميكرولتر من T4 RNA ligase2 اقتطاع، و 1 ميكرولتر من مثبطات RNase. الحضانة بين عشية وضحاها عند 16 درجة مئوية.
  2. القضاء على محول 3 'غير الليغا
    1. أضف 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلووووووووووووون واخلطي جيداً. إضافة 6 ميكرولتر من 3 M NaOAc درجة الحموضة 5.2 أو "محول استنفاد الحل" من مجموعة Nf(جدول المواد)ومزيج جيدا. إضافة 40 درجة مئوية من حبات تنقية المغناطيسي(جدول المواد)و 60 درجة مئوية من isopropanol ومزيج جيدا. الحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. ضع العينة في رف مغناطيسي حتى يظهر الحل واضحًا. إزالة وتجاهل supernatant.
    3. إضافة 180 درجة مئوية من الإيثانول أعدت حديثا 80٪. حضانة ل ~ 30 s، ثم إزالة. الحرص على استخدام الإيثانول أعدت حديثا 80٪ ولا حضانة مع الإيثانول 80٪ لفترات طويلة.
    4. تدور لفترة وجيزة الأنبوب وإزالة السائل المتبقية التي قد تكون جمعت في الجزء السفلي من البئر. دع الخرز يجف لمدة دقيقتين، ثم أعيد تعليقه في 22 ميكرولتر من 10 mM Tris pH 8 أو المخزن المؤقت لإعادة التعليق من مجموعة Nf. حضانة لمدة 2 دقيقة، ثم مغنطة العينة حتى يظهر الحل واضحة.
    5. إضافة 6 μL من 3 M NaOAc درجة الحموضة 5.2 أو "محول استنفاد الحل" من مجموعة Nf(جدول المواد)إلى أنبوب جديد. نقل 20 درجة مئوية من supernatant من الخطوة السابقة إلى هذا الأنبوب الجديد ومزيج من قبل pipetting. إضافة 40 درجة مئوية من الخرز المغناطيسي و 60 درجة مئوية من 100٪ isopropanol ومزيج جيدا عن طريق الأنابيب. الحضانة لمدة 5 دقائق.
    6. مغنطة العينة حتى يظهر الحل واضحة، ثم إزالة وتجاهل supernatant.
    7. إضافة 180 درجة مئوية من الإيثانول أعدت حديثا 80٪. حضانة ل ~ 30 s، ثم إزالة. Take الرعاية لاستخدام الإيثانول أعدت حديثا 80٪ ولا حضانة لمع الإيثانول 80٪ لفترات طويلة.
    8. تدور لفترة وجيزة الأنبوب وإزالة السائل المتبقية التي قد تكون جمعت في الجزء السفلي من البئر. يُترك الخرز جافًا لمدة دقيقتين، ويُعلّق من جديد في 10 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل. حضانة لمدة 2 دقيقة، ثم مغنطة العينة حتى يظهر الحل واضحة.
    9. نقل 9 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب جديد. إضافة 1 ميكرولتر من T4 RNA ligase العازلة (10X) و 1 ميكرولتر من الماء. بدلاً من ذلك، إضافة 2 μL من المخزن المؤقت ligase من مجموعة TS.
  3. ربط محول 5 '.
    1. إضافة 1 ميكرولتر من محول HD 5 ' (10 درجة مئوية; الجدول 1) إلى أنبوب PCR 200 ميكرولتر في دورة الحرارية مع غطاء ساخن. حضانة لمدة 2 دقيقة في 70 درجة مئوية، ثم وضع الأنبوب مباشرة على الجليد.
    2. إضافة 1 درجة مئوية من ATP 10 mM و 1 ميكرولتر من T4 RNA ligase 1. يُمزج المزيج جيّداً بالأنابيب برفق. إضافة 3 μL من هذا المزيج إلى الحمض النووي الريبي 3 'ligated من الخطوة 3.2.9 ومزيج من الأنابيب. حضانة لمدة 1 ساعة عند 28 درجة مئوية.
  4. النسخ العكسي (RT)
    1. نقل 6 μL من 3 ' و 5 ' محول ليغاد RNA إلى أنبوب PCR جديد 200 μL (الحفاظ على ما تبقى ~ 8 درجة مئوية في -80 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق إذا لزم الأمر). إضافة 1 ميكرولتر من التمهيدي RT (10 درجة مئوية; الجدول 1) ومزيج من قبل الأنابيب. حضانة لمدة 2 دقيقة في 70 درجة مئوية، ثم وضع الأنبوب مباشرة على الجليد.
    2. إضافة الكواشف التالية لRT: 2 μL من 5X المخزن المؤقت حبلا الأولى، 0.5 ميكرولتر من 12.5 مل dNTP مزيج، 1 ميكرولتر من 100 MM DTT، 1 ميكرولتر من مثبطات RNase، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي(جدول المواد). حضانة لمدة 1 ساعة عند 50 درجة مئوية.
  5. تضخيم PCR
    1. تضاف الكواشف التالية إلى خليط التفاعل RT الذي تبلغ 12.5 ميكرولتر: 10 ميكرولتر من المخزن الاحتياطي للبوليميراز PCR، و2 ميكرولتر من التمهيدي العالمي P5 (10 ميكرومتر؛ الجدول 1)،2 ميكرولتر من التمهيدي P7-مؤشر (10 درجة مئوية؛ الجدول 1)،و1 ميكرولتر من 12.5 مليون متر من الدنتس، و0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي(جدول المواد)،و22 ميكرولتر من الماء. الحفاظ على رد الفعل على الجليد حتى الاستخدام.
    2. تشغيل برنامج PCR التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ق، 11 دورات (98 درجة مئوية ل 10 ق، 60 درجة مئوية لمدة 30 ق و 72 درجة مئوية لمدة 15 ق) و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: فيما يتعلق بعدد دورات PCR: نقوم عادةً بتنفيذ 11 دورة ولكن يجب تحسين هذا من قبل المستخدم. حاول تنفيذ أصغر عدد ممكن من دورات PCR.
  6. تنقية الجل
    1. تشغيل 5، 10 و 20 ميكرولتر من المنتج PCR على هلام TBE الأصلي 6٪ (انظر جدول المواد)جنبا إلى جنب مع سلم مناسب (انظر جدول المواد). تشغيل هلام لحوالي 1 ساعة في 145 V (حتى الأزرق بروموفينول يصل إلى القاع؛ هذه الصبغة يهاجر في موقف 65 نقطة بقوة حصانة).
    2. إزالة هلام، وحضانة مع وصمة عار هلام حمض نووي (انظر جدول المواد)في الماء لمدة 10-15 دقيقة.
    3. عرض هلام على "قارئ الظلام" عبر المضيء (فمن المستحسن بشدة لتجنب الأشعة فوق البنفسجية لأن هذا قد يضر الحمض النووي الريبي) وقطع الفرقة مكتبة في 150 bp. إعداد نظام لelute RNA من هلام كما هو موضح في الخطوة 1.5 ونقل قطعة هلام إلى أنبوب 0.5 مل.
    4. الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي صغير في السرعة القصوى لمدة 2 دقيقة.
    5. إضافة 300 درجة مئوية من المياه الخالية من nuclease إلى أنبوب 2 مل التي تحتوي على هلام سحقت وتناوب لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. نقل تعليق قطع هلام سحقت في الماء إلى عمود تدور والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في السرعة القصوى.
    7. إضافة 1 ميكرولتر من (20 ميكروغرام / ميكرولتر) الجليكوجين، 30 ميكرولتر من 3 M NaOAc و 975 ميكرولتر من الجليد البارد 100٪ الإيثانول. الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في السرعة القصوى في 4 درجة مئوية.
    8. إعادة تعليق بيليه في 20 درجة مئوية من 10 MM تريس pH8. استخدم 1 ميكرولتر لقياس التركيز و1 ميكرو لتر لمراقبة الجودة.

4 - تحليل البيانات

ملاحظة: يستند إجراء تحليل البيانات الموضحة أدناه إلى نظام التشغيل Linux أوبونتو 16.04 LTS.

  1. معالجة ملفات التسلسل الخام
    1. قم بتنزيل ملف (ملفات) تسلسل FASTQ التي تم إنشاؤها أثناء تشغيل التسلسل. إذا لزم الأمر، قم بإجراء إلغاء تعدد الإرسال باستخدام bcl2fastq2 (الإصدار V2.2.18.12؛ ويمكن تنزيل دليل من الرابط التالي: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
      استخدم الأمر التالي:
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --Output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatch 1 --التجميع البلاط AUTO-r 16 -d 16 -p 16 -w 16
    2. إزالة تسلسلات المحول باستخدام Cutadapt19 الإصدار 1.15. يمكن تحميل دليل هنا: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      استخدم الأمر التالي:
      [سطول_تو_كتتكييف] / cutadapt-a TGGAATTCTCGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10-j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz Input_File_Read1 .fastq.gz
      لاحظ أن التسلسل في الأمر يتوافق مع محول HD 3 'دون النيوكليوتيدات العشوائية 4; ولذلك لن تتم إزالة هذه خلال هذه الخطوة.
    3. استخدام seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) لإزالة النيوكليوتيدات العشوائية الطرفية في يقرأ التسلسل. استخدم الأمر التالي (أسماء المتغيرات بخط غامق):
      seqtk trimfq -b 4 -e 4 إخراج_ملف_Read1_cutadapt .fastq > إخراج_ملف_قراءة1 _قلص .fastq
    4. استخدم الأمر awk التالي لتجاهل تسلسلات أقصر من 10 nt:
      awk 'BEGIN {FS = "\t" ; OFS = "\n"} {رأس = $0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; إذا (طول(seq) >= 10) {رأس الطباعة, seq, qheader, qseq}}' Output_File_Read1_rimmed.fastq > Length_Filtered.fastq
  2. تعيين التسلسلات المشذبة
    1. تحميل قاعدة البيانات المقابلة للكائن الحي للدراسة من miRBase على النحو التالي. انتقل إلى http://www.mirbase.org/ftp.shtml وتنزيل ملف 'mature.fa'. لاحظ أن تتم الإشارة إلى التسلسلات في تدوين RNA. استبدال المخلفات U بواسطة T الأمر التالي:
      Sed -i '/^>/! s/U/T/g'mature.fa
      ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى قائمة كاملة بجميع الميلانينات في miRBase، التي تنشأ من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية.
    2. حدد تسلسل miRNA الكائن الحي الخاص بك من الفائدة مع الأمر التالي:
      awk 'name_of_the_organism{print; nr[NR+1]; next}; NR في nr' mature.fa >ناضجة_ name_of_the_organism_mirs.fa
    3. تعيين القراءة إلى الملف الذي تم إنشاؤه أعلاه باستخدام Bowtie220 (الإصدار 2.3.0) السماح عدم التطابق. أولاً، إنشاء فهرس للملف الخاص بك مع الأمر التالي:
      بووتي2-بناء ناضجة_name_of_the_organism_mirs.faناضجة_ name_of_the_organism_mirs
    4. محاذاة يقرأ التسلسل إلى قاعدة البيانات، مما يتطلب أن يقرأ قراءة تماماً إلى miRNA من قاعدة البيانات، دون أي عدم تطابق. لهذه الغاية، استخدم الأداة التالية:
      bowtie2 -N 0 -L 10 -score-min C,0,0 -end-to-end-time-x mature_name_of_the_organism_mirs-U Length_Filtered.fastq-S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam
      ملاحظة: الخيار: ---النتيجة دقيقة C,0,0 يضمن أن المحاذاة بدون أي عدم تطابق. للحصول على شرح لمختلف المعلمات في الأداة، يرجى زيارة الموقع التالي: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
    5. لتجاهل القراءة التي لم تتم محاذاة، استخدم الأمر التالي:
      samtools عرض -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam
      ملاحظة: نتيجة لهذه الخطوات، يجب الآن الحصول على قراءات محاذاة، المقابلة لmiRNAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الخطوات الحاسمة هي عزل جزء RNA الصغيرة من المواد RNA مجموع البداية (الشكل 3) والمنتج المكتبة النهائية المطلوب (الشكل 4). كلا الخطوات تنطوي على تنقية هلام بوليأكريلاميد; يتم عزل الحمض النووي الريبي الصغيرة من 15٪ TBE هلام اليوريا، في حين يتم عزل المكتبات النهائية من 6٪ هلام TBE الأصلي. يمكن تحليل الحمض النووي الريبي الصغيرة المعزولة من هلام على رقاقة صغيرة RNA الكهربائي الشعرية(جدول المواد; الشكل 3 B).وهذا سوف يسمح للمستخدمين لتقدير كمية RNA الصغيرة المستردة ونسبة ميرنا في التحضير.

تنقية هلام من المنتج المكتبة النهائية هي خطوة حساسة كما يتم تشكيل عدد من المنتجات الإضافية التي تهاجر بالقرب من المكتبة المطلوبة. من المهم عدم التحميل الزائد للهلام لأن هذا سيزيد من خطر تلويث المكتبة مع الأنواع الأخرى مثل ديمر المحول. على سبيل المثال (الشكل 4) ، تم تحميل كميات متزايدة من مكتبة PCR-mplified (من B. napus RNA) على الجل وتم قطع المنتج المقابل للحجم المتوقع (150 نقطة أساس ) (الشكل 4A). بعد الإلتبيلة، تم فحص المكتبة النقية على رقاقة الكهربائي هلام الشعرية. بالإضافة إلى المنتج المتوقع 150 نقطة أساس، لوحظت نسبة متزايدة من 130 نوعا من وحدات ضغط الدم، المقابلة للمحول ديمترات كما تم تحميل كميات متزايدة من المنتج PCR(الشكل 4B، C).

لقد اختبرنا إذا كان بروتوكول TS5 ينفذ بالمثل مع الكواشف محلية الصنع كما هو الحال مع الكواشف من مجموعات. ولهذه الغاية، قمنا بإعداد المكتبات من مزيج من RNAs الاصطناعية الصغيرة 1-6، كل هدية دون أو مع تعديل 2'-OMe، كما هو الحال في دراستنا السابقة12. ويبين الشكل 5 نسبة القراءات المقابلة لكل من هذه التقييمات RNA التي تم الحصول عليها سابقاً ومع المكتبات الجديدة المصنوعة باستخدام الكواشف من مجموعات TS وNf أو من موردين آخرين. وكما يتضح من ذلك، تم الحصول على نتائج مماثلة جدا.

ويبين الشكل 6 مقارنة بين أداء بروتوكول TS5 وبروتوكول TS القياسي للكشف عن النبات(A. thaliana and B. napus)miRNAs، وهي معدلة 2'-OMe، وmiRNAs البشرية غير المعدلة. اختبرنا أيضا الكشف عن piRNAs، 2'-OMe تعديلها في عينات الإنسان. كما يمكن أن نرى، TS5 يؤدي أفضل بكثير من TS للكشف عن RNAs 2'-OMe ولكن ليس لRNAs غير معدلة. ومع ذلك، أيضا بالنسبة لsRNAs غير المعدلة، على الرغم من عدم الكشف عن عدد أكبر من RNAs، أرقام القراءة التي تم الحصول عليها ربما تعكس مستويات التعبير الحقيقي مع TS5 أفضل من مع TS بسبب انخفاض مستويات التحيز.

Figure 1
الشكل 1 . تمثيل تخطيطي لسير عمل إعداد مكتبة sRNA لتسلسل Illumina. أولا، يتم عزل sRNAs من قبل خطوة تنقية هلام. هنا، يتم الإشارة إلى نطاق حجم miRNAs ولكن يمكن اختيار أي نطاق حجم آخر، اعتماداً على RNAs ذات الفائدة. ثم يتم تنفيذ خطوة مراقبة الجودة (QC) للتحقق من نوعية وكمية sRNA معزولة. أثناء إعداد المكتبة، يتم ربط محول preadenylated (التطبيق) 3 ' لأول مرة إلى sRNA. ثم، محول 5 'هو ربط. يتم إجراء النسخ العكسي في وقت لاحق باستخدام التمهيدي المكمل للمحول 3 '، تليها تضخيم PCR، خلالها يتم إضافة تسلسل Illumina P5، P7، والفهرس ('In'). المكتبة الناتجة هي هلام تنقية، تليها خطوة مراقبة الجودة. ثم يتم تسلسل المكتبة، ويتم تحليل البيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 . التحيز بسبب تسلسل تعتمد على محول-sRNA للطي المشترك. في خليط ربط المحول، سيتم دمج المحولات مع sRNAs بطريقة تعتمد على تسلسل المحول وsRNA. وهكذا، فإن sRNAs مختلفة (موضحة في الأمثلة أ، ب، ج؛ المشار إليها بظلال مختلفة من الأخضر) سوف تتضاعف بشكل مختلف مع محول معين (يتم الإشارة إلى محول 3' باللون الأحمر، يشار إلى محول 5 ' باللون الأزرق). تشير الأسهم السوداء إلى تقاطعات الربط. وهذا قد يؤدي إلى سياق مواتية أو غير مواتية للربط. كما RNL2 يبدو أن تفضل بيئة تقطعت بهم السبل مزدوجة، ومن المتوقع أن يكون الربط 3 'أكثر كفاءة لRNAs أ و ب من لRNA ج. مع RNL1 وجود تفضيل لمنطقة واحدة تقطعت بهم السبل حول تقاطع الربط، 5 'محول الربط قد تكون أكثر كفاءة لRNA أ، تليها ب وأقل كفاءة لج. معا هذا قد يؤدي إلى التمثيل المفرط للرنا أ، وسيطة تمثيل من [رنا] [ب] وتمثيل ناقصة من [رنا] [ك] في المكتبة نهائيّة, [إفن يف] الثلاثة [رنك] حاضرة في يتماثل مبلغات في الأصليّة [رنا] عينة. لاحظ أنه بطريقة مشابهة، سيتم تمثيل sRNA معينة بشكل مختلف عند تغيير تسلسل المحول (على سبيل المثال، عن طريق إضافة الباركود مختلفة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 . عزل الحمض النووي الريبي الصغيرة ومراقبة الجودة. (A). فصل الكهربائي من براسيكا نابوس مجموع RNA (10 ميكروغرام) على 15٪ TBE اليوريا denaturing جل بولياكريلاميد. تم ترحيل سلم RNA صغير (انظر جدول المواد) على طول كعلامة حجم جزيئي. بعد هجرة كان الهلام يلوّن وكان ال [رنا] يكون صوّرت على مضيء [ترنس]. تم قطع المنطقة من 17 إلى 29 النيوكليوتيدات (المشار إليها من قبل مستطيل أحمر) والحمض النووي الريبي كان eluted. (ب). تم فحص نوعية الحمض النووي الريبي النقي من قبل الكهربائي هلام الشعرية. لاحظ أن هذا التحليل يوفر معلومات عن نسبة ميرنا في العينة (93٪ في هذه الحالة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 . تنقية هلام من مكتبة B. نابوس RNA الصغيرة أعدت بعد بروتوكول TS5 ومراقبة الجودة. (A). تم تحميل كميات متزايدة من مكتبة PCR تضخيم من B. نابوس RNA الصغيرة على هلام TBE الأصلي 6٪؛ 2.5 ميكرولتر (أ) أو 5 ميكروت (ب) أو 10 ميكروت (ج) أو 20 ميكرولتر (د) منتج PCR. تم ترحيل سلم 50 نقطة أساس جنبا إلى جنب. تم عزل منتجات PCR المهاجرة في موقف 150 pb المتوقع (مستطيل أحمر)، تم تحديد الحمض النووي وتنقيته. (ب) مراقبة جودة المكتبة النقية؛ هلام التمثيل. (ج). تمثيل التيكونوبي للتحليل نفسه. وكما يتضح من ذلك، فإن منتج 150 pb ملوث بشكل متزايد بوحدات المحولات (~130 bp) حيث يتم ترحيل كميات أكبر من منتج PCR على الجل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 . وبالمثل، يؤدي بروتوكول TS5 مع الكواشف من مجموعات TS وNf أو مع الكواشف من موردين آخرين. الرسوم البيانية التي تمثل النسبة المئوية للأعداد الإجمالية للقراءات الخام (قبل التشذيب) المقابلة لRNA(OMe)1-6 مع بروتوكول TS5 تليها الكواشف من TS ومجموعات Nf (القضبان الزرقاء)، أو الكواشف من الموردين الآخرين (قضبان البرتقال). للمقارنة، تظهر نتائج دراستنا السابقة من قبل الحانات الرمادية. يتم عرض الأرقام الإجمالية للقراءات المقابلة لRNA1-6(إجمالي RNA)أو RNA-OMe1-6(إجمالي RNA-OMe)كذلك. تظهر القيم المتوسطة لتجربتين مستقلتين على الأقل. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. تم تعديل جزء من هذا الرقم من Dard-Dascot وآخرون, 201812الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 . مقارنة من [ميرنا] كشف من بروتوكول [تس5] مع الكلاسيكيّة [تس] طريقة. (أ) تم تحديد نسبة القراءات التي تحدد رسم الخرائط إلى A. thaliana أو B. napus أو H. sapiens miRNAs في miRBase. كما قمنا بتعيين قراءات المكتبات البشرية لpiRBase للكشف عن البيرنا. لاحظ أن A.thaliana و B.napus miRNAs، فضلا عن piRNAs البشرية هي 2'-OMe المعدلة، على النقيض من miRNAs الإنسان. تظهر القيم المتوسطة لتجربتين مستقلتين على الأقل وتمثل أشرطة الخطأ انحرافات قياسية. (باء) عدد الميرنات (أو البيرانا) التي تم تحديدها. حددنا أعداد miRNAs المعروفة من الأنواع المختلفة المحددة مع بروتوكولات TS أو TS5. لاحظ أنه بالنسبة لـ A. thaliana أو B. napus أو H. sapiens،تم تسجيل 427 و92 و2588 miRNAs في miRBase، على التوالي. تم تعيين 0.5 مليون قراءة من مكتبات TS أو TS5 إلى B. napus miRNAs في miRbase، تم تعيين مليون قراءة إلى A. thaliana أو قواعد البيانات البشرية. تظهر القيم المتوسطة لتجربتين مستقلتين على الأقل مع الانحرافات المعيارية التي تمثلها أشرطة الخطأ. تم تعديل هذا الرقم من Dard-Dascot وآخرون، 201812. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم أوليغونوكليوتيد 5'تعديل 3' تعديل تسلسل 5 'إلى 3' تنقيه
5 'HD (TS5) محول 5AmMC6 [5AmMC6] GTTCAGAGTTACAGTCCGACGTATCNrNrN (لاحظ أن هذا القلة هي الحمض النووي-RNA chimeric؛ وثلاثة 3 'NTS الطرفية هي RNA) HPLC
3 'HD (TS5) محول الفوسفات 3AmMO [Phos]rNrNrNrNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG[3AaMO] (لاحظ أن هذا القلة هو الحمض النووي-RNA chimeric؛ وأربعة 5 'NTS الطرفية هي RNA) HPLC
محول MRL (TS7) ٥ '، 5AmMC6 [5AmMC6] GTTCAGAGTTACAGTCCGACGTATCNNNNrArArArArUrUrArC (لاحظ أن هذا القلة هي الشميرية الحمض النووي الريبي؛ و7 '3' محطة NTS هي RNA) HPLC
3 ' MRL (TS7) محول محمد محمد 3AmMO لا ، لا ، لا ، لا ، لا ، لا ، لا ، GTATCGTNNNNNNTGGAATTCTCGG[3AmMO] HPLC
RT التمهيدي مجلس التعاون الخليجي HPLC
العالمي P5 التمهيدي AATGATACCGACCACCGAGATACACGTTGTGTATACATACAGTCCGA HPLC
P7-مؤشر التمهيدي CAAGCAGAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGAGTTCCTTCCACCCGAGAATTCCA (NNNNNN = index) HPLC
المؤشر 1: CGTGAT
المؤشر 2: ACATCG
مؤشر 3: GCCTAA
المؤشر 4: TGGTCA
المؤشر 5: CACTGT
المؤشر 6: ATTGGC
المؤشر 7: GATCTG
المؤشر 8: TCAAGT
المؤشر 9: CTGATC
مؤشر 10: AAGCTA
مؤشر 11: GTAGCC
المؤشر 12: TACAAG

الجدول 1 Oligonucleotides المستخدمة مع هذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إعداد مكتبة RNA الصغيرة لا يزال تحديا بسبب التحيز، التي أدخلت أساسا خلال خطوات ربط محول. RNAs مع تعديل 2'-OMe في نهايتها 3 'مثل miRNAs النبات، piRNA في الحشرات، الديدان الخيطية والثدييات، وRNAs التدخل الصغيرة (siRNA) في الحشرات والنباتات من الصعب بشكل خاص لدراسة لأن تعديل 2'-OMe يمنع ربط محول 3'. وقد اقتُرح عدد من الحلول في المؤلفات لتحسين بروتوكولات إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي، ولكن معظم المجموعات المتاحة تجارياً لا تزال تستند إلى بروتوكول TS التقليدي، الذي تنطوي على تحيز شديد. وهناك عدد قليل من مجموعات 'التحيز منخفضة' موجودة، ومع ذلك، بما في ذلك عدة Nf مع محولات معشاة وPEG في ردود الفعل الربط، وظهرت مؤخرا مجموعات قليلة أن تجنب ربط محول تماما12. أبلغنا سابقا أن Nf يكشف عن miRNAs أكثر مختلفة من بروتوكول TS القياسية، ولكن بروتوكول 'S' (دون ربط محول) أداء ضعيف نسبيا بسبب تشكيل كبير من المنتجات الجانبية12. ومن المثير للدهشة، عند التعديل، كان لبروتوكولات TS اكتشاف أكثر حساسية من sRNAs 2'-OMe من البروتوكولات الأخرى، ولكن ليس من sRNAs العادية. اخترنا هنا لوصف بالتفصيل بروتوكول TS5، الذي يتم عشوائية المحولات في أطرافها، ويستخدم PEG في ردود الفعل الربط ويتم القضاء على محول الزائدة 3 'عن طريق تنقية على الخرز. تجدر الإشارة هنا إلى أن بروتوكول مختلف (TS7) ، باستخدام محولات MRL قد يؤدي أفضل قليلاً من بروتوكول TS5. ومع ذلك، كما أن هناك اختلافات طفيفة فقط بين الاثنين ولأنه مع TS7، فمن الأصعب لفصل المنتج المكتبة المطلوب من ديمرز محول، فضلنا هنا لوصف بالتفصيل بروتوكول TS5. ومع ذلك، يمكن للمستخدمين، إذا رغبت في ذلك، استبدال محولات TS5 بمحولات TS7. لاحظ أن هذه أطول قليلاً مما يؤدي إلى منتج مكتبة النهائي من ~ 170 نقطة أساس بدلاً من ~ 150 نقطة أساس.

إمكانية تنفيذ بروتوكول TS5 أو TS7 مع المواد "المصنوعة في المنزل" يسمح لخفض التكلفة إلى حد كبير. ومع ذلك، قد يكون هناك تباين أكبر من حيث الجودة مع المواد المصنوعة منزليا؛ خاصة المنزل-- صنع قبل adenylated 3' محول قد تخضع لنوعية متغيرة بسبب فعالية متفاوتة من pre-adenylation. ولذلك يوصى بإعداد مخزون كبير، وإذا تم إعداد مخزون جديد، قارن أدائه بالمخزون السابق. يمكن استخدام عينة RNA عنصر التحكم لهذا الغرض.

ومن عيوب البروتوكولات الواردة هنا تشكيل منتجات جانبية قوي نسبيا وصعوبة فصل المكتبة المطلوبة عن هذه المنتجات. يجب الحرص على عدم إثقال هلام أكريلاميد لتنقية. في الآونة الأخيرة، تم تطوير محولات المعدلة التي لديها ميل منخفض بشدة لتشكيل dimers21. تعديل 2'-OMe في نهاية 3 'من محول 5 ' جنبا إلى جنب مع تعديل ميثيل فوسفونات في الطرف 5 'من محول 3 ' قمعت بكفاءة ديمترات محول. سيكون من المثير للاهتمام لاختبار مثل هذه المحولات المعدلة في البروتوكول الموضح هنا.

خطوات تنقية هلام في بروتوكول TS5 هي كثيفة العمالة نسبيا. إذا كان استخدام محولات معدلة يقلل بكفاءة من تشكيل وحدات الديمتر، قد لا يكون من الضروري تنقية هلام المكتبة النهائية بعد الآن. وبالإضافة إلى ذلك، كبديل لخطوة تنقية هلام لعزل RNA الصغيرة (الخطوة 1)، توجد استراتيجية باستخدام الخرز المغناطيسي لإثراء لRNAs الصغيرة (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). ونحن لم نستخدم هذه الطريقة بأنفسنا، ولكنها تستحق الاختبار، وإذا كانت تعمل بشكل جيد فإنه يمكن تبسيط البروتوكول إلى حد كبير.

وفي الختام، في حين يمكن زيادة تحسين البروتوكول TS5، فإنه يؤدي أفضل من مجموعات المواد المتاحة تجاريا، على الأقل تلك التي تم اختبارها في تحليلنا المقارن السابق، للكشف عن 2'OMe sRNA. ويمكن اتباعذلك باستخدام مواد مصنوعة منزليا، مما يسمح بتخفيض كبير في التكاليف. للراحة، وربما أكثر أداء ثابت، يمكن استخدام الكواشف من مجموعات TS وNf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل المركز الوطني للبحوث العلمية، واللجنة الفرنسية للطاقات البديلة والطاقة الذرية، وجامعة باريس - سود. وقد أجريت جميع عمليات إعداد المكتبة وتسلسل إلومينا وتحليلات المعلوماتية الحيوية لهذه الدراسة في مرفق التسلسل من الجيل التالي من الـ I2BC. ويُعترف بأعضاء مرفق I2BC NGS للقراءة النقدية للمخطوطة والاقتراحات المفيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument  Agilent G2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) ThermoFisher AM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) Nex England Biolabs P0756S
Agencourt AMPure XP beads Beckman Coulter A63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Bioanalyzer Small RNA Kit Agilent 5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters Sigma Aldrich CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminator various suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPs Kapa Biosystems KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit BIOO Scientific NOVA-5132-05 optional
Novex TBE gels 6% ThermoFisher EC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15% ThermoFisher EC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen  28304
Qubit 4 Quantitation Starter Kit ThermoFisher Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit ThermoFisher Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X) ThermoFisher R0641
RNA Gel Loading Dye (2X) ThermoFisher R0641
RNase Inhibitor, Murine  Nex England Biolabs M0314S
SuperScript IV Reverse Transcriptase ThermoFisher 18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain ThermoFisher S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) Nex England Biolabs M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated Nex England Biolabs M0242S
TrackIt 50 bp DNA ladder ThermoFisher 10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012/24/36/48 optional
UltraPure Glycogen ThermoFisher 10814010
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher EI0001
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher EI0001
ZR small RNA ladder Zymo Research R1090
the last two numbers correspond to the set of indexes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
  2. Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
  3. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
  4. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
  5. Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
  6. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
  7. Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
  8. Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
  9. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
  10. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
  11. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
  12. Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
  13. Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
  14. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
  15. Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
  16. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
  17. Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
  18. Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
  21. Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).

Tags

علم الوراثة العدد 151 RNA الصغيرة RNA-seq الصغيرة التحيز إعداد المكتبة تسلسل الجيل القادم NGS 2'-O-ميثيل (2'-OMe) RNA الرنا النباتية مصنع ميرنا
تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من RNAs 2'-O-Methyl
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van Dijk, E. L., Eleftheriou, E.,… More

van Dijk, E. L., Eleftheriou, E., Thermes, C. Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs. J. Vis. Exp. (151), e60056, doi:10.3791/60056 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter