Summary
Vi præsenterer en detaljeret lille RNA bibliotek reparation protokol med mindre bias end standardmetoder og en øget følsomhed for 2 '-O-methyl RNAs. Denne protokol kan følges ved hjælp af hjemmelavede reagenser for at spare omkostninger eller bruge kits til bekvemmelighed.
Abstract
Studiet af små RNAs (sRNAs) ved næste generations sekvensering (NGS) udfordres af bias-problemer under biblioteks forberedelsen. Flere typer sRNA såsom plante microRNAs (miRNAs) bære en 2 '-O-methyl (2 '-OMe) modifikation på deres 3 ' Terminal nucleotid. Denne modifikation tilføjer en anden vanskelighed, da det hæmmer 3 ' adapter ligation. Vi har tidligere demonstreret, at modificerede versioner af ' TruSeq (TS) ' protokollen har mindre bias og en forbedret påvisning af 2 '-OMe RNAs. Her beskriver vi i detaljer protokol ' TS5 ', som viste den bedste samlede præstation. TS5 kan følges enten ved hjælp af hjemmelavede reagenser eller reagenser fra TS kit, med samme ydeevne.
Introduction
Små RNAs (sRNAs) er involveret i kontrollen af en mangfoldighed af biologiske processer1. Eukaryotic Regulatory sRNAs er typisk mellem 20 og 30 NT i størrelse; de tre hovedtyper er microRNAs (miRNA), Piwi-interagerende RNAs (piRNA) og små forstyrrende RNAs (siRNA). Afvigende miRNA udtryk niveauer har været impliceret i en række forskellige sygdomme2. Dette understreger betydningen af miRNAs i sundhed og sygdom og kravet om nøjagtige, kvantitative forskningsværktøjer til at opdage sRNAs i almindelighed.
Next-Generation sekventering (NGS) er en meget anvendt metode til at studere srnas. De vigtigste fordele ved NGS sammenlignet med andre tilgange, såsom kvantitative PCR-eller microarray-teknikker (qPCR), er, at det ikke har brug for en priori-viden om sRNA-sekvenser og derfor kan bruges til at opdage nye RNAs, og at det desuden lider mindre baggrunds signal og mætningseffekter. Yderligere, det kan detektere enkelt nukleotid forskelle og har en højere gennemløb end mikroarrays. Men NGS har også nogle ulemper; omkostningerne ved en sekvens kørsel er fortsat relativt høje, og den Step-proces, der kræves for at konvertere en prøve til et bibliotek til sekvensering, kan introducere bias. I en typisk sRNA-Biblioteks forberedelsesproces er en 3 ' adapter først ligeret til sRNA (ofte gel-renset fra Total RNA) ved hjælp af en afkortet version af RNA-ubiquitinligase 2 (RNL2) og en præadenyleret 3 ' adapter (figur 1) i fravær af ATP. Dette øger effektiviteten af Srna-adapter ligering og reducerer dannelsen af sidereaktioner såsom Srna cirkularisering eller koncatemerisering. Efterfølgende, en 5 ' adapter er ligeret af RNA ubiquitinligase 1 (RNL1), efterfulgt af reverse transkriptionen (RT) og PCR amplifikation. Alle disse trin kan indføre bias3,4. Læse numrene afspejler derfor muligvis ikke de faktiske sRNA-udtryks niveauer, hvilket fører til kunstige, metode afhængige udtryks mønstre. Specifikke sRNAs kan være enten over-eller underrepræsenteret i et bibliotek, og stærkt underrepræsenterede sRNAs kan undslippe afsløring. Situationen er særlig kompliceret med plante miRNAs, siRNAs i insekter og planter, og piRNAs i insekter, nematoder og pattedyr, hvor 3 ' Terminal nucleotid har en 2 '-O-methyl (2 '-OMe) modifikation1. Denne ændring hæmmer kraftigt 3 ' adapter ligering5, hvilket gør biblioteket forberedelse til disse typer af RNA en vanskelig opgave.
Tidligere arbejde viste, at adapter ligering introducerer alvorlig bias, på grund af RNA sekvens/struktureffekter6,7,8,9,10,11. Trin nedstrøms for adapter ligering såsom reverse transkription og PCR bidrager ikke signifikant til bias6,11,12. Ligering bias er sandsynligvis på grund af det faktum, at adapter molekyler med en given sekvens vil interagere med Srna molekyler i reaktionsblandingen til dannelse af co-folder, der kan enten føre til gunstige eller ugunstige konfigurationer for ligering (figur 2). Data fra Sorefan et al7 antyder, at RNL1 foretrækker en enkelt strandede sammenhæng, mens RNL2 foretrækker en dobbelt streng til ligation. Det forhold, at adapter/sRNA Co-fold strukturer er bestemt af den specifikke adapter og sRNA sekvenser forklarer, hvorfor specifikke sRNA er over-eller underrepræsenteret med en given adapter sæt. Det er også vigtigt at bemærke, at der inden for en række sRNA biblioteker, der skal sammenlignes, de samme adapter sekvenser bør anvendes. Faktisk er det tidligere blevet bemærket, at skiftende adaptere ved indførelsen af forskellige stregkode sekvenser ændrer Mirna profiler i sekvensering biblioteker9,13.
Randomisering af adapter sekvenser i nærheden af ligationskrydset reducerer sandsynligvis disse skævheder. Sorefan og kolleger7 brugte adaptere med 4 tilfældige nukleotider på deres ekstremiteter, udpegede "high definition" (HD) adaptere, og viste, at brugen af disse adaptere fører til biblioteker, der bedre afspejler sande Srna ekspressionsniveauer. Nyere arbejde bekræftet disse observationer og afslørede, at den randomiserede region ikke behøver at være støder op til ligering Junction11. Denne nye type adaptere blev "MidRand"-adaptere. Tilsammen viser disse resultater, at forbedret adapter design kan reducere bias.
I stedet for at ændre adapterne kan bias undertrykkes gennem optimering af reaktions forholdene. Polyethylenglycol (peg), et makromolekyle-fortrængning-middel, der vides at øge ligations effektiviteten14, har vist sig at reducere bias15,16betydeligt. Baseret på disse resultater, flere "Low bias" kits dukkede op på markedet. Disse omfatter kits, der bruger PEG i ligations reaktionerne, enten i kombination med klassiske adaptere eller HD-adaptere. Andre kits undgå ligering helt, og brug 3 ' polyadenylering og skabelon Skift til 3 ' og 5 ' adapter addition, henholdsvis12. I endnu en strategi, 3 ' adapter ligering efterfulgt af en cirkularisering skridt, og dermed udelade 5 ' adapter ligering17.
I en tidligere undersøgelse, vi søgte efter en sRNA bibliotek forberedelse protokol med de lavest mulige niveauer af bias og den bedste påvisning af 2 '-OMe RNAs12. Vi testede nogle af de ovennævnte ' low bias ' kits, som havde en bedre påvisning af 2 '-OMe RNAs end standardprotokollen (TS). Overraskende dog, efter modifikation (brug af randomiserede adaptere, PEG i ligations reaktioner og fjernelse af overskydende 3 ' adapter ved rensning) sidstnævnte udkonkurreret de andre protokoller til påvisning af 2 '-OMe RNAs. Her beskriver vi i detaljer en protokol baseret på TS-protokollen, ' TS5 ', som havde den bedste samlede opdagelse af 2 '-OMe RNAs. Protokollen kan følges ved hjælp af reagenser fra TS kit og en reagens fra ' NF ' kit eller, for at spare penge, ved hjælp af hjemmelavede reagenser, med samme ydeevne. Vi leverer også en detaljeret protokol til rensning af sRNA fra Total RNA og fremstilling af præadenyleret 3 ' adapter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolering af små RNAs
- Uddrag total RNA ved hjælp af phenol-baserede reagenser eller enhver anden metode. Kontroller, om RNA er af god kvalitet.
- Pre-Run en 15% TBE-urea gel (Se tabel over materialer) for 15 min ved 200 V.
- Mens gelen er pre-Running, bland 5-20 μg total RNA i en 5-15 μl volumen med et tilsvarende volumen af formamid loading Dye (Se tabel over materialer; 95% deioniseret formamid, 0,025% bromphenolblåt blå, 0,025% xylen cyanol, 5 mm EDTA pH 8) i et 200 μl PCR tube. Ligeledes blandes 10 μL (200 ng) af små-RNA stigen (Se tabel over materialer) med et tilsvarende volumen af formamid lastning farvestof. Der inkuberes i 5 min ved 65 °C i en termo cycler med opvarmet låg, og anbring derefter rørene straks på isen.
- Læg stigen og prøven på den samme gel med mindst én vognbane mellem dem og Kør ved 200 V, indtil bromphenolblåt Blue (mørkeblå) har migreret omkring to-tredjedel af gellængden (ca. 40 min).
- Forbered et system til at elueres RNA fra gel som følger: punktering bunden af en nuclease-fri 0,5 ml mikro centrifuge tube med en 21-gauge nål. Placer det punkterede 0,5 mL rør i et nuklease frit, rundbundet 2 mL mikro-centrifugeglas.
- Tag gelen ud og Inkuber ved stuetemperatur med 3 μL nukleinsyre gel bejdse (10.000 x koncentrat; jf. tabel over materialer) i 30 ml vand til 10-15 min.
- Se gelen på en ' Dark Reader ' Trans illuminator (det anbefales kraftigt at undgå UV, da dette kan beskadige RNA) og skære prøven RNA mellem de 17 NT og 29 NT stigen bands. Gelstykket overføres til 0,5 mL røret fra trin 1,5.
- 0,5 mL røret centrifugeres i 2 mL-røret i en mikro-centrifuge ved maksimal hastighed i 2 min. Fjern 0,5 mL røret, som skal være tomt nu.
- Tilsæt 300 μL nuklease frit 0,3 M NaCl til 2 mL røret, der indeholder den knuste gel, og Roter i mindst 2 timer ved stuetemperatur eller ved 4 °C natten over (16 timer).
- Suspensionen af knuste gel-stykker overføres til en spin kolonne (Se tabel over materialer) og centrifugeres i 2 min ved maksimal hastighed i en mikro-centrifuge.
- Tilsæt 1 μL (20 μg/μL) glykogen (Se tabel over materialer) og 950 μl rumtemperatur 100% ethanol. Inkuber i mindst 30 min ved-80 °C.
- Der centrifugeres i 20 minutter ved maksimal hastighed i en mikro-centrifuge ved 4 °C. Fjern supernatanten, vask pellet med 800 μL kold 80% ethanol. Centrifugér igen i 5 minutter ved 4 °C, og fjern forsigtigt alle supernatanten. Resuspension af RNA-pellet i 15 μL nuklease frit vand. Typisk, ~ 5-20 ng af små RNA skal inddrives, afhængigt af mængden af input total RNA (~ 1 ng af små RNA pr 1 μg input total RNA).
- Anbefalet ekstra trin: Kontroller mængden og kvaliteten af den gendannede sRNA (f. eks. ved hjælp af kapillær gel-elektroforese med et lille RNA-sæt; Se tabel over materialer).
2. klargøring af præadenyleret 3 ' HD-adapter
Bemærk: Præadenylering af 3 ' HD-adapter blev udført på samme måde som den protokol, der er beskrevet af Chen et al18. Bemærk, at preadenylated adapter kan bestilles direkte (/5rApp/modifikation), men det er ret dyrt.
- Bestil 5 ' phosphorylated, 3 ' blokeret 3 ' HD adapter oligonucleotid. Se tabel 1 for sekvens og modifikationer. Bemærk, at ' 3AmMO ' er en 3 ' amino modifikator gruppe, kan de fleste leverandører producere oligonukleotid med denne modifikation. Fortyndes i nuklease frit vand til 100 μM.
- Der oprettes en 100 μL reaktion, som indeholder følgende reagenser: 10 μL oligo (100 μM), 10 μL T4 RNA-ligasebuffer (10x), 10 μL ATP (10 mM), 40 μL 50% PEG8000, 5 μL T4 RNA-ubiquitinligase 1 (50 enheder), 25 μL nuklease frit vand. Inkuber natten over ved 20 °C.
- Udfør en klassisk phenol-chloroform ekstraktion af præadenyleret oligonukleotid efterfulgt af ethanol nedbør. Tilsæt 100 μL syre (pH 4,5) phenol: chloroform og vortex. Spin i 5 minutter ved stuetemperatur, maksimal hastighed. Overfør forsigtigt 90 μL af den øvre fase til et nyt rør; Tilsæt 10 μL 3 M natriumacetat pH 5,2, 1 μL ultra-ren glykogen og 250 μL kold 100% ethanol.
- Opbevares ved-20 °C i mindst 30 min. centrifuge i 30 minutter ved 4 °C maksimal hastighed. Fjern supernatanten, vask pellet en gang med 500 μL kold 80% ethanol. Som et alternativ til phenol-chloroform ekstraktion og ethanol nedbør, et nucleotid fjernelse kit kan anvendes (Se tabel over materialer). Resuspension i 25 μL vand.
- Mål koncentrationen af adapteren ved hjælp af et sæt til specifik påvisning af enkeltstrenget DNA (Se tabel over materialer). Fortyndes til 80 ng/μL (10 μM).
- Anbefalet ekstra trin: Kontroller effekten af præadenylering ved at migrere 1 μL 10 μM adapter på en 15% TBE-urea-gel (tabel over materialer) sammen med ubehandlet oligonukleotid. Den præadenylerede adapter skal migrere lidt langsommere end ubehandlet oligonukleotid. Hvis det ønskes, kan den præadenylerede adapter være gel-renset; Fortsæt som beskrevet ovenfor (trin 1.2-1.12).
3. forberedelse af biblioteket-protokol TS5
Bemærk: Vi præsenterer her den modificerede TS-protokol ' TS5 ', som vi beskrev tidligere12 , og som kan udføres enten med reagenser fra sættet eller med selv leverede reagenser. Det skal bemærkes, at vi opnåede lignende eller endda lidt bedre resultater med en anden protokol, ' TS7 '. Men med TS7 er det vanskeligere at eliminere adapter dimers. Vi har derfor foretrukket at beskrive TS5 i detaljer, men TS7 kan følges ved blot at udskifte adapterne. For TS7 brug adapter sekvenserne ' MidRand-like (MRL) ' (tabel 1). Bemærk, at her de randomiserede regioner er i midten af adapterne. Primers for reverse transskription og PCR vil hybridisere til sekvenserne nedstrøms for den randomiserede region i 3 ' adapter og opstrøms for den randomiserede region i 5 ' adapter. Sekvensering vil starte fra det første randomiserede nukleotid i 5 ' adapteren.
- 3 ' adapter ligation.
- 1 μL præadenyleret 3 ' HD-adapter (10 μM) kombineres med 1 μL renset lille RNA (~ 0,1-1 μM) i et 0,2 mL mikro-centrifugeglas. Inkuber i 2 min ved 72 °C i en Thermo cycler, og sæt derefter direkte på is.
- Tilsæt 4 μL 50% PEG 8000 (viskøs opløsning, pipet langsomt), 1 μL RNA-ligasebuffer (10x), 1 μL H2O, 1 ΜL T4 RNA ligase2 afkortet og 1 μl rnasehæmmer. Inkuber natten over ved 16 °C.
- Eliminering af uligeret 3 ' adapter
- Tilsæt 10 μL nuklease frit vand, og bland godt. Tilsæt 6 μL 3 M NaOAc pH 5,2 eller ' adapter Depletering ' fra NF Kit (tabel over materialer) og bland godt. Tilsæt 40 μL magnetisk rensning perler (tabel over materialer) og 60 μl af isopropanol og bland godt. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Anbring prøven i et magnetisk rack, indtil opløsningen ser ud til at være klar. Fjern og kassér supernatanten.
- Tilsæt 180 μL frisklavet 80% ethanol. Inkuber for ~ 30 s, og fjern derefter. Vær forsigtig med at bruge frisklavet 80% ethanol og Inkuber ikke med 80% ethanol i længere perioder.
- Drej kortvarigt røret og fjern rest væsken, der kan have samlet sig i bunden af brønden. Lad perlerne tørre i 2 min., derefter opblanding i 22 μl 10 mm Tris pH 8 eller opblanding buffer fra NF kit. Inkuber i 2 min, derefter Isere prøven, indtil opløsningen vises klar.
- Der tilsættes 6 μL 3 M NaOAc pH 5,2 eller ' adapter Depletering ' fra NF Kit (tabel over materialer) til et nyt rør. Overfør 20 μL af supernatanten fra det foregående trin til dette nye rør og bland ved pipettering. Tilsæt 40 μL magnetiske perler og 60 μL 100% isopropanol og bland godt ved pipettering. Inkuber i 5 min.
- Prøv at magnetisere prøven, indtil opløsningen vises klar, og fjern derefter supernatanten, og kassér den.
- Tilsæt 180 μL frisklavet 80% ethanol. Inkuber for ~ 30 s, og fjern derefter. Take Care at bruge frisk tilberedt 80% ethanol og ikke inkubere for med 80% ethanol i længere perioder.
- Drej kortvarigt røret og fjern rest væsken, der kan have samlet sig i bunden af brønden. Lad perlerne tørre i 2 minutter, og resuspension i 10 μL nuklease frit vand. Inkuber i 2 min, derefter Isere prøven, indtil opløsningen vises klar.
- Overfør 9 μL supernatanten til et nyt rør. Tilsæt 1 μL T4 RNA-ligasebuffer (10x) og 1 μL vand. Alternativt kan du tilføje 2 μL ligasebuffer fra TS-sættet.
- Ring af 5 ' adapter.
- Tilsæt 1 μL 5 ' HD-adapter (10 μM; Tabel 1) til et 200 μl PCR-rør i en Thermo variator med opvarmet låg. Inkuber i 2 min ved 70 °C, og sæt derefter røret direkte på isen.
- Tilsæt 1 μL 10 mM ATP og 1 μL T4 RNA-ubiquitinligase 1. Bland godt ved forsigtigt pipettering. Tilsæt 3 μL af denne blanding til 3 ' ligeret RNA fra trin 3.2.9 og bland ved pipettering. Inkuber i 1 time ved 28 °C.
- Omvendt transskription (RT)
- Overfør 6 μL 3 ' og 5 ' adapter ligeret RNA til et nyt 200 μL PCR-rør (Opbevar de resterende ~ 8 μL ved-80 °C til senere brug, hvis det er nødvendigt). Tilsæt 1 μL RT primer (10 μM; Tabel 1) og bland ved pipettering. Inkuber i 2 min ved 70 °C, og sæt derefter røret direkte på isen.
- Tilsæt følgende reagenser til RT: 2 μL 5x første strand buffer, 0,5 μL 12,5 mM dNTP mix, 1 μL 100 mM DTT, 1 μL Rnasehæmmer og 1 μL revers transkriptase (tabel over materialer). Inkuber i 1 time ved 50 °C.
- PCR amplifikation
- Tilsæt følgende reagenser til 12,5 μL RT-reaktionsblandingen: 10 μL PCR-polymerasebuffer, 2 μL Universal P5-primer (10 μM; Tabel 1), 2 μl P7-index primer (10 μM; Tabel 1), 1 μl 12,5 mm dNTPs, 0,5 μl DNA-Polymerase (tabel over materialer) og 22 μl vand. Hold reaktionen på isen indtil brug.
- Kør følgende PCR-program: 98 °C i 30 s, 11 cyklusser (98 °C i 10 s, 60 °C i 30 s og 72 °C i 15 s) og 72 °C i 10 min. hold reaktionen ved 4 °C, når den er færdig.
Bemærk: vedrørende antallet af PCR-cyklusser: vi udfører typisk 11 cyklusser, men dette skal optimeres af brugeren. Prøv at udføre det mindst mulige antal PCR-cyklusser.
- Gel rensning
- Kør 5, 10 og 20 μL PCR-produkt på en oprindelig 6% TBE-gel (Se tabel over materialer) sammen med en passende stige (Se tabel over materialer). Kør gelen i ca. 1 time ved 145 V (indtil bromphenolblåt blå når bunden; dette farvestof migrerer ved 65 BP position).
- Tag gelen og Inkuber med nukleinsyre gel bejdse (jf. tabel over materialer) i vand i 10-15 min.
- Se gelen på en "Dark Reader" Trans illuminator (det anbefales kraftigt at undgå UV, da dette kan beskadige RNA) og klippe Biblioteks båndet ud på 150 BP. Forbered et system til at elueres RNA fra gel som beskrevet i trin 1,5 og Overfør gel stykket til 0,5 ml røret.
- Centrifugeres i en mikro-centrifuge ved maksimal hastighed i 2 min. Fjern 0,5 mL røret, som skal være tomt nu.
- Tilsæt 300 μL nuklease frit vand til 2 mL-røret, der indeholder den knuste gel, og Roter i mindst 2 timer ved stuetemperatur eller ved 4 °C natten over.
- Overføre suspensionen af knuste gel stykker i vand til en spin kolonne og centrifugeres i 2 min ved maksimal hastighed.
- Tilsæt 1 μL (20 μg/μL) glykogen, 30 μL 3 M NaOAc og 975 μL iskold 100% ethanol. Centrifuger i 20 minutter ved max-hastighed ved 4 °C.
- Resuspension af pellet i 20 μL 10 mM Tris pH8. Brug 1 μL til koncentrationsmåling og 1 μL til kvalitetskontrol.
4. data analyse
Bemærk: den dataanalyse procedure, der er beskrevet nedenfor, er baseret på Linux-operativsystemet Ubuntu 16,04 LTS.
- Behandling af RAW sekvens filer
- Hent de FASTQ-sekvensfil (er), der blev genereret under sekvensering af kørslen. Udfør om nødvendigt demultiplexede med bcl2fastq2 (version v 2.2.18.12; en manual kan downloades fra følgende link: http://EMEA.support.Illumina.com/Sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-Conversion-software/Documentation.html).
Brug følgende kommando:
nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq--runfolder-dir Pathway_of_Run --Ignorer-mangler-BCL--output-dir Pathway_of_Output_Directory --stregkode-uoverensstemmelser 1--aggregerede felter Auto-r 16-d 16-p 16-w 16 - Fjern adapter sekvenser ved hjælp af Cutadapt19 version 1,15. En manual kan downloades her: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
Brug følgende kommando:
Pathway_to_cutadapt/ cutadapt-a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-n 5-O 4-m 10-j 0--nextseq-trim 10-O Output_File_Read1_cutadapt. Fastq. gz Input_File_Read1. fastq. gz
Bemærk, at sekvensen i kommandoen svarer til 3 ' HD-adapteren uden de 4 tilfældige nukleotider; disse vil derfor ikke blive fjernet i dette trin. - Brug seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) til fjernelse af terminalerne tilfældige nukleotider i sekvensering læser. Brug følgende kommando (variabelnavne med fed skrift):
seqtk trimfq-b 4-e 4 Output_File_Read1_cutadapt . fastq > Output_File_Read1 _trimmet . fastq - Brug følgende AWK-kommando for at kassere sekvenser, som er kortere end 10 NT:
AWK ' Begin {FS = "\t"; OFS = "\n"} {header = $0; getline SEQ; getline qheader; getline qseq; IF (længde (SEQ) > = 10) {print header, SEQ, qheader, qseq}} ' Output_File_Read1_trimmet. fastq > Length_Filtered. fastq
- Hent de FASTQ-sekvensfil (er), der blev genereret under sekvensering af kørslen. Udfør om nødvendigt demultiplexede med bcl2fastq2 (version v 2.2.18.12; en manual kan downloades fra følgende link: http://EMEA.support.Illumina.com/Sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-Conversion-software/Documentation.html).
- Kortlægning af de trimmede sekvenser
- Download databasen svarende til organismen i studiet fra miRBase som følger. Gå til http://www.mirbase.org/ftp.shtml, og Hent filen ' Mature. FA '. Bemærk, at sekvenserne er angivet i RNA-notation. Udskift U-rester med T med følgende kommando:
SED-i '/^ >/! s/U/T/g ' moden. FA
Bemærk: Dette vil give en komplet liste over alle miRNAs i miRBase, der stammer fra en række organismer. - Vælg miRNA sekvenser af din organisme af interesse med følgende kommando:
AWK 'name_of_the_organism{print; NR [nr + 1]; næste}; NR i nr ' moden. FA > mature_name_of_the_organism_Mirs. FA - Kortlæser til den ovenfor oprettede fil ved hjælp af Bowtie220 (version 2.3.0) tillader ingen mismatch. Byg først et indeks til din fil med følgende kommando:
bowtie2-Build mature_name_of_the_organism_Mirs. FA mature_name_of_the_organism_Mirs - Juster sekvensering læser til databasen, hvilket kræver, at en læse kort helt til en miRNA af databasen, uden nogen uoverensstemmelser. Til dette formål skal du bruge følgende værktøj:
bowtie2-N 0-L 10-score-min C, 0, 0--end-to-end-tid-x mature_name_of_the_organism_Mirs-U Length_Filtered. Fastq-S Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam
Bemærk: muligheden:--score-min C, 0, 0 sikrer, at tilpasningen er uden uoverensstemmelser. For en forklaring af de forskellige parametre i værktøjet, kan du besøge følgende hjemmeside: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - Hvis du vil kassere de læsninger, der ikke er justeret, skal du bruge følgende kommando:
samtools View-F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam > Reads_aligned_to_Mirs. Sam
Bemærk: som et resultat af disse trin, bør du nu have opnået de justerede læsninger, svarende til miRNAs.
- Download databasen svarende til organismen i studiet fra miRBase som følger. Gå til http://www.mirbase.org/ftp.shtml, og Hent filen ' Mature. FA '. Bemærk, at sekvenserne er angivet i RNA-notation. Udskift U-rester med T med følgende kommando:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kritiske trin er isoleringen af den lille RNA-fraktion af det første totale RNA-materiale (figur 3) og det ønskede endelige Biblioteks produkt (figur 4). Begge trin involverer polyacrylamid gel rensning; lille RNA er isoleret fra 15% TBE urea gels, mens de endelige biblioteker er isoleret fra 6% indfødte TBE gels. Lille RNA isoleret fra gel kan analyseres på en lille RNA kapillar elektroforese chip (tabel over materialer; Figur 3 B). Dette vil give brugerne mulighed for at anslå mængden af små RNA inddrives og andelen af Mirna i præparatet.
Gel rensning af det endelige Biblioteks produkt er et delikat skridt, da en række yderligere produkter dannes, der migrerer tæt på det ønskede bibliotek. Det er vigtigt ikke at overbelaste gelen, da dette vil øge risikoen for at forurenes biblioteket med andre arter såsom adapter dimers. Som eksempel (figur 4) blev der lagt stigende mængder PCR-forstærket bibliotek (fra B. napus RNA) på gelen, og det produkt, der svarer til den forventede størrelse (150 BP), blev skåret ud (figur 4A). Efter eluering blev det rensede bibliotek kontrolleret på en kapillar gel elektroforese chip; ud over det forventede 150 BP-produkt blev der observeret en stigende andel af en 130 BP-art, svarende til adapter-dimere, da der blev indlæst stigende mængder PCR-produkt (figur 4B, C).
Vi har testet, om Protocol TS5 fungerer på samme måde med hjemmelavede reagenser som med reagens fra kits. Til dette formål forberedte vi biblioteker fra en blanding af syntetiske små RNAs 1-6, hver til stede uden eller med en 2 '-OMe modifikation, som gjort i vores tidligere undersøgelse12. Figur 5 viser andelen af læsninger svarende til hver af disse RNAs opnået tidligere og med de nye biblioteker lavet ved hjælp af reagenser fra TS og NF kits eller fra andre leverandører. Som det kan ses, blev der opnået meget lignende resultater.
Figur 6 viser en sammenligning af resultaterne af protokol TS5 med standard TS-protokollen til påvisning af anlæg (a. thaliana og B. napus) Mirnas, som er 2 '-OMe modificeret, og af umodificerede humane Mirnas. Vi testede også påvisning af piRNAs, 2 '-OMe modificeret i humane prøver. Som det kan ses, TS5 udfører betydeligt bedre end TS til påvisning af 2 '-OMe RNAs, men ikke for umodificerede RNAs. Men også for umodificerede sRNAs, selvom ikke et større antal RNAs detekteres, de opnåede læse numre sandsynligvis bedre afspejle sande ekspressionsniveauer med TS5 end med TS på grund af lavere niveauer af bias.
Figur 1 . Skematisk gengivelse af sRNA Library forberedelse workflow for Illumina sekvensering. Først, sRNAs er isoleret af en gel rensning skridt. Her er størrelsesintervallet for miRNAs indikeret, men alle andre størrelsesområde kan vælges, afhængigt af de RNAs af interesse. Et kvalitetskontrol trin (QC) udføres derefter for at kontrollere kvaliteten og mængden af isoleret sRNA. Under klargøring af biblioteket er en preadenylated (app) 3 ' adapter først ligeret til sRNA. Derefter, en 5 ' adapter er ligated. Efterfølgende udføres reverse transkriptionen ved hjælp af en primer, der supplerer 3 ' adapteren, efterfulgt af PCR-forstærkning, hvor Illumina P5-, P7-og Index (' in ')-sekvenserne tilføjes. Det resulterende bibliotek er gel renset, efterfulgt af et kvalitetskontrol trin. Så biblioteket er sekvenserede, og data analyseres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Partiskhed på grund af sekvens afhængig adapter-sRNA-sammenfoldning. I blandingen af adapter ligering vil adaptere blive sammenfoldet med srnas på en måde, der afhænger af adapterens rækkefølge og Srna. Således, forskellige sRNAs (illustreret med eksempler a, b, og c; angivet med forskellige nuancer af grøn) vil sammenfolde forskelligt med en given adapter (den 3 ' adapter er angivet med rødt, 5 ' adapter er angivet med blåt). De sorte pile indikerer ligations knudepunkter. Dette kan føre til en gunstig eller ugunstig kontekst for ligation. Da RNL2 synes at foretrække en dobbelt strandede miljø, 3 ' ligering forventes at være mere effektiv for RNAs a og b end for RNA c. Med RNL1, der foretrækker en enkelt strandede region omkring ligations krydset, kan 5 ' adapter ligering være mest effektiv for RNA a, efterfulgt af b og mindst effektiv for c. sammen kan dette resultere i en overrepræsentation af Srna a, en mellemliggende repræsentation af RNA b og en underrepræsentation af RNA c i det endelige bibliotek, selv om de tre RNAs er til stede på lige store mængder i den oprindelige RNA-prøve. Bemærk, at en given sRNA på samme måde vil være repræsenteret forskelligt, når adapter sekvensen ændres (f. eks. ved at tilføje forskellige stregkoder). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Isolering af små RNA og kvalitetskontrol. (A). elektroforetisk adskillelse af Brassica napus total RNA (10 μg) på en 15%, der denaturerede polyacrylamid gel. En lille RNA-stige (Se tabel over materialer) blev migreret sammen som en molekyl størrelses markør. Efter migrationen blev gelen plettet, og RNA blev visualiseret på en Trans illuminator. Regionen fra 17 til 29 nukleotider blev skåret ud (indikeret med et rødt rektangel), og RNA blev elueret. (B). kvaliteten af det rensede RNA blev kontrolleret af kapillar gel elektroforese. Bemærk, at denne analyse indeholder oplysninger om andelen af miRNA i stikprøven (93% i dette tilfælde). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Gel rensning af et B. napus lille RNA-bibliotek udarbejdet efter protokol TS5 og kvalitetskontrol. (A). stigende mængder af et PCR forstærket bibliotek fra B. napus lille RNA blev indlæst på en 6% Native TBE gel; 2,5 μL (a), 5 μL (b), 10 μL (c) eller 20 μL (d) PCR-produkt. En 50 BP stigen blev migreret sammen. PCR-produkter, der migrerer ved den forventede 150 PB-position, blev isoleret (rødt rektangel), DNA blev elueret og renset. (B). kvalitetskontrol af det rensede bibliotek gel-repræsentation. (C). elektro pherogram repræsentation af samme analyse. Som det kan ses, er 150 PB produktet i stigende grad forurenet med adapter dimerer (~ 130 BP) som større mængder af PCR produkt er migreret på gel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Protokol TS5 udfører tilsvarende med reagenser fra TS-og NF-kits eller med reagenser fra andre leverandører. Histogrammer, der repræsenterer den procentdel af det samlede antal rå læsninger (før trimning) svarende til RNA (OMe) 1-6 med protokol TS5 fulgt med reagenser fra TS og NF kits (blå stænger), eller reagenser fra andre leverandører (orange bars). Til sammenligning vises resultaterne fra vores tidligere undersøgelse af grå stænger. Det samlede antal læsninger, der svarer til RNA1-6 (Total RNA) eller RNA-OMe1-6 (totalt RNA-OMe), vises også. Vist er middelværdien af mindst to uafhængige eksperimenter. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. En del af dette tal er blevet ændret fra dard-Dascot et al, 201812Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Sammenligning af miRNA påvisning af protokol TS5 med den klassiske TS-metode. (A). andelen af læsninger, der knytter sig til A. thaliana, B. napus eller H. sapiens Mirnas i mirbase, blev bestemt. Vi har også kortlagt de læser af de menneskelige biblioteker til piRBase for piRNA afsløring. Bemærk, at A. thaliana og B. napus Mirnas, samt menneskelige Pirnas er 2 '-OMe modificeret, i modsætning til human Mirnas. Vist er middelværdien af mindst to uafhængige eksperimenter, og fejllinjerne repræsenterer standardafvigelser. (B). antallet af identificerede Mirnas (eller Pirnas). Vi fastsatte antallet af kendte miRNAs fra de forskellige arter identificeret med protokoller TS eller TS5. Bemærk, at for A. thaliana, B. napus, eller H. sapiens, 427, 92, og 2588 Mirnas er blevet registreret i mirbase, hhv. 500.000 læser fra TS eller TS5 biblioteker blev kortlagt til B. napus Mirnas i mirbase, 1.000.000 læsninger blev knyttet til a. thaliana eller humane databaser. Vist er middelværdien af mindst to uafhængige eksperimenter med standardafvigelser, der repræsenteres af fejllinjer. Dette tal er blevet ændret fra dard-Dascot et al, 201812. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn oligonucleotid | 5 ' ændring | 3 ' ændring | sekvens 5 ' til 3 ' | Rensning | |||||
| 5 ' HD-adapter (TS5) | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNrNrNrN (Bemærk, at dette oligo er en DNA-RNA chimeric; de tre 3 ' Terminal NTS er RNA) | Hplc | ||||||
| 3 ' HD-adapter (TS5) | Fosfat | 3AmMO | [Phos] rNrNrNrNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG [3AaMO] (Bemærk, at dette oligo er en DNA-RNA-chimeric; de fire 5 ' Terminal NTS er RNA) | Hplc | |||||
| 5 ' MRL-adapter (TS7) | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNNNNrArCrGrArUrArC (Bemærk, at dette oligo er en DNA-RNA chimeric; de syv 3 ' Terminal NTS er RNA) | Hplc | ||||||
| 3 ' MRL-adapter (TS7) | phospate | 3AmMO | Phos GTATCGTNNNNNNTGGAATTCTCGG [3AmMO] | Hplc | |||||
| RT primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | Hplc | |||||||
| Universal P5 primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | Hplc | |||||||
| P7-index primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA (NNNNNN = index) | Hplc | |||||||
| indeks 1: CGTGAT | |||||||||
| indeks 2: ACATCG | |||||||||
| indeks 3: GCCTAA | |||||||||
| indeks 4: TGGTCA | |||||||||
| indeks 5: CACTGT | |||||||||
| indeks 6: ATTGGC | |||||||||
| indeks 7: GATCTG | |||||||||
| indeks 8: TCAAGT | |||||||||
| indeks 9: CTGATC | |||||||||
| indeks 10: AAGCTA | |||||||||
| indeks 11: GTAGCC | |||||||||
| indeks 12: TACAAG | |||||||||
Tabel 1. Oligonukleotider, der anvendes med denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lille RNA-bibliotek forberedelse forbliver udfordrende på grund af bias, primært introduceret under adapter ligering trin. RNAs med en 2 '-OMe modifikation på deres 3 ' ende, såsom plante miRNAs, piRNA i insekter, nematoder og pattedyr, og små interfererende RNAs (siRNA) i insekter og planter er særligt vanskeligt at studere, fordi 2 '-OMe modifikation hæmmer 3 ' adapter ligation. En række løsninger er blevet foreslået i litteraturen til at forbedre sRNA bibliotek forberedelse protokoller, men de fleste kommercielt tilgængelige kits er stadig baseret på den klassiske TS-protokollen, som har alvorlige bias. Et par ' low bias ' kits findes dog, herunder NF kit med randomiserede adaptere og pind i ligering reaktioner, og et par kits dukkede for nylig, at undgå adapter ligering helt12. Vi rapporterede tidligere, at NF opdager flere forskellige miRNAs end standard TS-protokollen, men protokollens ' (uden adapter ligation) udført relativt dårligt på grund af en betydelig dannelse af side-produkter12. Overraskende, efter ændring TS protokoller havde en mere følsom påvisning af 2 '-OMe sRNAs end de andre protokoller, men ikke af normale sRNAs. Vi valgte her til at beskrive i detaljer TS5 protokol, hvor adapterne er randomiseret på deres ekstremiteter, PEG bruges i ligations reaktioner og overskydende 3 ' adapter elimineres ved rensning på perler. Det skal her bemærkes, at en anden protokol (TS7), ved hjælp af MRL adaptere kan udføre lidt bedre end TS5 protokollen. Men da der kun er mindre forskelle mellem de to, og fordi med TS7, er det vanskeligere at adskille den ønskede Biblioteks produkt fra adapter dimers, vi foretrak her for at beskrive i detaljer TS5 protokollen. Brugerne kan dog, hvis det ønskes, udskifte TS5-adapterne med TS7 adaptere. Bemærk, at disse er lidt længere fører til et endeligt bibliotek produkt af ~ 170 BP snarere end ~ 150 BP.
Muligheden for at udføre protokol TS5 eller TS7 med "hjemmelavede" materialer gør det muligt at reducere omkostningerne betydeligt. Der kan dog være en større variation med hensyn til kvalitet med hjemmelavede materialer; især hjemmelavet præ-adenyleret 3 ' adapter kan være underlagt variabel kvalitet på grund af varierende virkningsgrader af præ-adenylering. Det anbefales derfor at forberede en stor bestand, og hvis en ny bestand er forberedt, sammenligne sin præstation med den foregående. En Control RNA-prøve kan bruges til dette formål.
En ulempe ved protokollerne beskriver heri er den relativt stærke dannelse af side-produkter og vanskeligheden med at adskille det ønskede bibliotek fra disse produkter. Der skal udvises forsigtighed for ikke at overbelaste acrylamid-gelen til rensning. For nylig blev der udviklet modificerede adaptere, som har en stærkt reduceret tendens til at danne dimerer21. En 2 '-OMe modifikation på 3 ' enden af 5 ' adapter kombineret med en methylfosfonat modifikation på 5 ' ekstremitet af 3 ' adapter effektivt undertrykt adapter dimers. Det vil være interessant at teste sådanne modificerede adaptere i den heri beskrevne protokol.
Gelrensnings trinnene i protokol TS5 er relativt arbejdskraftintensive. Hvis brugen af modificerede adaptere effektivt reducerer dannelsen af adapter dimers, kan gel rensning af det endelige bibliotek ikke længere være nødvendig. Hertil kommer, som et alternativ til gel rensning skridt til at isolere små RNA (trin 1), en strategi ved hjælp af magnetiske perler til at berige for små RNAs eksisterer (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). Vi har ikke brugt denne metode selv, men det er værd at teste, og hvis det fungerer godt det kunne betydeligt forenkle protokollen.
Afslutningsvis, mens protokol TS5 kunne forbedres yderligere, det udfører bedre end kommercielt tilgængelige kits, i det mindste dem, der er testet i vores tidligere sammenlignende analyse, til påvisning af 2 ' OMe sRNA. Det kan følges ved hjælp af hjemmelavede materialer, hvilket giver betydelige omkostningsreduktion. For nemheds skyld, og måske mere konstant ydeevne, kan reagenser fra TS og NF kits anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det nationale center for videnskabelig forskning (CNRS), den franske alternative energier og Atomenergikommissionen (CEA) og Paris-Sud Universitet. Alle Biblioteks forberedelser, Illumina sekvensering og bioinformatik analyser for denne undersøgelse blev udført på I2BC Next-generations sekventering (NGS) facilitet. Medlemmerne af I2BC NGS-faciliteten er anerkendt til kritisk læsning af manuskriptet og nyttige forslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
