Summary
Мы представляем подробный небольшой протокол репарации библиотеки РНК с меньшим уклоном, чем стандартные методы и повышенной чувствительностью для 2'-O-метил РНК. Этот протокол можно соблюдать с помощью самодельных реагентов, чтобы сэкономить стоимость или с помощью комплектов для удобства.
Abstract
Изучение малых РНК (РНК) по секвенированию следующего поколения (NGS) оспаривается проблемами предвзятости при подготовке библиотеки. Несколько типов сРНК, таких как микроРНК растений (миРНК) имеют модификацию 2'O-метил (2'-OMe) на их 3' терминал нуклеотида. Эта модификация добавляет еще одну трудность, поскольку она подавляет 3' перевязки адаптера. Ранее мы продемонстрировали, что модифицированные версии протокола 'TruSeq (TS)' имеют меньшую предвзятость и улучшенное обнаружение 2'-OMe РНК. Здесь мы подробно описываем протокол 'TS5', который показал лучшую общую производительность. За TS5 можно следить либо с помощью самодельных реагентов, либо реагентов из комплекта TS, с одинаковой производительностью.
Introduction
Малые РНК (РНК) участвуют в контроле разнообразия биологических процессов1. Eukaryotic нормативных sRNAs, как правило, между 20 и 30 nt в размере; три основных типа: микроРНК (miRNA), piwi-взаимодействующих РНК (piRNA) и малых интерферирующих РНК (siRNA). Аномальные уровни экспрессии miRNA были вовлечены в различные заболевания2. Это подчеркивает важность миРНК в области здравоохранения и болезней и потребность в точных количественных исследовательских инструментах для выявления СРНК в целом.
Секвенирование следующего поколения (NGS) является широко используемым методом изучения сРНК. Основные преимущества NGS по сравнению с другими подходами, такими как количественные методы ПЦР или microarray (qPCR), заключаются в том, что он не нуждается в априори знания последовательностей сРНК и поэтому может быть использован для обнаружения новых РНК, и, кроме того, он страдает меньше фоновый сигнал и эффекты насыщения. Кроме того, он может обнаружить одно нуклеотидные различия и имеет более высокую пропускную мощность, чем microarrays. Тем не менее, NGS также имеет некоторые недостатки; стоимость последовательного запуска остается относительно высокой, и многоступенчатый процесс, необходимый для преобразования образца в библиотеку для секвенирования, может привести к смещениям. В типичном процессе подготовки библиотеки sRNA, 3' адаптер сначала ligated к sRNA (часто гель-очищенной от полной РНК) используя усеченную версию RNA ligase 2 (RNL2) и preadenylated 3' адаптер(Рисунок 1) в отсутствии ATP. Это повышает эффективность перевязки sRNA-адаптера и уменьшает образование побочных реакций, таких как циркуляризация sRNA или конкатегоризация. Впоследствии 5' адаптер сливается с помощью РНК лигаза 1 (RNL1), а затем обратная транскрипция (RT) и pcR усиление. Все эти шаги могут ввести предвзятость3,4. Следовательно, считываемые числа могут не отражать фактические уровни экспрессии sRNA, ведущие к искусственным, зависимым от метода шаблонам выражения. Конкретные СРНК могут быть либо чрезмерно или недопредставлены в библиотеке, а сильно недопредставленные СРНк могут избежать обнаружения. Особенно сложная ситуация с растительными миРНКами, сиРНК у насекомых и растений, а также пиРНК у насекомых, нематод и млекопитающих, в которых 3' терминальный нуклеотид имеет 2'O-метил (2'-OMe) модификацию1. Эта модификация сильно подавляет перевязку 3' адаптера5,что делает подготовку библиотеки для этих типов РНК трудной задачей.
Предыдущая работа показала, что перевязка адаптера вводит серьезные предубеждения, из-за РНК последовательности / структурных эффектов6,7,8,9,10,11. Шаги вниз по течению перевязки адаптера, такие как обратная транскрипция и ПЦР, существенно не способствуют смещению6,11,12. Смещение лигации, вероятно, связано с тем, что молекулы адаптера с заданной последовательностью будут взаимодействовать с молекулами SRNA в реакционной смеси для формирования сгибов, что может либо привести к благоприятным или неблагоприятным конфигурациям для перевязки(рисунок 2). Данные Sorefan et al7 свидетельствуют о том, что RNL1 предпочитает один контекст, в то время как RNL2 предпочитает двойную нить для перевязки. Тот факт, что структуры совместного сгиба адаптера/sRNA определяются конкретным истектором адаптера и последовательностями sRNA, объясняет, почему конкретные sRNA чрезмерно или недопредставлены с данным набором адаптера. Важно также отметить, что в рамках серии библиотек sRNA для сопоставления следует использовать одни и те же последовательности адаптера. Действительно, ранее было отмечено, что изменение адаптеров путем введения различных последовательностей штрих-кодов изменяет профили miRNA в секвенирующих библиотеках9,13.
Рандомизация последовательностей адаптера вблизи перевязочных узлов, вероятно, уменьшает эти предубеждения. Sorefan и коллеги7 использовали адаптеры с 4 случайных нуклеотидов на их конечностях, назначенных "Высокой четкости" (HD) адаптеры, и показал, что использование этих адаптеров привести к библиотекам, которые лучше отражают истинные уровни экспрессии SRNA. Более поздние работы подтвердили эти наблюдения и показали, что рандомизированный регион не должен быть рядом с перевязочную перевязку11. Этот новый тип адаптеров был назван "MidRand" адаптеры. В совокупности эти результаты показывают, что улучшение конструкции адаптера может уменьшить предвзятость.
Вместо того, чтобы изменять адаптеры, смещение может быть подавлено путем оптимизации условий реакции. Полиэтиленгликоль (PEG), макромолекулярный скученность агент, как известно, увеличение эффективности перевязки14, было показано, значительно уменьшить предвзятость15,16. На основе этих результатов на рынке появилось несколько комплектов "низкой предвзятости". К ним относятся комплекты, которые используют PEG в реакции перевязки, либо в сочетании с классическими адаптерами или HD адаптеры. Другие комплекты избежать перевязки в целом, и использовать 3' полиаденилаации и шаблона переключения для 3' и 5' адаптер дополнение, соответственно12. В еще одной стратегии, 3' перевязка адаптера сопровождается круговой шаг, таким образом, опуская 5' адаптер перевязки17.
В предыдущем исследовании мы искали протокол подготовки библиотеки sRNA с наименьшими уровнями смещения и лучшим обнаружением 2'-OMe РНК12. Мы протестировали некоторые из вышеупомянутых комплектов «низкого смещения», которые имели лучшее обнаружение 2'-OMe РНК, чем стандартный протокол (TS). Удивительно, однако, при модификации (использование рандомизированных адаптеров, PEG в реакции перевязки и удаление избытка 3' адаптера путем очистки) последний превзошел другие протоколы для обнаружения 2'-OMe РНК. Здесь мы подробно описываем протокол, основанный на протоколе TS, 'TS5', который имел лучшее общее обнаружение 2'-OMe РНК. Протокол можно соблюдать с помощью реагентов из комплекта ТС и одного реагента из комплекта «Nf» или, чтобы сэкономить деньги, с помощью самодельных реагентов, с одинаковой производительностью. Мы также предоставляем подробный протокол для очистки сРНК от общей РНК и подготовки предаденина 3' адаптера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изоляция малых РНК
- Извлекайте полную РНК с помощью реагентов на основе фенола или любого другого метода. Проверьте, является ли РНК хорошего качества.
- Предварительно запустить 15% TBE-мочевого геля (см. Таблица материалов) в течение 15 мин при 200 В.
- В то время как гель предварительно работает, смешать 5-20 мкг общего РНК в 5-15 л объема с равным объемом formamide загрузки красителя (см. Таблица Материалов; 95% деионизированной формамид, 0,025% бромофенол синий, 0,025% ксилена цианола, 5 мМ PCTA pH 8) в 200 л. Аналогичным образом, смешайте 10 кЛ (200 нг) мелкой РНК-лестницы (см. Таблица материалов)с равным объемом погрузочного красителя formamide. Инкубировать в течение 5 мин при 65 градусах По Цельсия в термоцикле с нагретой крышкой, затем поместите трубки сразу на лед.
- Загрузите лестницу и образец на тот же гель с по крайней мере одной полосой между ними и запустить на 200 V до бромофенола синий (темно-синий) мигрировали около двух третей длины геля (примерно 40 мин).
- Подготовьте систему, чтобы вычеркнить РНК из геля следующим образом: прокол нижней части нуклеазы свободной 0,5 мл микро центрифуги трубки с 21-калиберной иглой. Поместите прокол0,5 мл трубки в нуклеазе-бесплатно едкой 2 мл микроцентрифуги трубки.
- Удалить гель, и инкубировать при комнатной температуре с 3 юклеиновой кислоты гель пятно (10000 х концентрат; см. Таблица материалов) в 30 мл воды в течение 10-15 мин.
- Посмотреть гель на транс-иллюминатор "Темный читатель" (настоятельно рекомендуется, чтобы избежать УФ, как это может повредить РНК) и вырезать образец РНК между 17 nt и 29 nt лестницы полос. Перенесите кусок геля в трубку 0,5 мл со ступени 1,5.
- Centrifuge 0,5 мл трубки в 2 мл трубки в микро центрифуги на максимальной скорости в течение 2 мин. Удалите 0,5 мл трубки, которая должна быть пустой сейчас.
- Добавьте 300 qL без нуклеаза 0,3 М NaCl в трубку 2 мл, содержащую измельченный гель, и поверните по крайней мере 2 ч при комнатной температуре или при температуре 4 градусов по Цельсию (16 ч).
- Перенесите подвеску измельченных кусочков геля в колонку спина (см. Таблица Материалов)и центрифугу на 2 мин на максимальной скорости в микроцентрифуге.
- Добавьте 1 кЛ (20 мкг/Л) гликогена (см. Таблицу Материалов)и 950 л комнатной температуры 100% этанола. Инкубировать не менее 30 мин при -80 градусах По Цельсию.
- Центрифуга в течение 20 минут на максимальной скорости в микроцентрифуге при 4 градусах Цельсия. Удалить супернатант, вымыть гранулы с 800 л холодного 80% этанола. Центробежа снова в течение 5 мин при 4 градусах по Цельсию, и осторожно удалите все супернатанты. Повторное увеличение РНК-гранул в 15 л безнужной воды. Как правило, следует восстановить 5-20 нг мелкой РНК, в зависимости от количества входного общего ОБЪЕМА РНК (1 нг небольшой РНК на 1 мкг входного общего объема РНК).
- Рекомендуемый дополнительный шаг: Проверьте количество и качество восстановленной сРНК (например, с помощью капиллярного геля электрофорасиса с помощью небольшого комплекта РНК; см. Таблица материалов).
2. Подготовка предаденилатированный 3' HD адаптер
ПРИМЕЧАНИЕ: Преаденэлация 3' HD адаптер был сделан таким образом, похожим на протокол, описанный Чэнь идр. Обратите внимание, что предаденилатированный адаптер можно заказать напрямую (/5rApp/модификация), но это довольно дорого.
- Заказать 5' фосфорилированный, 3' заблокирован 3' HD адаптер олигонуклеотид. Смотрите таблицу 1 для последовательности и модификаций. Обратите внимание, что '3AmMO' является 3' аминомодификатор группы, большинство поставщиков могут производить олигонуклеотид с этой модификацией. Разбавить в нуклеазе свободной воды до 100 км.
- Настройка реакции 100 л, содержащая следующие реагенты: 10 л олиго (100 мкм), 10 л буфера Лиги Т4 РНК (10x), 10 л АТФ (10 мМ), 40 л 50% PEG8000, 5 л T4 RNA ligase 1 (50 единиц), 25 L Инкубировать ночь при 20 градусах Цельсия.
- Выполните классическую добычу фенола-хлороформа из предаденилатного олигонуклеотида с последующим итанолом осадков. Добавьте 100 кЛ кислоты (pH 4.5) фенола: хлороформ и вихрь. Спин в течение 5 минут при комнатной температуре, максимальной скорости. Тщательно перенесите 90 л верхней фазы на новую трубку; добавьте 10 кл/л 3 М ацетата натрия pH 5.2, 1 л ультра-чистого гликогена и 250 л холодного 100% этанола.
- Держите сью 20 градусов по Цельсию в течение не менее 30 мин. Центрифуге в течение 30 мин при максимальной скорости 4 градуса По Цельсию. Удалить супернатант, вымыть гранулы один раз с 500 Л холодного 80% этанола. В качестве альтернативы экстракции фенола хлороформа и осадка в этанол можно использовать комплект удаления нуклеотидов (см. Таблицу Материалов). Повторное вводе воды в 25 л.
- Измерьте концентрацию адаптера с помощью комплекта для конкретного обнаружения одноцепочечной ДНК (см. Таблицу Материалов). Разбавить до 80 нг/л (10 мкм).
- Рекомендуемый дополнительный шаг: Проверьте эффективность преадениэлирования путем миграции 1 зл 1 л из 10 мкм адаптер на 15% TBE-мочевой гель (Таблица материалов) вместе с необработанным олигонуклеотидом. Предаденированный адаптер должен мигрировать немного медленнее, чем необработанный олигонуклеотид. При желании предаденированный адаптер может быть очищен от геля; продолжение, как описано выше (шаги 1.2-1.12).
3. Подготовка библиотеки - Протокол TS5
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы представляем здесь модифицированный протокол TS 'TS5', который мы описали ранее12 и который может быть выполнен либо с реагентами из комплекта, либо с самообеспеченными реагентами. Следует отметить, что мы получили аналогичные или даже чуть лучшие результаты с другим протоколом, 'TS7'. Однако с TS7 труднее устранить димеры адаптера. Поэтому мы предпочли подробно описать TS5, но за TS7 может последовать просто замена адаптеров. Для TS7 используйте адаптерные последовательности 'MidRand-Like (MRL)'(таблица 1). Обратите внимание, что здесь рандомизированные области находятся в середине адаптеров. Праймеры для обратной транскрипции и ПЦР будут гибридизироваться с последовательностями вниз по течению рандомизированной области в 3' адаптер и вверх по течению рандомизированной области в 5' адаптер. Секвенирование начнется с первого рандомизированного нуклеотида в 5' адаптере.
- 3' перевязка адаптера.
- Объедините 1 зл предаденированного 3' HD адаптера (10 мкм) с 1 злочищеной небольшой РНК (0,1-1 мкм) в микроцентрифуговой трубке 0,2 мл. Инкубировать в течение 2 мин при 72 градусах По Цельсию в термоциклисте, затем положить прямо на лед.
- Добавьте 4 злиц 50% PEG 8000 (вязкий раствор; труба медленно), 1 Зл буфера лигазы РНК (10x), 1 Зл H2O, 1 Зл T4 РНК ligase2 усеченный, и 1 Зл ингибитора RNase. Инкубировать на ночь при 16 градусах Цельсия.
- Ликвидация разгертетов 3' адаптера
- Добавьте 10 кл.л. безнуса воды и хорошо перемешайте. Добавьте 6 злотизму 3 M NaOAc pH 5.2 или «Решение по истощению адаптера» из комплекта Nf(Таблица материалов)и хорошо перемешайте. Добавьте 40 зЛ магнитных очистных шариков(Таблица Материалов)и 60 л изопропанола и хорошо перемешайте. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Поместите образец в магнитную стойку, пока решение не появится ясным. Удалите и отбросьте супернатант.
- Добавьте 180 л свежеприготовленного 80% этанола. Инкубировать за 30 с, затем удалить. Позаботьтесь, чтобы использовать свежеприготовленные 80% этанола и не инкубировать с 80% этанола в течение длительных периодов.
- Кратко спина трубки и удалить остаточной жидкости, которые, возможно, собрали в нижней части колодца. Пусть бусы высохнут в течение 2 мин, затем повторно в 22 л 10 мМ Tris pH 8 или resuspension буфера из комплекта Nf. Инкубировать в течение 2 мин, затем намагничить образец, пока раствор не появится ясным.
- Добавьте 6 кЛ 3 M NaOAc pH 5.2 или 'Решение по истощению адаптера' из комплекта Nf(Таблица материалов)в новую трубку. Передача 20 зл и супернатант с предыдущего шага на эту новую трубку и перемешать путем пипетки. Добавьте 40 л магнитных бусин и 60 л 100% изопропанола и хорошо перемешайте путем пипетки. Инкубировать в течение 5 мин.
- Магнитизировать образец, пока решение появляется ясно, а затем удалить и отбросить супернатант.
- Добавьте 180 л свежеприготовленного 80% этанола. Инкубировать за 30 с, затем удалить. Take уход использовать свежеприготовленный 80% этанола и не инкубировать для 80% этанола в течение длительных периодов.
- Кратко спина трубки и удалить остаточной жидкости, которые, возможно, собрали в нижней части колодца. Пусть бусы высохнут в течение 2 мин, и повторно в 10 зл и без nuclease воды. Инкубировать в течение 2 мин, затем намагничить образец, пока раствор не появится ясным.
- Передача 9 Зл супернатанта в новую трубку. Добавьте 1 qL буфера лигазы T4 РНК (10x) и 1 зл воды. Кроме того, добавьте 2 юл буфера лигазэ из комплекта ТС.
- Лигация 5' адаптера.
- Добавить 1 юл 5' HD адаптер (10 мкм; Таблица 1) до 200 Л ПЦР трубки в термоциклер с нагретой крышкой. Инкубировать в течение 2 мин при 70 градусах Цельсия, затем положить трубку прямо на лед.
- Добавьте 1 зл 10 мМ АТФ и 1 Зл Т4 РНК лигаза 1. Хорошо перемешать, аккуратно пипетка. Добавьте 3 зЛ этой смеси в 3' ligated РНК от шага 3.2.9 и перемешайте путем пипетки. Инкубировать в течение 1 ч при 28 градусах Цельсия.
- Обратная транскрипция (RT)
- Передача 6 злификатора 3' и 5' адаптера ligated РНК в новую трубку ПЦР 200 л (держать оставшиеся 8 евро при -80 градусов по Цельсию для последующего использования в случае необходимости). Добавить 1 злиц rt грунтовки (10 мкм; Таблица 1) и смешивать путем пипетки. Инкубировать в течение 2 мин при 70 градусах Цельсия, затем положить трубку прямо на лед.
- Добавьте следующие реагенты для RT: 2 злитромы 5x первого буфера пряди, 0,5 л 12,5 мМ dNTP смеси, 1 л 100 мМ DTT, 1 л ингибитора RNase, и 1 л обратной транскриптазы (Таблица материалов). Инкубировать в течение 1 ч при 50 градусах Цельсия.
- Усиление ПЦР
- Добавьте следующие реагенты в 12,5 л реакционной смеси РТ: 10 л буфера полимеразы ПЦР, 2 злиц универсальной грунтовки P5 (10 мкм; Таблица 1, 2 л p7-индекса грунтовки (10 мкм; Таблица 1), 1 л 12,5 мМ dNTPs, 0,5 л полимеразы ДНК(Таблица материалов), и 22 л воды. Держите реакцию на льду до использования.
- Запустите следующую программу ПЦР: 98 градусов по Цельсию на 30 с, 11 циклов (98 градусов по Цельсию на 10 с, 60 градусов по Цельсию для 30 с и 72 градусов по Цельсию для 15 с) и 72 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Держите реакцию при 4 градусах по Цельсию, когда закончите.
ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается количества циклов ПЦР: обычно мы выполняем 11 циклов, но это должно быть оптимизировано пользователем. Попробуйте выполнить наименьшее количество циклов ПЦР.
- Очистка геля
- Выполнить 5, 10 и 20 л ПЦР продукта на родном 6% TBE гель (см. Таблица материалов) вместе с подходящей лестницей (см. Таблица материалов). Выполнить гель около 1 ч на 145 V (до бромофенола синий достигает дна; этот краситель мигрирует в положении 65 bp).
- Удалить гель, и инкубировать с нуклеиновой кислотой гель пятно (см. Таблица материалов) в воде в течение 10-15 мин.
- Посмотреть гель на "Темный читатель" транс-иллюминатор (настоятельно рекомендуется, чтобы избежать УФ, как это может повредить РНК) и вырезать библиотеку полосы на 150 bp. Подготовьте систему, чтобы удлинить РНК из геля, как описано в шаге 1.5 и передать кусок геля на 0,5 мл трубки.
- Центрифуга в микроцентрифуге на максимальной скорости в течение 2 мин. Удалите трубку 0,5 мл, которая должна быть пуста сейчас.
- Добавьте 300 л воды без нуклеаза в трубку 2 мл, содержащую измельченный гель, и поверните по крайней мере 2 ч при комнатной температуре или при температуре 4 градусов Цельсия на ночь.
- Перенесите подвеску измельченных кусочков геля в воде в спин-колонку и центрифугу на 2 мин на максимальной скорости.
- Добавьте 1 зл (20 мкг/Л) гликогена, 30 л из 3 М НаОАК и 975 л ледяного холода 100% этанола. Центрифуга в течение 20 минут на максимальной скорости при 4 градусах Цельсия.
- Приостановите гранулы в 20 л 10 мМ Tris pH8. Используйте 1 зл для измерения концентрации и 1 Зл для контроля качества.
4. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура анализа данных, описанная ниже, основана на операционной системе Linux Ubuntu 16.04 LTS.
- Обработка необработанных файлов последовательности
- Загрузите файл последовательность FAST (ы), сгенерированный во время выполнения последовательности. При необходимости выполните демонксинг с bcl2fastq2 (версия V2.2.18.12; руководство можно загрузить по следующей ссылке: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
Используйте следующую команду:
nohup Pathway-of'bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway-of-Run--ignore-missing-bcl --выход-dir Pathway-of-Output-Directory --barcode-mismatches 1 --агрегированные плитки AUTO -r 16-d 16 -p 16 -w 16 - Удалите последовательности адаптера с помощью версии Cutadapt19 1.15. Руководство можно скачать здесь: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
Используйте следующую команду:
Путьк-ккатада/ cutadapt-TGGAATCTCGGGGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -м 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Выход-Файл-Читать1'cutadapt.fastq.gz Ввода-File
Обратите внимание, что последовательность в команде соответствует 3' HD адаптер без 4 случайных нуклеотидов; поэтому они не будут удалены во время этого шага. - Используйте seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) для удаления терминала случайных нуклеотидов в секвенировании. Используйте следующую команду (переменные имена жирным шрифтом):
seqtk trimfq -b 4 -e 4 Выходное-Филе-Read1'cutadapt .fastq Выходное-файле-Чтение1 Обрезается .fastq - Используйте следующую команду awk для того, чтобы отказаться от последовательностей короче 10 nt:
awk 'BEGIN ЗФС ) " OFS - "N" ( »Заголовок - $0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; если (длина (seq)
- Загрузите файл последовательность FAST (ы), сгенерированный во время выполнения последовательности. При необходимости выполните демонксинг с bcl2fastq2 (версия V2.2.18.12; руководство можно загрузить по следующей ссылке: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
- Картирование обрезанных последовательностей
- Скачать базу данных, соответствующую организму исследования из miRBase следующим образом. Перейти к http://www.mirbase.org/ftp.shtml и скачать файл 'mature.fa'. Обратите внимание, что последовательности указаны в RNA нотации. Замените остатки U на T следующей командой:
sed -i '/'gt;/! s/U/T/g' mature.fa
ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст полный список всех miRNAs в miRBase, происходящих из различных организмов. - Выберите последовательности miRNA вашего организма, представляющие интерес, со следующей командой:
awk 'имя »оф--организм»печать; nr»NR); следующий»; NR в nr' mature.fa (г-н)имя »из-организм»mirs.fa - Карта считывает выше созданного файла с помощью Bowtie220 (версия 2.3.0), что не позволяет не совпадений. Во-первых, создайте индекс для файла со следующей командой:
bowtie2-build зрелые' имя 'of'the-organism'mirs.fa зрелые'имя - Выровняйте секвенирование считывает к базе данных, требуя, чтобы читать карты полностью miRNA базы данных, без каких-либо несоответствий. Для этого используйте следующий инструмент:
bowtie2 -N 0 -L 10 --оценка-мин C,0,0 --конец-к-конец --время -xзрелый' имя »из-организма»миры -U Длина -Фильтр.fastq .fastq-S Длина -Фильтрованный.sam .sam
ПРИМЕЧАНИЕ: Вариант: --оценка-мин C,0,0 гарантирует, что выравнивание без каких-либо несоответствий. Для объяснения различных параметров в инструменте, пожалуйста, посетите следующий веб-сайт: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - Чтобы отбросить считыватель, которые не выровнялись, используйте следующую команду:
samtools зрения -F 4 Длина "Фильтр"СТОНКТ".Сантетит; Читает
ПРИМЕЧАНИЕ: В результате этих шагов, вы должны теперь получили выровненные чтения, соответствующие miRNAs.
- Скачать базу данных, соответствующую организму исследования из miRBase следующим образом. Перейти к http://www.mirbase.org/ftp.shtml и скачать файл 'mature.fa'. Обратите внимание, что последовательности указаны в RNA нотации. Замените остатки U на T следующей командой:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Критическими шагами являются изоляция небольшой рнковой доли исходного материала РНК(рисунок 3)и желаемого конечного продукта библиотеки(рисунок 4). Оба этапа включают очистку полиакриламидного геля; малая РНК выделена из 15% гелей мочевины TBE, в то время как окончательные библиотеки изолированы от 6% родных гелей TBE. Небольшая РНК, выделенная из геля, может быть проанализирована на небольшом чипе электрофореза РНК(Таблица материалов; Рисунок 3 B). Это позволит пользователям оценить количество небольших РНК восстановленных и доля miRNA в подготовке.
Гель очистки конечного продукта библиотеки является деликатным шагом, как ряд дополнительных продуктов формируются, которые мигрируют близко к желаемой библиотеке. Важно не перегружать гель, так как это увеличит риск заражения библиотеки другими видами, такими как димеры адаптера. В качестве примера(рисунок 4), увеличение количества ПЦР-усиленной библиотеки (от B. napus RNA) были загружены на гель и продукт, соответствующий ожидаемому размеру (150 bp) был вырезан(рисунок 4A). После угона очищенная библиотека была проверена на чипе электрофореза капиллярного геля; в дополнение к ожидаемому продукту 150 bp, увеличивающ пропорции видов 130 bp, соответствуя к димерым адаптера наблюдался по мере того как увеличивая количество продукта PCR было нагружено(рисунок 4B,C).
Мы проверили, если протокол TS5 выполняет аналогично с самодельными реагентами, как с реагентом из комплектов. С этой целью мы подготовили библиотеки из смеси синтетических малых РНК 1-6, каждый из которых присутствует без или с модификацией 2'OMe, как это было сделано в нашем предыдущем исследовании12. На рисунке 5 показана доля считывателей, соответствующих каждому из этих РНК, полученных ранее, и с новыми библиотеками, изготовленными с использованием реагентов из комплектов ТС и Nf или от других поставщиков. Как видно, были получены очень похожие результаты.
На рисунке 6 показано сравнение выполнения протокола TS5 со стандартным протоколом ТС для обнаружения растений(A. thaliana и B. napus)miRNA, которые являются 2'-OMe модифицированными, и неизмененными человеческими миРНК. Мы также протестировали обнаружение piRNAs, 2'-OMe модифицированных в человеческих образцов. Как видно, TS5 работает значительно лучше, чем ТС для обнаружения 2'-OMe РНК, но не для неизмененных РНК. Однако, также для неизмененных SRNAs, даже если не более большое количество RNA обнаружено, полученные номера чтения вероятно более лучше отражают истинные уровни выражения с TS5 чем с TS из-за более низких уровней смещения.
Рисунок 1 . Схематическое представление рабочего процесса подготовки библиотеки sRNA к секвенированию Illumina. Во-первых, РНК выделены шагом очистки геля. Здесь указан диапазон размеров miRNAs, но любой другой диапазон размеров может быть выбран, в зависимости от РНК интересов. Затем выполняется шаг контроля качества (КК) для проверки качества и количества изолированной sRNA. Во время подготовки библиотеки, preadenylated (App) 3' адаптер сначала ligated к sRNA. Затем 5' адаптер ligated. Затем обратная транскрипция выполняется с помощью грунтовки, дополняет 3' адаптер, а затем pcR усиление, во время которого Illumina P5, P7, и индекс ('In') последовательности добавляются. Полученная библиотека очищается от геля, за которым следует шаг контроля качества. Затем библиотека секвенируется, и данные анализируются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 . Смещение из-за последовательно-зависимого адаптера-sRNA совместного складывания. В смеси перевязки адаптера, адаптеры будут cofold с sRNAs таким образом, что зависит от последовательности адаптера и sRNA. Таким образом, различные sRNAs (иллюстрированные примерами a, b, и c; показанные по-разному оттенками зеленого цвета) будут по-разному сворачивать с данным адаптером (3' адаптер показан красным цветом, 5' адаптер показан синим цветом). Черные стрелки указывают на перевязочные соединения. Это может привести к благоприятному или неблагоприятному контексту для перевязки. Как RNL2, как представляется, предпочитают двойной мель окружающей среды, 3 'перевязка, как ожидается, будет более эффективным для РНК и b, чем для РНК c. С RNL1, имеющих предпочтение для одного мель области вокруг перевязки, 5' адаптер перевязки может быть наиболее эффективным для РНК, а затем b и наименее эффективным для c. Вместе это может привести к чрезмерной представленности sRNA a, промежуточный представление РНК b и недопредставленность РНК c в окончательной библиотеке, даже если три РНК присутствуют в равных количествах в исходном образце РНК. Обратите внимание, что аналогичным образом, данная sRNA будет представлена по-разному при изменении последовательности адаптера (например, путем добавления различных штрих-кодов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 . Изоляция малой РНК и контроль качества. (A). Электрофоретольное разделение Brassica napus общей РНК (10 мкг) на 15% TBE мочевины денатурирующий полиакриламид гель. Небольшая РНК-лестница (см. Таблица материалов) была перенесена вместе в качестве маркера молекулярного размера. После миграции гель был запятнан и РНК была визуализирована на транс-осветителе. Область от 17 до 29 нуклеотидов была вырезана (указана красным прямоугольником) и РНК была eluted. (B). Качество очищенной РНК проверяли с помощью капиллярного геля электрофорасиса. Обратите внимание, что этот анализ содержит информацию о доле miRNA в выборке (93% в данном случае). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 . Гель очистки B. napus небольшой РНК-библиотеки, подготовленной по протоколу TS5 и контроля качества. (A). Увеличение количества пЦР усиленной библиотеки от B. napus небольшой РНК были загружены на 6% родной гель TBE; 2,5 л (а), 5 л (б), 10 л (с) или 20 Л л (д) ПЦР продукт. Лестница 50 bp была migrated наряду. Продукты ПЦР, мигрирующие в ожидаемом положении 150 пб, были изолированы (красный прямоугольник), ДНК была выдавлена и очищена. (B). Контроль качества очищенной библиотеки; гелевое представление. (C). Электроферограмма представление того же анализа. Как видно, 150 pb продукт все больше и больше загрязненный с димерами адаптера (130 bp) по мере того как более большие количества продукта PCR мигрировали на геле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 . Протокол TS5 выполняет аналогично с реагентами из комплектов TS и Nf или с реагентами от других поставщиков. Гистограммы, представляющие процент от общего числа необработанных считываний (до обрезки), соответствующие РНК (OMe)1-6 с протоколом TS5, за которыми следуют реагенты из комплектов TS и Nf (синие полосы) или реагенты от других поставщиков (оранжевые бары). Для сравнения, результаты нашего предыдущего исследования показаны серыми полосами. Показано также общее количество считывателей, соответствующих RNA1-6(общая РНК)или RNA-OMe1-6(общее количество RNA-OMe). Показаны средние значения, по крайней мере, двух независимых экспериментов. Бары ошибок представляют собой стандартные отклонения. Часть этой цифры была изменена с Dard-Dascot и др., 201812Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 . Сравнение обнаружения miRNA протокола TS5 с классическим методом ТС. (A). Определена доля считывающих карт для A. thaliana, B. napus или H. sapiens miRNAs в miRBase. Мы также нанесли на карту считываний библиотек человека на piRBase для обнаружения piRNA. Обратите внимание, что A.thaliana и B.napus miRNAs, а также человеческие пиРНК модифицированы 2'-OMe, в отличие от человеческих миРНК. Показаны средние значения по крайней мере двух независимых экспериментов, а бары ошибок представляют собой стандартные отклонения. (B). Числа miRNAs (или piRNAs) определены. Мы определили количество известных miRNAs от различных видов, идентифицированных с протоколами TS или TS5. Обратите внимание, что для A. thaliana, B. napus, или H. sapiens, 427, 92 и 2588 miRNAs были зарегистрированы в miRBase, соответственно. 0,5 миллиона считывателей из библиотек TS или TS5 были отображены на B. napus miRNAs в miRbase, 1 миллион считывателей были отображены в базах данных A. thaliana или человеческих баз данных. Показаны средние значения по крайней мере двух независимых экспериментов со стандартными отклонениями, представленными барами ошибок. Эта цифра была изменена с Dard-Dascot и др., 201812. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Имя олигонуклеотид | 5' модификация | 3' модификация | последовательность от 5'до 3' | Очистки | |||||
| 5' HD (TS5) адаптер | 5AmMC6 | (5AmMC6) GTTCAGAGTTTACAGTCGATCATCATCCCCANrNrNrNrN (обратите внимание, что это олиго является ДНК-РНК химерной; три 3' терминала NTS ЯВЛЯЮТСЯ РНК) | Вэжх | ||||||
| 3' HD (TS5) адаптер | Фосфат | 3АММО | «Фос-рнрНрНрННГГАААТТКГКГГККААГГЗ 3ААМО» (обратите внимание, что этот олиго является химерной ДНК-РНК; четыре 5' терминала являются РНК) | Вэжх | |||||
| 5' MRL (TS7) адаптер | 5AmMC6 | (5AmMC6) GTTCAGAGTTTACAGTCCGACGATCNNNNrCrGrArArArC (обратите внимание, что это олиго является ДНК-РНК химерной; семь 3' терминала NTS являются РНК) | Вэжх | ||||||
| 3' MRL (TS7) адаптер | фоспат | 3АММО | (Фос) Я не сказал, что я не против. GTATCGTNNNNNnTGGAATTCTCGG | Вэжх | |||||
| RT грунтовка | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | Вэжх | |||||||
| Универсальная грунтовка P5 | ААТГАТАКХАККАКСАГАТТАКАКАТТАКТЦАГАГАГАГАГАГТАКТЦАГАГАГАГАГАГТТАКТТАКТЦТККГА | Вэжх | |||||||
| Праймер P7-индекс | CAAGGAAGACGGGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTTTTGGCACCCGAGAATTCCA (NNNNNN ) | Вэжх | |||||||
| индекс 1: CGTGAT | |||||||||
| индекс 2: ACATCG | |||||||||
| индекс 3: GCCTAA | |||||||||
| индекс 4: TGGTCA | |||||||||
| индекс 5: CACTGT | |||||||||
| индекс 6: ATTGGC | |||||||||
| индекс 7: GATCTG | |||||||||
| индекс 8: TCAAGT | |||||||||
| индекс 9: CTGATC | |||||||||
| индекс 10: AAGCTA | |||||||||
| индекс 11: GTAGCC | |||||||||
| индекс 12: ТАСС | |||||||||
Таблица 1. Олигонуклеотиды используются с этим протоколом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подготовка небольшой библиотеки РНК остается сложной из-за предвзятости, в основном внедряемой во время этапов перевязки адаптера. РНК с 2'-OMe модификации в их 3 'конец, такие как мифы растений, piRNA у насекомых, нематод и млекопитающих, и малых вмешательства РНК (siRNA) в насекомых и растений особенно трудно изучать, потому что 2'-OMe модификация подавляет 3' адаптер перевязки. В литературе был предложен ряд решений по совершенствованию протоколов подготовки библиотеки СРНК, однако большинство коммерчески химков по-прежнему основаны на классическом протоколе ТС, который имеет серьезные предубеждения. Несколько "низкий уклон" комплекты существуют, однако, в том числе Nf комплект с рандомизированными адаптерами и ПЭГ в перевязки реакций, и несколько комплектов появились недавно, что избежать перевязки адаптера вообще12. Мы сообщали ранее, что Nf обнаруживает больше различных miRNAs, чем стандартный протокол TS, но протокол 'S' (без перевязки адаптера) выполняется относительно плохо из-за значительного формирования побочных продуктов12. Удивительно, но при модификации протоколы ТС имели более чувствительное обнаружение 2'-OMe sRNA, чем другие протоколы, но не нормальных sRNAs. Мы выбрали здесь, чтобы подробно описать протокол TS5, в котором адаптеры рандомизированы на их конечностях, PEG используется в реакции перевязки и избыток 3' адаптер устраняется путем очистки на бисере. Здесь следует отметить, что другой протокол (TS7), использующий адаптеры MRL, может работать несколько лучше, чем протокол TS5. Однако, поскольку между ними есть лишь незначительные различия, а с TS7 сложнее отделить желаемый библиотечный продукт от димеров адаптера, мы предпочли подробно описать протокол TS5. Однако пользователи могут при желании заменить адаптеры TS5 на адаптеры TS7. Обратите внимание, что они немного длиннее, что приводит к конечному продукту библиотеки в размере 170 б.п., а не 150 б.п.
Возможность выполнения протокола TS5 или TS7 с «домашними» материалами позволяет существенно снизить стоимость. Однако может быть больше йенсуа с точки зрения качества с домашними материалами; особенно самодельные предварительно adenylated 3' адаптер может быть предметом переменного качества из-за различной эффективности предварительной адениляции. Поэтому рекомендуется подготовить большой запас и, если готовится новый запас, сравнить его производительность с предыдущим. Для этого можно использовать контрольный образец РНК.
Недостатком протоколов, описываемых здесь, является относительно сильное формирование побочных продуктов и трудность отделения желаемой библиотеки от этих продуктов. Необходимо позаботиться о том, чтобы не перегружать гель акриламида для очищения. Недавно были разработаны модифицированные адаптеры, которые имеют сильно сниженную тенденцию к формированию димеров21. Модификация 2'-OMe на 3'end 5' адаптера в сочетании с метилфосфонатной модификацией на 5' конечности 3' адаптера эффективно подавленный димеры адаптера. Будет интересно протестировать такие модифицированные адаптеры в описанном в описанном в нем протоколе.
Шаги очистки геля в протоколе TS5 являются относительно трудоемкими. Если использование модифицированных адаптеров эффективно снижает образование адаптерных димеров, очистка геля конечной библиотеки может больше не потребоваться. Кроме того, в качестве альтернативы шагу очистки геля для изоляции небольшой РНК (шаг 1), существует стратегия с использованием магнитных бусин окрадных для малых РНК (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). Мы сами не использовали этот метод, но его стоит проверить, и если он хорошо работает, это может значительно упростить протокол.
В заключение, в то время как протокол TS5 может быть улучшен, он работает лучше, чем коммерчески доступные комплекты, по крайней мере те, которые были протестированы в нашем предыдущем сравнительном анализе, для обнаружения 2'OMe sRNA. За ним можно следить с помощью самодельных материалов, что позволяет значительно снизить затраты. Для удобства и, возможно, более постоянной работы можно использовать реагенты из комплектов TS и Nf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным центром научных исследований (CNRS), Французской комиссией по альтернативным энергетикам и атомной энергии (CEA) и Университетом Париж-Суд. Вся подготовка библиотеки, анализы последовательности illumina и биоинформатики для данного исследования были проведены на объекте I2BC Next-Generation Sequencing (NGS). Члены i2BC NGS объекта признаны для критического чтения рукописи и полезные предложения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
