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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

Wir beschreiben die Anwendung von Infrarot-Nanospektroskopie und hochauflösender Atomkraftmikroskopie, um den Prozess der Protein-Selbstmontage in oligomere Aggregate und Amyloidfibrillen zu visualisieren, die eng mit dem Beginn und der Entwicklung verbunden sind. einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen.

Abstract

Das Phänomen der Proteinfehlfaltung und -aggregation führt zur Bildung hochheterogener Proteinaggregate, die mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson in Verbindung gebracht werden. Insbesondere niedermolekulare Aggregate, Amyloid-Oligomere, haben nachweislich generische zytotoxische Eigenschaften und sind als Neurotoxine in vielen Formen von Demenz involviert. Wir veranschaulichen den Einsatz von Methoden auf Basis der Atomkraftmikroskopie (AFM), um die anspruchsvolle Aufgabe der Charakterisierung der morphologischen, strukturellen und chemischen Eigenschaften dieser Aggregate anzugehen, die mit konventionellen strukturellen biophysikalische Methoden aufgrund ihrer Heterogenität und Vergänglichkeit. Scan-Sondenmikroskopie-Ansätze sind nun in der Lage, die Morphologie von Amyloid-Aggregaten mit Sub-Nanometer-Auflösung zu untersuchen. Wir zeigen hier, dass die Infrarot-Nanospektroskopie (AFM-IR), die gleichzeitig die hohe Auflösung von AFM und die chemische Erkennungskraft der IR-Spektroskopie ausnutzt, weiter gehen und die Charakterisierung der strukturellen Eigenschaften einzelner Proteinaggregate und bieten so Einblicke in die Aggregationsmechanismen. Da der von uns beschriebene Ansatz auch auf die Untersuchungen der Wechselwirkungen von Proteinassemblys mit kleinen Molekülen und Antikörpern angewendet werden kann, kann er grundlegende Informationen liefern, um neue therapeutische Verbindungen zur Diagnose oder Behandlung zu entwickeln. neurodegenerative Störungen.

Introduction

Mehr als 40 Millionen Menschen weltweit sind derzeit von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer (AD)1 und Parkinson (PD)2 Krankheiten betroffen. Allgemeiner gesagt, sind mehr als fünfzig Pathologien auf molekularer Ebene mit Proteinfehlfaltung und -aggregation assoziiert, ein Prozess, der zur Proliferation von unlöslichen fibrillaren Proteinaggregaten führt, die als Amyloidablagerungen3 bekannt sind. 4. Die molekularen Ursprünge der Neurodegeneration und ihre Verbindungen mit Proteinkonformationsveränderungen von Proteinen, die zur Amyloidbildung führen, bleiben jedoch weitgehend unklar, was zum großen Teil auf das hohe Maß an Heterogenität, transikulären Natur und nanoskalige Abmessungen der pathologischen Aggregate4,5.

Sehr erfolgreiche Untersuchungen von Proteinstrukturen in den letzten Jahrzehnten basierten weitgehend auf dem Einsatz von Massenmethoden, einschließlich Röntgenkristallographie, Kryo-Elektronenmikroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie5, 6 , 7 , 8 , 9. Innerhalb dieser Klasse von Techniken hat sich die Infrarotspektroskopie (IR) als ein sensibles Analysewerkzeug herausgebildet, um die chemischen Eigenschaften biologischer Systeme wie Proteine8zu entwirren. IR-Methoden ermöglichen die Quantifizierung von sekundären und quartären Strukturveränderungen des Proteins während ihrer Fehlfaltung und Aggregation. Um auf mikroskopischer Ebene die mechanistischen Details, die in den komplexen freien Energielandschaften von Proteinen während ihrer Aggregation involviert sind, weiter zu entschlüsseln, war ein großer Fortschritt die Entwicklung chemischer Kinetik-Werkzeuge, die sich auf komplexe Selbstmontagewege einschließlich AmyloidfibrillenBildung5,6,7,10,11,12. Massenspektroskopische Methoden liefern jedoch nur durchschnittliche Informationen über das heterogene Artenensemble, das in Lösung oder in bestimmten mikroskopischen Schritten vorhanden ist, wodurch die Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften einzelner aggregierte Arten, die auf der Nanoskala anspruchsvoll sind13,14.

In den letzten Jahrzehnten sind mehrere Mikroskopietechniken mit der Fähigkeit entstanden, auf Skalen zu arbeiten, die kleiner als die Beugungsgrenze des Lichts sind. Diese Methodenklasse umfasst Elektronenmikroskopie (EM) und Atomkraftmikroskopie (AFM). Während Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zweidimensionale (2D) Bilder einer Probe liefern, hat sich AFM in den letzten Jahrzehnten als eine leistungsfähige und vielseitige Technik zur Untersuchung dreidimensionaler (3D) Morphologien sowie die nanomechanischen Eigenschaften einer Probe mit Sub-Nanometer-Auflösung13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Der Grund für die Untersuchung der Proteinaggregation über AFM ist, dass dieser Ansatz die Untersuchung der Morphologie einzelner Arten in Lösung13,14,16ermöglicht. 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Insbesondere durch die Überwachung der Probe als Funktion der Zeit, AFM ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung der Morphologie der Art innerhalb der Probe, die es ermöglicht, zu folgen und visualisieren die Wege der Amyloidbildung23, 25,38,39,40,41,42. Darüber hinaus ermöglicht AFM die Quantifizierung von Strukturparametern wie Querschnittshöhen und -längen der einzelnen Arten in Lösung13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. Die Untersuchung einer einzigen biophysikalischen Eigenschaft, wie z. B. der Morphologie, reicht jedoch bei der Untersuchung heterogener und komplexer biologischer Systeme oft nicht aus. AFM-, SEM- oder TEM-Bildgebungsverfahren allein zeigen nicht ohne weiteres die chemischen Eigenschaften heterogener Arten von Amyloid-Aggregaten im Nanomaßstab.

Ein großer Fortschritt für die Analyse heterogener biologischer Proben in diesem Maßstab wurde in jüngster Zeit mit der Entwicklung und Anwendung auf dem Gebiet der Proteinaggregation der Infrarot-Nanospektroskopie (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Diese innovative Methode nutzt die Kombination der räumlichen Auflösung von AFM (1,10 nm) mit der chemischen Analyseleistung von IR. Die AFM-IR-Technik basiert auf der Messung des photothermischen induzierten Resonanzeffekts, der von einem IR-Laser angetrieben wird, und auf der Messung der thermischen Ausdehnung der Probe, die von der AFM-Spitze untersucht wird. Die Probe kann mit dem IR-Laser direkt von oben oder von unten in der gesamten inneren Reflexion beleuchtet werden, ähnlich wie bei der herkömmlichen Infrarotspektroskopie24,42,52,53 . Der IR-Laser kann mit typischen Frequenzen in der Größenordnung von Hunderten von Kilohertz (1x1000 kHz) gepulst und über einen weiten Spektralbereich abgestimmt werden, typischerweise zwischen 1000 und 3300 cm-1. Obwohl die Laserquelle eine Fläche von 30 m Durchmesser abdeckt, wird die räumliche Auflösung der AFM-IR-Technik nominell durch den AFM-Spitzendurchmesser bestimmt, der die lokale Wärmeausdehnung des Systems erkennt. AFM-IR eignet sich gut für die Untersuchung biologischer Proben, da das IR-Signal proportional zu ihrer Dicke bis zu 1,5 m ist und die resultierenden IR-Spektren im Allgemeinen mit den entsprechenden FTIR-Übertragungsspektren13,54 übereinstimmen. ,55. Aus diesem Grund können etablierte Analysemethoden in der Spektroskopie problemlos angewendet werden, wie z. B. die Untersuchung chemischer Verschiebungen, Bandformänderung und De-Konvolution durch zweite Derivateanalyse52. Insgesamt ermöglicht AFM-IR durch die Kombination der räumlichen Auflösung von AFM mit der chemischen Erkennungskraft der IR-Spektroskopie die gleichzeitige Erfassung einer vielzahl morphologischer, mechanischer und chemischer Eigenschaften einer Probe im Nanomaßstab.

Hier illustrieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung des Prozesses der Proteinaggregation, das die Kombination von In-vitro-Fluoreszenz-Assays, hochauflösender AFM-Bildgebung und nanoskaliger AFM-IR nutzt. Dieser kombinierte Ansatz hat sich bereits durch detaillierte Ergebnisse bei der Untersuchung der chemischen und strukturellen Eigenschaften einzelner Mikrotröpfchen, die durch Proteinaggregate gebildet werden, bei der Untersuchung der Flüssigkeits-Flüssig-Proteinphasentrennung und in Untersuchung der Heterogenität und der biophysikalischen Eigenschaften einzelner aggregierter Arten im Nanomaßstab23,26,38,45,50,53, 56,57.

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Protocol

1. Aggregations-Assays auf Fluoreszenzplattenlesern

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel dafür, wie die Aggregation von Proteinen oder Peptiden durch chemische Kinetik untersucht werden kann. Insbesondere beschreibt es ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung der Aggregation des Peptids A-42, das am Beginn und fortschreitender Alzheimer-Krankheit beteiligt ist58,59. Ein ähnliches Protokoll kann angepasst und angenommen werden, um die Aggregation von Proteinen oder Peptiden zu untersuchen.

  1. Erhalten Sie eine hochreine monomerische Lösung von A-42 durch Ionenaustausch- und Größenausschluss-Chromatographie-Techniken, um Proteinfraktionen zu unterscheiden, die A42 enthalten, und um die monomere Fraktion von anderen aggregierten Formen von A-42 zu isolieren58 , 59.
  2. Verdünnen Sie das Peptid A-42 in 20 mM Natriumphosphatpuffer, 200 m EDTA bei pH 8,058 auf eine gewünschte Endkonzentration zwischen 1 und 5 m, in 1,5 ml bindungsarmen Röhrchen. Proben, die für AFM-Messungen gesammelt wurden, sollten nicht den fluoreszierenden Farbstoff enthalten, der im Aggregationstest verwendet wird (Thioflavin T, ThT), da es Artefakte während der Probenabscheidung für die AFM-Analyse einführen könnte. So bereiten Sie Triplicate von zwei identischen Lösungen vor: i) die erste, die monomeric A-42 enthält, um den Prozess der Aggregation durch AFM zu verfolgen; ii) die zweite, die die A-42-Monomeric-Datei mit einer Zugabe von 20 M ThT als Tracer zur Überwachung der Kinetik der Aggregation enthält.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Schritte 1.1 und 1.2 auf Eis durchzuführen. Mit diesem Verfahren soll sichergestellt werden, dass sich die monomere Lösung A-42 erst aggregiert, wenn sie im Plattenleser initiiert wird. Bei der Handhabung von Proben ist eine sorgfältige Pipettierung unerlässlich, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden, die die Proteinprobe beeinflussen können.
  3. Pipette 80 l jeder Probe in jeder Bohrung einer 96-Well-Halbflächenplatte aus schwarzem Polystyrol mit klaren Boden- und unverbindlichen Oberflächen.
  4. Versiegeln Sie die Platte mit einer Folie, um die Verdunstung der Probe im Verlauf der Aggregation zu minimieren.
  5. Die Temperatur des Plattenlesers auf 37 °C ausdemieren.
  6. Richten Sie das Aggregationsprotokoll ein, um Fluoreszenzmessungen in festen Zeitpunktintervallen bei einer Anregungswellenlänge von 440 nm und einer Emissionswellenlänge von 480 nm zu lesen. Die Aggregation sollte unter stillen Bedingungen initiiert werden.
  7. Setzen Sie die Platte in den Plattenleser ein.
    HINWEIS: Es ist wichtig, beim Umgang mit der Platte vorsichtig zu sein, um sicherzustellen, dass die Aggregation nicht ausgelöst wird, bevor der Plattenleser gestartet wird. Verwenden Sie die Gain-Einstellungseinstellungen, um die optimale Auslesung der Fluoreszenz jeder Probe sicherzustellen.
  8. Starten Sie die Messung.
    ANMERKUNG: Das Aggregationsexperiment wird abgeschlossen, wenn die ThT-Fluoreszenz-Sigmoidalkurve ein Plateau58erreicht.

2. Probenvorbereitung für AFM- und Nano-IR-Messungen

  1. Kleben Sie die hochwertigste V1 Glimmerscheibe auf hochwertige magnetische Edelstahlscheibe mit Klebelaschen oder doppelseitigem Klebeband.
  2. Ätzen Sie Glimmer, indem Sie ein Stück Klebeband auf die Glimmeroberfläche legen und die obere Schicht des Glimmers abziehen. Dieses Verfahren erzeugt eine saubere, atomar flache Oberfläche, die für die Probenabscheidung geeignet ist.
    HINWEIS: Die geätzte Oberfläche muss gleichmäßig und glatt sein.
    VORSICHT: Berühren oder atmen Sie nicht direkt über frisch geätztem Glimmer, da dies Artefakte einführt.
  3. Halten/stoppen Sie die Plattenlesermessung, um den Zeitpunkt des Interesses während des Aggregationsprozesses des Proteins zu erfassen.
  4. Entfernen Sie die Dichtfolie und sammeln Sie 10 L Aliquot der Proben ohne ThT aus dem Brunnen in ein 1,5 ml tief bindendes Rohr.
  5. Legen Sie die 10 l der Probe auf den frisch geätzten Glimmer ab. Für AFM-IR-Messungen müssen Proben auf frisch abgestreiftem Goldsubstrat abgelagert werden.
  6. Inkubieren Sie die Lösung auf der Glimmer für 1 min, um eine Physisorbtion zu ermöglichen.
    HINWEIS: Eine längere Inkubationszeit würde eine bessere Absorption auf der Oberfläche ermöglichen, kann aber eine künstliche Selbstorganisation und Selbstmontage induzieren25. Um diese Effekte zu vermeiden, kann die Sprühabscheidung25ausgenutzt werden.
  7. Spülen Sie dreimal mit 1 ml Reinstwasser.
  8. Trocknen Sie unter einem sanften Stickstofffluss, um die Probe in der Luftumgebung zu messen.

3. AFM-Bildgebung der Morphologie von Proteinaggregaten

HINWEIS: Morphologiemessungen können sowohl im Kontakt- als auch im dynamischen Modus durchgeführt werden, in den folgenden Schritten wird letzteres beschrieben, da es die seitlichen Kräfte reduziert, um die 3D-Morphologie der Probe mit hoher Auflösung zu messen. AFM-IR-Messungen werden im Kontaktmodus durchgeführt, um das AFM-IR-Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.

  1. Schalten Sie das AFM-System mindestens 30 min vor den Messungen ein, damit das System eine thermische Stabilität erreicht. Klicken Sie auf Setup, dann auf Probe. Klicken Sie im Fenster Probewechsel auf Weiter, um Z vorzubereiten, Fokusstufe.
  2. Schalten Sie den AFM-Strahlschalter aus (falls er eingeschaltet ist). Entsperren Sie die Schwalbenschwanzschlösser, trennen Sie den Kopf vom System und klicken Sie im Fenster Probewechsel auf Weiter.
  3. Montieren Sie den AFM-Ausleger am Sondenhalter. Schließen Sie den Kopf an das System an und verriegeln Sie die Schwalbenschwanzschlösser.
    HINWEIS: Optimale Ausleger zur Untersuchung biologischer Proben im dynamischen Modus AFM haben eine Federkonstante zwischen 2 x 40 N m-1 und eine Spitzenradien zwischen 2 8 nm14.
  4. Schalten Sie den AFM-Laserstrahlschalter ein und klicken Sie im Fenster Probewechsel auf Weiter.
  5. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Nein, wenn sich der Freischwingertyp nicht geändert hat. Passen Sie die optischen Ausrichtungsknöpfe an, um den Ausleger zu finden. Passen Sie den Fokus auf den Ausleger an und klicken Sie auf Weiter.
  6. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Ja, wenn der Fokus auf dem Ausleger liegt.
  7. Positionieren Sie den Laserstrahl am Ende des Auslegers mit den Knöpfen, die die Position des Detektionslasers steuern. Maximieren Sie das von der Vier-Quadranten-Photodiode gemessene Gesamtsignal auf mindestens >1 V mit den Knöpfen, die die Position des abgelenkten Laserstrahls auf der positionsempfindlichen Photodiode (PSPD) steuern. Klicken Sie im Fenster Probeänderung auf Weiter und dann auf Schließen.
  8. Warten Sie 15 min, bis der Ausleger thermische Stabilität erreicht. Stellen Sie bei Bedarf die Position des abgelenkten Laserstrahls auf dem PSPD nach.
  9. Klicken Sie auf NCM SWEEP, wählen Sie die gewünschte Amplitude der Schwingung, klicken Sie auf Phase verwenden, klicken Sie auf Auto und stimmen Sie den Ausleger in der Nähe des Maximums seiner ersten freien Resonanz der Schwingung, die von ca. 300 kHz für eine Ausleger mit einer Federkonstante von 40 N m-1.
    HINWEIS: Das Ausstellen des Auslegers aus dem Maximum seiner freien Resonanz gewährleistet eine höhere Stabilität der Messungen14.
  10. Legen Sie die Probe auf den Probenhalter. Wählen Sie geeignete Bildparameter aus. Die typische Scanrate liegt bei 0,3 bis 1,0 Hz für eine Scanfläche von 1 x 1 m2 bis 5 x 5 m2. Die typische Auflösung liegt zwischen 256 x 256 und 1024 x 1024 Pixeln. Klicken Sie auf Scanbereich, um die Scangröße und die Pixelzahl auszuwählen.
  11. Konzentrieren Sie die optische Ansicht auf die Probe. Klicken Sie auf Ansatz, um sich der Probenoberfläche zu nähern. Sobald der Anflug abgeschlossen ist, klicken Sie auf Lift 100 'm, um die AFM-Spitze 100 'm über die Oberfläche der Probe zu erheben. Klicken Sie auf das optische Bild des Samples erweitern. Klicken Sie auf die Fokusstufenleiste, um die Ansicht auf die Oberfläche des Beispiels zu fokussieren.
  12. Verwenden Sie die Pfeile, um sich im Bereich der Interessenprobe zu bewegen. Betreiben Sie die Oberfläche, indem Sie die Anflugtaste drücken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Linienscan, und überprüfen Sie, ob die Spitze der Oberfläche gut folgt, passen Sie ggf. den Sollwert an.
  13. Starten Sie die Bildgebung der Probenoberfläche durch Drücken der Scan-Taste. Während der Bildgebung, um große bildgebende Kraft zu vermeiden und die Konsistenz innerhalb unabhängiger Proben zu halten, halten Sie ein konstantes Regime der Phasenänderung nicht mehr als 20 °42.
  14. Geben Sie den Dateinamen ein, und wählen Sie das Basisverzeichnis aus, in dem das erworbene Bild gespeichert werden soll.

4. Infrarot-Nanospektroskopie-Messungen von Proteinaggregaten

  1. Schalten Sie das AFM-IR-System und den Infrarot-Laser (IR)60 30 bis 60 min vor Messungen zur thermischen Stabilisierung ein. Typische Laser für AFM-IR-Instrumente sind optische Parameteroszillatoren (OPO) und Quantenkaskadenlaser (QCL).
  2. Öffnen Sie die integrierte Software, um das Gerät zu steuern. Klicken Sie auf Datei und dann auf neu, um eine neue nanoIR-Datei zu öffnen. Drücken Sie die Taste initialisieren, um das AFM-IR-System zu starten.
  3. Öffnen Sie die Instrumentenabdeckung und montieren Sie am AFM-IR-System eine siliziumgoldbeschichtete Sonde mit einem Nennradius von 30 nm und einer Federkonstante von 0,2 N/m, um die Probe im Kontaktmodus zu messen.
  4. Klicken Sie im Abschnitt AFM-Sonde auf Laden und dann weiter. Klicken Sie im Fokus auf den Sondenabschnitt auf die Pfeile, um die Kamera auf den Ausleger zu fokussieren. Verwenden Sie im Abschnitt SbXY-Bewegungdie Pfeile, um die Querluft am Ende des Auslegers zu platzieren.
  5. Drehen Sie die Knöpfe, die die Position des Erkennungslasers steuern, um den Laser am Ende des Auslegers zu positionieren. Drehen Sie die Laserknöpfe, um die von der Vier-Quadranten-Photodiode gemessene Summe auf einen Wert >3 V zu erkennen und zu maximieren. Drehen Sie den Umlenkknopf, um die Auslegerablenkung auf -1 V einzustellen, und klicken Sie dann auf weiter. Schließen Sie die Abdeckung des Instruments.
  6. Verwenden Sie im Abschnitt Fokus auf Beispiel die Pfeile, um die Kamera auf das Beispiel zu fokussieren. Dann, in der Abschnittsbeispiel XY Bewegung verwenden Sie die Pfeile in den Bereich des Interesses der Probe zu bewegen und klicken Sie auf Ansatz und engagieren.
  7. Wählen Sie im Mikroskopfenster als Eingänge die Kanäle aus, die von Interesse sind, um die biophysikalischen Eigenschaften der Probe abzubilden. Wählen Sie insbesondere Die Höhe für die Morphologie, Amplitude 2 für IR-Absorption und PLL-Frequenz, um die Kontaktresonanz der Spitze und der Probe zu kartieren.
  8. Verwenden Sie im AFM-Scanbereich des Steuerelementfensters ähnliche Parameter wie in Abschnitt 3 (d. h. Scanrate 0,1 x 1,0 Hz, zwischen 256 x 256 und 1024 x 1024 Pixel). Wählen Sie als Wert der Gewinne nach Stichprobenrauheit: Integral I = 1x10 und proportional P = 10-30. Klicken Sie dann auf Scannen, um eine Morphologiekarte zu erhalten.
    HINWEIS: Die Morphologie kann im dynamischen Abstichmodus ähnlich gemessen werden, aber AFM-IR-Messungen werden hier im Kontaktmodus durchgeführt, um höhere Signal-Rausch-Verhältnisse zu haben.
  9. Nachdem die Kartierung der Morphologie abgeschlossen ist, klicken Sie im Mikroskopfenster auf die Höhenkarte, um die Sonde oben auf einem Aggregat zu positionieren. Klicken Sie dann im Bereich nanoIR des Steuerungsfensters auf IR starten, um die Probe mit dem IR-Laser zu beleuchten.
  10. Um den Infrarotlaser auf den Ausleger zu fokussieren, klicken Sie auf Optimierung. Schreiben Sie in diesem Fenster eine Wellenzahl, bei der die Probe eine hohe Absorption simiert hat, und klicken Sie auf Hinzufügen. Für Protein ist ein typischer Wert 1655 cm-1. Klicken Sie auf Scannen, um die IR-Laserposition zu finden, und klicken Sie auf Update, um ihre Position am Ausleger auszurichten. Schließen Sie das Fenster.
  11. Schreiben Sie im Abschnitt Allgemein der nanoIR-Einstellung eine Wellenzahl, bei der eine hohe Absorption im relativen Feld erwartet wird. Deaktivieren Sie dann die Option Bandpassfilter und schauen Sie sich den Zählerstand und die schnelle Fourier-Transformation (FFT) der Auslegerantwort an. Bewegen Sie im FFT-Fenster den grünen Cursor, um die Resonanzfrequenz des Auslegers zu lesen. Ein typischer Wert der FFT der Resonanz der Ausleger liegt bei etwa 300 kHz. Schreiben Sie diesen Resonanzfrequenzwert in den allgemeinen Abschnitt im Freq.-Mittelfeld und verwenden Sie ein Freq.-Fenster von 50 kHz.
    HINWEIS: Wählen Sie eine Laserleistung aus, die niedrig genug ist, um den Zählerstand nicht zu sättigen und eine Verzerrung in der Auslegerantwort zu haben und die Probe nicht zu überhitzen.
  12. Klicken Sie auf das Laserpuls-Tuning-Fenster, um den Resonanz-verbesserten Modus zu verwenden. Wählen Sie einen Frequenzbereich von 300 kHz, einen Stimmbereich von 50 kHz und einen Einschaltzyklus des Lasers von 5%. Klicken Sie auf erwerben, um die Pulsfrequenz des Lasers zu fegen. Stimmen Sie den Laserpuls mithilfe des Cursors im Diagramm auf die Frequenz der mechanischen Reaktion der thermischen Ausdehnung der Probe ab, die das IR-Licht absorbiert. Wählen Sie dann die Option PLL aus, um die Kontaktresonanz zwischen der Probe und der Spitze zu überwachen. Drücken Sie die Nulltaste im PLL-Fenster und aktivieren Sie die Taste, um die Kontaktresonanz der Sample-Spitze zu verfolgen. Wählen Sie eine integrale Verstärkung I = 0,5 und proportionale Verstärkung P = 10. Schließen Sie das Fenster.
  13. Öffnen Sie erneut das Optimierungsfenster und finden Sie die Position des IR-Lasers für mindestens 3 Wellenzahlen, die den großen Absorptionsbändern der Probe (Amidband I-II-III) entsprechen, und für mindestens eine Wellenzahl für jeden Chip des Lasers.
  14. Klicken Sie auf Extras | IR-Hintergrundkalibrierung | Neu. Wählen Sie im Fenster den spektroskopischen Bereich aus, der von Interesse ist (1800 x 1200 cm-1, um Proteinproben zu untersuchen); die gleiche Pulsrate wie in Schritt 4.12 und einem Betriebszyklus von 5% zu wählen; Klicken Sie auf schnelle Erfassung und wählen Sie die Lasergeschwindigkeit, typische Reichweite für einen Quantenkaskadenlaser liegt zwischen 20 x 500 cm-1. Klicken Sie auf Acquire, um den IR-Laserhintergrund zu messen. Dieses Hintergrundspektrum wird zur Normalisierung der gemessenen nanoskaligen lokalisierten Spektren verwendet. Schließen Sie das Fenster.
    HINWEIS: Wenn ein schneller Laser- und Resonanz-verbesserter Modus nicht verfügbar ist, überspringen Sie Schritt 4.12 und wählen Sie gestufte Spektren anstelle von schnell im Hintergrund- und IR-Spektrenerfassungsfenster aus. Eine einzige Aggregatempfindlichkeit wird jedoch nicht erreicht.
  15. Wählen Sie in den IR-Spektreneinstellungen eine IR-Spektrumauflösung zwischen 1 x 4 cm-1 und einer Anzahl von Co-Durchschnitten von mindestens 64x. Klicken Sie auf Erwerben, um ein nanoskaliges lokalisiertes IR-Spektrum im Proteinbereich zu messen (1800 x 1200 cm-1).
  16. Um eine nanoskalige gelöste chemische Karte zu erhalten, wählen Sie die IR-Bildgebungsoption, wählen Sie eine Wellenzahl von Interesse (z. B. 1655 cm-1 für Amidband I) und klicken Sie im AFM-Scanfenster auf Scan.
  17. Sobald die Zuordnung abgeschlossen ist, gehen Sie zu Datei und speichern Sie die Messungen. Um die erworbenen Karten der Morphologie, Kontaktresonanz und Chemie sowie der nanoskaligen lokalisierten Spektren zu analysieren, verwenden Sie die integrierte AFM-Bildverarbeitungssoftware. Spectra und Images können als .csv- oder .axz-Dateien für eine weitere detaillierte Analyse mit kommerzieller Software gespeichert werden.

5. Bildverarbeitung und Analyse von Querschnittsabmessungen

  1. Flatten Rohbilder14,17,19,41,42,59 mit eingebauter AFM Bildverarbeitungssoftware oder kommerzieller Software.
    HINWEIS: Die Aggregate sollten aus der Berechnung verdeckt werden, um Artefakte der Analyse und Unterschätzung ihrer gemessenen Höhe zu vermeiden.
  2. Flachen Sie das Bild um 0 Order-Ebene passen Subtraktion.
  3. Das Bild nach Ebene und dann Zeile für Zeile in einer1. Regressionsreihenfolge abflachen, wird der zweite Schritt wiederholt, bis die flache Grundlinie im Linienprofil des Bildes erreicht ist.
  4. Wenn die Probe sehr überfüllt ist, außergewöhnlich hohe Aggregate enthält oder Scanner-Bogen-Artefakt vorhanden ist, flachten Sie das Bild mit 2nd Regressionsreihenfolge fit.
  5. Messen Sie die Aggregathöhe und -breite von einem Linienprofil, das senkrecht zur Fibrillenachse14,17,19,41,42,59genommen wird.
  6. Messen Sie die Fibrillenlänge parallel zur Fibrillenachse14,17,19,41,42,59.

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Representative Results

Abbildung 1zeigt einen repräsentativen Zeitverlauf der A-42-Aggregation, gemessen anhand des ThT-Fluoreszenz-Assays. Der Aggregationsprozess ist häufig durch eine sigmoidale Kurve gekennzeichnet, bei der zunächst eine Verzögerungsphase beobachtet wird, gefolgt von einer steilen Wachstumsphase, bevor die Kurve ein Plateau erreicht, wenn ein Gleichgewichts-Stabilitätszustand erreicht wird6,7 , 58. Es muss unbedingt sichergestellt werden, dass ein optimiertes Aggregationsprotokoll verwendet wird, um qualitativ hochwertige Daten zu generieren, um die molekularen Details zu Aggregationsprozessen zu untersuchen58.

Die hohe Auflösung von AFM ermöglicht es, die Morphologie und Heterogenität der aggregierten Arten zu verschiedenen Zeitpunkten des Prozesses zu untersuchen. Während der Aggregation, die vom ThT-Test überwacht wird, werden Die Aliquots der Probe in den Platten für eine einzelaggregierte Untersuchung durch AFM und Nano-IR vorbereitet (Abbildung 1). Der typische Prozessablauf der manuellen Probenvorbereitung ist in Abbildung 2dargestellt. Nach Abschluss der Messung der 3D-Morphologie der Probe durch hochauflösende und phasengesteuerte AFM werden die Karten abgeflacht, um die Nichtlinearität des piezoelektrischen Scanners zu entfernen und Fehlerquellen bei der Nachbearbeitungsanalyse der Probe zu reduzieren. Morphologie (Abbildung 3). Anschließend kann eine genaue und sensible statistische Einzelmolekülanalyse durchgeführt werden, wie in Abbildung 4dargestellt. Aus einer 3D-Morphologiekarte ist es möglich, aggregierte Querschnittshöhe, -breite und -länge (oder Durchmesser bei sphäroidalen Partikeln) zu extrahieren, was es ermöglicht, verschiedene Arten von Aggregaten zu unterscheiden und zu charakterisieren, die während der Aggregationszeit vorhanden sind. Kurs23,38. Typische Zeitpunkte, die für die Untersuchung des Aggregationsprozesses von Interesse sind, sind die Verzögerungsphase, die Wachstumsphase und die Plateauphase (Abbildung 1). Während der Verzögerungsphase sind in erster Linie monomere und oligomere Arten von A-42 vorhanden. Wenn sie von AFM visualisiert werden, erscheinen monomere und oligomere Arten von A-42 in der Regel als sphäroide Partikel mit einem Durchmesser von 1 bis 15 nm und einer Höhe von 0,3 bis 2 nm (Abbildung 1,unten links)38,39. Die Bildung von länglichen Protofilamenten, Protofibrillen und Fibrillen ist während der Wachstumsphase des A-42-Aggregationszeitverlaufs sichtbar (Abbildung 1, untere Mitte)38,39. Typischerweise erscheinen Protofilamente als längsförmige Merkmale von Hunderten von Nanometern in der Länge und 0,5 x 2 nm in der Höhe, während Protofibrillen als längsare lineare oder gekrümmte Aggregate mit einer Höhe von 1 bis 5 nm und Hunderten von Nanometern in der Länge38erscheinen, 39. Während der Plateauphase sind Fibrillen die vorherrschende Art von A-42-Aggregaten. Die Fibrillen von A-42 erscheinen in der Regel als unverzweigte, fadenartige Strukturen mit einem Querschnittsdurchmesser von 6 x 10 nm und einer Länge in der Reihenfolge, in der Mikrometer (Abbildung 3,unten rechts)38,39. Bemerkenswerterweise ist diese schematische Darstellung der morphologischen Eigenschaften der Aggregate ein allgemeines Merkmal der meisten aggregierenden Proteine und Peptide13,14.

Nach der Untersuchung der Probenmorphologie kann Nano-IR verwendet werden, um die chemischen Eigenschaften der einzelnen Protein-Aggregatarten zu untersuchen, die während des Aggregationsprozesses vorhanden sind, indem nanoskalige gelöste IR-Karten und Spektren sowohl in der Luft als auch in native flüssige Umgebung24,26,38,4249,50,51,52,. Abbildung 5 zeigt eine schematische Darstellung des AFM-IR-Setups. Eine IR-Quelle wird verwendet, um die Probe von unten in der gesamten internen Reflexion oder direkt von oben wie in Abbildung 5azu beleuchten. Wenn das IR-Licht von der Probe absorbiert wird, wird es die entsprechenden molekularen Schwingungs-Energiewende-Ebenen der vorhandenen Arten anregen. Die Schwingungsenergie wird in Form einer thermischen Erwärmung in der Probe abgeführt, was die thermische Ausdehnung der Probe bewirkt. Diese Ausdehnung wird im Nanomaßstab durch die AFM-Spitze in Kontakt mit der Probe mit einer Auflösung in der Größenordnung von 10 nm gemessen. Bei jedem Impuls erkennt der Ausleger die Wärmeausdehnung. Insbesondere die schnelle Ausdehnung der Probe wirft den Ausleger aus dem Kontakt mit der Probe, und nach dem Kick-out klingelt der Ausleger bei seinen natürlichen Frequenzen. Um die Empfindlichkeit von AFM-IR zu erhöhen, ist es möglich, die Laserpulsfrequenz bei der gleichen Frequenz der Schwingung des Auslegers54einzustellen. Um in diesem resonanzverstärkten Modus zu arbeiten, ist es notwendig, IR-Quellen zu haben, die in einem breiten Bereich von Frequenzen gepulst werden können, wie Quantenkaskadenlaser, die typischerweise in einem Bereich zwischen 1-1000 kHz arbeiten. Die Peak-to-Peak-Amplitude und die schnelle Fourier-Transformation des Ringdown-Signals, die als IR-Amplitude bezeichnet wird, der rohen Ausleger-Ablenkung sind proportional zum absorbierten IR-Licht. Diese Signale werden in Echtzeit erkannt, indem die Durchbiegung eines roten Lasers gemessen wird, der auf die Oberseite des Auslegers fokussiert ist. Um chemische Karten zu erhalten, wird die Laserwellenzahl auf eine bestimmte Wellenzahl fixiert und das IR-Amplitudensignal wird an jedem Punkt der Karte gesammelt, während, um IR-Spektren zu erfassen, die Position des Auslegers in einer Position von Interesse und dem Laser befestigt ist. Wellenlänge wird entlang des spektroskopischen Interessenbereichs gefegt. Die endgültige Auflösung von AFM-IR ermöglicht die Messung der chemischen Eigenschaften von Proteinaggregaten mit einer Querschnittshöhe von ca. 5 nm, wie in Abbildung 6dargestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Überwachung des Aggregationszeitverlaufs in vitro über ThT-Fluoreszenz und AFM.
Proben, die während der Verzögerungsphase, der Wachstumsphase und der Plateauphase des Aggregationsprozesses entnommen wurden, wie sie von der ThT-Fluoreszenz nachgewiesen wurden, wurden über hochauflösendes AFM abgestellt. Diese Figur wurde von Ruggeri et al.38adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Substratvorbereitung und Probenabscheidung für AFM-Messungen.
(A, B) Glimmerätzung mit Klebeband. (C) Stichprobenabscheidung. (D) Probeninkubation. (E) Probenspülung mit Reinstwasser. (F) Probentrocknung unter schonendem Stickstofffluss. (G) Probenbildgebung mit mikrofabriziertem AFM-Ausleger mit scharfer Spitze am Ende. (H) Verarbeitetes Bild von Amyloidfibrillen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: AFM-Bildverarbeitungsverfahren42.
Der obere Teil jedes Bedienfelds zeigt eine Profillinie der Stichprobenfläche (rote Linie), die durch das entsprechende AFM-Bild dargestellt wird, während der untere Teil ein Histogramm der Höhe aller Pixel im Bild zeigt. (a) Rohes AFM-Bild vor der Bildabflachung. (b) AFM-Bild nach der Verarbeitung mit der gesamten Ebene Abflachung. Fibrillare Strukturen (rosa Farbe) wurden durch das Abflachungsverfahren maskiert. (c) Bild, das mit zeilenfürstigem Abflachungsverfahren verarbeitet wird. (d) Endgültiges Bild nach der Bildverarbeitung. Diese Figur wurde von Ruggeri et al.42adaptiert.

Figure 4
Abbildung 4: Einzelne aggregierte statistische Analyse von AFM-Bildern.
(a) Beispiel für die Rückverfolgung der Höhen und Längen von fibrillaren Strukturen, angegeben mit 1 und 2. (b) Schaubild mit Abschnitten der nachverfolgten Fibrillen und ihrer durchschnittlichen Höhe. (c) Beispiel eines Histogramms, das die durchschnittliche Höhe von fibrillaren Strukturen anzeigt. (d) Schaubild mit normalisiertem Profil der nachverfolgten Fibrillen 1 und 2. (e) Histogrammverteilung der normalisierten Profilhöhenpunkte. Diese Figur wurde von Ruggeri et al.42adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Funktionsprinzip der AFM-IR-Methode.
(a) Absorbiertes IR-Licht bewirkt die thermische Ausdehnung der Probe und spannend die mechanischen Resonanzen des AFM-Auslegers in Kontakt mit der Probe. Die Amplitude der Auslegerschwingungen ist proportional zur IR-Absorption. (b) IR-Absorptionskarten werden erhalten, um den Ausleger auf der Probe zu scannen und gleichzeitig die Laserwellenlänge zu fixieren. (c) Spitze und Berührungsprobe verhalten sich wie ein System gekoppelter Federn, deren Resonanzfrequenz monoton mit der intrinsischen Steifigkeit der Probe50zunimmt. (d) Lokalisierte Spektren werden durch Wellenwellung der Laserwellenlänge bei gleichzeitiger Fixierung der Position des AFM-Auslegers ermittelt. (e) IR-Spektrum von Proteinen. (f) Zusammenfassend ermöglicht AFM-IR die gleichzeitige Untersuchung morphologischer, mechanischer und chemischer Eigenschaften im Nanomaßstab26. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Infrarot-Nanospektroskopie (Nano-IR) eines einzelnen Amyloidaggregats.
(a) AFM-Morphologiekarte. (b) IR-Absorptionskarte an der Laserresonanzspitze bei 1658 cm-1. (c) Querschnittsmaße der Fibrillenhöhe. (d) IR-Spektren an verschiedenen Positionen der Fibrillarstruktur (gekennzeichnet in Tafel b mit blauen Kreisen) und des Substrats (in Tafel b mit grünen Kreisen markiert). Das durchschnittliche Nettosignal, das von der Aggregatstruktur (solide schwarze Linie) ableitet, wurde durch Subtraktion des gemittelten Hintergrundsignals (solide grüne Linie) vom gemittelten Fibrillensignal (solide blaue Linie) ermittelt. Diese Figur wurde von Ruggeri et al.42adaptiert.

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Discussion

Der erste kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Herstellung monomerer Proteine, wie im Fall der in den Schritten 1.1 und 1.2 beschriebenen Lösung A-42. Es ist wichtig, den Aggregationsprozess aus einer hochreinen, monomeren Lösung zu initiieren, da das Vorhandensein von oligomeren oder aggregierten Arten zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Aggregationskinetik führen kann58, und Artefakte im AFM induzieren kann. (z. B. fibrillare Arten werden in den Anfangsstadien der Aggregation sichtbar sein), was zu einer Fehlinterpretation der Daten führen kann. Hochreproduzierbare Kinetikdaten der Amyloidbildung auf Basis des ThT-Fluoreszenz-Assays in Verbindung mit dem Master-Gleichungsformalismus der chemischen Kinetik5,6,7haben es erlaubt, die A-42-Aggregation zu definieren. Mechanismus in Bezug auf seine zugrunde liegenden molekularen Ereignisse. Die chemische Kinetik verbindet die mikroskopischen Schritte, die der Amyloidbildung zugrunde liegen, mit ihren makroskopischen Manifestationen, indem sie die verschiedenen Arten berücksichtigt, wie sich neue Aggregate bilden und wachsen können, die z.B. Dehnung an den Aggregatenden oder sekundäre Kernbildung auf der Aggregierten Oberfläche. Die chemische Kinetik allein ermöglicht jedoch nicht direkt die Visualisierung möglicher Keimbildungen im Nanomaßstab, die ihre Kombination mit Einzelmolekülmethoden erfordern.

Der zweite kritische Schritt in diesem Protokoll sind die in den Schritten 2.2 und 2.6-2.8 beschriebenen Verfahren zur Substratvorbereitung und Probenabscheidung. Um Artefakte zu vermeiden, muss die Probe auf einer sauberen, atomar flachen Oberfläche abgelagert werden. Die richtige Ätzung des Glimmers ist unerlässlich, um artefaktfreie, hochauflösende AFM-Messungen zu erreichen. Die Abscheidungszeit der Probe ist ebenfalls extrem wichtig, da eine längere Inkubationszeit eine bessere Absorption auf der Substratoberfläche ermöglicht. Es kann jedoch auch künstliche Selbstorganisation und Selbstmontage25induzieren, die Artefakte (z. B. oberflächeninduzierte Aggregatarten) induzieren kann, die zu Datenfehlinterpretationen führen können. Darüber hinaus ist die Glimmeroberfläche negativ geladen, was bedeutet, dass nur positiv geladene Moleküle leicht auf sie absorbieren. Wenn die Nettoladung der Probe negativ ist, kann die Oberfläche des Glimmers mit APTES für eine bessere Phisisorption23positiv funktionalisiert werden. Die mikrofluidische Sprühabscheidung25 kann genutzt werden, um diese Effekte und Artefakte zu vermeiden und die Probe in einem einzigen Schritt und artefaktfrei ablagern.

Der dritte kritische Schritt ist die richtige Einrichtung und die Wahl der Bildgebungsparameter für die Probenabbildung über AFM und AFM-IR, die in Abschnitt 3 beschrieben werden. Die Für die Probenabbildung verwendeten AFM-Spitzen sollten scharf genug sein (Apexradien von 2 bis 8 nm), um eine hohe Auflösung zu erzielen und Faltungseffekte zu minimieren (Verbreiterung der Probenmerkmale durch die Spitze)14 ,die Unsicherheiten im Bild der Probe verursachen können. Die Wahl des Bildverarbeitungsmodus, Kontakt oder dynamisch, ist ebenfalls wichtig. Bei der Probenbildgebung über herkömmliches AFM wird der dynamische Modus dem Kontaktmodus vorgezogen, da der letztere Modus große seitliche Spitzen-Proben-Reibungskräfte induziert, die Probenschäden verursachen und Artefakte in die Messungen einbringen können (z. B. Probenhöhe durch Nanoeindierung)14,61,62. Umgekehrt wird der Kontaktmodus für die Messungen über Nano-IR bevorzugt, um das AFM-IR-Signal zu verbessern. Für Messungen im dynamischen Modus sollte der Ausleger etwas unterhalb (Abstichmodus) oder höher (berührungsloser Modus) das Maximum seiner ersten freien Schwingungsresonanz einstellen, um eine höhere Stabilität der Messungen zu gewährleisten14. Die Bildauflösung, die von der Pixelzahl und dem Scanbereich abhängt, sollte hoch genug sein, um den kleinsten Detailgrad in einer Probe zu erfassen (z. B. 1024 x 1024 Pixel für einen Bereich von 4 x 4 m2) 14,63. Eine geringe Bildauflösung kann Verzerrungen und Unsicherheiten im Bild der Probe aufgrund des Verlusts der vertikalen und seitlichen Informationen bei der Digitalisierung des Signals14verursachen. Die Scanrate, die für die Bildgebung verwendet wird, sollte niedrig genug sein, damit die Spitze Oberflächenmerkmale richtig verfolgen kann und genügend Zeit hat, um chemische Informationen zu erhalten14. Einer der wichtigsten bildgebenden Parameter ist die Bildkraft. Im Kontaktmodus ist es von grundlegender Bedeutung, eine geringe Wechselwirkungskraft zu verwenden, um die Struktur der Probe zu erhalten. Im dynamischen Modus sollte die Energieableitung an den Proben konstant gehalten werden, um die Morphologie verschiedener Proben konsistent zu vergleichen; eine konsistente Bildgebung unabhängiger Proben kann durch aufrechterhaltung eines konstanten Regimes einer Phasenänderung von nicht mehr als 20°14,42erreicht werden. Große bildgebende Kräfte sollten vermieden werden, da sie Verzerrungen und Unsicherheiten in den Beispielbildern verursachen können.

Thermische Drift durch die Ausdehnung und Kontraktion von AFM-Teilen aufgrund von thermischen Schwankungen kann Verzerrungen und Artefakte im Bild der Probe64,65verursachen. Drifts in vertikaler Richtung können dazu führen, dass der Ausleger die Spur der Oberfläche verliert und in die Oberfläche stürzt, während Drifts in seitlicher Richtung in der Regel zu einer Dehnung der Oberflächenmerkmale und Bildverzerrungen führen, was es schwierig macht, präzise Messungen der Probenmerkmale zu erreichen. Die Wirkung dieser thermischen Drifts kann durch genaue Temperaturregelung des Labors minimiert werden und genügend Zeit (ca. 30 min) geben, damit das System stabil wird, oder durch schnelle Scans66,67,68 , 69 , 70.

Die Qualität der Nano-IR-Bildgebung und Spektrensammlung durch AFM-IR kann durch mehrere Faktoren beeinflusst werden, von denen die wichtigsten sind: (i) eine falsche Teilung des IR-Signals auf der Probe durch den IR-Hintergrund, (ii) eine große Variation des nanomechanischen Kontakts zwischen und die Probe und (iii) eine übermäßige Erwärmung der Probe, die ihre Enthärtung verursacht. Um das IR-Spektrum der Probe korrekt durch den gesammelten Hintergrund zu dividieren, ist es entscheidend, dass sie mit der gleichen Laserleistung gesammelt werden. Tatsächlich hängt die spektrale Linienform des IR-Laserhintergrunds von der Leistung des Lasers ab. Um den Einfluss der mechanischen Eigenschaften der Probe auf die gemessenen chemischen Informationen zu vermeiden, ist es dann entscheidend, die Kontaktresonanz zwischen der Probe und der Spitze während der Spektren- und Bildaufnahme zu überwachen und zu verfolgen. Für die Spektrenerfassung reicht es idealerweise aus, den Laser bei einer festen Kontaktresonanz pulsieren zu lassen. Wenn das Spektrum jedoch auf einem großen spektroskopischen Bereich erworben wird, können hohe Intensitätsspitzen zu einer starken Erwärmung der Probe und ihrer Erweichung führen, wodurch die Kontaktresonanz der Spitze der Probe verändert und die IR-Spitzenamplitude künstlich reduziert wird. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Kontaktresonanz während der Spektrenerfassung zu verfolgen, um zu überprüfen, ob das Spektrum nicht durch übermäßige Erwärmung der Probe beeinflusst wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass konventionelle AFM und Nano-IR in der Lage sind, mit hoher Auflösung die morphologischen, strukturellen und chemischen Eigenschaften der einzelnen Arten zu untersuchen, die sich während der Proteinaggregationbilden 24,38. Allerdings fehlt ihnen die Fähigkeit der chemischen Kinetik, ihre schnelle Kinetik der Bildung unter nativen Massenbedingungen zu verfolgen. Um die konformen Veränderungen zu entwirren, die Proteine während ihrer Aggregation und Fehlfaltung erfahren, ist es notwendig, neuartige biophysikalische Methoden zu entwickeln und anzuwenden, die in der Lage sind, die Fähigkeiten biophysikalischer Massenmethoden mit den Untersuchung der Heterogenität und der ultrastrukturellen Eigenschaften der Proteinaggregation im Nanomaßstab. Dieser Ansatz stellt einen fruchtbaren Weg dar, um die Herausforderung des Verständnisses des Problems der Proteinselbstmontage und seiner Rolle bei Gesundheit und Krankheit anzugehen. Tatsächlich sind einzelne Aggregatansätze in der Lage, die molekularen Mechanismen des Proteinaggregationspolymorphismus und der Bildung zu entwirren und aufzuklären. Diese Informationen sind von zentraler Bedeutung, um die Herausforderung des Verständnisses der Proteinaggregation und ihrer Rolle beim Auftreten und Fortschreiten menschlicher Krankheiten zu bewältigen und ihre biophysikalischen Eigenschaften für biotechnologische Anwendungen zu verstehen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken der Schweizerischen Nationalstiftung für Wissenschaft (SNF) für die finanzielle Unterstützung (Fördernummer P2ELP2_162116 und P300P2_171219), dem Darwin College, Erasmus+ Programm für die finanzielle Unterstützung (Fördernummer 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) und Forschung, die zu diesen Ergebnissen führt, wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (RP7/2007-2013) über das ERC-Stipendium PhysProt (Vereinbarung nr. 337969), die Newman Foundation (T.P.J.K.) und The The Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. und T.P.J.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

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Biochemie Ausgabe 151 Amyloid Neurodegeneration Proteinaggregation Atomkraftmikroskopie Infrarot-Nanospektroskopie Einzelmolekülanalyse Spektroskopie
Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie
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