Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

نحن نصف تطبيق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية عالية الدقة لتصور عملية التجميع الذاتي للبروتين في مجاميع oligomeric وfibrils الأميلويد، والتي ترتبط ارتباطا وثيقا مع بداية والتنمية من مجموعة واسعة من الاضطرابات العصبية البشرية.

Abstract

ظاهرة عدم طي البروتين والتجميع يؤدي إلى تشكيل المجاميع البروتين غير متجانسة للغاية، والتي ترتبط مع الظروف العصبية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون. وعلى وجه الخصوص، تبين أن المجاميع ذات الوزن الجزيئي المنخفض، وهي قلة الأميلويد، تمتلك خصائص سمية سماوية عامة، وهي متورطة كسموم عصبية في العديد من أشكال الخرف. نحن نوضح استخدام الأساليب القائمة على الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) لمعالجة المهمة الصعبة المتمثلة في توصيف الخصائص المورفولوجية والهيكلية والكيميائية لهذه المجاميع، والتي يصعب دراستها باستخدام الهيكلية التقليدية الأساليب أو الأساليب البيوفيزيائية السائبة بسبب عدم تجانسها وطبيعتها العابرة. وتقترب التنظير المجهري للمسبار المسحي قادرة الآن على التحقيق في مورفولوجيا المجاميع النشوانية ذات الاستبانة دون النانومترية. نبين هنا أن الأشعة تحت الحمراء (IR) nanospectroscopy (AFM-IR)، الذي يستغل في وقت واحد دقة عالية من AFM وقوة التعرف على المواد الكيميائية من مطياف الأشعة تحت الحمراء، يمكن أن تذهب أبعد من ذلك وتمكين توصيف الخصائص الهيكلية للفرد المجاميع البروتين، وبالتالي تقديم رؤى في آليات التجميع. وبما أن النهج الذي نصفه يمكن تطبيقه أيضا على التحقيقات في تفاعلات تجمعات البروتين مع الجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة، فإنه يمكن تقديم معلومات أساسية لتطوير مركبات علاجية جديدة لتشخيص أو علاج الاضطرابات العصبية.

Introduction

أكثر من 40 مليون شخص في جميع أنحاء العالم يتأثرون حاليا بالاضطرابات العصبية، مثل مرض الزهايمر (AD)1 ومرض باركنسون (PD)2 الأمراض. وبشكل أعم، يرتبط أكثر من خمسين علم أمراض على المستوى الجزيئي مع سوء طي البروتين والتجميع، وهي عملية تؤدي إلى انتشار مجاميع بروتين الفيبريلار غير القابلة للذوبان، والمعروفة باسم رواسب الأميلويد3، 4.الأصول الجزيئية للتنكس العصبي وصلاتها مع التغيرات المطابقة البروتينية للبروتينات مما يؤدي إلى تشكيل الأميلويد، ومع ذلك، لا تزال غير واضحة، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى مستوى عال من التغاير، والطبيعة العابرة ونانوscale أبعاد المجاميع المرضية4،5.

وقد استندت التحقيقات الناجحة للغاية من هياكل البروتين في العقود القليلة الماضية على نطاق واسع على استخدام أساليب السائبة، بما في ذلك الأشعة السينية البلورات، والفحص المجهري الإلكترون بالتبريد ومطياف الرنين المغناطيسي النووي5، 6 , 7 , 8 , 9. ضمن هذه الفئة من التقنيات، ظهرت الأشعة تحت الحمراء (IR) مطياف كأداة تحليلية حساسة لكشف الخصائص الكيميائية للنظم البيولوجية مثل البروتينات8. تسمح أساليب الأشعة تحت الحمراء بالقياس الكمي للتغيرات الهيكلية الثانوية والرباعية للبروتين أثناء طيها وتجميعها. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل المزيد من فك على المستوى المجهري التفاصيل الميكانيكية التي تنطوي عليها المناظر الطبيعية المعقدة للطاقة الحرة من البروتين أثناء تجميعها، كان تقدما كبيرا في تطوير أدوات الحركية الكيميائية لتمتد إلى معقدة مسارات التجميع الذاتي بما في ذلك تشكيل الفيبريلات الأميلويد5،6،7،10،11،12. ومع ذلك، فإن الأساليب الطيفية السائبة لا توفر سوى معلومات متوسطة عن مجموعة غير متجانسة من الأنواع الموجودة في الحل أو المشاركة في خطوات مجهرية محددة، مما يجعل التحقيق في الخصائص البيوفيزيائية للفرد الأنواع المجمعة التي تتحدى على مستوى النانو13،14.

وقد ظهرت في العقود الأخيرة عدة تقنيات للتنظير المجهري مع القدرة على العمل على مقاييس أصغر من حد الانعراج للضوء. وتشمل هذه الفئة من الأساليب الفحص المجهري الإلكتروني (EM) والفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). في حين أن المسح المجهري الإلكتروني (SEM) والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM) يوفران صورًا ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) للعينة، فقد ظهر AFM في العقود الأخيرة كتقنية قوية ومتعددة الاستخدامات لدراسة المورفولوجيا ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)، كما فضلا عن الخصائص النانوية الميكانيكا للعينة مع قرار دون نانومتر13،14،15،16،17،18،19، 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27.الأساس المنطقي وراء دراسة تجميع البروتين عن طريق AFM هو أن هذا النهج يتيح التحقيق في مورفولوجيا الأنواع الفردية الموجودة في الحل13،14،16، 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31،32،33،34،35،36،37. على وجه الخصوص، من خلال رصد العينة كدالة للوقت، يسمح AFM بالتحقيق في تطور مورفولوجيا الأنواع داخل العينة، مما يجعل من الممكن متابعة وتصور مسارات تشكيل الأميلويد23، 25،38،39،40،41،42. وعلاوة على ذلك، يتيح AFM التحديد الكمي للمعلمات الهيكلية مثل ارتفاعات وأطوال الأنواع الفردية الموجودة في الحل13و19و30و31 ،32،33،34،35،36،37،40،43، 44 , 45 , 46 , 47 , 48- غير أن دراسة خاصية فيزيائية حيوية واحدة، مثل علم المورفولوجيا، كثيرا ما لا تكون كافية عند دراسة النظم البيولوجية غير المتجانسة والمعقدة. طرق التصوير AFM أو SEM أو TEM وحدها لا تكشف بسهولة عن الخصائص الكيميائية للأنواع غير المتجانسة من المجاميع الأميلويد على مقياس النانو.

وقد أحرز تقدم كبير لتحليل العينات البيولوجية غير المتجانسة على هذا النطاق في الآونة الأخيرة مع تطوير وتطبيق في مجال تجميع البروتين من التصوير النانوبي بالأشعة تحت الحمراء (AFM-IR)24،26، 38،42،49،50،51،52. يستغل هذا الأسلوب المبتكر الجمع بين الاستبانة المكانية لـ AFM (حوالي 1-10 نانومتر) مع قوة التحليل الكيميائي للالأشعة تحت الحمراء. وتستند تقنية AFM-IR إلى قياس تأثير الرنين المستحث بالحرارة الضوئية مدفوعاً بليزر الأشعة تحت الحمراء، وإلى قياس التوسع الحراري للعينة قيد التحقيق من طرف AFM. يمكن إضاءة العينة بواسطة ليزر الأشعة تحت الحمراء مباشرة من أعلى أو من أسفل في انعكاس داخلي كامل، وبالمثل كما هو الحال في مطياف الأشعة تحت الحمراء التقليدية24،42،52،53 . يمكن نبض ليزر الأشعة تحت الحمراء بترددات نموذجية بحسب مئات الكيلوهرتز (1-1000 كيلوهرتز) وضبطه على نطاق طيفي واسع، عادة بين 1000-3300 سم-1. على الرغم من أن مصدر الليزر يغطي مساحة تبلغ حوالي 30 درجة مئوية، يتم تحديد الاستبانة المكانية لتقنية AFM-IR اسمياً من خلال قطر طرف AFM، الذي يكشف التوسع الحراري المحلي للنظام. AFM-IR مناسبة تماما لدراسة العينات البيولوجية لأن إشارة الأشعة تحت الحمراء يتناسب مع سمكها تصل إلى 1-1.5 ميكرومتر، وأطياف الأشعة تحت الحمراء الناتجة عموما تتفق مع أطياف الإرسال FTIR المقابلة13،54 ،55. ولهذا السبب، يمكن تطبيق أساليب التحليل المعمول بها في التحليل الطيفي بسهولة، مثل دراسة التحولات الكيميائية، وتغيير شكل النطاق، وفك الإلتواء عن طريق تحليل المشتقات الثانية52. وعموما، فإن الجمع بين الاستبانة المكانية للمركبات المضادة للمواد الكيميائية وقوة التعرف الكيميائي على مطياف الأشعة تحت الحمراء، يتيح AFM-IR الحصول في وقت واحد على مجموعة واسعة من الخصائص المورفولوجية والميكانيكية والكيميائية لعينة على مقياس النانو.

هنا، نقوم بتوضيح بروتوكول لتوصيف عملية تجميع البروتين الذي يستغل مزيج من اختبارات الفلورة في المختبر، والتصوير عالي الدقة AFM والأشعة تحت الحمراء نانوية AFM. وقد برع هذا النهج المشترك بالفعل في تقديم نتائج مفصلة في دراسة الخصائص الكيميائية والهيكلية للقطرات الصغيرة الفردية التي شكلتها المجاميع البروتين، في دراسة فصل مرحلة البروتين السائل السائل، وفي التحقيق في التغايرية والخصائص الفيزيائية الحيوية للأنواع المجمعة الفردية في النانومقياس23،26،38،45،50،53، 56و57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تجميع الاختبارات على قارئات لوحة الفلورة

ملاحظة: البروتوكول الموضح هنا هو مثال على كيفية دراسة تجميع أي بروتين أو ببتيد بواسطة الحركية الكيميائية. على وجه الخصوص، فإنه يصف بروتوكول الأمثل لدراسة تجميع الببتيد Aβ42، الذي يشارك في بداية وتطور مرض الزهايمر58،59. ويمكن تعديل بروتوكول مماثل واعتمادها نحو دراسة تجميع أي بروتين أو ببتيد.

  1. الحصول على حل أحادي نقي للغاية من Aβ42 من خلال تقنيات تبادل أيون واستبعاد حجم اللونية للتمييز بين كسور البروتين التي تحتوي على Aβ42، وعزل الكسر الأحادي من الأشكال المجمعة الأخرى من Aβ42 التي تم الحصول عليها58 , 59.
  2. تمييع الببتيد Aβ42 في 20 مل من احتياطي فوسفات الصوديوم، 200 درجة مئوية EDTA عند درجة الحموضة 8.058 إلى التركيز النهائي المطلوب تتراوح بين 1-5 ميكرومتر، في أنابيب منخفضة الربط 1.5 مل. وينبغي ألا تحتوي العينات التي يتم جمعها لأغراض قياسات AFM على صبغة الفلورسنت المستخدمة في فحص التجميع (الثيوفلافين T, ThT)، لأنها قد تقدم قطعاً أثرية أثناء ترسيب العينات لتحليل هاف. وهكذا، إعداد ثلاثة توائم من حلين متطابقين: '1' الأول الذي يحتوي على Aβ42 الأحادي ة لمتابعة عملية التجميع من قبل AFM؛ '2' الأول الذي يحتوي على Aβ42 الأحادية المنضوية لمتابعة عملية التجميع من جانب AFM؛ '2' أن يكون الأول يحتوي على Aβ42 الأحادية المنضوية لمتابعة عملية التجميع من جانب AFM؛ '2' أن يكون الأول يحتوي على Aβ42 الأحادية ال 2) الثاني الذي يحتوي على aβ42 أحادي مع إضافة 20 μM ThT كمتتبع لرصد حركية التجميع.
    ملاحظة: من المهم تنفيذ الخطوتين 1.1 و 1.2 على الجليد. هذا الإجراء هو التأكد من أن الحل Aβ42 أحادية لا تجميع حتى بدأت في قارئ لوحة. عند التعامل مع العينات، الأنابيب بعناية أمر ضروري لتجنب إدخال أي فقاعات الهواء التي قد تؤثر على عينة البروتين.
  3. ماصة 80 ميكرولتر من كل عينة في كل بئر من 96 جيدا، لوحة نصف منطقة من البوليسترين الأسود مع أسفل واضحة والأسطح غير ملزمة.
  4. ختم لوحة مع احباط لتقليل تبخر العينة على مدى التجميع.
  5. معادلة درجة حرارة قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية.
  6. إعداد بروتوكول التجميع لقراءة قياسات الفلورة على فترات زمنية محددة، في الطول الموجي للإثارة من 440 نانومتر وطول موجة الانبعاثات 480 نانومتر. وينبغي الشروع في التجميع في ظروف هادئة.
  7. أدخل اللوحة في قارئ اللوحة.
    ملاحظة: من المهم أن تكون حذراً أثناء التعامل مع اللوحة للتأكد من عدم تشغيل التجميع قبل بدء تشغيل قارئ اللوحة. استخدم إعدادات ضبط الكسب لضمان القراءة المثلى لفلورة كل عينة.
  8. بدء القياس.
    ملاحظة: يتم الانتهاء من تجربة التجميع عندما يصل منحنى الفلورة السينية ThT إلى هضبة58.

2. إعداد عينة لقياسات AFM ونانو الأشعة تحت الحمراء

  1. الغراء أعلى جودة الصف V1 الميكا القرص إلى جودة عالية المغناطيسي الفولاذ المقاوم للصدأ القرص باستخدام علامات التبويب لاصقة أو الشريط على الوجهين.
  2. حفر الميكا عن طريق وضع قطعة من شريط لاصق على سطح الميكا وسحب قبالة الطبقة العليا من الميكا. هذا الإجراء سوف تنتج نظيفة، سطح مستو ذري، ومناسبة لترسب العينة.
    ملاحظة: يجب أن يكون السطح المحفور موحدًا وسلسًا.
    تحذير: لا تلمس أو تتنفس مباشرة فوق الميكا محفورة حديثا، وهذا سوف يقدم التحف.
  3. إيقاف/إيقاف قياس قارئ اللوحة لجمع نقطة الاهتمام الزمنية أثناء عملية تجميع البروتين.
  4. إزالة احباط الختم وجمع 10 ميكرولتر aliquot من العينات دون ThT من البئر إلى أنابيب منخفضة الربط 1.5 مل.
  5. إيداع 10 ميكرولتر من العينة على الميكا محفورة حديثا. لAFM-IR القياسات يجب أن تودع عينات على الركيزة الذهب جردت حديثا.
  6. احتضان الحل على الميكا لمدة دقيقة واحدة للسماح physisorbtion.
    ملاحظة: وقت الحضانة أطول من شأنه أن يسمح امتصاص أفضل على السطح ولكن قد تحفز التنظيم الذاتي الاصطناعي والتجمع الذاتي25. لتجنب هذه الآثار ، يمكن استغلال ترسب الرش25.
  7. شطف ثلاث مرات مع 1 مل من الماء النقي جدا.
  8. يجف تحت تدفق لطيف من النيتروجين لقياس العينة في بيئة الهواء.

3. AFM التصوير من مورفولوجيا مجاميع البروتين

ملاحظة: يمكن إجراء قياسات مورفولوجيا في كل من الاتصال والوضع الديناميكي، في الخطوات التالية يتم وصف هذا الأخير لأنه يقلل من القوى الجانبية لقياس مورفولوجيا 3D للعينة مع دقة عالية. وسيتم إجراء قياسات AFM-IR في وضع الاتصال لتعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء AFM-IR.

  1. تشغيل نظام AFM ما لا يقل عن 30 دقيقة قبل القياسات من أجل تمكين النظام من الوصول إلى الاستقرار الحراري. انقر على الإعداد، ثم على التحقيق. في نافذة تغيير التحقيق انقر على التالي لإعداد Z، مرحلة التركيز.
  2. إيقاف تشغيل مفتاح شعاع AFM (إذا كان على). فتح أقفال dovetail، وقطع الرأس من النظام وفي نافذة تغيير التحقيق انقر على التالي.
  3. قم بتركيب الشمعدانات AFM على حامل المسبار. ربط الرأس إلى النظام وقفل أقفال dovetail.
    ملاحظة: تحتوي الكانتيليفرز المثلى لدراسة العينات البيولوجية في الوضع الديناميكي AFM على ثابت ربيعي يتراوح بين 2-40 نيوتنمتر -1 ورادي قمة تتراوح بين 2-8 نانومتر14.
  4. تشغيل مفتاح شعاع الليزر AFM وفي نافذة تغيير التحقيق انقر على التالي.
  5. في النافذة المنبثقة انقر على لا إذا لم يتغير نوع cantilever. ضبط مقابض المحاذاة البصرية للعثور على cantilever. ضبط التركيز على cantilever وانقر على التالي.
  6. في النافذة المنبثقة انقر على نعم إذا كان التركيز على cantilever.
  7. وضع شعاع الليزر في نهاية cantilever باستخدام المقابض السيطرة على موقف الليزر الكشف. قم بتعظيم الإشارة الإجمالية التي تقاس بالصمام الضوئي المكون من أربعة أرباع إلى ما لا يقل عن >1 V باستخدام المقابض التي تتحكم في موضع شعاع الليزر المنحرف على الصمام الضوئي الحساس (PSPD). في نافذة تغيير التحقيق انقر فوق التالي ثم على إغلاق.
  8. انتظر 15 دقيقة حتى تصل إلى الاستقرار الحراري. تعديل موقف شعاع الليزر المنحرف على PSPD إذا لزم الأمر.
  9. انقر على NCM SWEEP، اختر السعة المطلوبة من التذبذب ، انقر على مرحلة الاستخدام، انقر على السيارات ولحن cantilever على مقربة من الحد الأقصى من أول رنين حر من التذبذب ، والذي هو ما يقرب من 300 كيلو هرتز ل cantilever مع ثابت الربيع من 40 N م-1.
    ملاحظة: ضبط cantilever للخروج من الحد الأقصى من الرنين الحر يضمن استقرار أعلى من القياسات14.
  10. ضع العينة على حامل العينة. اختر معلمات التصوير المناسبة. معدل المسح النموذجي هو 0.3−1.0 هرتز لمنطقة المسح الضوئي من 1 × 1 ميكرومتر2 إلى 5 × 5 ميكرومتر2. الدقة النموذجية المطلوبة بين 256 × 256 و 1024 × 1024 بكسل. انقر على منطقة المسح الضوئي لاختيار حجم المسح الضوئي ورقم البكسل.
  11. تركيز طريقة العرض البصرية على العينة. انقر على نهج للاقتراب من سطح العينة. بمجرد الانتهاء من الاقتراب انقر على رفع 100 ميكرومتر لرفع طرف AFM 100 ميكرومتر فوق سطح العينة. انقر فوق توسيع الصورة البصرية للعينة. انقر على شريط "مرحلة التركيز" لتركيز طريقة العرض على سطح العينة.
  12. استخدام الأسهم للتحرك في المنطقة من عينة من الفائدة. إشراك السطح عن طريق الضغط على زر النهج. انقر على زر مسح الخط، وتحقق مما إذا كان الطرف يتبع السطح بشكل جيد، إذا لزم الأمر، وضبط نقطة تعيين.
  13. ابدأ تصوير سطح العينة عن طريق الضغط على زر المسح الضوئي. أثناء التصوير، لتجنب قوة التصوير الكبيرة والحفاظ على الاتساق داخل عينات مستقلة، والحفاظ على نظام ثابت من تغيير المرحلة لا تتجاوز Δ20 °42.
  14. أدخل اسم الملف واختر الدليل الأساسي حيث سيتم حفظ الصورة المكتسبة.

4. قياسات الأشعة تحت الحمراء nanospectroscopy من المجاميع البروتين

  1. قم بتشغيل نظام AFM-IR وليزر الأشعة تحت الحمراء(IR) 60 30-60 دقيقة قبل قياسات التثبيت الحراري. الليزر النموذجي لأدوات AFM-IR هي مذبذبات المعلمة البصرية (OPO) والليزر تتالي الكم (QCL).
  2. افتح البرنامج المدمج للتحكم في الأداة. انقر فوق الملف ثم على جديد لفتح ملف nanoIR جديد. اضغط على الزر الأحرف الأولى لبدء تشغيل نظام AFM-IR.
  3. فتح غطاء الصك وجبل على نظام AFM-IR مسبار السيليكون الذهب المغلفة مع دائرة نصف قطرها الاسمية من 30 نانومتر وثابت الربيع من 0.2 N / م لقياس العينة في وضع الاتصال.
  4. انقر على تحميل في التحقيق AFM القسم ثم التالي. في التركيز على قسم التحقيق انقر على الأسهم لتركيز الكاميرا على cantilever. في المقطع عينة حركة XY، استخدم الأسهم لوضع الهواء عبر في نهاية cantilever.
  5. تدوير المقابض السيطرة على موقف الليزر الكشف لوضع الليزر في نهاية cantilever. تدوير المقابض الليزر للكشف عن وتعظيم المبلغ الذي يقاس بأربعة أرباع الصمام الضوئي إلى قيمة >3 V. تدوير مقبض انحراف لضبط انحراف cantilever إلى -1 V ثم انقر فوق التالي. أغلق غطاء الأداة.
  6. في القسم التركيز على عينة استخدام الأسهم لتركيز الكاميرا على العينة. ثم، في نموذج المقطع حركة XY استخدام الأسهم للتحرك في المنطقة من مصلحة العينة وانقر على النهج والانخراط.
  7. في إطار المجهر حدد كمدخلات القنوات ذات الأهمية لرسم خريطة الخصائص البيوفيزيائية للعينة. على وجه الخصوص، واختيار الارتفاع للمورفولوجيا، السعة 2 لامتصاص الأشعة تحت الحمراء وتردد PLL لرسم خريطة طرف عينة رنين الاتصال.
  8. في قسم المسح الضوئي AFM من إطار عناصر التحكم، استخدم معلمات مشابهة كما في القسم 3 (أي معدل المسح الضوئي 0.1−1.0 هرتز، بين 256 × 256 و1024 × 1024 بكسل). اختر كقيمة للمكاسب وفقًا لخشونة العينة: التكامل الأول = 1-10 وP النسبي = 10-30. ثم، انقر على المسح الضوئي للحصول على خريطة مورفولوجيا.
    ملاحظة: يمكن قياس المورفولوجيا بشكل مماثل في وضع التنصت الديناميكي، ولكن يتم إجراء قياسات AFM-IR هنا في وضع الاتصال للحصول على إشارة أعلى إلى نسب الضوضاء.
  9. بعد الانتهاء من رسم الخرائط من مورفولوجيا، في نافذة المجهر، انقر على خريطة الارتفاع لوضع التحقيق على الجزء العلوي من تجميع واحد. ثم في قسم nanoIR من نافذة عناصر التحكم، انقر فوق بدء تشغيل الأشعة تحت الحمراء لإلقاء الضوء على العينة باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء.
  10. لتركيز الليزر بالأشعة تحت الحمراء على cantilever، انقر على تحسين. في هذا الإطار، اكتب number موجة حيث العينة ستكون لها امتصاص عالية وانقر فوق إضافة. بالنسبة للبروتين، تبلغ القيمة النموذجية 1655 سم-1. انقر على المسح الضوئي للعثور على موقف الليزر الأشعة تحت الحمراء وانقر على التحديث لمحاذاة موقفها مع cantilever. أغلق النافذة.
  11. في القسم العام من إعداد nanoIR، اكتب number موجة حيث من المتوقع امتصاص عالية في المجال النسبي. ثم قم بإلغاء تنشيط خيار "تصفية تمرير النطاق" وانظر إلى قراءة العداد وفي تحويل فورييه السريع (FFT) للاستجابة. في إطار FFT نقل المؤشر الأخضر لقراءة تردد الرنين من cantilever. قيمة نموذجيّة من ال [فّت] من الرنين من ال [كنتلفرس] حوالي 300 [كهز]. اكتب قيمة تردد الرنين هذه في القسم العام في حقل مركز freq. واستخدم نافذة freq. من 50 كيلو هرتز.
    ملاحظة: حدد قوة الليزر منخفضة بما يكفي لعدم تشبع قراءة العداد ويكون التشويه في استجابة cantilever وعدم تسخين العينة.
  12. انقر على نافذة لحن نبض الليزر لاستخدام وضع الرنين المحسن. اختر مركز تردد 300 كيلو هرتز، ومجموعة من الأنيقات 50 كيلو هرتز ودورة عمل الليزر بنسبة 5%. انقر على الحصول على اكتساح معدل نبض الليزر. باستخدام المؤشر في الرسم البياني، ضبط نبض الليزر إلى تردد الاستجابة الميكانيكية للتوسع الحراري للعينة استيعاب ضوء الأشعة تحت الحمراء. ثم حدد الخيار PLL لمراقبة رنين جهة الاتصال بين العينة والطرف. اضغط على زر الصفر في إطار PLL ووضع علامة تمكين لتتبع رنين جهة الاتصال طرف العينة. اختيار ربح متكامل I = 0.5 والربح النسبي P = 10. أغلق النافذة.
  13. فتح مرة أخرى نافذة التحسين والعثور على موقف الليزر الأشعة تحت الحمراء لما لا يقل عن 3 أرقام الموجي المقابلة لنطاقات امتصاص الرئيسية للعينة (أميد الفرقة I-II-III) ولعدد موجة واحد على الأقل لكل رقاقة من الليزر.
  14. انقر على أدوات | معايرة خلفية الأشعة تحت الحمراء | جديد. في النافذة حدد المنطقة الطيفية ذات الأهمية (1800-1200 سم-1 لدراسة عينات البروتين)؛ اختيار نفس معدل النبض كما هو محدد في الخطوة 4.12 ودورة عمل بنسبة 5٪؛ انقر على اكتساب سريع وحدد سرعة الليزر، ومجموعة نموذجية لليزر تتالي الكم بين 20−500 سم-1. انقر على الحصول على لقياس خلفية الليزر الأشعة تحت الحمراء. وسيستخدم هذا الطيف الضوئي لتطبيع الأطياف المحلية النانومترية المقاسة. أغلق النافذة.
    ملاحظة: في حالة عدم توفر وضع محسّن ليزر ورنين سريع، قم بتخطي الخطوة 4.12 وحدد الأطياف المخطوّفة بدلاً من السرعة في كل من الخلفية ونوافذ اكتساب أطياف الأشعة تحت الحمراء. ومع ذلك، لن يتم الوصول إلى حساسية تجميعية واحدة.
  15. في إعدادات أطياف الأشعة تحت الحمراء، اختر دقة طيف الأشعة تحت الحمراء بين 1-4 سم-1 وعدد من المتوسطات المشتركة التي لا تقل عن 64 x. انقر على الحصول على لقياس طيف الأشعة تحت الحمراء المترجمة نانوية في نطاق البروتين (1800-1200 سم-1).
  16. للحصول على خريطة كيميائية ذات مقياس نانوي، حدد خيار التصوير بالأشعة تحت الحمراء، واختر عدد الأمواج ذات الفائدة (على سبيل المثال، 1655 سم-1 للشريط amid i) وانقر على المسح الضوئي في نافذة المسح الضوئي AFM.
  17. بمجرد اكتمال التعيين، انتقل إلى ملف وحفظ القياسات. لتحليل الخرائط المكتسبة من مورفولوجيا، والاتصال بالرنين والكيمياء، فضلا عن الأطياف المحلية نانوية، استخدم المدمج في AFM برنامج معالجة الصور. يمكن حفظ Spectra والصور كملفات .csv أو .axz لمزيد من التحليل التفصيلي مع البرامج التجارية.

5 - معالجة الصور وتحليل الأبعاد الشاملة لعدة أقسام

  1. تسطيح الصور الخام14،17،19،41،42،59 باستخدام المدمج في AFM برامج معالجة الصور أو البرامج التجارية.
    ملاحظة: ينبغي إخفاء المجاميع من الحساب لتجنب القطع الأثرية من التحليل والتقليل من تقدير ارتفاعها المقاس.
  2. تسطيح الصورة بواسطة 0 ترتيب مستوى تناسب الطرح.
  3. تسوية الصورة حسب المستوى ثم سطراً سطراً بترتيب تراجع1 st، يتم تكرار الخطوة الثانية حتى يتم الوصول إلى خط الأساس المسطح في ملف تعريف سطر الصورة.
  4. إذا كانت العينة مزدحمة جدا، ويحتوي على المجاميع عالية بشكل استثنائي أو الماسح الضوئي القوس التحف موجود، وتسطيح الصورة باستخدام 2nd ترتيب الانحدار تناسب.
  5. قياس الارتفاع الكلي والعرض من ملف تعريف خط مأخوذ عمودي إلى محور fibril14،17،19،41،42،59.
  6. قياس طول الفيبريل موازية للمحور الفيبريل14،17،19،41،42،59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1مسار زمني تمثيلي لتجميع Aβ42، مقيساً بـ "قياس الفلورة" (ThT) . تتميز عملية التجميع عادة بمنحنى السيني، حيث يتم ملاحظة مرحلة التأخر في البداية، ويليها مرحلة نمو حاد، قبل أن يصل المنحنى إلى هضبة عندما يتم الوصول إلى حالة توازنثابتة6،7 , 58- ومن الضروري ضمان استخدام بروتوكول تجميع يُحسَّن لتوليد بيانات عالية الجودة لدراسة التفاصيل الجزيئية المتعلقة بعمليات التجميع58.

عالية الدقة من AFM تمكن من التحقيق في مورفولوجيا وعدم تجانس الأنواع المجمعة في نقاط زمنية مختلفة من العملية. أثناء التجميع, يراقب ب ال [ت] فحص, [أليكوتس] من العينة في اللوحات أعدّت لوحيد تحقيق إجماليّة ب [أفف] و [نانو-ير](شكل 1). ويبين الشكل 2تدفق العملية النموذجي لإعداد العينات يدوياً. عند الانتهاء من قياس مورفولوجيا 3D للعينة عن طريق عالية الدقة والمرحلة التي تسيطر عليها AFM، يتم تسوية الخرائط لإزالة غير الخطية من الماسح الضوئي كهرضغطي والحد من مصادر الخطأ في تحليل ما بعد المعالجة للعينة مورفولوجيا(الشكل 3). وفي وقت لاحق، يمكن إجراء تحليل إحصائي دقيق وحساس لجزيء واحد، كما هو مبين في الشكل 4. من خريطة مورفولوجيا ثلاثية الدُعد، من الممكن استخراج الارتفاع العرضي الكلي والعرض والطول (أو القطر في حالة الجسيمات السفيرة)، مما يسمح بتمييز وتمييز الأنواع المتميزة من المجاميع الموجودة خلال وقت التجميع دورة23,38. النقاط الزمنية النموذجية ذات الأهمية للتحقيق في عملية التجميع هي مرحلة التأخير، ومرحلة النمو ومرحلة الهضبة(الشكل 1). خلال مرحلة التأخير، الأنواع الأحادية وoligomeric من Aβ42 موجودة في المقام الأول. عندما تصورها AFM، تظهر الأنواع الأحادية وoligomeric من Aβ42 عادة كجسيمات صفرية 1−15 نانومتر في القطر و 0.3−2 نانومتر في الارتفاع (الشكل 1،أسفل اليسار)38،39. تشكيل protofilaments ممدود، protofibrils وfibrils مرئية خلال مرحلة النمو من Aβ42 دورة وقت التجميع(الشكل 1،أسفل الوسط)38،39. عادةً ما تظهر خيوط البروتوديل اتّاست مئات النانومترات في الطول و0.5−2 نانومتر في الارتفاع، بينما تظهر البروتوفيبريلات كمجاميع خطية أو منحنية ممدودة 1−5 نانومتر في الارتفاع ومئات النانومترات في الطول38، 39. خلال مرحلة الهضبة، الفيبريلهي هي الأنواع المهيمنة من المجاميع Aβ42. عادة ً ما تظهر الفيبريلات Aβ42 كهياكل غير متفرعة وتشبه الخيط، بقطر مقطعي 6−10 نانومتر وطول في الترتيب إذا كانت الميكرومترات(الشكل 3،أسفل اليمين)38و39. بشكل ملحوظ، هذا التمثيل التخطيطي للخصائص المورفولوجية للمجاميع هو سمة عامة لمعظم البروتينات والببتيدات تجميع13،14.

بعد التحقيق في مورفولوجيا العينة، يمكن استخدام الأشعة تحت الحمراء النانوية للتحقيق في الخصائص الكيميائية للأنواع الفردية من البروتين الكلي الموجودة أثناء عملية التجميع، عن طريق الحصول على خرائط الأشعة تحت الحمراء ذات الدقة النانوية والأطياف في الهواء والأطياف على حد سواء في الهواء و البيئة السائلة الأصلية24،26،38،4249،50،51،52،. ويبين الشكل 5 رسماً تخطيطياً لإعداد AFM-IR. يتم استخدام مصدر الأشعة تحت الحمراء لإلقاء الضوء على العينة من أسفل في الانعكاس الداخلي الكلي أو مباشرة من أعلى كما هو الحال في الشكل 5a. إذا تم امتصاص ضوء الأشعة تحت الحمراء من قبل العينة، فإنه سوف يثير مستويات انتقال الطاقة الاهتزازية الجزيئية المقابلة للأنواع الموجودة. وتبدد الطاقة الاهتزازية داخل العينة في شكل التدفئة الحرارية، مما يسبب التوسع الحراري للعينة. ويقاس هذا التوسع على مقياس النانو عن طريق طرف AFM في اتصال مع العينة مع قرار في حدود 10 نانومتر. في كل نبض، يكتشف الكانتيلفير التمدد الحراري. على وجه الخصوص، فإن التوسع السريع للعينة يطرد الكانتيلفيل من الاتصال مع العينة، وبعد طرد حلقات الكانتيلفير أسفل في تردداتها الطبيعية. من أجل تعزيز حساسية AFM-IR، فمن الممكن لضبط تردد نبض الليزر في نفس التردد من التذبذب من cantilever54. من أجل العمل في هذا الوضع المعزز بالرنين، من الضروري أن يكون لديك مصادر الأشعة تحت الحمراء التي يمكن نبضها في مجموعة واسعة من الترددات، مثل الليزر التعاقبي الكمي الذي يعمل عادة في نطاق بين 1-1000 كيلو هرتز. السعة من الذروة إلى الذروة وتحويل فورييه السريع للإشارة الدائرية، التي تسمى سعة الأشعة تحت الحمراء، من انحراف الكانتلفير الخام يتناسبان مع ضوء الأشعة تحت الحمراء الممتص. يتم الكشف عن هذه الإشارات في الوقت الحقيقي عن طريق قياس انحراف الليزر الأحمر تركز على الجزء العلوي من cantilever. من أجل الحصول على الخرائط الكيميائية، يتم إصلاح number wavenumber الليزر في عدد موجة معينة ويتم جمع إشارة السعة الأشعة تحت الحمراء في كل نقطة من الخريطة، في حين، للحصول على أطياف الأشعة تحت الحمراء، يتم إصلاح موقف cantilever في موقف الفائدة والليزر واجتاحت الطول الموجي على طول مجموعة الطيفية من الفائدة. القرار النهائي من AFM-IR تمكن من قياس الخصائص الكيميائية لمجامية البروتين مع ارتفاع المقطع العرضي من حوالي 5 نانومتر، كما هو متمثل في الشكل 6.

Figure 1
الشكل 1: رصد دورة وقت التجميع في المختبر عن طريق الفلورة ThT وAFM.
تم تصوير العينات المأخوذة خلال مرحلة التأخير، ومرحلة النمو، ومرحلة الهضبة من عملية التجميع كما تم الكشف عنها من قبل الفلورة ThT عن طريق AFM عالية الدقة. وقد تم تكييف هذا الرقم من Ruggeri وآخرون38. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التمثيل التخطيطي لإعداد الركيزة وترسب العينات لقياسات AFM.
(ألف، باء) النقش الميكا باستخدام شريط لاصق. (ج)عينة الترسيب. (د)حضانة عينة. (E)عينة الرينينغ مع الماء النقي جدا. (F)تجفيف عينة تحت تدفق لطيف من النيتروجين. (G)عينة التصوير باستخدام مقصف AFM مجهّزة مع طرف حاد على نهايته. (H)صورة معالجة من fibrils الأميلويد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إجراء معالجة الصور AFM42.
يظهر الجزء العلوي من كل لوحة خط ملف تعريف لسطح العينة (الخط الأحمر) موضح في صورة AFM المقابلة، في حين يظهر الجزء السفلي رسمبياني لارتفاع جميع البيكسلات في الصورة. (أ)صورة AFM الخام قبل إجراء تسوية الصورة. (ب)صورة AFM بعد إجراء المعالجة باستخدام تسوية الطائرة بأكملها. تم إخفاء هياكل الفيبريلار (اللون الوردي) من إجراء التسوية. (ج)صورة معالجتها باستخدام إجراء التسوية سطرا سطرا. (د)الصورة النهائية بعد إجراء معالجة الصور. وقد تم تكييف هذا الرقم من Ruggeri وآخرون42.

Figure 4
الشكل 4: التحليل الإحصائي الكلي الوحيد لصور AFM.
(أ)مثال على تتبع ارتفاعات وأطوال هياكل الفيبريلار، المشار إليها مع 1 و 2. (ب)الرسم البياني مع أقسام من fibrils تتبع ومتوسط ارتفاعها. (ج)مثال على الرسم البياني الذي يبين متوسط ارتفاع هياكل الفيبريلار. (د)الرسم البياني مع ملف تعريف تطبيع من fibrils تتبع 1 و 2. (هـ)توزيع الرسم البياني لنقاط ارتفاع الملف الشخصي الطبيعية. وقد تم تكييف هذا الرقم من Ruggeri وآخرون42. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مبدأ وظيفة طريقة AFM-IR.
(أ)ضوء الأشعة تحت الحمراء استيعاب يسبب التوسع الحراري للعينة، مثيرة الرنين الميكانيكية من cantilever AFM في اتصال مع العينة. السعة من التذبذبات cantilever يتناسب مع امتصاص الأشعة تحت الحمراء. (ب)يتم الحصول على خرائط امتصاص الأشعة تحت الحمراء مسح cantilever على العينة أثناء تحديد الطول الموجي الليزر. (ج)تلميح وعينة في اتصال يتصرف كنظام من الينابيع المقترنة التي يزيد تردد رنانة من الناحية النمنية مع صلابة جوهرية من العينة50. (د)يتم الحصول على الأطياف الموضعية عن طريق كنس الطول الموجي بالليزر مع تحديد موضع cantilever AFM. (هـ)طيف الأشعة تحت الحمراء من البروتين. (و)باختصار، AFM-IR تمكن من دراسة متزامنة من الخصائص المورفولوجية والميكانيكية والكيميائية في مقياس النانو26. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التحليل النانوي بالأشعة تحت الحمراء (nano-IR) لمجموع أميلويد واحد.
(أ)خريطة مورفولوجيا AFM. (ب)خريطة امتصاص الأشعة تحت الحمراء في ذروة الرنين بالليزر في 1658 سم-1. (ج)الأبعاد المقطعية العرضية للارتفاع الفيبريلي. (د)أطياف الأشعة تحت الحمراء على مواضع مختلفة من بنية الفيبريلار (ملحوظ في لوحة ب مع الدوائر الزرقاء) والركيزة (ملحوظ في لوحة ب مع الدوائر الخضراء). تم الحصول على متوسط الإشارة الصافية المستمدة من الهيكل الكلي (الخط الأسود الصلب) عن طريق طرح إشارة الخلفية المتوسطة (الخط الأخضر الصلب) من إشارة الفيبريل المتوسط (الخط الأزرق الصلب). وقد تم تكييف هذا الرقم من Ruggeri وآخرون42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوة الحاسمة الأولى في هذا البروتوكول هي إعداد البروتينات الأحادية، كما هو الحال في حل Aβ42 الموضح في الخطوتين 1.1 و1.2. من الضروري الشروع في عملية التجميع من حل أحادي النضوس، حيث أن وجود الأنواع القلة أو المجمعة قد يؤدي إلى ضعف إمكانية استنساخ حركية التجميع58،والحث على المصنوعات اليدوية في AFM القياسات (على سبيل المثال، أنواع الفيبريلستكون ستكون واضحة في المراحل الأولية من التجميع)، مما قد يؤدي إلى سوء تفسير البيانات. بيانات حركية قابلة للاستنساخ للغاية من تشكيل الأميلويد على أساس تحليل الفلورة ThT، بالتعاون مع المعادلة الشكلية الرئيسية للحركية الكيميائية5،6،7،وقد سمحت لتحديد تجميع Aβ42 آلية من حيث الأحداث الجزيئية الكامنة. وتربط الحركية الكيميائية الخطوات المجهرية الكامنة وراء تكوين الأميلويد بمظاهرها العيانية من خلال النظر في الطرق المختلفة التي يمكن أن تتشكل وتنمو بها المجاميع الجديدة، والتي هي على سبيل المثال استطالة في النهايات الإجمالية أو الثانوية النوى على السطح الكلي. ومع ذلك، فإن الحركية الكيميائية في حد ذاتها لا تمكن مباشرة من تصور الظواهر النووية المحتملة على مقياس النانو التي تتطلب الجمع بينها مع أساليب جزيء واحد.

والخطوة الحاسمة الثانية في هذا البروتوكول هي إعداد الركيزة وإجراءات الترسيب العينات الموصوفة في الخطوتين 2-2 و2-6-2-2-8. لتجنب القطع الأثرية، يجب إيداع العينة على سطح مستو نظيف وذري. النقش السليم من الميكا ضروري لتحقيق خالية من القطع الأثرية، عالية الدقة في قياسات AFM. الوقت عينة ترسب هو أيضا مهم للغاية، كما أطول وقت الحضانة يسمح امتصاص أفضل على سطح الركيزة. ومع ذلك، فإنه قد يؤدي أيضا إلى التنظيم الذاتي الاصطناعي والتجمع الذاتي25،والتي قد تحفز القطع الأثرية (مثل الأنواع السطحية الكلي) التي قد تؤدي إلى سوء تفسير البيانات. وبالإضافة إلى ذلك، يتم شحن سطح الميكا سلبا، مما يعني أن الجزيئات المشحونة إيجابيا فقط تمتص بسهولة على ذلك. إذا كان صافي تهمة العينة سلبية، يمكن أن يكون سطح الميكا وظيفية بشكل إيجابي باستخدام APTES لتحسين phisisorption23. يمكن استغلال ترسب رذاذ Microfluidic25 لتجنب هذه الآثار والمصنوعات اليدوية وإيداع العينة في خطوة واحدة وبطريقة خالية من القطع الأثرية.

والخطوة الحرجة الثالثة هي الإعداد المناسب واختيار معلمات التصوير لتصوير العينات عن طريق AFM وAFM-IR الموصوفة في القسم 3. يجب أن تكون نصائح AFM المستخدمة في تصوير العينة حادة بما فيه الكفاية (قمة رادي من 2−8 نانومتر) لتحقيق دقة عالية وتقليل تأثيرات الإلتواء (توسيع ميزات العينة بواسطة الطرف)14، والتي قد تؤدي إلى عدم اليقين في صورة العينة. اختيار وضع التصوير، الاتصال أو الديناميكية، مهم أيضا. بالنسبة لتصوير العينة عبر AFM التقليدي، يفضل الوضع الديناميكي على وضع الاتصال حيث أن الوضع الأخير يحفز قوى احتكاك كبيرة جانبية من طرف طرف قد تسبب تلف العينة وإدخال قطع أثرية في القياسات (على سبيل المثال، الحد من القوى الاحتكاكية الجانبية الجانبية التي قد تسبب تلف العينة وإدخال القطع الأثرية في القياسات (على سبيل المثال، الحد من القوى الجانبية في ارتفاع العينة بسبب nanodentation)14،61،62. وعلى العكس من ذلك، يفضل وضع الاتصال للقياسات عن طريق الأشعة تحت الحمراء النانوية لتعزيز إشارة AFM-IR. بالنسبة للقياسات في الوضع الديناميكي، يجب ضبط الكانتيلفير أقل قليلاً (وضع التنصت) أو أعلى (وضع عدم الاتصال) الحد الأقصى لرنينه الحر الأول من التذبذب لضمان استقرار أعلى للقياسات14. يجب أن تكون دقة التصوير، التي تعتمد على عدد البكسل ومنطقة المسح الضوئي، عالية بما يكفي لالتقاط أصغر درجة من التفاصيل الموجودة في العينة (على سبيل المثال، 1024 × 1024 بكسل لمنطقة 4 × 4 ميكرومتر2) 14،63. انخفاض دقة التصوير يمكن أن يسبب تشوهات وشكوك في صورة العينة بسبب فقدان المعلومات الرأسية والجانبية عند رقمنة الإشارة14. يجب أن يكون معدل المسح الضوئي، المستخدم في التصوير، منخفضًا بما يكفي لكي يتمكن الطرف من متابعة الميزات السطحية بشكل صحيح، فضلاً عن أن يكون لديك الوقت الكافي للحصول على المعلومات الكيميائية14. واحدة من أهم معلمات التصوير هي قوة التصوير. في وضع الاتصال، من الضروري استخدام قوة تفاعل منخفضة للحفاظ على بنية العينة. وفي الوضع الدينامي، ينبغي أن يظل تبديد الطاقة على العينات ثابتاً من أجل المقارنة المستمرة بين مورفولوجيا العينات المتميزة؛ يمكن الحصول على التصوير المستمر للعينات المستقلة من خلال الحفاظ على نظام ثابت لتغيير المرحلة لا يتجاوز Δ20 °14،42. وينبغي تجنب قوى التصوير الكبيرة لأنها قد تؤدي إلى تشوهات وشكوك في صور العينة.

الانجراف الحراري الناجم عن توسع وانكماش أجزاء AFM بسبب التقلبات الحرارية يمكن أن يسبب تشوهات والتحف في صورة العينة64،65. الانجرافات في الاتجاه الرأسي قد يسبب cantilever لتفقد المسار من السطح، فضلا عن تحطمها في السطح، في حين الانجرافات في الاتجاه الجانبي عادة ما يؤدي إلى استطالة ملامح السطح وتشويه الصورة، مما يجعل من الصعب على تحقيق قياسات دقيقة لميزات العينة. يمكن التقليل من تأثير هذه الانجرافات الحرارية عن طريق التحكم الدقيق في درجة الحرارة في المختبر، فضلا عن إعطاء ما يكفي من الوقت (حوالي 30 دقيقة) للنظام لتصبح مستقرة أو عن طريق إجراء عمليات مسح سريع66،67،68 , 69 , 70.

يمكن أن تتأثر جودة التصوير بالنانو-IR وجمع الأطياف من قبل AFM-IR بعدة عوامل أهمها: '1' تقسيم خاطئ لإشارة الأشعة تحت الحمراء على العينة حسب خلفية الأشعة تحت الحمراء، '2' اختلاف كبير في الاتصال الميكانيكي النانوي بين الطرف والعينة، و (3) التدفئة المفرطة للعينة مما تسبب في تليين لها. لتقسيم طيف الأشعة تحت الحمراء للعينة بشكل صحيح من قبل الخلفية التي تم جمعها، فمن الأهمية بمكان أن يتم جمعها في نفس قوة الليزر. في الواقع، شكل الخط الطيفي لخلفية الليزر الأشعة تحت الحمراء يعتمد على قوة الليزر. ثم، من أجل تجنب تأثير الخصائص الميكانيكية للعينة في المعلومات الكيميائية المقاسة، من الأهمية بمكان رصد وتتبع صدى الاتصال بين العينة والطرف أثناء الأطياف واكتساب الصورة. للحصول على الأطياف، من الناحية المثالية، يكفي لنبض الليزر في صدى اتصال ثابت. ومع ذلك، إذا تم الحصول على الطيف على نطاق مطياف كبير، يمكن أن تسبب قمم عالية الكثافة تدفئة قوية للعينة وتليينها، وبالتالي تغيير رنين الاتصال طرف عينة والحد بشكل مصطنع من السعة الذروة الأشعة تحت الحمراء. ولهذا السبب، من المهم تتبع رنين الاتصال أثناء اكتساب الأطياف من أجل التحقق من أن الطيف لا يتأثر بالتسخين المفرط للعينة.

في الختام، AFM التقليدية ونانو-IR قادرة على التحقيق مع دقة عالية الخصائص المورفولوجية والهيكلية والكيميائية للأنواع الفردية التي تشكل خلال تجميع البروتين24،38. ومع ذلك، فإنها تفتقر إلى القدرة على الحركية الكيميائية لمتابعة حركيتها السريعة من تشكيل في الظروف السائبة الأصلية. من أجل كشف التغيرات المطابقة التي يخضع لها البروتين أثناء تجميعها وطيها، فمن الضروري تطوير وتطبيق أساليب فيزيائية حيوية جديدة قادرة على الجمع بين قدرات الأساليب البيوفيزيائية السائبة مع التحقيق في التغايرية والخصائص الهيكلية جدا لتجميع البروتين على مقياس النانو. ويمثل هذا النهج سبيلا مثمرا للتصدي للتحدي المتمثل في فهم مشكلة التجميع الذاتي للبروتين ودوره في الصحة والمرض. في الواقع، نُهج تجميع ية واحدة قادرة على كشف وتوضيح الآليات الجزيئية لتعدد الأشكال والتركيب لتجميع البروتين. وهذه المعلومات أساسية للتصدي للتحدي المتمثل في فهم تجميع البروتين ودوره في ظهور الأمراض البشرية وتطورها، فضلا عن فهم خصائصها البيوفيزيائية لتطبيقات التكنولوجيا الأحيائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNF) على الدعم المالي (رقم المنحة P2ELP2_162116 و P300P2_171219)، وكلية داروين، برنامج Erasmus+ للدعم المالي (رقم المنحة 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) وقد تلقت البحوث التي أدت إلى هذه النتائج تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013) من خلال منحة ERC PhysProt (الاتفاق رقم 337969)، ومؤسسة نيومان (T.P.J.K.) ومؤسسة مركز كامبريدج للأمراض القابلة للطي (C.G., M.V., and T.P.J.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926 (2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541 (2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101 (2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225 (2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9 (2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903 (2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 151، الأميلويد، التنكّن العصبي، تجميع البروتين، مجهري القوة الذرية، التحليل النانوي بالأشعة تحت الحمراء، تحليل جزيء واحد، التحليل الطيفي
وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruggeri, F. S., Šneideris, T.,… More

Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter