Summary
我々は、標準的な方法よりもバイアスが少ない詳細な小さなRNAライブラリー修復プロトコルと2'-O-メチルRNAの感度の増加を提示する。このプロトコルは、コストを節約するために自家製試薬を使用するか、便宜上キットを使用して従うことができます。
Abstract
次世代シーケンシング(NGS)による小型RNA(sRNA)の研究は、図書館準備中のバイアス問題に挑戦しています。植物マイクロRNA(miRNA)のようないくつかのタイプのsRNAは、3'末端ヌクレオチドで2'-O-メチル(2'-OMe)修飾を運ぶ。この変更は、3' アダプターのライゲーションを阻害するので、別の難しさを追加します。以前に、'TruSeq(TS)プロトコルの変更バージョンはバイアスが少なく、2'-OMe RNAの検出が改善されたことを実証しました。ここでは、最高の全体的なパフォーマンスを示したプロトコル'TS5'を詳細に説明します。TS5は、同等の性能を持つTSキットの自家製試薬または試薬を使用して従うことができます。
Introduction
小さなRNA(sRNA)は、生物学的プロセス1の多様性の制御に関与している。真核生物調節sRNAは、通常、サイズが20〜30 ntの間です。主な3つのタイプは、マイクロRNA(miRNA)、ピウィ相互作用RNA(piRNA)、小干渉RNA(siRNA)です。異常なmiRNA発現レベルは、様々な疾患2に関与している。これは、健康と病気におけるmiRNAの重要性と、sRNA全般を検出するための正確で定量的な研究ツールの要件を強調しています。
次世代シーケンシング(NGS)は、sRNAを研究するために広く使用されている方法です。定量的PCRやマイクロアレイ技術(qPCR)などの他のアプローチと比較したNGSの主な利点は、sRNA配列の事前知識を必要としないため、新しいRNAを発見するために使用できることであり、さらに、より少ないバックグラウンド信号と彩度効果。さらに、単一ヌクレオチドの違いを検出でき、マイクロアレイよりも高いスループットを有する。ただし、NGS にはいくつかの欠点もあります。シーケンス実行のコストは比較的高く、サンプルをシーケンス用ライブラリに変換するために必要なマルチステップ プロセスによってバイアスが発生する可能性があります。典型的なsRNAライブラリー調製プロセスでは、3'アダプターは、ATPが存在しない場合に、RNAリガーゼ2(RNL2)の切り捨てられたバージョンと予備の3'アダプター(図1)を使用してsRNA(多くの場合、全RNAからゲル精製)にライゲーションされます。これにより、sRNAアダプタライゲーションの効率が向上し、sRNAの循環化や連結などの副反応の形成が減少します。続いて、5'アダプターをRNAリガーゼ1(RNL1)によってライゲーションし、続いて逆転転写(RT)およびPCR増幅を行う。これらのステップはすべて、バイアス3,4を導入する可能性があります。したがって、読み取り数は、人工的な、方法依存性発現パターンにつながる実際のsRNA発現レベルを反映しない場合があります。特定の sRNA は、ライブラリ内で過剰または過小表現され、厳密に表現されていない sRNA が検出を逃れる可能性があります。この状況は、特に植物miRNA、昆虫および植物のsiRNA、および昆虫、線虫および哺乳動物におけるpiRNAで、3'末端ヌクレオチドが2'-O-メチル(2'-OMe)修飾1を有する。この修飾は、3'アダプタライゲーション5を強く阻害し、これらのタイプのRNAに対するライブラリー調製を困難な作業にする。
以前の研究は、アダプタライゲーションがRNA配列/構造効果6、7、8、9、10、11に起因する深刻なバイアスを導入することを実証しました。逆転写やPCRなどのアダプタライゲーションの下流のステップは、バイアス6、11、12に有意に寄与しない。ライゲーションバイアスは、特定の配列を有するアダプタ分子が反応混合物中のsRNA分子と相互作用して共折を形成し、ライゲーションに有利または好ましくない構成を引き起こす可能性があるという事実に起因する可能性が高い(図2)。Sorefan et al7のデータは、RNL1 が単一の孤立したコンテキストを好む一方、RNL2 がライゲーション用の二本鎖を好むことを示唆しています。アダプター/sRNA 共折構造が特定のアダプターと sRNA シーケンスによって決定されるという事実は、特定の sRNA が特定のアダプター・セットで過剰または過小表現される理由を説明します。また、一連の sRNA ライブラリー内で比較する場合は、同じアダプタシーケンスを使用する必要があることも重要です。実際、異なるバーコードシーケンスの導入によってアダプタを変更すると、シーケンスライブラリ9、13のmiRNAプロファイルが変更されることが以前に観察されています。
ライゲーションジャンクション付近のアダプタシーケンスのランダム化は、これらのバイアスを減らす可能性が高いです。Sorefanたちは、4つのランダムなヌクレオチドを持つアダプターを四肢に使用し、「高精細」(HD)アダプターと指定し、これらのアダプターを使用すると、真のsRNA発現レベルをよりよく反映するライブラリにつながることを示した。より最近の研究は、これらの観察を確認し、無作為化領域がライゲーション接合部11に隣接する必要がならないことを明らかにした。この新しいタイプのアダプターは"MidRand"アダプターと名付けられました。これらの結果を組み合わせることで、アダプターの設計が改善され、バイアスが軽減される可能性が示されています。
アダプターを変更する代わりに、反応条件の最適化によってバイアスを抑制できます。ポリエチレングリコール(PEG)は、ライゲーション効率14を高くすることが知られている高分子群集剤であり、バイアス15、16を有意に減少させることが示されている。これらの結果に基づいて、いくつかの「低バイアス」キットが市場に登場しました。これには、古典的なアダプターまたは HD アダプターと組み合わせて、ライゲーション反応に PEG を使用するキットが含まれます。他のキットは、ライゲーションを完全に回避し、それぞれ12'と5'アダプタの追加のための3'ポリアデニル化とテンプレート切り替えを使用します。さらに別の戦略では、3' アダプターライゲーションに続いて循環ステップが続き、5' アダプターライゲーション17を省略します。
前回の研究では、バイアスの可能な限り低いレベルと2'-OMe RNA12の最良の検出を持つsRNAライブラリー調製プロトコルを検索しました。上記の「低バイアス」キットのいくつかをテストし、標準プロトコル(TS)よりも2'-OMe RNAの検出が優れています。しかし、驚くべきことに、修正時(無作為化アダプターの使用、ライゲーション反応におけるPEG、精製による余分な3'アダプタの除去)は、後者が2'-OMe RNAの検出のための他のプロトコルを上回った。ここでは、2'-OMe RNA の全体的な検出が最も優れた TS プロトコル 'TS5' に基づくプロトコルについて詳しく説明します。プロトコルは、TSキットの試薬と'Nf'キットの試薬1つを使用して、または同等の性能を持つ自家製試薬を使用して、お金を節約することができます。また、総RNAからのsRNAの精製と、3'アダプターの準備のための詳細なプロトコルを提供します。
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Protocol
1. 小型RNAの分離
- フェノール系試薬またはその他の方法を用いて総RNAを抽出する。RNA の品質が良好かどうかを確認します。
- 200Vで15%のTBE-ureaゲル(材料の表を参照)を15分間事前に実行します。
- ゲルがプレランニングされている間、5-15 μLの総RNAを5-20 μLの総体積に混合し、同量のホルムアミドローディング色素を含む(材料表、95%脱イオン化されたホルムアミド、0.025%ブロムフェノールブルー、0.025%キシレンシアン、5mM EDTA pH)を20μHの管に混ぜる。同様に、10 μL(200 ng)の小型RNAラダー(材料の表を参照)を同量のホルムアミドローディング色素と混合します。加熱された蓋を持つサーモサイクラーで65°Cで5分間インキュベートし、その後、すぐに氷の上にチューブを置きます。
- はしごとサンプルを少なくとも1つのレーンで同じゲルに積み込み、ブロモフェノールブルー(ダークブルー)がゲル長の約3分の2(約40分)に移行するまで200Vで走ります。
- 次のようにゲルからRNAを溶出させるシステムを準備する:21ゲージの針でヌクレアーゼフリー0.5 mLマイクロ遠心管の底部を穿刺する。パンクした0.5 mLチューブをヌクレアーゼフリーのラウンドボトム2mLマイクロ遠心分離管に入れます。
- ゲルを取り出し、3μL核酸ゲル染色(10,000 x 濃縮物、材料の表を参照)で室温で10〜15分間インキュベートします。
- 「ダークリーダー」トランスイルミネータでゲルを表示し(これはRNAを損傷する可能性があるため、UVを避けることを強くお勧めします)、17 ntと29 ntのはしごバンドの間のサンプルRNAを切り取ります。ゲル片をステップ1.5から0.5 mLチューブに移します。
- 2 mLチューブ内の0.5mLチューブをマイクロ遠心分離機で2分間最大速度で遠心分離します 0.5 mL チューブを取り外します。
- 破砕ゲルを含む2mLチューブにヌクレアーゼフリー0.3M NaClを300μL加え、室温または一晩4°C(16時間)で少なくとも2時間回転させます。
- 砕いたゲル片の懸濁液をスピンカラム(材料表参照)に移し、マイクロ遠心分離機で最高速度で2分間遠心分離機を使用します。
- グリコーゲンの1 μL(20 μg/μL)と室温100%エタノールの950 μLを加えます。-80 °Cで少なくとも30分間インキュベートします。
- 4 °Cのマイクロ遠心分離機の最高速度で20分の遠心分離機。上清を取り出し、800μLの冷たい80%エタノールでペレットを洗浄する。4°Cで5分間再度遠心分離機を、慎重にすべての上清を除去します。ヌクレアーゼフリー水の15 μLでRNAペレットを再中断します。典型的には、入力総RNAの量に応じて、小さなRNAの〜5〜20 ngを回収する必要があります(入力総RNAの1μg当たり小さなRNAの〜1 ng)。
- 推奨される追加手順:回収されたsRNAの量と質を確認してください(例えば、小さなRNAキットを使用して毛細血管ゲル電気泳動によって、材料の表を参照してください)。
2. 予備3'HDアダプターの準備
注:3'HDアダプタのプリアデニル化は、Chenら18によって記述されたプロトコルと同様の方法で行われました。事前に識別可能なアダプターは直接注文できますが(/5rApp/変更)、これは非常に高価です。
- 注文5'リン酸化、3'ブロック3'HDアダプタオリゴヌクレオチド。シーケンスと変更については、表 1を参照してください。なお、「3AmMO」は3'アミノ修飾群であり、ほとんどのサプライヤーは、この修飾でオリゴヌクレオチドを産生することができる。ヌクレアーゼフリー水を100μMに希釈します。
- 以下の試薬を含む10μLのオリゴ(100μM)、T4 RNAリゲスバッファーの10μL(10倍)、ATPの10μL(10mM)、50%PEG8000の40μL、T4 RNAリゲス1(50単位)の5μL、25μLの水を含む100μL反応を設定します。20°Cで一晩インキュベートします。
- 前に行われたオリゴヌクレオチドの古典的なフェノールクロロホルム抽出を行い、続いてエタノール沈殿を行う。100 μL の酸 (pH 4.5) フェノール:クロロホルムおよび渦を加えます。室温、最高速度で5分間スピンします。慎重に新しいチューブに上相の90 μLを転送します。3M酢酸ナトリウムpH 5.2の10 μL、超純血性グリコーゲンの1μL、冷たい100%エタノールの250 μLを加えます。
- -20 °Cで、最高速度4°Cで30分間、少なくとも30分間-20°Cに保ちます。上清を取り出し、500μL冷たい80%エタノールでペレットを1回洗います。フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の代替として、ヌクレオチド除去キットを使用することができる(材料の表を参照)。25 μLの水で再中断します。
- 一本鎖DNAの特定の検出のためのキットを使用してアダプターの濃度を測定します(材料の表を参照)。80 ng/μL (10 μM) に希釈します。
- 推奨される追加手順:未処理のオリゴヌクレオチドと共に15%TBE-ureaゲル(材料の表)に10 μMアダプターの1μLを移行することにより、前アデニル化の有効性を確認します。前に出されたアダプターは、未処理のオリゴヌクレオチドよりもわずかに遅く移行する必要があります。必要に応じて、予備アダプターはゲル精製することができます。上記のように進みます(手順 1.2-1.12)。
3. ライブラリの準備 - プロトコル TS5
注:我々は、前述の12を変更したTSプロトコル'TS5'をここに提示し、キットからの試薬または自己提供試薬のいずれかで行うことができる。異なるプロトコル'TS7'で同様またはわずかに良い結果を得たことに留意すべきです。ただし、TS7 では、アダプターダイマーを除去することはより困難です。したがって、TS5 を詳細に記述することをお勧めしますが、TS7 の後にアダプターを交換するだけでよいでしょう。TS7 の場合は、'MidRand-Like (MRL)' アダプター シーケンスを使用します (表 1)。ここでは、ランダム化された領域がアダプターの中央にあることに注意してください。逆転写とPCRのプライマーは、3'アダプターのランダム化領域の下流のシーケンスと、5'アダプター内のランダム化領域のアップストリームにハイブリダイズされます。シーケンスは、5' アダプターの最初のランダム化ヌクレオチドから開始されます。
- 3'アダプタライゲーション。
- 0.2 mLマイクロ遠心管に精製された小型RNA(〜0.1-1 μM)の1 μLと1 μLの予備3'HDアダプタ(10 μM)を組み合わせます。サーモサイクラーで72°Cで2分間インキュベートし、氷の上に直接置きます。
- 50%PEG 8000(粘性溶液;ピペット)の4μL(粘性溶液、ピペト)、RNAリガーゼバッファーの1μL(10x)、H2Oの1μL、T4 RNA ligae2切り捨ての1μL、およびRNase阻害剤の1μLを添加する。16 °Cで一晩インキュベートします。
- 非リガデッド3'アダプターの除去
- ヌクレアーゼフリー水を10μL加え、よく混ぜます。Nfキット(材料の表)から3 M NaOAc pH 5.2または「アダプタ枯渇溶液」の6 μLを追加し、よく混ぜます。40 μLの磁気精製ビーズ(材料表)と60μLのイソプロパノールを加え、よく混ぜます。室温で5分間インキュベートします。
- 溶液が明確になるまで、サンプルを磁気ラックに入れます。上清を取り除いて捨てます。
- 新たに調製した80%エタノールの180μLを加えます。約30sのためにインキュベートし、その後、除去します。新たに調製した80%エタノールを使用し、80%エタノールで長期間インキュベートしないでください。
- チューブを簡単に回転させ、井戸の底部に集めた可能性のある残留液を除去します。ビーズを2分間乾燥させ、10 mMトリスpH 8の22 μLまたはNfキットからの再懸濁バッファーで再懸濁させます。2分間インキュベートし、溶液が明確になるまでサンプルを磁化します。
- Nfキット(材料の表)から3 M NaOAc pH 5.2または「アダプタ枯渇溶液」の6 μLを新しいチューブに追加します。この新しいチューブに前のステップから上清の20 μLを転送し、ピペッティングによって混合します。40 μLの磁気ビーズと100%イソプロパノールの60μLを加え、ピペッティングでよく混ぜます。5分間インキュベートします。
- 溶液が明確になるまでサンプルを磁化し、上清を取り除いて廃棄します。
- 新たに調製した80%エタノールの180μLを加えます。約30sのためにインキュベートし、その後、除去します。T akeケアは、新たに調製された80%エタノールを使用し、長期間80%エタノールでインキュベートしないでください。
- チューブを簡単に回転させ、井戸の底部に集めた可能性のある残留液を除去します。ビーズを2分間乾燥させ、ヌクレルトフリー水を10μLで再濁させます。2分間インキュベートし、溶液が明確になるまでサンプルを磁化します。
- 上清の9 μLを新しいチューブに移します。T4 RNA リゲスバッファー (10x) と 1 μL の水を 1 μL を追加します。または、TS キットから 2 μL のリゲス バッファーを追加します。
- 5'アダプターのライゲーション。
- 5' HD アダプターの 1 μL を追加します (10 μM;表 1)加熱されたふたが付いている熱サイクラーの200 μL PCR管に。70°Cで2分間インキュベートし、その後、氷の上に直接チューブを置きます。
- 10 mM ATP の 1 μL と T4 RNA リゲス 1 の 1 μL を追加します。ゆっくりとピペッティングでよく混ぜます。このミックスの3 μLをステップ3.2.9から3'ライゲーションRNAに加え、ピペッティングで混ぜます。28 °Cで1時間インキュベートします。
- 逆転写 (RT)
- 3'および5'アダプターの6 μLを新しい200 μL PCRチューブに移す(必要に応じて後で使用するために-8μLの残りの〜8 μLを保つ)。RTプライマーの1 μLを追加します(10 μM;表 1)ピペッティングでミックスします。70°Cで2分間インキュベートし、その後、氷の上に直接チューブを置きます。
- RTに次の試薬を加える:5x第一鎖バッファーの2 μL、12.5 mM dNTPミックスの0.5 μL、100 mM DTTの1μL、RNase阻害剤の1μL、および1 μLの逆転写酵素(材料表)を追加する。50°Cで1時間インキュベートします。
- PCR増幅
- RT反応混合物の12.5 μLに以下の試薬を追加します:PCRポリメラーゼバッファーの10 μL、ユニバーサルP5プライマーの2 μL(10 μM;表 1、2 μL の P7 インデックス プライマー (10 μM;表1、12.5 mM dNTPの1 μL、DNAポリメラーゼ(材料表)の0.5 μL、および22 μLの水。使用するまで氷の上に反応を保ちます。
- 次の PCR プログラムを実行する: 30 s の場合は 98 °C、11 サイクル (10 s の場合は 98 °C、30 s は 60 °C、15 s では 72 °C) と 72 °C を 10 分間実行します。
注:PCRサイクルの数に関して:我々は通常11サイクルを実行しますが、これはユーザーによって最適化されるべきです。可能な限り少ない数の PCR サイクルを実行するようにしてください。
- ゲル精製
- ネイティブの6%TBEゲル(材料の表を参照)と適切なはしご(材料の表を参照)でPCR製品の5、10、20 μLを実行します(材料の表を参照)。145Vで約1時間ゲルを実行します(ブロモフェノールブルーが底に達するまで、この色素は65bpの位置で移動します)。
- ゲルを取り出し、核酸ゲル汚れ(材料の表を参照)で10〜15分間水中でインキュベートします。
- 「ダークリーダー」トランスイルミネータでゲルを表示し(これはRNAを損傷する可能性があるため、UVを避けることを強くお勧めします)、150 bpでライブラリーバンドを切り取り、ステップ1.5で説明するようにゲルからRNAを溶出し、ゲル片を0.5 mLチューブに移すシステムを準備します。
- マイクロ遠心分離機で最高速度2分で遠心分離機を取り外し、0.5 mLチューブを取り外します。
- 破砕したゲルを含む2mLチューブに300μLのヌクレアーゼフリー水を加え、室温または一晩4°Cで少なくとも2時間回転させます。
- 水中の破砕ゲル片の懸濁液をスピンカラムと遠心分離機に最大速度で2分間移します。
- グリコーゲン(20 μg/μL)の1 μL、3M NaOAcの30 μL、975 μLの氷冷100%エタノールを加えます。4 °Cの最高速度で20分の遠心分離機。
- 10 mMトリスpH8の20 μLでペレットを再ステースします。濃度測定には1 μL、品質管理には1μLを使用してください。
4. データ分析
注: 以下に説明するデータ分析手順は、Linux オペレーティング システム Ubuntu 16.04 LTS に基づいています。
- 生のシーケンスファイルの処理
- シーケンス実行中に生成された FASTQ シーケンス ファイルをダウンロードします。必要に応じて、bcl2fastq2 (バージョン V2.2.18.12; マニュアルは次のリンクからダウンロードできます) を使用して多重化を実行http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html。
次のコマンドを使用します。
nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --無視欠落-bcl --出力-dir Pathway_of_Output_Directory --バーコードミスマッチ 1 --集約タイル AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16 - Cutadapt 19 バージョン1.15を使用してアダプター シーケンスを削除します。マニュアルはこちらからダウンロードできます: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html。
次のコマンドを使用します。
パスウェイ_to_カットアダプト/カットアダプト -A TGGAATTCTCGGGTCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o出力_File_Read1_cutadapt.fastq.gz入力_File_Read1.fastq.gz
コマンドのシーケンスは、4つのランダムなヌクレオチドなしで3'HDアダプタに対応することに注意してください。したがって、これらの手順では削除されません。 - シーケンシング読み取りにおける末端ランダムヌクレオチドの除去には、seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) を使用します。次のコマンド (太字の変数名) を使用します。
seqtk トリムフク -b 4 -e 4出力_ファイル_読み取り1_カットアダプト.fastq >出力_ファイル_読み取り1_トリミング.fastq - 10 nt より短いシーケンスを破棄するには、次の awk コマンドを使用します。
awk 'BEGIN { FS = "\t" ;OFS = "\n" } {ヘッダー = $0 ; ゲトリライン qeq ; getline qeq ; ゲトリライン qseq ; if (長さ(seq) >= 10) {印刷ヘッダー、seq、qeq、qseq}}' 出力_File_Read1_trimmed .fastq>長さフィルタリング済み
- シーケンス実行中に生成された FASTQ シーケンス ファイルをダウンロードします。必要に応じて、bcl2fastq2 (バージョン V2.2.18.12; マニュアルは次のリンクからダウンロードできます) を使用して多重化を実行http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html。
- トリミングされたシーケンスのマッピング
- miRBaseから研究の生物に対応するデータベースをダウンロードしてください。http://www.mirbase.org/ftp.shtmlに移動し、'mature.fa' ファイルをダウンロードします。配列はRNA表記で示されている点に注意してください。U 残渣を T で置き換えるには、次のコマンドを使用します。
sed -i '/^>/!s/U/T/g' 成熟した.fa
注:これは、様々な生物に由来するmiRBase内のすべてのmiRNAの完全なリストを生成します。 - 次のコマンドを使用して、対象の生物の miRNA シーケンスを選択します。
awk 'name_of_the_organism{印刷; nr[NR+1]; 次 };NR の成熟した.fa > 成熟した_名前_of_the_組織_mirs.fa - Bowtie220 (バージョン 2.3.0) を使用して、読み取りを上記で作成したファイルにマップし、不一致を許しません。まず、次のコマンドを使用してファイルのインデックスを作成します。
bowtie2-ビルド成熟した_name_of_the_organism_mirs.fa 成熟した_name_of_the_organism_mirs - シーケンス読み取りをデータベースに合わせ、読み取りがデータベースの miRNA に完全にマップされ、不一致が生じずに必要になります。この目的のために、次のツールを使用します。
bowtie2 -N 0 -L 10 --スコア分 C,0,0 --エンドツーエンド --時間 -x 成熟_name_of_the_organism_mirs -U長さ_フィルタリングされた.fastq -S長さ_Filtered_ALIGNMENT.sam
注: オプション: --score-min C,0,0,0 は、位置合わせに不一致がないことを保証します。ツールのさまざまなパラメータの説明については、次のウェブサイトをご覧くださいhttp://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - 整列しなかった読み取りを破棄するには、次のコマンドを使用します。
サムツールビュー -F 4長さ_フィルタリング_アライメント.sam >読み取り_aligned_to_Mirs.sam
注: これらの手順の結果、miRNA に対応する整列された読み取りを取得する必要があります。
- miRBaseから研究の生物に対応するデータベースをダウンロードしてください。http://www.mirbase.org/ftp.shtmlに移動し、'mature.fa' ファイルをダウンロードします。配列はRNA表記で示されている点に注意してください。U 残渣を T で置き換えるには、次のコマンドを使用します。
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Representative Results
重要なステップは、開始総RNA材料(図3)および所望の最終ライブラリー産物(図4)の小さなRNA分率の単離である。両方のステップは、ポリアクリルアミドゲル精製を含みます;小さなRNAは15%TBE尿素ゲルから単離され、最終ライブラリーは6%天然TBEゲルから単離されます。ゲルから単離された小さなRNAは、小さなRNA毛細血管電気泳動チップ(材料の表;図 3B)これにより、ユーザーは回収された小さなRNAの量と調製中のmiRNAの割合を推定できるようになります。
最終ライブラリー産物のゲル精製は、所望のライブラリの近くに移行する多数の追加製品が形成されるにつれて微妙なステップである。これは、アダプタダイマーなどの他の種でライブラリを汚染するリスクを増加させるので、ゲルを過負荷にしないことが重要です。例として(図4)、ゲルにPCR増幅ライブラリー(B.ナプスRNA由来)の増加量をロードし、期待サイズ(150bp)に対応する製品を切り取った(図4A)。溶出後、精製されたライブラリーは毛細血管ゲル電気泳動チップ上でチェックされた。予想される150bp製品に加えて、130bp種の増加率は、PCR製品の増加量がロードされたとしてアダプタダイマーに対応することが観察された(図4B,C)。
プロトコルTS5がキットの試薬と同様に自家製試薬と同様に動作するかどうかをテストしました。この目的のために、我々は、前の研究12で行われたように、合成小さなRNA 1-6の組み合わせからライブラリを準備し、2'-OMe修飾なしで、または2'-OMe修飾を持つ各存在を準備しました。図5は、以前に取得したこれらのRNAのそれぞれに対応する読み取りの割合を示し、TSおよびNfキットまたは他のサプライヤーからの試薬を使用して作られた新しいライブラリを用いて示す。ごく一見、非常に類似した結果が得られた。
図6は、2'-OMe修飾された植物(A.タリアナおよびB.ナプス)miRNAの検出のための標準TSプロトコルとプロトコルTS5の性能と、および未改変ヒトmiRNAの性能を比較した図である。また、ヒトサンプルで改変されたpiRNA、2'-OMeの検出も試験した。ごく一見ですが、TS5は2'-OMe RNAの検出に対してTSよりも有意に優れていますが、未変更のRNAでは実行できません。ただし、変更されていない sRNA の場合も、検出される RNA の数が多くなくても、取得した読み取り数は、バイアスのレベルが低いため TS よりも TS5 の真の発現レベルを反映している可能性があります。
図 1.イルミナシーケンシングのためのsRNAライブラリー準備ワークフローの概略表現。まず、sRNAはゲル精製工程により単離される。ここでは、miRNA のサイズ範囲が示されますが、対象の RNA に応じて、他のサイズ範囲を選択できます。その後、品質管理(QC)ステップを実行して、単離されたsRNAの品質と量を確認します。ライブラリの準備中に、事前に拡張された(App)3'アダプターが最初にsRNAにライゲーションされる。その後、5'アダプターがライゲーションされます。その後、3'アダプターを補完するプライマーを使用して逆転転写が行われ、続いてPCR増幅が行われ、その間にイルミナP5、P7、およびインデックス('In')配列が追加されます。得られたライブラリは、ゲル精製され、続いて品質管理ステップが続く。次に、ライブラリの順序が配列され、データが分析されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.配列依存性アダプター sRNA 共折りたたみによるバイアス。アダプターライゲーション混合物では、アダプターは、アダプターと sRNA の順序に依存する方法で sRNA と共存します。したがって、異なる sRNA (例 a、b、および c; で示される緑色の色合いで示されます) は、特定のアダプターと異なるコフォールドを行います (3' アダプターは赤で示され、5' アダプターは青色で示されます)。黒い矢印はライゲーションジャンクションを示します。これは、ライゲーションの有利または不利なコンテキストにつながる可能性があります。RNL2は二本鎖環境を好むように見えるので、3'ライゲーションはRNA cよりもRNAaとbの方が効率的であると予想される。RNL1がライゲーション接合部の周りの単一の鎖領域を好む場合、5'アダプタライゲーションはRNA aに対して最も効率的であり、次にbが続き、c.の場合は最も効率が悪い場合があり、これはsRNA a、中間体の過剰表現をもたらす可能性があります。3つのRNAが元のRNAサンプル中に等しい量で存在する場合でも、最終的なライブラリーにおけるRNA bおよびRNA cの過小表現の表現。同様の方法で、アダプターシーケンスを変更する場合(例えば、異なるバーコードを追加することによって)、特定のsRNAが異なる表現されることに注意してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.小さいRNAの分離および質管理。(A)15%TBE尿素脱電ポリアクリルアミドゲル上のブラッシカナプス総RNA(10μg)の電気泳動分離。小さなRNAはしご(材料の表を参照)を分子サイズマーカーとして一緒に移動した。移行後、ゲルを染色し、RNAをトランスイルミネータで可視化した。17から29ヌクレオチドの領域を切り取り(赤い長方形で示す)、RNAを取り除いた。(B)精製RNAの品質を毛細血管ゲル電気泳動により確認した。この分析は、サンプル中のmiRNAの割合に関する情報を提供します(この場合は93%)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.B.ナプス小RNAライブラリーのゲル精製は、以下のプロトコルTS5および品質管理に調製した。(A)B.ナプス小RNAからのPCR増幅ライブラリーの増加量は、6%の天然TBEゲルにロードされた。2.5 μL (a)、5 μL (b)、10 μL (c)または 20 μL (d) PCR 製品。50 bpのはしごが横に移動されました。予想される150pb位置で移動するPCR産物を単離し(赤い長方形)、DNAを精製して精製した。(B)精製ライブラリの品質管理ゲル表現。(C)同じ分析のエレクトロフェログラム表現。ご覧の通り、150 pb製品は、大量のPCR製品がゲル上に移行されるにつれて、アダプタダイマー(〜130 bp)でますます汚染されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.プロトコルTS5は、TSおよびNfキットの試薬や他のサプライヤーからの試薬と同様に実行されます。プロトコルTS5を持つRNA(OMe)1-6に対応する生の読み取りの総数(トリミング前)の割合を表すヒストグラムは、TSおよびNfキット(青いバー)からの試薬、または他のサプライヤー(オレンジバー)からの試薬が続きます。比較のために、我々の前の研究の結果は灰色の棒によって示される。RNA1-6(全RNA)またはRNA-OMe1-6(全RNA-OMe)に対応する読み取りの総数も示されています。少なくとも2つの独立した実験の平均値を示す。誤差余数は標準偏差を表します。この図の一部は Dard-Dascot らから変更されています, 201812この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.プロトコルTS5のmiRNA検出と古典的なTS法との比較。(A) miRBaseにおけるA.タリアナ、B.ナプス、またはH.サピエンスmiRNAにマッピングする読み取りの割合が決定された。また、ヒトライブラリの読み取り値をpiRNA検出用のpiRBaseにマッピングしました。A.thalianaおよびB.napus miRNAおよびヒトpiRNAは、ヒトmiRNAとは対照的に2'-OMe修飾されたことに注意してください。少なくとも2つの独立した実験の平均値を示し、誤差バーは標準偏差を表します。(B)識別された miRNA (または piRNA) の番号。我々は、プロトコルTSまたはTS5で同定された異なる種からの既知のmiRNAの数を決定した。A. タリアナ、B.ナプス、または H. サピエンスの場合、427、92、および 2588 miRNA がそれぞれ miRBase に登録されています。TSまたはTS5ライブラリからの050万通の読み取りはmiRbaseのB.napus miRNAにマッピングされ、100万通の読み取りはA.タリアナまたは人間のデータベースにマッピングされました。エラーバーで表される標準偏差を持つ少なくとも2つの独立した実験の平均値を示します。この図は、Dard-Dascot et al. 201812から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前オリゴヌクレオチド | 5' 変更 | 3' 変更 | シーケンス 5' から 3' | 浄化 | |||||
| 5' HD (TS5) アダプター | 5AmMC6 | [午前5時]。GTTCAGAGTTCTACCCCCGCNrNrN(このオリゴはDNA-RNAキメラであり、3つの3'末端ntsはRNAである) | Hplc | ||||||
| 3' HD (TS5) アダプター | リン酸 | 3アンモ | [Phos]rNrNTGAATTCTCGGGTGCCAAGG[3AaMO](このオリゴはDNA-RNAキメラであり、4つの5'末端ntsはRNAである) | Hplc | |||||
| 5' MRL (TS7) アダプター | 5AmMC6 | [午前5時]。GTTCAGAGTTCTACAGTCCCGCNNNrArCrGrArArC(このオリゴはDNA-RNAキメラであり、7つの3'末端ntsはRNAである) | Hplc | ||||||
| 3' MRL (TS7) アダプター | ホスフェート | 3アンモ | [ホス]GTATCGTNNNNNNTGAATTCTCGG[3AmMO] | Hplc | |||||
| RT プライマー | GCCTTGGCCCCガトッカ | Hplc | |||||||
| ユニバーサルP5プライマー | AATGATACGCGACCGAGGAGATCTCTCTTCAGAGTTTCTCACTCCGA | Hplc | |||||||
| P7 インデックス プライマー | CAAGCAGAAGAGGGGGAGGAGGAGTCCTCCCCCCCCCCCCCCCCCA (NNNN = インデックス) | Hplc | |||||||
| インデックス 1: CGTGAT | |||||||||
| インデックス 2: ACATCG | |||||||||
| インデックス 3: GCCTAA | |||||||||
| インデックス 4: TGGTCA | |||||||||
| インデックス 5: CACTGT | |||||||||
| インデックス 6: ATTGGC | |||||||||
| インデックス 7: GATCTG | |||||||||
| インデックス 8: TCAAGT | |||||||||
| インデックス 9: CTGATC | |||||||||
| インデックス 10: アグクタ | |||||||||
| インデックス 11: GTAGCC | |||||||||
| インデックス 12: タカアグ | |||||||||
表 1.このプロトコルで使用されるオリゴヌクレオチド。
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Discussion
小さなRNAライブラリーの準備は、主にアダプタライゲーションステップ中に導入されるバイアスのために困難なままです。植物miRNA、昆虫、線虫および哺乳類のpiRNA、昆虫および植物における小さな干渉RNA(siRNA)のような3'末端に2'-OMe修飾を伴うRNAは、2'-OMe修飾が3'アダプターリゲーションを阻害するので、特に研究が困難である。sRNAライブラリー調製プロトコルを改善するために多くの解決策が文献に提案されているが、市販されているキットのほとんどは依然として、深刻なバイアスを有する古典的なTSプロトコルに基づいている。しかし、ライゲーション反応にランダム化されたアダプターとPEGを備えたNfキットを含むいくつかの「低バイアス」キットが存在し、アダプタライゲーションを完全に回避するいくつかのキットが最近登場しました12。我々は以前、Nfが標準的なTSプロトコルよりも異なるmiRNAを検出することを報告したが、プロトコル'S'(アダプタライゲーションなし)は、副産物12の有意な形成のために比較的不十分に行われた。驚くべきことに、TSプロトコルは、変更時に他のプロトコルよりも2'-OMe sRNAのより敏感な検出を持っていましたが、通常のsRNAではありません。ここでは、アダプターが四肢でランダム化される TS5 プロトコルを詳細に説明し、PEG はライゲーション反応に使用され、ビーズの精製によって余分な 3' アダプターが除去されます。MRL アダプタを使用する別のプロトコル (TS7) は、TS5 プロトコルよりも若干優れたパフォーマンスを発揮する可能性があることに注意してください。ただし、両者の間にはわずかな違いしか存在しないため、TS7 では、目的のライブラリ製品をアダプタ ダイマーから分離するのがより困難であるため、ここでは TS5 プロトコルを詳細に説明することをお勧めします。ただし、必要に応じて、TS5 アダプターを TS7 アダプターに置き換えることができます。これらは、~150 bpではなく、~170 bpの最終ライブラリー積につながるのがわずかに長いことに注意してください。
「自家製」材料でプロトコルTS5またはTS7を実行する可能性は、大幅にコストを削減することができます。しかし、自家製材料との品質の面で大きな変動がある可能性があります。特に自家製の事前アデニル化された3'アダプターは、事前アデニル化の様々な有効性のために可変品質の影響を受ける可能性があります。したがって、大きな在庫を準備し、新しい株式が準備されている場合は、そのパフォーマンスを前のものと比較することをお勧めします。この目的のために制御RNAサンプルを使用することができます。
本明細書に記述されるプロトコルの欠点は、副産物の比較的強力な形成と、これらの製品から所望のライブラリを分離するのが難しいことです。精製のためにアクリルアミドゲルを過負荷にしないように注意する必要があります。最近では、ダイマー21を形成する傾向が強く低下する改変アダプターが開発された。5'アダプターの3'端の2'-OMeの変更は、3'アダプターの5'端部でメチルホスホネートの変更と組み合わせることで、効率的にアダプタダイマーを抑制しました。このような改変されたアダプタを、以下の記述プロトコルでテストすることは興味深いでしょう。
プロトコルTS5におけるゲル精製ステップは、比較的労働集約的である。変更されたアダプターを使用すると、アダプターダイマーの形成が効率的に減少する場合、最終的なライブラリのゲル精製はもはや必要ないかもしれません。また、小さなRNAを単離するゲル精製工程の代替として(ステップ1)、小型RNAに対して濃縮する磁気ビーズを用いた戦略が存在する(https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf)。私たちはこの方法を自分たちで使用していませんが、テストする価値があり、うまくいけばプロトコルを大幅に簡素化できます。
結論として、プロトコルTS5はさらに改善され得るが、2'OMe sRNAの検出のために、少なくとも以前の比較分析でテストされたキットよりも優れた性能を発揮する。自家製素材を使用してフォローできるため、大幅なコスト削減が可能です。便宜上、そしておそらくより一定の性能のために、TSおよびNfキットからの試薬を使用することができる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、国立科学研究センター(CNRS)、フランス代替エネルギー・原子力委員会(CEA)、パリ・スード大学によって支援されました。本研究のための全ての図書館準備、イルミナシーケンシングおよびバイオインフォマティクス分析は、I2BC次世代シーケンシング(NGS)施設で行われました。I2BC NGS施設のメンバーは、原稿の批判的な読み取りと有用な提案のために認められている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
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