Summary
Presentamos un protocolo detallado de reparación de la biblioteca de ARN pequeño con menos sesgo que los métodos estándar y una mayor sensibilidad para los ARN de 2'-O-metil. Este protocolo se puede seguir utilizando reactivos caseros para ahorrar costos o usar kits para mayor comodidad.
Abstract
El estudio de los ARN pequeños (ARN) mediante la secuenciación de próxima generación (NGS) se ve cuestionado por problemas de sesgo durante la preparación de la biblioteca. Varios tipos de ARNS, como los microARN vegetales (miRNAs) llevan una modificación de 2'-O-metil (2'-OMe) en su nucleótido terminal de 3'. Esta modificación añade otra dificultad, ya que inhibe la ligadura del adaptador de 3'. Anteriormente demostramos que las versiones modificadas del protocolo 'TruSeq (TS)' tienen menos sesgo y una mejor detección de ARN 2'-OMe. Aquí describimos en detalle el protocolo 'TS5', que mostró el mejor rendimiento general. TS5 se puede seguir utilizando reactivos caseros o reactivos del kit TS, con el mismo rendimiento.
Introduction
Pequeños ARN (ARN) participan en el control de una diversidad de procesos biológicos1. Los ARNm reguladores eucariotas suelen tener entre 20 y 30 nt de tamaño; los tres tipos principales son los microARN (miRNA), los ARN que interactúan con piwi (piRNA) y los ARN pequeños que interfieren (siRNA). Los niveles de expresión de miRNA aberrante se han implicado en una variedad de enfermedades2. Esto subraya la importancia de los miRNA en la salud y las enfermedades y el requisito de herramientas de investigación precisas y cuantitativas para detectar los ARNNa en general.
La secuenciación de próxima generación (NGS) es un método ampliamente utilizado para estudiar los ARN. Las principales ventajas de NGS en comparación con otros enfoques, como las técnicas cuantitativas de PCR o microarray (qPCR), son que no necesita conocimiento a priori de las secuencias de ARN y, por lo tanto, puede utilizarse para descubrir nuevos ARN, y además sufre menos de señal de fondo y efectos de saturación. Además, puede detectar diferencias de nucleótidos individuales y tiene un mayor rendimiento que los microarrays. Sin embargo, NGS también tiene algunos inconvenientes; el costo de una ejecución de secuenciación sigue siendo relativamente alto y el proceso de varios pasos necesario para convertir una muestra en una biblioteca para la secuenciación puede introducir sesgos. En un proceso típico de preparación de la biblioteca de ARNS, un adaptador de 3' se liga primero al ARNS (a menudo purificado en gel del ARN total) utilizando una versión truncada de la ligada de ARN 2 (RNL2) y un adaptador de 3' preadenilado(Figura 1) en ausencia de ATP. Esto aumenta la eficiencia de la ligadura del adaptador de ARN sRNA y reduce la formación de reacciones secundarias como la circularización del ARNS o la concatemerización. Posteriormente, un adaptador de 5' es ligado por la ligada de ARN 1 (RNL1), seguido de transcripción inversa (RT) y amplificación pcR. Todos estos pasos pueden introducir sesgo3,4. Por consiguiente, es posible que los números de lectura no reflejen los niveles reales de expresión de ARNS reales que conducen a patrones de expresión artificiales dependientes del método. Los ARNEspecíficos específicos pueden estar sobrerrepresentados o subrepresentados en una biblioteca, y los ARNs fuertemente subrepresentados pueden escapar a la detección. La situación es particularmente complicada con miRNAs vegetales, siRNAs en insectos y plantas, y piRNAs en insectos, nematodos y mamíferos, en los que el nucleótido terminal de 3' tiene una modificación de 2'-O-metil (2'-OMe)1. Esta modificación inhibe fuertemente la ligadura del adaptadorde 3',haciendo que la preparación de la biblioteca para estos tipos de ARN sea una tarea difícil.
Trabajos anteriores demostraron que la ligadura del adaptador introduce un sesgo grave, debido a los efectos de secuencia/estructura de ARN6,7,8,9,10,11. Los pasos aguas abajo de la ligadura del adaptador, como la transcripción inversa y la PCR, no contribuyen significativamente al sesgo6,11,12. Es probable que el sesgo de ligadura se deba al hecho de que las moléculas adaptadoras con una secuencia determinada interactuarán con moléculas de ARNS en la mezcla de reacción para formar pliegues, que pueden conducir a configuraciones favorables o desfavorables para la ligadura(Figura 2). Los datos de Sorefan et al7 sugieren que RNL1 prefiere un solo contexto trenzado, mientras que RNL2 prefiere una doble hebra para la ligadura. El hecho de que las estructuras de plegado conjunto del adaptador/sRNA estén determinadas por las secuencias específicas de adaptador y sRNA explica por qué el ARNS específico está sobrerrepresentado o subrepresentado con un conjunto de adaptadores determinado. También es importante tener en cuenta que dentro de una serie de bibliotecas de SRNA que se van a comparar, se deben utilizar las mismas secuencias de adaptador. De hecho, se ha observado anteriormente que el cambio de adaptadores mediante la introducción de diferentes secuencias de códigos de barras altera los perfiles de miRNA en las bibliotecas de secuenciación9,13.
La aleatorización de secuencias de adaptadores cerca de la unión de ligación probablemente reduce estos sesgos. Sorefan y sus colegas7 utilizaron adaptadores con 4 nucleótidos aleatorios en sus extremidades, designaron adaptadores de "alta definición" (HD) y demostraron que el uso de estos adaptadores conduce a bibliotecas que reflejan mejor los verdaderos niveles de expresión de ARNS. Trabajos más recientes confirmaron estas observaciones y revelaron que la región aleatorizada no necesita ser adyacente a la unión de ligación11. Este novedoso tipo de adaptadores se llamaba "MidRand" adaptadores. Juntos, estos resultados demuestran que el diseño mejorado del adaptador puede reducir el sesgo.
En lugar de modificar los adaptadores, el sesgo se puede suprimir mediante la optimización de las condiciones de reacción. Se ha demostrado que el polietilenglicol (PEG), un agente de aglomeración macromolecular conocido por aumentar la eficiencia de la ligadura14,reduce significativamente el sesgo15,16. Sobre la base de estos resultados, varios kits de "bajo sesgo" aparecieron en el mercado. Estos incluyen kits que utilizan PEG en las reacciones de ligadura, ya sea en combinación con adaptadores clásicos o adaptadores HD. Otros kits evitan la ligadura por completo, y utilizar 3' poliadenilación y cambio de plantilla para 3' y 5' adición de adaptador, respectivamente12. En otra estrategia, la ligadura del adaptador de 3' es seguida por un paso de circularización, omitiendo así 5' ligadura del adaptador17.
En un estudio anterior, buscamos un protocolo de preparación de la biblioteca de ARNS con los niveles más bajos posibles de sesgo y la mejor detección de los ARN 2'-OMe12. Probamos algunos de los kits de "sesgo bajo" antes mencionados, que tenían una mejor detección de los ARN 2'-OMe que el protocolo estándar (TS). Sorprendentemente, sin embargo, tras la modificación (el uso de adaptadores aleatorios, PEG en las reacciones de ligación y la eliminación del exceso de adaptador de 3' por purificación) este último superó a los otros protocolos para la detección de RNA 2'-OMe. Aquí, describimos en detalle un protocolo basado en el protocolo TS, 'TS5', que tenía la mejor detección general de 2'-OMe RNAs. El protocolo se puede seguir utilizando reactivos del kit TS y un reactivo del kit 'Nf' o, para ahorrar dinero, utilizando reactivos caseros, con el mismo rendimiento. También proporcionamos un protocolo detallado para la purificación de ARN SRNA a partir del ARN total y la preparación del adaptador preadenilado de 3'.
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Protocol
1. Aislamiento de pequeños ARN
- Extraiga el ARN total utilizando reactivos a base de fenol o cualquier otro método. Verifique si el ARN es de buena calidad.
- Pre-ejecutar un gel tBE-urea 15% (ver Tabla de Materiales)durante 15 min a 200 V.
- Mientras el gel está pre-funcionando, mezcle 5-20 g de ARN total en un volumen de 5-15 l con un volumen igual de tinte de carga de formamida (ver Tabla de Materiales;Formamida 95% desionizada, 0.025% de azul bromofenol, 0.025% de cianoleo de xileno, 5 mM EDTA pH 8) en un tubo de PCR de 200 Ol. Del mismo modo, mezcle 10 l (200 ng) de escalera de ARN pequeño (ver Tabla de materiales)con un volumen igual de tinte de carga de formamida. Incubar durante 5 min a 65 oC en un termociclador con tapa calentada, luego colocar los tubos inmediatamente sobre hielo.
- Cargue la escalera y la muestra en el mismo gel con al menos un carril entre ellos y corra a 200 V hasta que el azul bromofenol (azul oscuro) haya migrado alrededor de dos tercios de la longitud del gel (aproximadamente 40 min).
- Prepare un sistema para eluir el ARN del gel de la siguiente manera: perfore la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml sin nucleasa con una aguja de calibre 21. Coloque el tubo perforado de 0,5 ml en un tubo de microcentrífuga de fondo redondo sin nucleasa de 2 ml.
- Retirar el gel e incubar a temperatura ambiente con una mancha de gel de ácido nucleico de 3 l (10.000 x concentrado; ver Tabla de materiales)en agua de 30 ml durante 10-15 min.
- Vea el gel en un iluminador trans 'Dark Reader' (se recomienda encarecidamente evitar los rayos UV, ya que esto podría dañar el ARN) y cortar el ARN de la muestra entre las bandas de escalera de 17 nt y 29 nt. Transfiera la pieza de gel al tubo de 0,5 ml desde el paso 1.5.
- Centrifugar el tubo de 0,5 ml en el tubo de 2 ml en una microcentrífuga a velocidad máxima durante 2 minutos. Retire el tubo de 0,5 ml, que debería estar vacío ahora.
- Añadir 300 ml de naCl sin nucleasas 0,3 M al tubo de 2 ml que contiene el gel triturado y rotar durante al menos 2 h a temperatura ambiente o a 4 oC durante la noche (16 h).
- Transfiera la suspensión de las piezas de gel trituradas a una columna de centrifugado (ver Tabla de Materiales)y centrífuga durante 2 minutos a la velocidad máxima en una microcentrrípica.
- Añadir 1 l (20 g/l) de glucógeno (ver Tabla de materiales)y 950 ml de etanol a temperatura ambiente 100%. Incubar durante al menos 30 min a -80oC.
- Centrífuga durante 20 minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga a 4oC. Retire el sobrenadante, lave el pellet con 800 ml de etanol frío al 80 %. Centrifugar de nuevo durante 5 min a 4oC, y retirar cuidadosamente todo el sobrenadante. Resuspenda el gránulo de ARN en 15 ml de agua libre de nucleasas. Por lo general, se deben recuperar 5-20 ng de ARN pequeño, dependiendo de la cantidad de ARN total de entrada (1 ng de ARN pequeño por 1 g de ARN total de entrada).
- Paso adicional recomendado: Compruebe la cantidad y la calidad del ARNS recuperado (por ejemplo, mediante electroforesis de gel capilar utilizando un pequeño kit de ARN; véase Tabla de materiales).
2. Preparación del adaptador HD preadenilado de 3'
NOTA: La preadenilación del adaptador HD de 3' se hizo de una manera similar al protocolo descrito por Chen et al18. Tenga en cuenta que el adaptador preadenilado se puede pedir directamente (/5rApp/ modificación), pero esto es bastante caro.
- Pedido 5' fosforilado, 3' bloqueado 3' hd adaptador oligonucleótido. Consulte la Tabla 1 para ver la secuencia y las modificaciones. Tenga en cuenta que '3AmMO' es un grupo modificador de amino 3', la mayoría de los proveedores pueden producir oligonucleótidos con esta modificación. Diluir en agua libre de nucleasas a 100 m.
- Establecer una reacción de 100 l que contenga los siguientes reactivos: 10 ml de oligo (100 oM), 10 ml de tampón de ligasa de ARN T4 (10x), 10 ml de ATP (10 ml), 40 ml de 50% de PEG8000, 5 ml de l de l de anerbosa de ARN T4 1 (50 unidades), 25 ml de agua libre de nucleasas. Incubar durante la noche a 20oC.
- Realizar una extracción clásica de fenol-cloroformo del oligonucleótido preadenilado seguido de precipitación de etanol. Añadir 100 l de ácido (pH 4.5) fenol:cloroformo y vórtice. Girar durante 5 minutos a temperatura ambiente, velocidad máxima. Transfiera cuidadosamente 90 l de la fase superior a un tubo nuevo; Añadir 10 ml de acetato de sodio pH de 3 M 5,2, 1 l de glucógeno ultrapuro y 250 ml de etanol en frío 100%.
- Mantener a -20 oC durante al menos 30 minutos centrífuga durante 30 min a una velocidad máxima de 4 oC. Retire el sobrenadante, lave el pellet una vez con 500 éL frío 80% etanol. Como alternativa a la extracción de fenol-cloroformo y la precipitación de etanol, se puede utilizar un kit de eliminación de nucleótidos (ver Tabla de Materiales). Resuspender en agua de 25 l.
- Mida la concentración del adaptador utilizando un kit para la detección específica de ADN de una sola cadena (ver Tabla de Materiales). Diluir hasta 80 ng/L (10 m).
- Paso adicional recomendado: Verificar la eficacia de la preadenilación migrando 1 l de adaptador de 10 m en un gel de 15% de TBE-urea(Tabla de materiales)junto con oligonucleótido no tratado. El adaptador preadenilado debe migrar ligeramente más lento que el oligonucleótido no tratado. Si lo desea, el adaptador preadenilado puede ser purificado en gel; proceder como se describió anteriormente (pasos 1.2-1.12).
3. Preparación de la biblioteca - Protocolo TS5
NOTA: Presentamos aquí el protocolo TS modificado 'TS5' que describimos anteriormente12 y que se puede realizar con reactivos del kit o con reactivos autoproporcionados. Cabe señalar que obtuvimos resultados similares o incluso ligeramente mejores con un protocolo diferente, 'TS7'. Sin embargo, con TS7 es más difícil eliminar los atenuadores del adaptador. Por lo tanto, hemos preferido describir TS5 en detalle, pero TS7 puede ser seguido simplemente reemplazando los adaptadores. Para TS7, utilice las secuencias de adaptador 'MidRand-Like (MRL)'(Tabla 1). Tenga en cuenta que aquí las regiones aleatorias están en el medio de los adaptadores. Los imprimadores para transcripción inversa y PCR se hibridarán a las secuencias aguas abajo de la región aleatoria en el adaptador de 3' y aguas arriba de la región aleatoria en el adaptador de 5'. La secuenciación comenzará desde el primer nucleótido aleatorio en el adaptador de 5'.
- 3' ligadura del adaptador.
- Combinar 1 l de adaptador HD preadenilado de 3' (10 m) con 1 ml de ARN pequeño purificado (0,1-1 m) en un tubo de microcentrífuga de 0,2 ml. Incubar durante 2 min a 72 oC en un termociclador, luego poner directamente sobre hielo.
- Añadir 4 ml de 50 % de PEG 8000 (solución viscosa; pipeteo lentamente), 1 l de tampón de la ligasa de ARN (10x), 1 l de H2O, 1 l de l de arn ligóleo T4 truncado y 1 l de inhibidor de la rnasa. Incubar durante la noche a 16oC.
- Eliminación del adaptador de 3' sin parar
- Añadir 10 l de agua libre de nucleasas y mezclar bien. Añadir 6 l de 3 M NaOAc pH 5.2 o 'Adapter Depletion Solution' desde el kit Nf(Tabla de materiales)y mezclar bien. Añadir 40 s de perlas de purificación magnética(Tabla de Materiales)y 60 l de isopropanol y mezclar bien. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Coloque la muestra en un bastidor magnético hasta que la solución parezca clara. Retire y deseche el sobrenadante.
- Añadir 180 ml de etanol al 80 % recién preparado. Incubar durante 30 s y, a continuación, retirar. Tenga cuidado de usar etanol 80% recién preparado y no incubar con 80% de etanol durante períodos prolongados.
- Gire brevemente el tubo y retire el líquido residual que pueda haberse acumulado en la parte inferior del pozo. Deje secar las perlas durante 2 min, luego resuspenda en 22 ml de 10 mM Tris pH 8 o tampón de resuspensión del kit Nf. Incubar durante 2 min, luego magnetizar la muestra hasta que la solución parezca clara.
- Añadir 6 l de 3 M NaOAc pH 5.2 o 'Adapter Depletion Solution' desde el kit Nf(Tabla de materiales)a un nuevo tubo. Transfiera 20 l del sobrenadante del paso anterior a este nuevo tubo y mezcle mediante pipeteo. Añadir 40 l de perlas magnéticas y 60 l de isopropanol 100% y mezclar bien mediante pipeteo. Incubar durante 5 min.
- Magnetizar la muestra hasta que la solución parezca transparente, luego retirar y desechar el sobrenadante.
- Añadir 180 ml de etanol al 80 % recién preparado. Incubar durante 30 s y, a continuación, retirar. Take cuidado de usar etanol recién preparado 80% y no incubar con 80% etanol durante períodos prolongados.
- Gire brevemente el tubo y retire el líquido residual que pueda haberse acumulado en la parte inferior del pozo. Deje que las perlas se sequen durante 2 minutos y resuspendan en 10 ml de agua libre de nucleasas. Incubar durante 2 min, luego magnetizar la muestra hasta que la solución parezca clara.
- Transfiera 9 l de sobrenadante a un tubo nuevo. Añadir 1 l de tampón de ligasa de ARN T4 (10x) y 1 l de agua. Alternativamente, agregue 2 l de tampón de ligasa desde el kit de TS.
- Adaptador de ligadura de 5'.
- Añadir 1 l de adaptador HD de 5' (10 m; Tabla 1) a un tubo PCR de 200 l en un termociclador con tapa calentada. Incubar durante 2 min a 70 oC, luego poner el tubo directamente sobre hielo.
- Añadir 1 l de 10 mM de ATP y 1 l de la ligasa de ARN T4 1. Mezcle bien pipeteando suavemente. Añadir 3 l de esta mezcla al ARN ligado de 3' del paso 3.2.9 y mezclar mediante pipeteo. Incubar durante 1 h a 28oC.
- Transcripción inversa (RT)
- Transfiera el ARN ligado del adaptador de 6' y 5' a un nuevo tubo pcR de 200 ml (mantenga el tubo de PCR restante de 8 oC a -80 oC para su uso posterior si es necesario). Añadir 1 l de imprimación RT (10 m; Tabla 1) y mezclar mediante pipeteo. Incubar durante 2 min a 70 oC, luego poner el tubo directamente sobre hielo.
- Añadir los siguientes reactivos para RT: 2 l de tampón de primera hebra de 5x, 0,5 ml de mezcla dNTP de 12,5 mM, 1 l de TDT de 100 mM, 1 l de inhibidor de la rnalosa y 1 l de transcriptasa inversa(tabla de materiales). Incubar durante 1 h a 50oC.
- Amplificación de PCR
- Añadir los siguientes reactivos a la mezcla de reacción RT de 12,5 l: 10 ml de tampón de polimerasa de PCR, 2 ml de imprimación P5 universal (10 oM; Tabla 1), 2 l de imprimación de índice P7 (10 m; Tabla 1), 1 l de dNTPs de 12,5 mM, 0,5 ml de ADN polimerasa(Tabla de materiales)y 22 ml de agua. Mantenga la reacción en hielo hasta su uso.
- Ejecutar el siguiente programa de PCR: 98 oC para 30 s, 11 ciclos (98 oC para 10 s, 60 oC para 30 s y 72 oC durante 15 s) y 72 oC durante 10 min. Mantener la reacción a 4 oC cuando haya terminado.
NOTA: En cuanto al número de ciclos de PCR: normalmente realizamos 11 ciclos, pero esto debe ser optimizado por el usuario. Intente realizar el menor número posible de ciclos pcR.
- Purificación de gel
- Ejecutar 5, 10 y 20 l de producto PCR en un gel TBE nativo del 6% (ver Tabla de Materiales)junto con una escalera adecuada (ver Tabla de Materiales). Ejecutar el gel durante aproximadamente 1 h a 145 V (hasta que el azul de bromofenol llegue a la parte inferior; este tinte migra en la posición de 65 bp).
- Retire el gel e incubar con mancha de gel de ácido nucleico (ver Tabla de Materiales)en agua durante 10-15 min.
- Ver el gel en un iluminador trans "Dark Reader" (se recomienda encarecidamente evitar los rayos UV, ya que esto podría dañar el ARN) y cortar la banda de la biblioteca a 150 bp. Preparar un sistema para eluir el ARN del gel como se describe en el paso 1.5 y transferir la pieza de gel al tubo de 0,5 ml.
- Centrífuga en una microcentrífuga a velocidad máxima durante 2 min. Retire el tubo de 0,5 ml, que debería estar vacío ahora.
- Añadir 300 ml de agua libre de nucleasas al tubo de 2 ml que contiene el gel triturado y rotar durante al menos 2 h a temperatura ambiente o a 4 oC durante la noche.
- Transfiera la suspensión de las piezas de gel trituradas en agua a una columna de centrifugar y centrífuga durante 2 minutos a la velocidad máxima.
- Añadir 1 l de glucógeno (20 g/L), 30 ml de 3 M de NaOAc y 975 ml de etanol 100% frío en frío. Centrífuga durante 20 min a velocidad máxima a 4oC.
- Resuspenda el pellet en 20 s de 10 mM Tris pH8. Utilice 1 l para la medición de la concentración y 1 l para el control de calidad.
4. Análisis de datos
NOTA: El procedimiento de análisis de datos descrito a continuación se basa en el sistema operativo Linux Ubuntu 16.04 LTS.
- Tratamiento de archivos de secuencia sin procesar
- Descargue los archivos de secuencia FASTQ generados durante la ejecución de secuenciación. Si es necesario, realice la desmultiplexación con bcl2fastq2 (versión V2.2.18.12; se puede descargar un manual desde el siguiente enlace: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
Utilice el siguiente comando:
nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatches 1 --aggregated-tiles AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16 - Quite las secuencias del adaptador mediante Cutadapt19 versión 1.15. Puede descargar un manual aquí: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
Utilice el siguiente comando:
Pathway_to_cutadapt/ cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz
Tenga en cuenta que la secuencia en el comando corresponde al adaptador HD de 3' sin los 4 nucleótidos aleatorios; por lo tanto, no se eliminarán durante este paso. - Utilice seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) para la eliminación de los nucleótidos aleatorios terminales en las lecturas de secuenciación. Utilice el siguiente comando (nombres variables en negrita):
seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt .fastq > Output_File_Read1 _trimmed .fastq - Utilice el siguiente comando awk para descartar las secuencias más cortas que 10 nt:
awk 'BEGIN 'FS' ''t' ; OFS á "'n'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
- Descargue los archivos de secuencia FASTQ generados durante la ejecución de secuenciación. Si es necesario, realice la desmultiplexación con bcl2fastq2 (versión V2.2.18.12; se puede descargar un manual desde el siguiente enlace: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
- Mapeo de las secuencias recortadas
- Descargue la base de datos correspondiente al organismo de estudio de miRBase de la siguiente manera. Vaya a http://www.mirbase.org/ftp.shtml y descargue el archivo 'mature.fa'. Tenga en cuenta que las secuencias se indican en notación de ARN. Sustituya los residuos U por T por el siguiente comando:
sed -i '/'>/! s/U/T/g' mature.fa
NOTA: Esto producirá una lista completa de todos los miRNAs en miRBase, que provienen de una variedad de organismos. - Seleccione las secuencias de miRNA de su organismo de interés con el siguiente comando:
awk 'name_of_the_organismá print; nr[NR+1]; siguiente; NR en nr' mature.fa > mature_name_of_the_organism_mirs.fa - Asigne las lecturas al archivo creado anteriormente utilizando Bowtie220 (versión 2.3.0) sin discrepancias. En primer lugar, cree un índice para el archivo con el siguiente comando:
bowtie2-build mature_name_of_the_organism_mirs.fa mature_name_of_the_organism_mirs - Alinee las lecturas de secuenciación con la base de datos, requiriendo que una lectura se asigne por completo a un miRNA de la base de datos, sin discrepancias. Para ello, utilice la siguiente herramienta:
bowtie2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -x mature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam
NOTA: La opción: --score-min C,0,0 garantiza que la alineación no tenga discrepancias. Para una explicación de los diversos parámetros en la herramienta, por favor visite el siguiente sitio web: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - Para descartar las lecturas que no se alinearon, utilice el siguiente comando:
vista samtools -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs .sams.sam
NOTA: Como resultado de estos pasos, ahora debería haber obtenido las lecturas alineadas, correspondientes a los miRNAs.
- Descargue la base de datos correspondiente al organismo de estudio de miRBase de la siguiente manera. Vaya a http://www.mirbase.org/ftp.shtml y descargue el archivo 'mature.fa'. Tenga en cuenta que las secuencias se indican en notación de ARN. Sustituya los residuos U por T por el siguiente comando:
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Representative Results
Los pasos críticos son el aislamiento de la pequeña fracción de ARN del material de ARN total inicial(Figura 3) y el producto de biblioteca final deseado (Figura 4). Ambos pasos implican la purificación del gel de poliacrilamida; ARN pequeño se aísla del 15% de geles de urea TBE, mientras que las bibliotecas finales están aisladas de geles TBE nativos al 6%. ARN pequeño aislado de gel se puede analizar en un pequeño chip de electroforesis capilar de ARN(Tabla de materiales; Figura 3 B). Esto permitirá a los usuarios estimar la cantidad de ARN pequeño recuperado y la proporción de miRNA en la preparación.
La purificación en gel del producto final de la biblioteca es un paso delicado, ya que se forman una serie de productos adicionales que migran cerca de la biblioteca deseada. Es importante no sobrecargar el gel, ya que esto aumentará el riesgo de contaminar la biblioteca con otras especies como los dimers adaptadores. Como ejemplo(Figura 4), se cargaron cantidades crecientes de biblioteca amplificada por PCR (a partir del ARN B. napus) en el gel y se recortó el producto correspondiente al tamaño esperado (150 bp)(Figura 4A). Después de la elución, la biblioteca purificada se comprobó en un chip de electroforesis de gel capilar; además del producto esperado de 150 bp, se observó una proporción cada vez mayor de una especie de 130 bp, correspondiente a los dimers de adaptador, ya que se cargaron cantidades crecientes de producto PCR(Figura 4B,C).
Hemos probado si el protocolo TS5 funciona de forma similar con reactivos caseros como con el reactivo de los kits. Para ello, preparamos bibliotecas a partir de una mezcla de ARN pequeños sintéticos 1-6, cada uno presente sin o con una modificación de 2'-OMe, como se hizo en nuestro estudio anterior12. La Figura 5 muestra la proporción de lecturas correspondientes a cada uno de estos ARN obtenidos anteriormente y con las nuevas bibliotecas realizadas con reactivos de los kits TS y Nf o de otros proveedores. Como se puede ver, se obtuvieron resultados muy similares.
La Figura 6 muestra una comparación del rendimiento del protocolo TS5 con el protocolo TS estándar para la detección de miRNAs de plantas (A. thaliana y B. napus), que son 2'-OMe modificados, y de miRNAs humanos no modificados. También probamos la detección de piRNAs, 2'-OMe modificados en muestras humanas. Como se puede ver, TS5 funciona significativamente mejor que TS para la detección de ARN 2'-OMe pero no para ARN sin modificar. Sin embargo, también para los ARNm no modificados, aunque no se detecte un mayor número de ARN, los números de lectura obtenidos probablemente reflejen mejor los niveles de expresión verdaderos con TS5 que con TS debido a niveles más bajos de sesgo.
Figura 1 . Representación esquemática del flujo de trabajo de preparación de la biblioteca sRNA para la secuenciación de Illumina. En primer lugar, los ARNS se aíslan mediante un paso de purificación de gel. Aquí, se indica el rango de tamaño de los miRNAs, pero cualquier otro rango de tamaño podría ser seleccionado, dependiendo de los ARN de interés. A continuación, se realiza un paso de control de calidad (QC) para comprobar la calidad y la cantidad de ARNS aislados. Durante la preparación de la biblioteca, un adaptador preadenylado (App) 3' se liga primero al SRNA. A continuación, se liga un adaptador de 5'. Posteriormente, la transcripción inversa se realiza utilizando una imprimación complementaria al adaptador de 3', seguida de la amplificación de PCR, durante la cual se añaden las secuencias Illumina P5, P7 e index ('In'). La biblioteca resultante es gel purificado, seguido de un paso de control de calidad. A continuación, se secuencia la biblioteca y se analizan los datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Sesgo debido al co-plegado de adaptador-sRNA dependiente de la secuencia. En la mezcla de ligadura del adaptador, los adaptadores se copiarán con los ARN De una manera que dependa de la secuencia del adaptador y del sRNA. Por lo tanto, diferentes sRNAs (ilustrados por ejemplos a, b, y c; indicados por diferentes tonos de verde) se coppirán de manera diferente con un adaptador dado (el adaptador de 3' se indica en rojo, el adaptador de 5' se indica en azul). Las flechas negras indican cruces de ligadura. Esto puede conducir a un contexto favorable o desfavorable para la ligadura. Como RNL2 parece preferir un entorno de doble trenzado, se espera que la ligadura de 3' sea más eficiente para los ARN a y b que para el ARN c. Dado que RNL1 tiene una preferencia por una sola región trenzada alrededor de la unión de ligadura, la ligadura del adaptador de 5' puede ser más eficiente para el ARN a, seguido de b y menos eficiente para c. Juntos esto puede dar lugar a una sobrerrepresentación de ARN a, un intermedio representación del ARN b y una subrepresentación del ARN c en la biblioteca final, incluso si los tres ARN están presentes en cantidades iguales en la muestra original de ARN. Tenga en cuenta que de una manera similar, un sRNA dado se representará de manera diferente al cambiar la secuencia del adaptador (por ejemplo, mediante la adición de diferentes códigos de barras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Aislamiento de ARN pequeño y control de calidad. (A). Separación electroforética del ARN total de Brassica napus (10 g) en un gel de poliacrilamida desnaturalizante de urea TBE al 15%. Una pequeña escalera de ARN (ver Tabla de Materiales) fue migrado a lo largo como un marcador de tamaño molecular. Después de la migración el gel se tiñó y el ARN fue visualizado en un iluminador trans. La región de 17 a 29 nucleótidos fue cortada (indicada por un rectángulo rojo) y el ARN fue eluida. (B). La calidad del ARN purificado fue comprobada por electroforesis de gel capilar. Tenga en cuenta que este análisis proporciona información sobre la proporción de miRNA en la muestra (93% en este caso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Purificación en gel de una biblioteca de ARN pequeño B. napus preparada siguiendo el protocolo TS5 y control de calidad. (A). Cada vez más cantidades de una biblioteca amplificada de PCR a partir de ARN pequeño B. napus se cargaron en un gel TBE nativo del 6%; 2,5 l (a), 5 l (b), 10 l (c) o 20 l (d) producto PCR. Una escalera de 50 bp fue migrado junto. Los productos de PCR que migraban a la posición esperada de 150 pb fueron aislados (rectángulo rojo), el ADN fue eludado y purificado. (B). Control de calidad de la biblioteca purificada; representación de gel. (C). Representación electroferogra del mismo análisis. Como se puede ver, el producto 150 pb está cada vez más contaminado con dimers de adaptador (130 bp) a medida que se migran grandes cantidades de producto PCR en gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . El protocolo TS5 funciona de forma similar con los reactivos de los kits TS y Nf o con reactivos de otros proveedores. Histogramas que representan el porcentaje del número total de lecturas en bruto (antes de recortar) correspondientes a RNA(OMe)1-6 con el protocolo TS5 seguido con reactivos de los kits TS y Nf (barras azules), o reactivos de otros proveedores (barras naranjas). Para la comparación, los resultados de nuestro estudio anterior se muestran con barras grises. También se muestran los números totales de lecturas correspondientes a RNA1-6(ARN total)o RNA-OMe1-6(ARN-OMe total). Se muestran los valores medios de al menos dos experimentos independientes. Las barras de error representan desviaciones estándar. Parte de esta figura ha sido modificada de Dard-Dascot et al, 201812Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 6 . Comparación de la detección de miRNA del protocolo TS5 con el método TS clásico. (A). Se determinó la proporción de lecturas que se asignaron a A. thaliana, B. napus o H. sapiens miRNAs en miRBase. También mapeamos las lecturas de las bibliotecas humanas a piRBase para la detección de piRNA. Tenga en cuenta que A.thaliana y B.napus miRNAs, así como piRNAs humanos son 2'-OMe modificados, en contraste con los miRNAs humanos. Se muestran los valores medios de al menos dos experimentos independientes y las barras de error representan desviaciones estándar. (B). Números de miRNAs (o piRNAs) identificados. Determinamos el número de miRNAs conocidos de las diferentes especies identificadas con los protocolos TS o TS5. Tenga en cuenta que para A. thaliana, B. napus, o H. sapiens, 427, 92 y 2588 miRNAs se han registrado en miRBase, respectivamente. 0,5 millones de lecturas de las bibliotecas TS o TS5 se asignaron a B. napus miRNAs en miRbase, 1 millón de lecturas fueron mapeadas a las bases de datos A. thaliana o humanas. Se muestran los valores medios de al menos dos experimentos independientes con desviaciones estándar representadas por barras de error. Esta cifra ha sido modificada de Dard-Dascot et al, 201812. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre oligonucleótido | 5' modificación | 3' modificación | secuencia de 5' a 3' | Purificación | |||||
| Adaptador HD (TS5) de 5' | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACACCCCCCGATCNrNrNNN (tenga en cuenta que este oligo es un quimérico DE ARN de ADN; los tres ntes terminales de 3' son ARN) | Hplc | ||||||
| 3' Adaptador HD (TS5) | Fosfato | 3AmMO | [Phos]rNrNrNrNTGGAATTCGGGAGCAAGG[3AaMO] (tenga en cuenta que este oligo es un quimérico DE ARN de ADN; los cuatro ntes terminales de 5' son ARN) | Hplc | |||||
| 5' Adaptador MRL (TS7) | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACACCCCGACGATCNNNNrArCrGrArUrArC (tenga en cuenta que este oligo es un quimérico DE ARN DE ADN; los siete ntes terminales de 3' son ARN) | Hplc | ||||||
| 3' Adaptador MRL (TS7) | fospato | 3AmMO | [Phos] GTATCGTNNNNNNTGGAATTCGG[3AmMO] | Hplc | |||||
| Imprimación RT | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | Hplc | |||||||
| Imprimación universal P5 | AATGATACGGCGACCACCATAPATCACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | Hplc | |||||||
| Imprimación de índice P7 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNGtGGACTAGTAGTTCCTTGGCACCCAATTCCA (NNNNNNN - índice) | Hplc | |||||||
| índice 1: CGTGAT | |||||||||
| índice 2: ACATCG | |||||||||
| índice 3: GCCTAA | |||||||||
| índice 4: TGGTCA | |||||||||
| índice 5: CACTGT | |||||||||
| índice 6: ATTGGC | |||||||||
| índice 7: GATCTG | |||||||||
| índice 8: TCAAGT | |||||||||
| índice 9: CTGATC | |||||||||
| índice 10: AAGCTA | |||||||||
| índice 11: GTAGCC | |||||||||
| índice 12: TACAAG | |||||||||
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados con este protocolo.
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Discussion
La preparación de la biblioteca de ARN pequeño sigue siendo difícil debido al sesgo, introducido principalmente durante los pasos de ligadura del adaptador. Los ARN con una modificación de 2'-OMe en sus 3' extremos como miRNAs vegetales, piRNA en insectos, nematodos y mamíferos, y pequeños ARN que interfieren (siRNA) en insectos y plantas son particularmente difíciles de estudiar porque la modificación 2'-OMe inhibe la ligadura adaptadora de 3'. En la literatura se han propuesto una serie de soluciones para mejorar los protocolos de preparación de bibliotecas de ARNS, pero la mayoría de los kits disponibles comercialmente todavía se basan en el protocolo TS clásico, que tiene un sesgo severo. Sin embargo, existen algunos kits de "sesgo bajo", incluyendo el kit Nf con adaptadores aleatorios y PEG en las reacciones de ligadura, y aparecieron algunos kits recientemente que evitan la ligadura del adaptador por completo12. Hemos informado anteriormente que Nf detecta más miRNAs diferentes que el protocolo TS estándar, pero el protocolo 'S' (sin ligadura de adaptador) se desempeñó relativamente mal debido a una formación significativa de productos secundarios12. Sorprendentemente, tras la modificación, los protocolos TS tenían una detección más sensible de los ARNm de 2'-OMe que los otros protocolos, pero no de los SRNA normales. Elegimos aquí para describir en detalle el protocolo TS5, en el que los adaptadores se aleatorizan en sus extremidades, PEG se utiliza en las reacciones de ligación y el exceso de adaptador de 3' se elimina mediante la purificación en perlas. Debe tenerse en cuenta aquí que un protocolo diferente (TS7), utilizando adaptadores MRL puede funcionar ligeramente mejor que el protocolo TS5. Sin embargo, como sólo hay pequeñas diferencias entre los dos y porque con TS7, es más difícil separar el producto de biblioteca deseado de los dimers del adaptador, preferimos aquí describir en detalle el protocolo TS5. Sin embargo, los usuarios pueden, si lo desean, reemplazar los adaptadores TS5 por adaptadores TS7. Tenga en cuenta que estos son ligeramente más largos que conducen a un producto de biblioteca final de 170 bp en lugar de 150 bp.
La posibilidad de realizar el protocolo TS5 o TS7 con materiales "hechos en casa" permite reducir sustancialmente los costos. Sin embargo, puede haber una mayor variabilidad en términos de calidad con materiales caseros; especialmente el adaptador de 3' preadenilado casero puede estar sujeto a una calidad variable debido a las diferentes eficacias de la preadenilación. Por lo tanto, se recomienda preparar un stock grande y, si se prepara un nuevo stock, comparar su rendimiento con el anterior. Para ello se puede utilizar una muestra de ARN de control.
Una desventaja de los protocolos aquí describen es la formación relativamente fuerte de productos secundarios y la dificultad para separar la biblioteca deseada de estos productos. Se debe tener cuidado de no sobrecargar el gel de acrilamida para su purificación. Recientemente, se desarrollaron adaptadores modificados que tienen una tendencia muy reducida a formar dimers21. Una modificación de 2'-OMe en el extremo de 3' del adaptador de 5' combinada con una modificación de metilfosfonato en la extremidad de 5' del adaptador de 3' suprimido eficientemente los dimers del adaptador. Será interesante probar estos adaptadores modificados en el protocolo aquí descrito.
Los pasos de purificación de gel en el protocolo TS5 son relativamente laboriosos. Si el uso de adaptadores modificados reduce eficientemente la formación de atenuadores de adaptadores, la purificación en gel de la biblioteca final puede no ser más necesaria. Además, como alternativa al paso de purificación de gel para aislar el ARN pequeño (paso 1), existe una estrategia que utiliza cuentas magnéticas para enriquecer para ARN pequeños (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). No hemos utilizado este método nosotros mismos, pero vale la pena probarlo y si funciona bien podría simplificar significativamente el protocolo.
En conclusión, si bien el protocolo TS5 podría mejorarse aún más, funciona mejor que los kits disponibles comercialmente, al menos los probados en nuestro análisis comparativo anterior, para la detección de arnar 2'OMe. Se puede seguir utilizando materiales caseros, lo que permite una reducción significativa de los costos. Para mayor comodidad, y tal vez un rendimiento más constante, se pueden utilizar reactivos de los kits TS y Nf.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNRS), la Comisión Francesa de Energías Alternativas y Energía Atómica (CEA) y la Universidad de París-Sud. Toda la preparación de la biblioteca, la secuenciación de Illumina y los análisis bioinformáticos para este estudio se realizaron en las instalaciones de secuenciación de próxima generación (NGS) de I2BC. Los miembros de las instalaciones de I2BC NGS son reconocidos por la lectura crítica del manuscrito y sugerencias útiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
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