Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisering af individuelle protein aggregater ved infrarød Nanospektroskopi og atomkraften mikroskopi

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

Vi beskriver anvendelsen af infrarød nanospektroskopi og høj opløsning atomkraft mikroskopi at visualisere processen med protein selvsamling i oligomer aggregater og amyloid fibrils, som er tæt forbundet med debut og udvikling af en lang række humane neurodegenerative lidelser.

Abstract

Fænomenet protein fejl foldning og aggregering resulterer i dannelsen af meget heterogene protein aggregater, som er forbundet med neurodegenerative lidelser som Alzheimers og Parkinsons sygdomme. Især lavmolekylære aggregater, amyloid oligomerer, har vist sig at besidde generiske cytotoksiske egenskaber og er impliceret som neurotoksiner i mange former for demens. Vi illustrerer brugen af metoder baseret på atomkraften mikroskopi (AFM) til at løse den udfordrende opgave at karakterisere de morfologiske, strukturelle og kemiske egenskaber af disse aggregater, som er vanskelige at studere ved hjælp af konventionelle strukturelle metoder eller bulk biopysiske metoder på grund af deres heterogenitet og forbigående karakter. Scanning sonde mikroskopi tilgange er nu i stand til at undersøge morfologien af amyloid aggregater med sub-nanometer opløsning. Vi viser her, at infrarød (IR) nanospektroskopi (AFM-IR), som samtidig udnytter den høje opløsning af AFM og den kemiske anerkendelse magt IR spektroskopi, kan gå videre og gøre det muligt karakterisering af de strukturelle egenskaber af individuelle protein aggregater, og dermed give indsigt i aggregerings mekanismerne. Da den tilgang, vi beskriver, også kan anvendes på undersøgelser af interaktioner mellem protein samlinger med små molekyler og antistoffer, kan den levere grundlæggende oplysninger til udvikling af nye terapeutiske forbindelser til diagnosticering eller behandling af neurodegenerative lidelser.

Introduction

Over 40.000.000 mennesker på verdensplan er i øjeblikket ramt af neurodegenerative lidelser, såsom Alzheimers (AD)1 og PARKINSONS (PD)2 sygdomme. Mere generelt er mere end 50 patologier forbundet på molekylær niveau med protein misfoldning og aggregering, en proces, der fører til spredning af uopløselige fibrillar protein aggregater, kendt som amyloid indskud3, 4. den molekylære oprindelse af neurodegeneration og dens forbindelser med protein konformationelle ændringer af proteiner, som fører til amyloid dannelse, er dog fortsat uklar, i vid grad på grund af det høje niveau af heterogenitet, forbigående natur og nanoskala dimensioner af de patologiske aggregater4,5.

Meget vellykkede undersøgelser af proteinstrukturer i de sidste mange årtier har været baseret bredt på brugen af bulk metoder, herunder røntgenkrystallografi, Cryo-elektronmikroskopi og nuklear magnetisk resonansspektroskopi5, 6 , 7 , 8 , 9. inden for denne klasse af teknikker, infrarød (IR) spektroskopi er dukket op som et følsomt analytisk værktøj til at afdække de kemiske egenskaber af biologiske systemer såsom proteiner8. INFRARØDE metoder gør det muligt at kvantificere protein sekundære og kvaternære strukturelle ændringer under deres misfoldning og sammenlægning. Desuden, for yderligere at dechifrere på mikroskopisk niveau de mekanistiske detaljer, der er involveret i den komplekse frie energi landskaber af protein i løbet af deres sammenlægning, et stort fremskridt har været udviklingen af kemiske kinetik værktøjer til at udvide til komplekse selv montage veje, herunder amyloid fibriller dannelse5,6,7,10,11,12. Bulk-spektroskopiske metoder giver dog kun gennemsnitlige oplysninger om det heterogene ensemble af arter, der findes i opløsningen eller er involveret i specifikke mikroskopiske trin, hvilket gør undersøgelsen af de biofysiske egenskaber af individuelle aggregerede arter udfordrende på nanoskala niveau13,14.

Flere mikroskopi teknikker med evnen til at betjene på skalaer mindre end diffraktion grænse for lys er dukket op i de sidste årtier. Denne klasse af metoder omfatter elektronmikroskopi (EM) og atomkraften mikroskopi (AFM). Mens scanning elektronmikroskopi (SEM) og transmission elektronmikroskopi (TEM) giver to-dimensionelle (2D) billeder af en prøve, AFM er dukket op i de sidste årtier som en kraftfuld og alsidig teknik til at studere tredimensionelle (3D) morfologier, som samt de nanomekaniske egenskaber ved en prøve med sub-nanometer opløsning13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. rationalet bag studiet af protein aggregering via AFM er, at denne fremgangsmåde gør det muligt at efterforske morfologien af de enkelte arter, der findes i løsning13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Navnlig ved at overvåge stikprøven som en funktion af tid, giver AFM mulighed for at efterforske udviklingen i morfologien af arterne i prøven, hvilket gør det muligt at følge og visualisere vejene for amyloid dannelse23, 25,38,39,40,41,42. Desuden gør AFM det muligt at kvantificere strukturelle parametre såsom tværsnits højder og længder af de enkelte arter, som findes i opløsning13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. studiet af en enkelt biopysisk egenskab, såsom morfologi, er imidlertid ofte ikke tilstrækkeligt til at studere heterogene og komplekse biologiske systemer. AFM, SEM eller TEM Imaging metoder alene ikke umiddelbart afslører de kemiske egenskaber af heterogene arter af amyloid aggregater i nanoskala.

Der er for nylig foretaget et stort fremskridt i analysen af heterogene biologiske prøver i denne størrelsesorden med udvikling og anvendelse inden for protein aggregering af infrarød nanospektroskopi (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Denne innovative metode udnytter kombinationen af den rumlige opløsning af AFM (~ 1 − 10 nm) med den kemiske analyse effekt af IR. AFM-IR-teknikken er baseret på målingen af den fototermiske inducerede resonans effekt, der drives af en IR-Laser, og på målingen af den termiske udvidelse af prøven under undersøgelse af AFM-spidsen. Prøven kan belyses af IR-laseren direkte fra toppen eller fra bunden i total intern refleksion, på samme måde som i konventionel infrarød spektroskopi24,42,52,53 . IR laseren kan pulseres med typiske frekvenser i rækkefølgen af hundredvis af kilohertz (1 − 1000 kHz) og tunet over et bredt spektralområde, typisk mellem 1000 − 3300 cm-1. Selvom laserkilden dækker et område med en diameter på ~ 30 μm, bestemmes den rumlige opløsning af AFM-IR-teknikken nominelt af AFM-spids diameteren, som registrerer systemets lokale termiske ekspansion. AFM-IR er velegnet til at studere biologiske prøver, fordi IR-signalet er proportionalt med deres tykkelse op til 1 − 1,5 μm, og den resulterende IR-spektre er generelt i enighed med den tilsvarende ftir-transmission Spectra13,54 ,55. Af denne grund kan der let anvendes etablerede analysemetoder i spektroskopi, såsom undersøgelse af kemiske forskydninger, ændring af båndform og afspænding ved anden derivat analyse52. Samlet set muliggør AFM-IR samtidig erhvervelse af en lang række morfologiske, mekaniske og kemiske egenskaber af en prøve i nanoskalaen ved at kombinere den rumlige opløsning af AFM med den kemiske anerkendelses effekt af IR-spektroskopi.

Her illustrerer vi en protokol for karakterisering af processen med protein aggregering, der udnytter kombinationen af in vitro fluorescens assays, høj opløsning AFM-billeddannelse og nanoskala AFM-IR. Denne kombinerede tilgang har allerede udmærket sig ved at give detaljerede resultater med hensyn til at studere de kemiske og strukturelle egenskaber af individuelle mikro-dråber dannet af protein aggregater, i studiet af flydende-flydende protein faseadskillelse, og i undersøgelse af heterogenitet og biofysiske egenskaber af individuelle aggregerede arter i nanoskala23,26,38,45,50,53, 56af57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. aggregerings analyser på fluorescens plade læsere

Bemærk: den protokol, der er beskrevet her, er et eksempel på, hvordan man studerer aggregeringen af ethvert protein eller peptid med kemiske kinetik. Især beskriver det en optimeret protokol til at studere aggregeringen af Aβ 42 peptid, som er involveret i udbrud og progression af Alzheimers sygdom58,59. En lignende protokol kan justeres og vedtages i retning af at studere aggregeringen af ethvert protein eller peptid.

  1. Opnå en meget ren monomerisk opløsning af Aβ 42 gennem ionbytnings-og størrelses udelukkelses-kromatografi teknikker til at skelne mellem protein fraktioner indeholdende Aβ 42 og til at isolere den monomere fraktion fra andre aggregerede former for Aβ 42 opnået58 , 59.
  2. Aβ 42 peptid fortyndes i 20 mM natriumfosfat buffer, 200 μM EDTA ved pH 8,058 til en ønsket slutkoncentration på mellem 1 − 5 μM, i 1,5 ml lav-binde rør. Prøver indsamlet til AFM-målinger bør ikke indeholde det fluorescerende farvestof, der anvendes i aggregerings analysen (thioflavin T, ThT), da det kan introducere artefakter under prøve aflejring for AFM-analyse. Således forberede tre eksemplarer af to identiske opløsninger: i) den første indeholdende mono Aβ 42 at følge processen med sammenlægning af AFM; II) den anden indeholder Aβ 42 mono med en tilsætning af 20 μM tht som en Tracer til at overvåge kinetikken af aggregering.
    Bemærk: det er vigtigt at udføre trin 1,1 og 1,2 på is. Denne fremgangsmåde er at sikre, at mono Aβ 42 opløsningen ikke aggregeres før initieret i plade læseren. Ved håndtering af prøver er omhyggelig pipettering afgørende for at undgå indførelse af eventuelle luftbobler, der kan påvirke protein prøven.
  3. Der afpipetteres 80 μL af hver prøve i hver brønd af en 96-brønd, halv område plade af sort polystyren med klare bund-og ikke bindende overflader.
  4. Forsegl pladen med en folie for at minimere fordampningen af prøven i løbet af aggregeringen.
  5. Temperaturen af plade læseren til 37 °C.
  6. Indstil aggregerings protokollen til at læse fluorescens målinger ved faste tidspunkt intervaller, ved en excitation bølgelængde på 440 nm og en emission bølgelængde på 480 nm. Aggregeringen skal initieres i de under spurgte betingelser.
  7. Sæt pladen ind i plade læseren.
    Bemærk: det er vigtigt at være forsigtig, når pladen håndteres, for at sikre, at aggregeringen ikke udløses, før plade læseren startes. Brug Gain-justeringsindstillingerne for at sikre den optimale aflæsning af fluorescensen for hver prøve.
  8. Start målingen.
    Bemærk: aggregerings forsøget afsluttes, når ThT fluorescens sigmoidal kurve når et plateau58.

2. prøveforberedelse til AFM-og nanoinfrarøde målinger

  1. Lim højeste kvalitet klasse v1 Mica disc til høj kvalitet magnetisk rustfri-stål skive ved hjælp af klæbende faner eller dobbeltsidet tape.
  2. Etch glimmer ved at placere et stykke klæbebånd på glimmer overfladen og trække det øverste lag af glimmer. Denne procedure vil producere ren, atomisk flad overflade, egnet til prøve deposition.
    Bemærk: den ætsede overflade skal være ensartet og glat.
    Forsigtig: Undlad at røre ved eller trække vejret direkte over frisk ætset glimmer, da dette vil introducere artefakter.
  3. Pause/stop plade læseren måling for at indsamle tidspunktet af interesse under aggregeringen processen med proteinet.
  4. Forseglings folien udtages, og der opsamles 10 μL alikvot af prøverne uden at nå ind i en 1,5 mL-rør med lav binding.
  5. Indbetal 10 μL af prøven på det frisk ætsede glimmer. For AFM-IR-målinger skal prøverne deponeres på frisk strippet guld substrat.
  6. Opløsningen inkubes på glimmer i 1 min. for at tillade fyring.
    Bemærk: længere inkubationstid vil give bedre absorption på overfladen, men kan fremkalde kunstig selvorganisering og selv montage25. For at undgå disse virkninger, spray aflejring kan udnyttes25.
  7. Skyl tre gange med 1 ml ultrarent vand.
  8. Tør under en mild kvælstofstrøm for at måleprøven i luftmiljøet.

3. AFM billeddannelse af morfologien af protein aggregater

Bemærk: morfologi målinger kan udføres både i kontakt og dynamisk tilstand, i de følgende trin sidstnævnte er beskrevet, da det reducerer laterale kræfter til at måle 3D morfologi af prøven med høj opløsning. AFM-IR-målinger vil blive udført i kontakttilstand for at forbedre AFM-IR-signal-støj-forholdet.

  1. Tænd for AFM-systemet mindst 30 minutter før målingerne for at gøre det muligt for systemet at opnå termisk stabilitet. Klik på Setup, derefter på Probe. I sonde Skift vindue Klik på næste for at forberede Z, fokus fase.
  2. Sluk for AFM-stråle kontakten (hvis den er tændt). Lås Dovetail låse, afbryde hovedet fra systemet og i sonde Skift vindue Klik på næste.
  3. Monter AFM cantilever på sonde holderen. Tilslut hovedet til systemet og lås Dovetail låse.
    Bemærk: optimale Canti håndtag til at studere biologiske prøver i dynamisk tilstand AFM har fjederkonstant, som spænder mellem 2 − 40 N m-1 og en Apex radier, som spænder mellem 2 − 8 nm14.
  4. Tænd AFM laserstråle kontakten og i sonde Skift vindue Klik på næste.
  5. Klik på Nej i pop op-vinduet, hvis typen cantilever ikke blev ændret. Juster optiske justeringsknapper for at finde Canti håndtaget. Juster fokus på cantilever og klik på næste.
  6. Klik på Ja i pop op-vinduet, hvis der er fokus på cantilever.
  7. Placer laserstrålen i enden af udbaffel håndtaget ved hjælp af den kontrollerende position på detektionslaseren. Maksimer det samlede signal målt ved den firekvadrant-fotodiode til mindst > 1 V ved hjælp af de knapper, som styrer positionen af den afbøjede laserstråle på den positions følsomme fotodiode (PSPD). I sonde Skift vindue Klik på næste og derefter på Luk.
  8. Vent 15 min for Canti håndtaget at nå termisk stabilitet. Juster kun positionen af den deflekteret laserstråle på PSPD, hvis det er nødvendigt.
  9. Klik på NCM SWEEP, vælge den ønskede amplitude af oscillation, skal du klikke på Brug fase, skal du klikke på Auto og tune cantilever tæt på den maksimale af sin første frie resonans af oscillation, som er på ca. 300 kHz for en en fjederkonstant på 40 N m-1.
    Bemærk: tuning af udcingen ud af den maksimale af dens frie resonans sikrer højere stabilitet af målingerne14.
  10. Prøven placeres på prøveholderen. Vælg egnede billedbehandlings parametre. Typisk scanningshastighed er 0,3 − 1,0 Hz for et scanningsområde på 1 x 1 μm2 til 5 x 5 μm2. Der kræves en typisk opløsning mellem 256 x 256 og 1024 x 1024 pixels. Klik på scanningsområdet for at vælge scanningsstørrelsen og pixel nummeret.
  11. Fokuser den optiske visning på prøven. Klik på tilgang til at nærme prøvefladen. Når tilgangen er afsluttet, klik på løft 100 μm for at hæve AFM spidsen 100 μm over overfladen af prøven. Klik på Udvid på det optiske billede af eksemplet. Klik på fokus trin bjælken for at fokusere visningen på overfladen af prøven.
  12. Brug pilene til at flytte i området af prøven af interesse. Engagere overfladen ved at trykke på approach -knappen. Klik på linje Scan knappen, og kontrollere, om spidsen følger overfladen godt, hvis det er nødvendigt, justere set punkt.
  13. Start billedbehandling af prøveoverfladen ved at trykke på knappen Scan . Under billeddannelse, for at undgå store billeddannelse kraft og holde konsistens af inden for uafhængige prøver, opretholde en konstant regime af fase ændring ikke overstiger Δ20 °42.
  14. Indtast filnavn, og vælg basismappe, hvor det erhvervede billede skal gemmes.

4. infrarøde nanospektroskopi målinger af protein aggregater

  1. Tænd AFM-IR-systemet og den infrarøde (IR) laser60 30 − 60 minutter før målinger til termisk stabilisering. Typiske lasere til AFM-IR-instrumenter er optiske parameteroscillatorer (OPO) og Quantum Cascade lasere (QCL).
  2. Åbn den indbyggede software til at styre instrumentet. Klik på fil og derefter på ny for at åbne en ny nanoir -fil. Tryk på knappen initialisere for at starte AFM-IR-systemet.
  3. Åbn instrument dækslet, og Monter det på AFM-IR-systemet en silikonebelagt sonde med en nominel radius på 30 nm og en fjederkonstant på 0,2 N/m for at måleprøven i kontakttilstand.
  4. Klik på belastning i afsnittet AFM sonde og derefter næste. I fokus på sonde sektion Klik på pilene for at fokusere kameraet på cantilever. I afsnittet Sample XY bevægelse, skal du bruge pilene til at placere Cross-Air i slutningen af cantilever.
  5. Drej knapperne, som kontrollerer placeringen af detektionslaseren, til positions laseren i slutningen af udcarmen. Drej laser knoppen for at detektere og maksimere summen målt ved den firekvadrant fotodiode til en værdi ≫ 3 V. Drej på afbøjnings knappen for at justere udbøjningen til-1 v, og klik derefter på næste. Luk dækslet på instrumentet.
  6. I afsnittet fokus på prøve brug pilene til at fokusere kameraet på prøven. Derefter, i afsnittet eksempel XY bevægelse bruge pilene til at flytte i regionen af interesse for prøven og klik på tilgang og engagere.
  7. I mikroskopet vindue vælge som input de kanaler af interesse for at kort de biofysiske egenskaber af prøven. Vælg især højde for morfologi, AMPLITUDE 2 for IR absorption og PLL frekvens for at kort spids-prøve kontakt resonans.
  8. I afsnittet AFM-scanning i vinduet kontrolelementer skal du bruge lignende parametre som i afsnit 3 (dvs. scanningshastigheden 0,1 − 1,0 Hz, mellem 256 x 256 og 1024 x 1024 pixels). Vælg som værdi af gevinsterne efterprøve ruhed: Integral I = 1 − 10 og proportional P = 10 − 30. Klik derefter på Scan for at erhverve et morfologi kort.
    Bemærk: morfologien kan måles på samme måde i den dynamiske tryk tilstand, men AFM-IR-målingerne udføres her i kontakttilstand for at have et højere signal til støjforhold.
  9. Efter kortlægningen af morfologi er færdig, i mikroskopet vindue, skal du klikke på højden kortet for at placere sonden på toppen af en aggregat. Derefter skal du i afsnittet Nanoir i vinduet kontrolelementer klikke på Start IR for at belyse prøven med IR-laseren.
  10. For at fokusere den infrarøde laser på cantilever, klik på optimering. I dette vindue skal du skrive et wavenumber, hvor eksemplet skal have høj absorbans, og klikke på Tilføj. For protein er en typisk værdi 1655 cm-1. Klik på Scan for at finde den infrarøde laser position og klik på Opdater for at justere dens position med cantilever. Luk vinduet.
  11. I afsnittet Generelt i nanoir -indstillingen skriver du et wavenumber, hvor der forventes høj absorbans i det relative felt. Deaktiver derefter indstillingen band pass filter , og se på måler aflæsningen og på Fast Fourier transformation (FFT) for cantilever-responset. I FFT vinduet flytte den grønne markør for at læse resonansfrekvens af cantilever. En typisk værdi af FFT af resonansen af CDer er omkring 300 kHz. Skriv denne resonansfrekvens værdi i afsnittet Generelt i feltet freq. Center , og brug et freq. Window på 50 kHz.
    Bemærk: Vælg en laser effekt, der er lav nok til ikke at mægle måleren aflæsning og til at have forvrængning i cantilever respons og til ikke overophedet prøven.
  12. Klik på laser Pulse tune vindue for at bruge resonans forbedret tilstand. Vælg et frekvens Center på 300 kHz, en tune rækkevidde på 50 kHz og en vagt cyklus af laseren på 5%. Klik på erhverve at feje puls hastighed af laseren. Ved at bruge markøren i grafen, tune laser puls til hyppigheden af den mekaniske respons af den termiske ekspansion af prøven absorbere IR lys. Vælg derefter indstillingen PLL for at overvåge kontakt resonansen mellem prøven og spidsen. Tryk på nulknappen i PLL-vinduet, og Marker Aktivér for at spore kontakt resonansen for eksempel spidsen. Vælg en Integral gevinst I = 0,5 og proportional gevinst P = 10. Luk vinduet.
  13. Åbn optimerings vinduet igen, og find placeringen af IR-laseren for mindst 3 wavenumbers svarende til de store absorbans-bånd i prøven (AMID-båndet I-II-III) og for mindst én wavenumber for hver chip af laseren.
  14. Klik på værktøjer | IR-baggrunds kalibrering | Nyt. I vinduet skal du vælge den spektroskopiske region af interesse (1800 − 1200 cm-1 at studere protein prøver); Vælg den samme puls sats som bestemt i trin 4,12 og en arbejdscyklus på 5%; Klik på hurtig erhvervelse og vælg laser hastighed, typisk område for en Quantum Cascade laser er mellem 20 − 500 cm-1. Klik på Hent for at måle den infrarøde laser baggrund. Dette baggrunds spektrum vil blive brugt til normalisering af målte nanoskala lokaliseret spektre. Luk vinduet.
    Bemærk: Hvis en hurtig laser-og resonans udvidet tilstand ikke er tilgængelig, skal du springe trin 4,12 over og vælge trådt Spectra i stedet for hurtig i både baggrunden og IR Spectra Acquisition Windows. Enkelt aggregat følsomhed vil dog ikke blive nået.
  15. I IR Spectra indstillinger, Vælg en IR-spektrum opløsning mellem 1 − 4 cm-1 og en række Co-gennemsnit på mindst 64x. Klik på Hent for at måle en nanoskala lokaliseret IR spektrum i protein området (1800 − 1200 cm-1).
  16. For at erhverve en nanoskala løst kemisk kort, Vælg IR Imaging option, Vælg en wavenumber af interesse (f. eks 1655 cm-1 for AMID band i) og klik på Scan i AFM Scan vinduet.
  17. Når tilknytningen er fuldført, skal du gå til fil og gemme målingerne. For at analysere de erhvervede kort over morfologi, kontakt-resonans og kemi, samt nanoskalaen lokaliseret Spectra, bruge den indbyggede AFM billedbehandling software. Spectra og billeder kan gemmes som. csv eller. axz filer for yderligere detaljeret analyse med kommerciel software.

5. billedbehandling og analyse af tværsnits dimensioner

  1. Samkopier RAW-billeder14,17,19,41,42,59 ved hjælp af indbygget AFM-billedbehandlings software eller kommerciel software.
    Bemærk: aggregaterne skal maskeres fra beregningen for at undgå analyse genstande og undervurdering af deres målte højde.
  2. Samkopier billedet med 0 Order plane fit subtraktion.
  3. Samkopier billedet med fly og derefter linje for linje ved en 1St regressions rækkefølge, gentages det andet trin, indtil den flade baseline i linje profilen for billedet er nået.
  4. Hvis prøven er meget overfyldt, indeholder usædvanligt høje aggregater eller scanner bue artefakt er til stede, flade billede ved hjælp af 2nd regressions rækkefølge pasform.
  5. Mål aggregat højde og-bredde fra en linje profil, der er taget vinkelret på og-aksen14,17,19,41,42,59.
  6. Mål og længde parallelt med og aksen14,17,19,41,42,59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et repræsentativt tidsforløb for Aβ 42-aggregeringen, som målt ved ThT-fluorescens analysen, er vist i figur 1. Aggregerings processen er almindeligvis karakteriseret ved en sigmoidal kurve, hvor en lag fase er oprindeligt observeret, og efterfølges af en stejl vækstfase, før kurven når et plateau, når en ligevægt Steady State er nået6,7 , 58. det er vigtigt at sikre, at en optimeret aggregerings protokol bruges til at generere data af høj kvalitet for at studere de molekylære detaljer vedrørende aggregerings processer58.

Høj opløsning af AFM gør det muligt at undersøge morfologien og heterogeniteten af de aggregerede arter på forskellige tidspunkter i processen. Under aggregeringen, der overvåges af ThT-analysen, forberedes prøvernes aliquoter i pladerne til enkelt aggregat undersøgelse af AFM og nano-IR (figur 1). Den typiske proces strøm af manuel prøveforberedelse er vist i figur 2. Ved afslutningen af målingen af 3D morfologi af prøven ved høj opløsning og fasestyret AFM, er kortene fladtrykt for at fjerne ikke-linearitet af piezoelektriske scanner og reducere fejlkilder i efter behandling analyse af prøven morfologi (figur 3). Efterfølgende kan der udføres en nøjagtig og følsom statistisk analyse af et enkelt molekyle, som vist i figur 4. Fra en 3D morfologi kort, er det muligt at udtrække aggregerede tværsnits højde, bredde og længde (eller diameter i tilfælde af kugleformede partikler), som gør det muligt at skelne og karakterisere forskellige arter af aggregater til stede i løbet af aggregeringen tid kursus23,38. Typiske tidspunkter af interesse for at undersøge processen med aggregering er lag fase, vækstfase og plateau fase (figur 1). Under LAG'ens fase er monomere og oligomeriske arter af Aβ 42 primært til stede. Når de visualiseres af AFM, optræder monomere og oligomeriske arter af Aβ 42 typisk som sfænoidal partikler 1 − 15 nm i diameter og 0,3 − 2 nm i højden (figur 1, nederst til venstre)38,39. Dannelse af aflange protofilamenter, protofibrier og fibrier er synlig i vækstfasen af Aβ 42 aggregerings tidsforløb (figur 1, nederst i midten)38,39. Typisk, protofilamenter vises som aflange funktioner hundredvis af nanometer i længden og 0,5 − 2 nm i højden, mens protofibrils vises som aflange lineære eller krum aggregater 1 − 5 Nm i højden og hundredvis af nanometer i længden38, 39. I plateaufasen er fibriller de dominerende arter af Aβ 42 aggregater. Aβ 42 fibriller optræder typisk som uforgrenede, trådlignende konstruktioner med en tværsnits diameter på 6 − 10 nm og længde i rækkefølgen, hvis mikrometre (figur 3, nederst til højre)38,39. Bemærkelsesværdigt, denne skematiske repræsentation af de morfologiske egenskaber af aggregater er et generelt træk ved de fleste aggregere proteiner og peptider13,14.

Efter undersøgelsen af prøve morfologien kan Nano-IR anvendes til at undersøge de kemiske egenskaber af de enkelte protein aggregerede arter, der er til stede under aggregerings processen, ved at erhverve nanoskala-løste infrarøde kort og spektre både i luft og Native flydende miljø24,26,38,4249,50,51,52,. Figur 5 viser en skematisk illustration af opsætningen af AFM-IR. En IR-kilde bruges til at belyse prøven fra bunden i total intern refleksion eller direkte fra toppen som i figur 5a. Hvis det infrarøde lys absorberes af prøven, vil det begejstre den tilsvarende molekylære vibrationelle energi overgangs niveauer af de tilstedeværende arter. Den vibrationelle energi spredes inde i prøven i form af termisk opvarmning, som forårsager den termiske ekspansion af prøven. Denne ekspansion måles i nanoskala af AFM spidsen i kontakt med prøven med en opløsning i rækkefølgen 10 nm. Ved hver puls detekterer cantilever den termiske ekspansion. Især den hurtige udvidelse af prøven sparker udcarmen fra kontakt med prøven, og efter kick ud udcret ringe ned på sine naturlige frekvenser. For at øge følsomheden af AFM-IR, er det muligt at tune laser pulsfrekvensen med samme frekvens af svingningen af cantilever54. For at arbejde i denne resonans forstærkede tilstand er det nødvendigt at have infrarøde kilder, der kan pulseres i en bred vifte af frekvenser, såsom Quantum Cascade lasere, der opererer typisk i et interval mellem 1 − 1000 kHz. Peak-to-peak amplitude og den hurtige Fourier transformation af ringdown signal, kaldet IR amplitude, af den rå cantilever afbøjning er proportional med IR lys absorberet. Disse signaler detekteres i realtid ved at måle afbøjning af en rød laser fokuseret på toppen af cantilever. For at erhverve kemiske kort, laser wavenumber er fastgjort på en bestemt wavenumber og IR amplitude signal er indsamlet på hvert punkt af kortet, mens, at erhverve IR Spectra, positionen af cantilever er fast i en position af interesse og laser bølgelængde er fejet langs spektroskopiske vifte af interesse. Den ultimative opløsning af AFM-IR gør det muligt at måle de kemiske egenskaber af protein aggregater med en tværsnits højde på ca. 5 nm som gengivet i figur 6.

Figure 1
Figur 1: overvågning af aggregerings tidsforløbet in vitro via ThT fluorescens og AFM.
Prøver udtaget under LAG'ens fase, vækstfase og plateau fase af aggregerings processen som påvist ved tht fluorescens blev afbildet via høj opløsning AFM. Dette tal er blevet tilpasset fra Ruggeri et al.38. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skematisk gengivelse af substrat præparatet og prøve aflejring for AFM-målinger.
(A, B) Glimmer ætsning ved hjælp af tape. C) prøve aflejring. D) prøve inkubation. E) prøve skylning med ultrarent vand. F) prøve tørring under blid kvælstoftilførsel. G) prøve billeder ved hjælp af MIKROFABRIKERET AFM-cantilever med skarp spids på enden. H) forarbejdet billede af amyloid fibrils. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: AFM-billedbehandlings procedure42.
Toppen af hvert panel viser en profillinje af prøveoverfladen (rød linje) illustreret af den tilsvarende AFM billede, mens den nederste del viser et histogram af højden af alle pixels i billedet. (a) RAW AFM billede før billed samkopiering procedure. b) AFM-billede efter behandlingsproceduren med brug af hele plane samkopiering. Fibrillar strukturer (Pink farve) blev maskeret fra samkopiering procedure. (c) billede behandlet ved hjælp af linje-for-linje-samkopiering procedure. d) endeligt billede efter billedbehandlings proceduren. Dette tal er blevet tilpasset fra Ruggeri et al.42.

Figure 4
Figur 4: samlet statistisk analyse af AFM-billeder.
a) eksempel på opsporing af fibrillarstrukturernes højder og længder, angivet med 1 og 2. (b) graf med sektioner af de sporede fibriller og deres gennemsnitlige højde. c) eksempel på et histogram, der viser den gennemsnitlige højde af fibrillære strukturer. (d) graf med normaliseret profil af de sporede fibriller 1 og 2. (e) histogram fordeling af de normaliserede profil højdepunkter. Dette tal er blevet tilpasset fra Ruggeri et al.42. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: princippet om AFM-IR-metodens funktion.
(a) ABSORBERET IR-lys forårsager prøvens termiske ekspansion, spændende de mekaniske resonanser af AFM cantilever i kontakt med prøven. Amplituden af cantilever svingningerne er proportional med den infrarøde absorption. (b) IR absorption kort er opnået scanning af cantilever på prøven, mens fastsættelse af laser bølgelængde. (c) spids og prøve i kontakt opfører sig som et system af koblede fjedre, hvis resonansfrekvens stiger monotisk med den iboende stivhed af prøven50. d) lokaliserede spektre opnås ved at feje laser bølgelængden, mens positionen af AFM cantilever fastsættes. e) det infrarøde spektrum af proteiner. f) Sammenfattende muliggør AFM-IR samtidig undersøgelse af morfologiske, mekaniske og kemiske egenskaber ved nanoskalaen26. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: infrarød nanospektroskopi (Nano-IR) af et enkelt amyloid aggregat.
a) kort over AFM morfologi. (b) IR absorption kort ved laser resonans peak på 1658 cm-1. c) tværsnits dimensioner af og højden. d) IR-spektre på forskellige positioner af fibrillar-strukturen (markeret i panel b med blå cirkler) og substratet (markeret i panel b med grønne cirkler). Det gennemsnitlige netto signal, som stammer fra den samlede struktur (solid Black Line), blev opnået ved at trække gennemsnittet af baggrunds signalet (solid grøn linje) fra gennemsnittet af og-signalet (solid blå linje). Dette tal er blevet tilpasset fra Ruggeri et al.42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det første kritiske trin i denne protokol er fremstilling af monomere proteiner, såsom i tilfælde af Aβ 42 opløsning beskrevet i trin 1,1 og 1,2. Det er vigtigt at indlede aggregerings processen fra en meget ren, monomerisk løsning, da tilstedeværelsen af oligomer eller aggregerede arter kan resultere i ringe reproducerbarhed af aggregerings kinetikken58og inducere artefakter i AFM- målinger (f. eks. vil fibrillar arter være tydelige i de indledende faser af aggregeringen), hvilket kan føre til fejlagtig fortolkning af dataene. Meget reproducerbare kinetik data for amyloid dannelse baseret på tht fluorescens analyse, i forbindelse med Master ligningen formalisme af kemisk kinetik5,6,7, har tilladt at definere Aβ 42-aggregeringen med hensyn til de underliggende molekylære hændelser. Kemiske kinetik forbinder de mikroskopiske trin underliggende amyloid dannelse med deres makroskopiske manifestationer ved at overveje de forskellige måder, hvorpå nye aggregater kan dannes og vokse, som er for eksempel forlængelse ved de samlede ender eller sekundære nukleation på den samlede overflade. Men kemiske kinetik i sig selv ikke direkte muliggøre visualisering af de mulige nukleation fænomener på nanoskalaen kræver deres kombination med enkelt molekyle metoder.

Det andet kritiske trin i denne protokol er den substrat forberedelse og prøve aflejrings procedure, der er beskrevet i trin 2,2 og 2.6 − 2,8. For at undgå artefakter skal prøven deponeres på en ren, atomisk flad overflade. Korrekt ætsning af glimmer er afgørende for at opnå artefakt-fri, høj opløsning i AFM målinger. Prøve aflejrings tiden er også ekstremt vigtig, da længere inkubationstid giver bedre absorption på substrat overfladen. Men det kan også fremkalde kunstig selvorganisering og selv montage25, som kan fremkalde artefakter (f. eks. overflade inducerede aggregerede arter), der kan føre til fejlagtig fortolkning af data. Derudover er glimmer overfladen negativt opladet, hvilket betyder, at kun positivt ladede molekyler let absorberer på den. Hvis netto afgiften af prøven er negativ, kan overfladen af glimmer være positivt funktionaliseret ved hjælp af APTES for en bedre phisisorption23. Microfluidic spray deposition25 kan udnyttes til at undgå disse effekter og artefakter og deponere prøven i et enkelt trin og artefakt-fri måde.

Det tredje kritiske trin er den korrekte opsætning og valget af billedbehandlings parametre for prøve billeder via AFM og AFM-IR beskrevet i afsnit 3. De AFM-spidser, der anvendes til prøve billeddannelse, skal være skarpe nok (Apex radier på 2 − 8 nm) for at opnå høj opløsning og minimere konvolution-effekterne (udvidelse af prøve funktionerne med spidsen)14, hvilket kan medføre usikkerhed i prøve eksemplet. Valget af Imaging mode, kontakt eller dynamisk, er også vigtigt. Ved prøve billeder via konventionel AFM foretrækkes den dynamiske tilstand over kontakt tilstanden, da sidstnævnte tilstand inducerer store laterale spids-prøve friktions kræfter, der kan forårsage prøve skader og indføre artefakter i målingerne (f. eks. reduktion af prøve højde på grund af nanoindrykning)14,61,62. Omvendt foretrækkes kontakt tilstanden for målingerne via Nano-IR for at forbedre AFM-IR-signalet. For målinger i dynamisk tilstand, skal Canti håndtaget justeres lige under (tryk tilstand) eller over (ikke-kontakttilstand) den maksimale af sin første frie resonans af svingning for at sikre højere stabilitet af målingerne14. Billedbehandlings opløsningen, som afhænger af pixel nummeret og scanningsområdet, skal være høj nok til at opfange den mindste detaljeringsgrad, der findes i en prøve (f. eks. 1024 x 1024 pixels for et 4 x 4 μm2 -område)14,63. Lav billeddannelse opløsning kan fremkalde forvridninger og usikkerhed i billedet af prøven på grund af tabet af de lodrette og laterale oplysninger ved digitalisering af signalet14. Scanningshastigheden, der bruges til billeddannelse, skal være lav nok til, at spidsen kan følge overfladens egenskaber korrekt, samt til at have tilstrækkelig tid til at erhverve kemiske oplysninger14. En af de vigtigste Imaging parametre er Imaging kraft. I kontakttilstand er det grundlæggende at bruge en lav interaktions styrke til at bevare prøvens struktur. I dynamisk tilstand, bør energi afledning på prøverne holdes konstant for at konsekvent sammenligne morfologi af særskilte prøver; der kan opnås konsistent billeddannelse af uafhængige prøver ved at opretholde en konstant ordning for en fase ændring, der ikke overstiger δ20 °14,42. Store billedbehandlings kræfter bør undgås, da de kan fremkalde forvrængninger og usikkerhedsmomenter i prøve billederne.

Termisk drift forårsaget af ekspansion og sammentrækning af AFM dele på grund af termiske udsving kan fremkalde forvrængninger og artefakter i billedet af prøven64,65. Driver i den lodrette retning kan få Canti håndtaget til at tabe overfladen samt til at gå ned i overfladen, mens driver i den laterale retning normalt resulterer i forlængelse af overflade funktioner og billedforvrængning, hvilket gør det vanskeligt at opnå præcise målinger af prøve funktionerne. Effekten af disse termiske driver kan minimeres ved nøjagtig temperaturstyring af laboratoriet samt give tid nok (ca. 30 min) for systemet til at blive stabil eller ved at udføre hurtige scanninger66,67,68 , 69 , 70.

Kvaliteten af Nano-IR Imaging og Spectra Collection af AFM-IR kan påvirkes af flere faktorer, hvoraf de vigtigste er: (i) en forkert opdeling af IR-signalet på prøven ved IR-baggrunden, (II) en stor variation af nanomekanisk kontakt mellem spids og (III) en overdreven opvarmning af prøven, som forårsager dens blødgøring. For at opdele det infrarøde spektrum af prøven korrekt ved den indsamlede baggrund er det afgørende, at de opsamles ved samme laser effekt. Faktisk, den spektrallinje form af IR Laser baggrund afhænger af effekten af laseren. For at undgå påvirkning af prøvens mekaniske egenskaber i de målte kemiske oplysninger er det vigtigt at overvåge og spore kontakt resonansen mellem prøven og spidsen under spektre og billed erhvervelse. For Spectra erhvervelse, ideelt set, er det tilstrækkeligt at puls laseren ved en fast kontakt resonans. Men hvis spektret er erhvervet på et stort spektroskopisk område, høj intensitet toppe kan forårsage kraftig opvarmning af prøven og dens blødgøring, således at ændre spidsen-prøve kontakt resonans og kunstigt reducere IR peak amplitude. Af denne grund er det vigtigt at spore kontakt resonans under spektra erhvervelse for at kontrollere, at spektret ikke påvirkes af overdreven opvarmning af prøven.

Afslutningsvis, konventionel AFM og nano-IR er i stand til at undersøge med høj opløsning de morfologiske, strukturelle og kemiske egenskaber af de enkelte arter, der dannes under protein aggregering24,38. Men de mangler evnen af kemiske kinetik til at følge deres hurtige kinetik af dannelse i indfødte bulk betingelser. For at opklare de konformationsmæssige ændringer, som protein gennemgår under deres sammenlægning og fejl foldning, er det nødvendigt at udvikle og anvende nye biofysiske metoder, der kan samle kapaciteten af bulk biopysiske metoder med undersøgelse af protein aggregerings heterogenitet og ultrastrukturelle egenskaber i nanoskalaen. Denne tilgang er en frugtbar vej til at løse udfordringen med at forstå problemet med protein selvsamling og dets rolle i sundhed og sygdom. Faktisk enkelt samlede tilgange er i stand til at opklare og belyse de molekylære mekanismer protein aggregering polymorfi og dannelse. Disse oplysninger er centrale for at løse udfordringen med at forstå protein aggregering og dens rolle i udbrud og progression af menneskelige sygdomme, samt forståelse af deres biofysiske egenskaber for bioteknologiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Swiss National Foundation for Science (SNF) for den finansielle støtte (tilskudsnummer P2ELP2_162116 og P300P2_171219), Darwin College, Erasmus + program for den finansielle støtte (tilskudsnummer 2018-1-LT01-KA103-046719 -15400-P3) og forskning, som fører til disse resultater, har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd under eu's syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) gennem EFR'S Grant Fysprot (aftalenummer 337969), Newman Foundation (T.P.J.K.) og Cambridge Center for Misfoldnings sygdomme (C.G., M.V. og T.P.J.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926 (2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541 (2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101 (2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225 (2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9 (2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903 (2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Tags

Biokemi amyloid neurodegeneration protein aggregering atomkraften mikroskopi infrarød nanospektroskopi enkelt molekyle analyse spektroskopi
Karakterisering af individuelle protein aggregater ved infrarød Nanospektroskopi og atomkraften mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruggeri, F. S., Šneideris, T.,… More

Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter