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Biochemistry

赤外線ナノ分光法と原子間力顕微鏡による個々のタンパク質凝集物の特徴付け

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

赤外線ナノ分光法と高分解能原子間近顕微鏡の応用を用いて、タンパク質自己組織化のプロセスをオリゴメラ凝集体とアミロイド線維に可視化し、発症と発達に密接に関連している。ヒト神経変性疾患の広い範囲の。

Abstract

タンパク質の誤折と凝集の現象は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性状態に関連する高度に異種タンパク質凝集体の形成をもたらします。特に低分子量凝集体は、アミロイドオリゴマーが、一般的な細胞傷害性を有することが示されており、認知症の多くの形態において神経毒として関与している。原子間力顕微鏡(AFM)に基づく方法を用いて、従来の構造を用いて研究が困難なこれらの集合体の形態的、構造的、化学的特性を特徴付けるという困難な課題に取り組む方法を示す。その不均一性と一過性の性質のために、方法またはバルク生物物理学的方法。スキャンプローブ顕微鏡アプローチは、サブナノメートル分解能を持つアミロイド凝集体の形態を調製できるようになりました。ここでは、AFMの高分解能とIR分光法の化学認識力を同時に利用する赤外線(IR)ナノ分光法(AFM-IR)が、個々の構造特性の特性をさらに高め、特性の特性を高めることができることを示します。タンパク質凝集体を提供し、集約メカニズムに関する洞察を提供します。我々が説明するアプローチは、低分子および抗体とのタンパク質アセンブリの相互作用の調査にも適用することができるので、診断または治療するための新しい治療化合物を開発するための基本的な情報を提供することができます神経変性疾患。

Introduction

現在、世界中で4,000万人以上の人々が、アルツハイマー病(AD)1やパーキンソン病(PD)2疾患などの神経変性疾患の影響を受けています。より一般的には、50以上の病理がタンパク質の誤折と凝集と分子レベルで関連しており、アミロイド沈着物として知られる不溶性線維性タンパク質凝集体の増殖につながるプロセス、 4.神経変性の分子起源とアミロイド形成につながるタンパク質のタンパク質立体構造変化との関連は、しかし、不均一性、一過性、ナノスケールの高いレベルのために、大部分は不明のままである。病理学的凝集体の次元4、5。

過去数十年のタンパク質構造の非常に成功した調査は、X線結晶学、クライオ電子顕微鏡および核磁気共鳴分光法5を含むバルク法の使用に広く基づいている。6,7,8,9.このクラスの技術の中で、赤外線(IR)分光法は、タンパク質8などの生物学的システムの化学的特性を解明するための敏感な分析ツールとして出現した。IR法は、タンパク質の二次的および四次構造変化の定量化を可能にします。さらに、凝集中のタンパク質の複雑な自由エネルギー景観に関与する機械的詳細を顕微鏡レベルでさらに解読するために、複雑にまで広がる化学運動学ツールの開発が大きな進歩を遂げました。アミロイド線維形成5、6、7、10、11、12を含む自己組み立て経路。しかし、バルク分光法は、溶液中に存在する種の異種アンサンブルに関する平均的な情報のみを提供し、特定の顕微鏡ステップに関与しているため、個々の生物物理学的特性の調査を行うナノスケールレベル13、14で挑戦する集約種。

光の回折限界よりも小さいスケールで動作する能力を持ついくつかの顕微鏡検査技術は、過去数十年で出現しています。このクラスの方法には、電子顕微鏡(EM)および原子間力顕微鏡(AFM)が含まれる。走査電子顕微鏡(SEM)と透過電子顕微鏡(TEM)は標本の2次元(2D)画像を提供する一方で、AFMは過去数十年にわたり、3次元(3D)形態を研究するための強力で汎用性の高い技術として登場しました。サブナノメートル分解能13、14、15、16、17、18、19、サンプルのナノ機械的特性と同様に、 20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27.AFMを介してタンパク質凝集を研究する背後にある根拠は、このアプローチは、溶液13,14,16に存在する個々の種の形態の調査を可能にする、 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37.特に、時間の関数としてサンプルをモニタリングすることにより、AFMは、サンプル内の種の形態の進化の調査を可能にし、アミロイド形成23の経路を追従および可視化することを可能にする。 25,38,39,40,41,42.さらに、AFMは、溶液13、19、30、31に存在する個々の種の断面高さおよび長さなどの構造パラメータの定量を可能にする ,32,33,34,35,36,37,40,43,44歳,45歳,46歳,47歳,48.しかし、形態学のような単一の生物物理学的性質の研究は、多くの場合、異種および複雑な生物学的システムを研究する際に十分ではない。AFM、SEMまたはTEMイメージング法だけでは、ナノスケールでのアミロイド凝集体の異種種の化学的特性を容易に明らかにしない。

この規模での異種生体試料の解析に大きな進歩が見られ、最近では、赤外線ナノ分光法(AFM-IR)24,26のタンパク質凝集分野への応用が進み、 38,42,49,50,51,52.この革新的な方法は、AFM(~1−10nm)の空間分解能とIRの化学分析力の組み合わせを利用します。AFM-IR技術は、IRレーザーによって駆動される光熱誘導共鳴効果の測定と、AFM先端によって調査中のサンプルの熱膨張の測定に基づいています。サンプルは、従来の赤外線分光法24、42、52、53と同様に、全体的な内部反射で上から直接または下からIRレーザーによって照射することができる.IRレーザーは数百キロヘルツ(1−1000 kHz)の順序で典型的な周波数で脈打ち、広いスペクトル範囲、典型的には1000−3300 cm-1の間で調整することができる。レーザー光源は直径約30μmの面積をカバーしますが、AFM-IR技術の空間分解能は、システムの局所的な熱膨張を検出するAFM先端径によって公称的に決定されます。AFM-IRは、IR信号が1−1.5 μmまでの厚さに比例し、得られるIRスペクトルは一般的に対応するFTIR透過スペクトル13、54と一致しているため、生物学的サンプルの研究に適しています。 、55.このため、分光法における確立された分析方法は、化学シフトの研究、バンド形状変化および第2誘導体分析による非畳み込み52の研究など容易に適用することができる。全体的に、AFMの空間分解能とIR分光法の化学認識力を組み合わせることで、AFM-IRはナノスケールでのサンプルの形態的、機械的、化学的特性の広い範囲の同時取得を可能にします。

ここでは、インビトロ蛍光アッセイ、高分解能AFMイメージングおよびナノスケールAFM-IRの組み合わせを利用するタンパク質凝集プロセスの特性評価のためのプロトコルを例示する。この組み合わせアプローチは、タンパク質凝集体によって形成された個々のマイクロ液滴の化学的および構造的特性の研究、液体液タンパク質相分離の研究において、およびナノスケール23、26、38、45、50、53における個々の凝集種の不均一性および生物物理学的特性を調べている 56、57。

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Protocol

1. 蛍光プレートリーダーの凝集アッセイ

注:ここで説明するプロトコルは、化学動態によるタンパク質またはペプチドの凝集を研究する方法の一例です。特に、アルツハイマー病58、59の発症および進行に関与するAβ42ペプチドの凝集を研究するために最適化されたプロトコルを記述する。同様のプロトコルは、任意のタンパク質またはペプチドの凝集を研究する方に調整および採用することができる。

  1. イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー技術を介してAβ42の非常に純粋なモノマー溶液を得て、Aβ42を含むタンパク質画分を区別し、単量体画をAβ42の他の凝集形態から分離する58を得た。,59.
  2. 20 mMリン酸ナトリウムバッファーでAβ42ペプチドを希釈し、pH 8.058で200 μM EDTAを1−5 μMの間の所望の最終濃度に、1.5 mLの低結合チューブで希釈する。AFM測定用に収集されたサンプルには、AFM分析用のサンプル堆積時にアーティファクトが導入される可能性があるため、凝集アッセイに使用される蛍光色素(チオブラビンT、ThT)を含めるべきではありません。したがって、2つの同一の溶液の三量三角形を準備する:i)AFMによる凝集のプロセスに従うモノメリックAβ42を含む最初の;ii)凝集の動態を監視するトレーサーとして20μM ThTを添加したAβ42モノマーを含有する第2。
    注: 氷の上で手順 1.1 と 1.2 を実行することが重要です。この手順は、単調なAβ42溶液がプレートリーダーで開始されるまで凝集しないことを確実にする。サンプルを取り扱う場合、タンパク質サンプルに影響を与える可能性のある気泡の導入を避けるためには、慎重なピペッティングが不可欠です。
  3. 明確な底面および非結合表面を持つ黒いポリスチレンの96ウェル、半面積プレートの各ウェルの各サンプルのピペット80 μL。
  4. 凝集の過程でサンプルの蒸発を最小限に抑えるために、ホイルでプレートを密封します。
  5. プレートリーダーの温度を37°Cに平衡化します。
  6. 440 nm の励起波長と 480 nm の発光波長で、一定の時間間隔で蛍光測定値を読み取る集約プロトコルを設定します。集約は静止状態で開始する必要があります。
  7. プレートリーダーにプレートを挿入します。
    注: プレートリーダーを起動する前に集約がトリガされないように、プレートの取り扱い時には注意が必要です。ゲイン調整設定を使用して、各サンプルの蛍光を最適に読み出します。
  8. 測定を開始します。
    注:集約実験は、ThT蛍光シグモイド曲線が高原58に達したときに終了する。

2. AFMおよびナノIR測定用のサンプル調製

  1. 接着剤のタブまたは両面テープを使用して高品質の磁気ステンレス鋼ディスクに最高品質のグレードのV1マイカディスクを接着します。
  2. 粘着テープをマイカ表面に置き、マイカの最上層を引っ張り出すことで、エッチマイカを取り出します。この手順は、サンプル堆積に適した、クリーンで原子的に平らな表面を生成します。
    注: エッチングサーフェスは均一で滑らかでなければなりません。
    注意:これはアーティファクトを導入しますので、新たにエッチングされたマイカの上に直接触れたり、呼吸したりしないでください。
  3. プレートリーダー測定を一時停止/停止し、タンパク質の凝集プロセス中に対象となる時間ポイントを収集します。
  4. シールホイルを取り外し、TTを除くサンプルの10 μLアリコートをウェルから1.5 mLの低結合チューブに集えます。
  5. 新鮮にエッチングされたマイカにサンプルの10 μLを堆積します。AFM-IR測定用サンプルは、新たに取り除かれた金基板に堆積する必要があります。
  6. マイカ上の溶液を1分間インキュベートして、生理を可能にする。
    注:より長いインキュベーション時間は、表面上のより良い吸収を可能にするが、人工的な自己組織化と自己組み立て25を誘発する可能性があります。これらの影響を避けるために、スプレー堆積は25を利用することができる。
  7. 1mLの超純水で3回すすいでください。
  8. 窒素の穏やかな流れの下で乾燥し、空気中のサンプルを測定します。

3. タンパク質凝集体の形態のAFMイメージング

注:形態測定は接触モードと動的モードの両方で行うことができ、次のステップでは、サンプルの3D形態を高解像度で測定する横力を減少させるため、後者について説明する。AFM-IR測定は、AFM-IR信号対雑音比を高めるために接触モードで行われます。

  1. 測定の30分前にAFMシステムの電源を入れ、システムが熱安定性に達できるようにします。[セットアップ]をクリックし、[プローブ]をクリックします。[プローブ変更]ウィンドウで[次へ]をクリックしてZ を準備します。
  2. AFM ビーム スイッチをオフにします(オンの場合)。鳩尾ロックのロックを解除し、システムから頭部を切断し、プローブ変更ウィンドウで[次へ]をクリックします。
  3. プローブホルダーにAFM片持ち式を取り付けます。頭部をシステムに接続し、鳩尾ロックをロックします。
    注:動的モードAFMで生物学的サンプルを研究するための最適片持ちは、2−40 N m-1と2−8 nm14の間の頂点半径の間のスプリング定数を持っています。
  4. AFMレーザービームスイッチをオンにし、プローブ変更ウィンドウで[次へ]をクリックします。
  5. ポップアップウィンドウで、片持ち型が変わらない場合は[いいえ]をクリックします。光学アライメントノブを調整して片持ちを見つけます。片持ちにフォーカスを調整し、[次へ]をクリックします。
  6. ポップアップウィンドウで、フォーカスが片持ち上げの場合は[はい]をクリックします。
  7. 検出レーザーのノブ制御位置を使用して、片持ち端の端にレーザー光を配置します。4象限フォトダイオードで測定した総信号を、位置感受性光ダイオード(PSPD)上の偏向レーザー光線の位置を制御するノブを使用して、少なくとも>1 Vまで最大化する。[プローブの変更]ウィンドウで [次へ] をクリックし、[閉じる]をクリックします。
  8. 片持ちが熱安定性に達するまで15分待ちます。必要に応じて、PSPD上の偏向レーザービームの位置を調整します。
  9. NCM SWEEPをクリックし、発振の所望の振幅を選択し、[使用フェーズ]をクリックし、自動をクリックし、振動の最初の自由な共振の最大値に近い片持ちを調整します。40 N m-1のばね定数を持つ片持ち。
    注:自由な共鳴の最大値から片持ち式をチューニングすると、測定値14の安定性が向上します。
  10. サンプルホルダーにサンプルを置きます。適切なイメージング パラメータを選択します。一般的なスキャンレートは、1 x 1 μm2 ~ 5 x 5 μm2のスキャン領域で 0.3~1.0 Hz です。一般的な解像度は 256 x 256 ~ 1024 x 1024 ピクセルです。[スキャン領域]をクリックして、スキャン サイズとピクセル番号を選択します。
  11. サンプルに光学ビューを集中します。[アプローチ]をクリックしてサンプル サーフェスに近づきます。アプローチが完了したら、リフト100 μmをクリックして、サンプルの表面の上にAFM先端100 μmを上昇させます。サンプルの光学画像を[展開]をクリックします。フォーカスステージバーをクリックすると、サンプルの表面にビューがフォーカスされます。
  12. 矢印を使用して、対象のサンプルの領域内を移動します。アプローチボタンを押して表面を係合します。[ライン スキャン]ボタンをクリックし、必要に応じて先端がサーフェスによく従っているかどうかを確認します。
  13. スキャンボタンを押してサンプル表面のイメージングを開始します。イメージング中、大きなイメージング力を回避し、独立したサンプル内の一貫性を保つために、Δ20°42を超えない相変化の一定の体制を維持する。
  14. ファイル名を入力し、取得したイメージが保存される基本ディレクトリを選択します。

4. タンパク質凝集体の赤外線ナノ分光測定測定

  1. 熱安定化の測定の前に、AFM-IRシステムと赤外線(IR)レーザー60 30−60分をオンにします。AFM-IR計測器の代表的なレーザーは、光学パラメータ発振器(OPO)と量子カスケードレーザ(QCL)です。
  2. 内蔵ソフトウェアを開き、計測器を制御します。ファイルをクリックし、新しいnanoIRファイルを開くためにnewをクリックします。ボタンの初期化を押して、AFM-IR システムを起動します。
  3. 器械カバーを開き、AFM-IRシステムに30 nmの公称半径および0.2 N/mのばね定数のシリコン金コーティングされた調査を取付け、接触モードでサンプルを測定する。
  4. セクションAFM プローブの[ロード]をクリックし、次に .プローブセクションに焦点を当てて、片持ち式にカメラを集中させるために矢印をクリックします。セクションサンプルXYムーブメントでは、矢印を使用して片持ちの端にクロスエアーを配置します。
  5. 検出レーザーの位置を制御するノブを回転させ、片持ち端にレーザーを配置します。レーザーノブを回転させて、4象限フォトダイオードで測定された合計を値>3 V に回転させ、片持ち偏向を-1 V に調整し、次にクリックします。器械のカバーを閉じる。
  6. セクションでは、サンプルに焦点を当てて、サンプルにカメラを焦点を合わせるために矢印を使用します。次に、セクションサンプルでXYの動きは、サンプルの対象領域に移動し、アプローチをクリックして従事する矢印を使用します。
  7. 顕微鏡ウィンドウでは、サンプルの生物物理学的特性をマッピングするために目的のチャネルを入力として選択します。特に、形態の高さを選択し、IR 吸収の振幅 2とPLL 周波数を選択して、先端サンプル接触共鳴をマッピングします。
  8. コントロールウィンドウのAFM スキャンセクションでは、セクション 3 と同様のパラメータを使用します (つまり、スキャン レート 0.1−1.0 Hz、256 x 256 x 1024 x 1024 ピクセル)。サンプル粗さに従ってゲインの値として選択します: 積分 I = 1−10 と比例 P = 10−30.次に、スキャンをクリックして形態マップを取得します。
    注:形態はダイナミックタッピングモードでも同様に測定できますが、AFM-IR測定はコンタクトモードで行われ、信号対雑音比が高くなります。
  9. 形態のマッピングが完了したら、顕微鏡ウィンドウで、高さマップをクリックして、プローブを1つの集合体の上部に配置します。次に、コントロールウィンドウのnanoIRセクションで、開始IRをクリックして、IRレーザーでサンプルを照らします。
  10. 赤外レーザーを片持ちに合わせるには、最適化をクリックします。このウィンドウで、サンプルの吸光度が高いウェーブナンバーを書き込み、[add を追加]をクリックします。タンパク質の場合、一般的な値は 1655 cm-1です。スキャンをクリックしてIRレーザー位置を見つけ、更新をクリックして片持ちでその位置を整列します。ウィンドウを閉じます。
  11. nanoIR設定のセクション一般部では、相対界の高い吸光度が予想される波数を書き込む。次に、バンドパスフィルタオプションを無効にし、メーターの読み取り値と片持ち応答の高速フーリエ変換(FFT)を見ます。FFT ウィンドウで緑色のカーソルを移動して、片持ちの共振周波数を読み取ります。片持ちの共振のFFTの典型的な値は約300 kHzです。この共振周波数値をfreq. centerフィールドの一般的なセクションに書き込み、50 kHz のfreq. ウィンドウを使用します。
    注:メーターの読み取り値を飽和させず、片持ち応答に歪みを持ち、サンプルを過熱しないように十分に低いレーザーパワーを選択します。
  12. 共振強化モードを使用するには、レーザーパルスチューンウィンドウをクリックします。300 kHzの周波数センター、50 kHzのチューンレンジ、5%のレーザーのデューティサイクルを選択します。レーザーの脈拍数を掃引するために取得をクリックします。グラフ内のカーソルを使用して、レーザーパルスをIR光を吸収する試料の熱膨張の機械的応答の周波数に調整する。次に、オプション PLL を選択して、サンプルと先端の間の接触共鳴を監視します。PLLウィンドウのゼロボタンを押すと、チェックを入れ、サンプルチップ接触の共振を追跡できます。積分ゲイン I = 0.5 と比例ゲイン P = 10 を選択します。ウィンドウを閉じます。
  13. 最適化ウィンドウをもう一度開き、サンプルの主要な吸光バンド(アミドバンドI-II-III)に対応する少なくとも3つの波数のIRレーザーの位置と、レーザーの各チップに対して少なくとも1つの波数を見つけます。
  14. ツールをクリック |IR背景校正|新しい.ウィンドウで目的の分光領域を選択します (1800−1200 cm-1タンパク質サンプルを研究する);ステップ4.12で決定したのと同じ脈拍数を選択し、デューティサイクルを5%にします。高速取得をクリックしてレーザー速度を選択し、量子カスケードレーザーの典型的な範囲は20−500 cm-1の間です。取得をクリックして、IRレーザーの背景を測定します。この背景スペクトルは、測定されたナノスケール局所スペクトルの正規化に使用されます。ウィンドウを閉じます。
    注:高速レーザーと共振強化モードが使用できない場合は、ステップ4.12をスキップし、バックグラウンドとIRスペクトル集録ウィンドウの両方で高速ではなくステップスペクトルを選択します。ただし、単一の集約感度に達しません。
  15. IRスペクトル設定で、1-4 cm-1と少なくとも 64 倍の共平均の数の間の IR スペクトル解像度を選択します。タンパク質範囲(1800−1200 cm-1)のナノスケール局在IRスペクトルを測定するには、[取得]をクリックします。
  16. ナノスケールの解決済みケミカルマップを取得するには、IRイメージングオプションを選択し、対象の波数(アミドバンドIの場合は1655cm-1など)を選択し、AFMスキャンウィンドウでスキャンをクリックします。
  17. マッピングが完了したら、ファイルに移動し、測定値を保存します。取得した形態、接触共鳴、化学の地図とナノスケールの局所スペクトルを解析するには、内蔵のAFM画像処理ソフトウェアを使用します。スペクトルと画像は、商用ソフトウェアでさらに詳細な分析のために.csvまたは.axzファイルとして保存することができます。

5. 断面寸法の画像処理と解析

  1. 生画像14、17、19、41、42、59を平坦化し、内蔵のAFM画像処理ソフトウェアまたは商用ソフトウェアを使用する。
    注: 集計は、分析のアーティファクトを避け、測定された高さの過小評価を避けるために、計算からマスクする必要があります。
  2. イメージを 0 オーダー平面適合減算で平坦化します。
  3. 画像を平面で平坦化し、次いで1番目の回帰順で1行ずつ平坦化し、2番目のステップは、画像のラインプロファイルの平坦なベースラインに達するまで繰り返される。
  4. サンプルが非常に混雑している場合、非常に高い凝集体またはスキャナ弓アーティファクトが存在する、第2回回帰順序適合を用いて画像を平坦化する。
  5. フィブリル軸14、17、19、41、42、59に垂直に撮影された線プロファイルから集約の高さと幅を測定します。
  6. フィブリル軸14、17、19、41、42、59に平行な線維長を測定する。

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Representative Results

ThT蛍光アッセイによって測定されたAβ42凝集の代表的な時間経過を図1に示す。集約プロセスは、一般的に、ラグ相が最初に観察されるシグモイド曲線によって特徴付けられ、その後、平衡定常状態に達したときに曲線が高原に達する前に急激な成長相が続きます。,58.集約プロセスに関する分子の詳細を研究するために、最適化された集約プロトコルを使用して高品質のデータを生成することが重要である 58.

AFMの高分解能は、プロセスの異なる時点で凝集種の形態および不均一性を調査することを可能にする。ThTアッセイによってモニターされた凝集の間、プレート内のサンプルのアリコートは、AFMおよびナノIR(図1)による単一凝集調査のために調製される。手動サンプル調製の一般的なプロセスフローを図 2 に示します。高解像度および位相制御AFMによるサンプルの3D形態の測定が完了すると、マップは圧電スキャナの非線形性を除去し、サンプルの後処理分析における誤差源を減らすために平坦化されます。形態学(図3)。その後、図4に示すように、正確で感度の高い単一分子統計分析を行うことができます。3D形態マップから、集約された断面の高さ、幅、長さ(または球状粒子の場合の直径)を抽出することができ、集約時間中に存在する集合体の異なる種を区別し、特徴付けることを可能にする。コース23、38.集約のプロセスを調査する一般的な時間ポイントは、ラグフェーズ、成長段階、高原相です(図1)。ラグフェーズの間に、Aβ42のモノマーおよびオリゴマー種が主に存在する。AFMによって可視化すると、Aβ42のモノマーおよびオリゴマー種は、典型的には直径1−15nmの球状粒子として現れ、高さは0.3−2nm(図1、左下)38、39である。細長い原型化症、原生線および線維の形成は、Aβ42凝集時間コース(図1、下中間)38、39の成長期に見える。一般的に、プロトフィラメントは長さが数百ナノメートル、高さが0.5~2nmの細長い特徴として現れ、プロトフィブリルは高さ1~5nm、長さ38ナノメートル数百ナノメートルの長さとして見えます。 39.高原期の間、フィブリルはAβ42凝集体の主要な種である。Aβ42フィブリルは、典型的には、分岐していない、糸状の構造として現れ、マイクロメートル(図3、右下)38、39の場合、断面直径6−10nmおよび長さである。驚くべきことに、凝集体の形態特性のこの概略表現は、最も凝集するタンパク質およびペプチド13、14の一般的な特徴である。

サンプル形態の調査後、ナノIRは、凝集の過程で存在する個々のタンパク質凝集種の化学的特性を調べ、空気中のナノスケール分解IRマップおよびスペクトルの両方を取得することにより使用することができる。ネイティブ液体環境24、26、38、4249、50、51、52、.図 5は、AFM-IR セットアップの概略図を示しています。IR ソースは、図 5aのように、内部反射全体または上から直接サンプルを照らすのに使用されます。IR光が試料によって吸収されると、存在する種の対応する分子振動エネルギー遷移レベルを励起する。振動エネルギーは、熱加熱の形でサンプル内部に放散され、サンプルの熱膨張を引き起こします。この膨張は、10 nmの順序で分解能を持つサンプルと接触するAFM先端によってナノスケールで測定される。各パルスで、片持ちは熱膨張を検出する。特に、サンプルの高速膨張は、サンプルとの接触から片持ち端を蹴り出し、片持ちは、その自然な周波数で下にリングをキックアウトした後。AFM-IRの感度を高めるために、片持ち54の発振と同じ周波数でレーザーパルス周波数を調整することができる。この共振強化モードで動作するためには、1-1000 kHzの範囲で動作する量子カスケードレーザーなど、幅広い周波数でパルスできるIR源が必要です。ピーク対ピーク振幅およびリングダウン信号の高速フーリー変換は、IR振幅と呼ば、生片持ち偏向の吸収されたIR光に比例する。これらの信号は、片持ちの上部に焦点を当てた赤色レーザーの偏向を測定することによってリアルタイムで検出されます。化学地図を取得するために、レーザー波数は特定の波数で固定され、IR振幅信号はマップの各ポイントで収集され、一方、IRスペクトルを取得するために、片持ちの位置は目的の位置とレーザーに固定されます。波長は、目的の分光範囲に沿って掃引されます。AFM-IRの究極の分解能により、図6に表すように、断面高さ約5nmのタンパク質凝集体の化学的特性の測定が可能になります。

Figure 1
図1:ThT蛍光およびAFMを介したインビトロにおける凝集時間経過のモニタリング。
ThT蛍光によって検出された凝集プロセスのラグ相、成長期、および高原期の間に採取されたサンプルを、高解像度AFMを介して画像化した。このフィギュアは、ルッジェリら38から適応されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:AFM測定のための基板調製およびサンプル堆積の概略表現。
(A, B)粘着テープを使用したマイカエッチング。(C)サンプル堆積。(D)サンプルインキュベーション。(E)超純水ですすいでサンプル。(F)窒素の穏やかな流れの下でのサンプル乾燥。(G)微細加工AFM片持ち式を用いたサンプルイメージングと、端部に鋭い先端を付けた。(H)アミロイド線維の処理画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:AFM画像処理手順42.
各パネルの上部には、対応する AFM イメージで示されるサンプル サーフェスのプロファイルライン (赤い線) が表示され、下部にはイメージ内のすべてのピクセルの高さのヒストグラムが表示されます。(a)画像フラット化手順の前に生のAFM画像。(b)平面全体の平坦化を用いて処理手順後のAFM画像。フィブリル構造(ピンク色)は、平坦化手順からマスクされた。(c)1行ずつフラット化手順を使用して処理された画像。(d)画像処理手順後の最終画像。この図は、ルッジェリら42から適応されています。

Figure 4
図4:AFM画像の単一集約統計分析。
(a)フィブリル構造の高さと長さのトレースの例を、1および2で示す。(b)トレースされた線維のセクションとその平均高さのグラフ。(c)フィブリル構造の平均高さを示すヒストグラムの例。(d)トレースされたフィブリル1および2の正規化されたプロファイルを持つグラフ。(e)正規化されたプロファイルの高さポイントのヒストグラム分布。この図は、ルッジェリら42から適応されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:AFM-IR法の機能原理
(a)吸収されたIR光は、試料の熱膨張を引き起こし、試料と接触するAFM片持ちの機械的共振を刺激する。片持ち振動の振幅は、IR吸収に比例します。(b)IR吸収マップは、レーザー波長を固定しながら試料上の片持ち直しをスキャンして得られる。(c)接触する先端およびサンプルは、共振周波数がサンプル50の本質的な剛性と単調に増加する結合スプリングのシステムとして振る舞う。(d)局所スペクトルは、AFM片持ちの位置を固定しながらレーザー波長を掃引することによって得られる。(e)タンパク質のIRスペクトル。(f)要約すると、AFM-IRはナノスケール26における形態学的、機械的および化学的特性の同時研究を可能にする。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:単一アミロイド凝集体の赤外ナノ分光法(nano-IR)。
(a)AFM形態マップ。(b)1658 cm-1のレーザー共振ピークにおけるIR吸収マップ。(c)フィブリルの高さの断面寸法。(d)フィブリラー構造の異なる位置のIRスペクトル(青い円でパネルbでマーク)と基板(緑色の円でパネルbでマーク)。集合体構造から導出する平均正味信号(黒線)は、平均線維信号(実線青色線)から平均バックグラウンド信号(実緑色線)を差し引いて得た。この図は、ルッジェリら42から適応されています。

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Discussion

このプロトコルの最初の重要なステップは、ステップ1.1および1.2で説明するAβ42溶液の場合のような単量体タンパク質の調製である。オリゴマーまたは凝集種の存在は、凝集運動学58の再現性が悪い可能性があり、AFMでアーティファクトを誘導する可能性があるため、非常に純粋な単量体溶液から集約プロセスを開始することが不可欠です。測定(例えば、フィブリル種は、集計の初期段階で明らかになる)、データの誤解につながる可能性があります。ThT蛍光アッセイに基づくアミロイド形成の高再現性の動態データは、化学動態のマスター方程式形式化に関連して5,6,7、Aβ42凝集を定義することができたその基礎となる分子事象の観点からメカニズム。化学動態は、新しい凝集体が形成および成長するさまざまな方法を考慮することによって、アミロイド形成の基礎となる顕微鏡的ステップをそのマクロスコピック症状と結び付けます。凝集面上の核生成。しかし、化学動態だけでは、単一分子法との組み合わせを必要とするナノスケールで起こりうる核生成現象の可視化を直接可能にするものではありません。

このプロトコルの2番目の重要なステップは、ステップ2.2および2.6−2.8で説明する基板調製およびサンプル堆積手順です。アーティファクトを避けるには、サンプルをクリーンで原子的に平らな表面に堆積させる必要があります。マイカの適切なエッチングは、AFM測定でアーティファクトフリーの高解像度を達成するために不可欠です。サンプル蒸着時間も非常に重要であり、インキュベーション時間が長いほど基板表面への吸収性が向上します。しかし、人工的な自己組織化および自己組織化25を誘発する可能性もあり、データの誤解釈を引き起こす可能性のあるアーティファクト(例えば、表面誘発凝集種)を誘発する可能性がある。さらに、マイカ表面は負に帯電し、正に帯電した分子だけが吸収しやすいことを意味します。試料の正味電荷が負の場合、マイカの表面は、より良いフィシソルプション23のためにAPTESを用いて正に機能化することができる。マイクロ流体スプレー堆積25は、これらの効果およびアーティファクトを回避し、単一のステップおよびアーティファクトのない方法でサンプルを堆積させるために利用することができる。

3 番目の重要な手順は、セクション 3 で説明する AFM および AFM-IR を介したサンプルイメージング用の適切なセットアップとイメージング パラメータの選択です。サンプルイメージングに使用されるAFMチップは、高解像度を達成し、畳み込み効果(先端によるサンプル特徴の拡大)を最小限に抑えるのに十分な鋭さ(2−8nmの頂点半径)でなければなりません14は、サンプルの画像に不確実性を誘発する可能性があります。イメージングモード、接触または動的の選択も重要です。従来のAFMを介したサンプルイメージングの場合、後者モードは、サンプル損傷を引き起こす可能性のある大きな横先端サンプル摩擦力を誘発し、測定にアーティファクトを導入する(例えば、減らす)ため、接触モードよりも動的モードが好ましい。ナノインデントによるサンプル高さ)14,61,62.逆に、接触モードは、AFM-IR信号を増強するためにナノIRを介した測定のために好ましい。動的モードでの測定では、片持ちは、測定14のより高い安定性を保証するために、振動の最初の自由共振の最大値(タッピングモード)または上(非接触モード)のわずかに下にチューニングする必要があります。撮像解像度は、ピクセル数とスキャン領域に依存し、標本に存在する最小の詳細度(例えば、4 x 4 μm2領域の1024 x 1024ピクセル)14、63をキャプチャするのに十分な高さでなければなりません。低い撮像解像度は、信号14のデジタル化時に垂直および横方向の情報が失われるため、サンプルの画像に歪みや不確実性を引き起こす可能性がある。画像化に使用されるスキャンレートは、先端が表面の特徴に正しく従うことができるだけでなく、化学情報14を取得するのに十分な時間を持つことができるのに十分低い必要があります。最も重要なイメージングパラメータの1つは、イメージング力です。接触モードでは、サンプルの構造を維持するために低い相互作用力を使用することが基本です。動的モードでは、異なるサンプルの形態を一貫して比較するために、サンプルのエネルギー放散を一定に保つ必要があります。独立したサンプルの一貫したイメージ投射はΔ20°14、42を超えない相変化の一定の体制を維持することによって得ることができる。大きなイメージング力は、サンプル画像に歪みや不確実性を引き起こす可能性があるため、避ける必要があります。

熱変動によるAFM部品の膨張および収縮によって引き起こされる熱ドリフトは、試料64、65の画像に歪みおよびアーティファクトを誘発しうる。垂直方向にドリフトすると、片持ちが表面を見失い、表面に衝突する可能性がありますが、横方向にドリフトすると、通常、表面の特徴や画像の歪みが伸び、表面の特徴や画像の歪みが生じにくくなります。サンプル特徴の精密な測定を達成する。これらの熱ドリフトの効果は、実験室の正確な温度制御だけでなく、システムが安定するために十分な時間(約30分)を与えるか、または高速スキャン66、67、68を行うことによって最小限に抑えることができます,69歳,70.

AFM-IRによるナノIRイメージングおよびスペクトル収集の品質は、いくつかの要因の影響を受ける可能性があり、その中で最も重要なのは、(i)IRバックグラウンドによるサンプル上のIR信号の誤った分割、(ii)先端間のナノメカニカル接触の大きなバリエーションである。試料と、(iii)その軟化を引き起こす試料の過度の加熱。サンプルのIRスペクトルを収集した背景で正しく分割するには、それらが同じレーザーパワーで収集することが重要です。確かに、IRレーザー背景のスペクトルライン形状は、レーザーのパワーに依存します。そして、測定された化学情報に対するサンプルの機械的特性の影響を避けるためには、スペクトルおよび画像取得時に試料と先端との接触共鳴を監視および追跡することが重要である。スペクトル集録の場合、理想的には、固定接触共振でレーザーをパルスするのに十分である。しかし、スペクトルが大きな分光範囲で獲得されると、高強度ピークが試料の強い加熱とその軟化を引き起こし、チップサンプル接触共鳴を変化させ、IRピーク振幅を人為的に減少させる可能性があります。このため、スペクトルがサンプルの過度の加熱の影響を受けないようにするために、スペクトル集録中の接触共鳴を追跡することが重要です。

結論として、従来のAFMおよびナノIRは、タンパク質凝集24、38の間に形成される個々の種の形態学的、構造的および化学的特性を高解像度で調製することができる。しかし、彼らはネイティブバルク条件で形成の彼らの急速な動態に従う化学動態の能力を欠いています。タンパク質の凝集や誤折時に起される立体構造の変化を解明するためには、バルク生物物理学的手法の能力と共に、新しい生物物理学的方法を開発し、適用する必要がある。ナノスケールにおけるタンパク質凝集の不均一性と超構造特性の調査このアプローチは、タンパク質自己組織化の問題と健康と病気におけるその役割を理解するという課題に対処するための実りある道を表しています。実際、単一凝集アプローチは、タンパク質凝集多型および形成の分子機構を解明し、解明することができる。この情報は、タンパク質凝集とヒト疾患の発症と進行におけるその役割を理解し、バイオテクノロジーアプリケーションに対する生物物理学的特性を理解するという課題に取り組むための中心的な役割を果たします。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

著者らは、スイス国立科学財団(SNF)の財政支援(助成番号P2ELP2_162116とP300P2_171219)、ダーウィンカレッジ、エラスムス+プログラム(助成番号2018-1-LT01-KA103-046719-154000)に感謝します。これらの成果につながる研究は、ERC助成金フィスプロト(契約番号337969)、ニューマン財団(T.P.J.K.)および欧州連合の第7フレームワークプログラム(FP7/2007-2013)の下で欧州研究評議会から資金を受け取っています。ケンブリッジ・センター・フォー・フォールディング・疾患(C.G.、M.V.、T.P.J.K.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

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