Summary
이 프로토콜의 목적은 배아 조직 이식 기술을 사용하여 Cas9 돌연변이 공여자 조직에서 유래한 haploid 앞다리를 가진 키메라 액록톨을 생산하는 것입니다.
Abstract
유전 기술과 자원의 성장 세트는 연구원이 성인으로 전체 사지를 재생하는 축색꽃과 같은 도롱뇽의 일부 종의 능력의 분자 기원을 탐구 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 유전자 기능 및 사지 재생의 충실도를 탐구하기 위하여 이용될 수 있는 Cas9 돌연변이 화한 haploid 앞다리를 가진 키메라 axolotls를 생성하는 데 이용된 기술을 개략적으로 설명합니다. 우리는 시험관 내 활성화, CRISPR/Cas9 돌연변이 발생, 조직 이식을 통해 여러 배아 및 유전 적 기술을 결합하여 재생의 모델 유기체에서 haploid 유전 스크리닝을위한 독특한 시스템을 생산합니다. 이 전략은 사지 재생에서 유전자의 기능 적 분석에 필요한 동물, 공간 및 시간의 수를 감소시킨다. 이것은 또한 유기 발생 조직 형성, 조직 형태 형성 및 그밖 필수 배아 프로세스와 같은 그밖 필수 프로세스를 위해 요구될 수 있는 유전자의 재생 특정 기능의 조사를 허용합니다. 여기에 설명된 방법은 척추동물 모델 시스템에서 haploid 유전자 스크리닝을 수행하기위한 독특한 플랫폼입니다.
Introduction
역사적으로, 양서류에 있는 배아 조직 이식은 발달 생물학 및 재생의 근본적인 기계장치를 탐구하기 위한 중요한 기술이었습니다. 도롱뇽 의 종 인 액소로틀은 부상이나 절단 후 사지 및 장기와 같은 조직과 복잡한 구조를 재생하는 인상적인 능력을 가지고 있습니다. 마찬가지로 인상적으로, 그들은 배아, 청소년 및 성인 단계1,2,3에서다른 개인으로부터 거부, 조직 이식을받지 않고받을 수 있습니다. 사지, 꼬리, 눈 및 머리와 같은 전체 구조를 생성하는 배아의 영역, 신경 외피 및 소미트와 같은 보다 구체적인 조직은 키메라 동물을 생산하기 위해 배아 사이에 이식 될 수 있습니다1,2,4,5,6. 거의 한 세기 동안, 이러한 키메라 동물의 연구는 재생에 중요한 통찰력을 제공하고있다, 조직 분화, 크기 제어, 및 패터닝1,7,8.
지난 10 년 동안, 재생 조직의 수많은 전사 연구는 도롱뇽 재생9,10,11,12,13의기본 유전 프로그램에 대한 통찰력을 생산하고있다. 이 연구 결과는, 현재까지, 재생의 맥락에서 크게 특성화되지 않은 후보 유전자의 확장 목록에 추가했습니다. CRISPR/Cas와 같은 표적 돌연변이 유발 기술은 이제 이러한 유전자의 조사를 허용하고, 이러한 유전적 접근법은 최근 큰 액소로틀 게놈14,15,16의시퀀싱 및 조립에 의해 크게 촉진된다.
우리는 재생의 기계장치를 해부하기 위한 목적으로 고전적인 발달 생물학을 새로운 유전 기술과 결합하는 기술을 개발하고자 했습니다. 액소로톨 및 기타 도롱뇽의 하플로이드 배아를 생성하는 방법은 수십 년 동안17년동안 확립되어 왔다. 이러한 기술은 오랫동안 유전 모델유기체18로도롱뇽의 장점으로 지적되었지만, 몇 가지 후속 유전 연구는 haploid 동물을 통합했다. 우리는이식19를위한 조직 기증자역할을 하는 haploid 배아를 생성하기 위하여 axolotl에 있는 시험관 내 활성화를 이용합니다. 형광 유전 마커를 운반하는 배아를 사용하여, 우리는 기증자 조직에서 거의 전적으로 파생된 사지를 생성하기 위한 믿을 수 있는 방법을 고안했습니다(그림 1A). 이 두 기술을 결합해서, 우리는 haploidy와 관련되었던 늦은 배아 치사성을 우회하여, 완전히 개발된, 이식된 haploid 사지의 생산을 허용합니다(그림 1B, 그림 1B'및 그림 2).
돌연변이 haploid 사지를 가진 키메라 axolotls를 만들기 위하여 이식하기 전에 haploid 태아에 있는 CRISPR/Cas 중재한 돌연변이 발생을 수행해서, 우리는 사지 발달 과 재생의 문맥 내의 유전자 기능을 구체적으로 조사할 수 있습니다. 이것은 잠재적으로 배아 치명적인 돌연변이 표현형에서 사지의 구출을 허용합니다. CRISPR/Cas 미세주사는 매우 돌연변이가 높은 동물을 생성할 수 있지만, 이러한 동물은 전형적으로 매우 모자이크이며, 어느 정도의 야생형 대두류및 표적 부위에서의 다양한 뚜렷한돌연변이를가진다.4,20. haploid 세포에 있는 CRISPR 기지를 둔 돌연변이 발생은 유지된 야생형 eeles에 의해 마스크될 수 없기 때문에, 기능의 단 하나 대문자 손실 돌연변이의 침투를 증가합니다. 이러한 이유로, 하플로이드 세포주에서 CRISPR 기반 스크리닝은 많은 세포 과정의 유전적 기초를 조사하기 위해 점점 더 많이 사용되고있다 21,22,23. CRISPR 기반 계보 추적과 우리의 haploid 사지 싹 접목 프로토콜을 결합함으로써, 여기에 설명된 접근법은 살아있는 동물20에서haploid 유전 스크린을 위한 플랫폼으로 작용할 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜에 사용된 실험 절차는 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC, 2017-10557)에 의해 승인되었으며 척추 동물의 사용을 규제하는 모든 연방 정책 및 지침에 따라있었습니다. 모든 동물 실험은 예일 대학의 시설에서 암비스토마 멕시카눔(악소로트)에서 수행되었다.
1. 디플로이드 배아 생성
- 하나 또는 두 개의 gfp 부모24를사용하여 자연 짝짓기를 통해 이식 호스트역할을 하는 GFP+ 디플로이드 배아를 획득한다.
- 갓 낳은 디플로이드 계란을 모아 금속 체에 넣습니다.
- 40% 홀트프레터용액(20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3,0.2 mM CaCl2,4 mM MgSO4,pH ~ 7.4)으로 계란을 철저히 헹구십시오.
- 계란을 신선한 40% 홀트프레터용액에 놓고 12°C에 보관합니다.
참고: 디플로이드 배아는 haploid 배아 생성으로 이동하기 전에 항상 얻어야 합니다.
2. 하플로이드 배아 생성
- 여성 게임 기증자 준비
- 48 시간 시험관 내 활성화를 수행하기 전에, 40% Holtfreter의 용액25에서1 g/L HEPES 완충MS-222에 침지함으로써 성적으로 성숙한 백색 또는 백색/RFP 암컷 액소를 마취시켰다.
- 엄지와 집게 손가락 사이에 꼬리를 단단히 꼬집어 약 30분간 침지한 후 동물이 완전히 마취되었는지 확인합니다. 완전히 마취 된 동물은 물리적으로 어떤 핀치에 반응하지 않습니다.
- 멸균 식염수에 10,000 U/mL을 함유한 인간 융모성 생식샘 자극호르몬(HCG)의 용액을 준비하십시오.
- 30 G 인슐린 주사기를 사용하여 0.15 CC의 HCG (1,500 단위)를 마취 된 여성의 뒷다리에 0.15 CC (1,500 단위)를 주입하여 척수와의 접촉을 피하기 위해 중간선에 45 ° 각도로 근육 등쪽을 주입하십시오.
- 암컷을 신선한 40% 홀트프레터용액으로 되돌려 놓고 8-12°C 냉장고에 놓습니다.
- 48 시간 후, 실온으로 여성을 반환합니다. 달걀 누워 표면으로 그녀의 용기에 몇 돌이나 플라스틱 식물을 놓는다.
참고 : HCG로 주입 된 여성은 종종 알을 낳기 전에 몇 시간 동안 빈 젤리 케이스를 입금합니다. - 암컷이 지속적으로 알을 낳기 시작한 후 돌이나 플라스틱 식물을 제거하십시오.
- 암컷이 빈 탱크에 30분에서 1시간 동안 앉도록 하십시오.
참고 : 동물이 알을 낳을 수있는 물질을 원천 징수하면 oocyte 수집을 보다 엄격하게 제어 할 수 있습니다.
- 남성 게임 컬렉션
- 여성의 알 누워 지연 하는 동안, 성적으로 성숙한 GFP+ 남성 axolotl 정자 기증자 역할을 마 신, 단계에서와 같이 2.1.1.
- 완전히 마취 된 남성을 해부 현미경 아래에 젖은 종이 타월에 등을 놓습니다.
- 실험자가 오른손잡이인 경우 P1000 파이펫 끝을 오른손으로 cloaca 의 바닥에 놓습니다.
- 왼쪽 집게 손가락과 왼손 엄지 손가락을 골반에 2−3cm 로스트랄로 놓습니다. 손가락을 뒷다리쪽으로 움직이면서 동물을 부드럽게 짜서 정자 소변 샘플을 씻어냅니다.
- 개별 미세 원심 분리튜브로 cloaca에서 플러시되는 각각을 수집합니다. 이 과정을 반복하여 6~10개의 샘플을 수집합니다.
- 각 샘플에서 페트리 접시에 피펫 5.0 μL을 사용하여 정자의 품질을 검사합니다.
참고: 농축된 정자 견본은 유백색, 전형적으로 5 에서 20 μL범위이고, 일반적으로 몇몇, 더 높은 양 정액 소변 견본이 추출된 후에 회수됩니다. 정액은 방해받지 않고 방치될 때 더 높은 양 견본에 있는 관의 바닥에 수집할 것입니다. 건강한 정자의 농축 된 샘플은 매우 운동성이며 집중력이 감소함에 따라 활동을 잃습니다. 건강한 남성은 농축 된 정자의 최대 50 μL을 생성 할 수 있습니다.
- 여성 게임 컬렉션
- 건강한 정자 샘플을 획득하고 확인한 후, 2.1.1단계에서와 같이 HCG 주입 된 여성 액소를 마취시.
- 완전히 마취 된 여성을 젖은 종이 타월에 등에 놓습니다.
- 2.2.4단계에서와 유사한 손 동작을 사용하여 암컷으로부터 수정되지 않은 난자를 추출한다.
- 젖은 집게를 사용하여 계란을 수집하고 10cm 페트리 접시에 전송합니다. 수집의 15 분 이내에 조사 된 정자로 계란을 치료하십시오.
- 남성 게임 테 준비 및 체외 활성화
- P10 또는 P20 피펫을 사용하여 정자를 위아래로 파이펫하고 덩어리를 분해하여 균일한 현탁액을 형성합니다.
- 페트리 접시 뚜껑 또는 유리 슬라이드에 희석되지 않은 정자 현탁액의 0.5 μL 드롭을 배치하고 거꾸로 현미경으로 검사하여 운동성 정자의 비율을 근사화.
- 9.5 μL의 0.1x 마크의 수정 링거 솔루션 (MMR; 재료 표) 이 샘플에 20 배 정자 희석을 합니다. 위아래로 부드럽게 파이펫을 섞어 주세요.
- 반전된 현미경으로, 페트리 접시 덮개 또는 혈세포계에 희석된 20x 의 3개의 1.0 μL 방울에 있는 정액을 계산하여 희석되지 않은 현탁액의 정액 농도를 추정합니다.
- 멸균 0.1x MMR에 있는 대략 80,000의 운동성 세포/mL에 원래 정액 견본의 aliquot를 희석하 여 조사를 위한 정액을 준비하십시오.
- 지난 15분 이내에 얻은 계란의 수를 계산합니다. 파이펫 팁을 사용하여 이 서스펜션을 1mm 두께의 층으로 펼입니다.
- 플라스틱 리프트를 사용하여 254 nm 가교의 전구에서 샘플을 4cm 떨어진 곳에 놓습니다. 800,000 uJ/mm2로견본을 조사하여 정액을 유전으로 비활성화하십시오.
- P10 파이펫을 사용하여, 비수정 계란에 현탁액을 파이펫, 조사 된 정자의 0.25−0.5 μL각 계란코팅. 계란을 실온에서 30 분 동안 앉게하십시오.
- 30 분 후, 0.1 x MMR로 계란을 홍수. 즉시 8-10 °C 인큐베이터에 계란을 주사를 위해 다음날 또는 18 °C에서 7 시간 후 활성화 (hpa) 이내에 주사를 하십시오.
- 수분 공급 후 30분 동안 날카로운 포셉을 사용하여 데젤리 하플로이드를 사용하소서. 즉시 8-10 °C 인큐베이터에 계란을 주사를 위해 또는 같은 날 주사를 위해 18 °C에서 놓습니다.
3. 하플로이드 돌연변이 발생 및 유지 보수
- CRISPR/Cas9 미세 주사
- CRISPRscan을 사용하여 sgRNAs를 설계하고26,27을합성합니다.
- 멀티플렉스 돌연변이 발생의 경우, 5 sgRNAs (각 sgRNA당 10 ng /μL) 및 Cas9 단백질 (1 μg / μL)의 주식을 준비하십시오. 주입을 위해 이 스톡의 100배 희석(sgRNA당 0.1 ng/μL, 10 ng/μL Cas9)을 준비합니다. 단일 유전자의 경우, 높은 돌연변이 주파수 돌연변이 발생, 이전에 설명 된 프로토콜을 따르십시오28.
- 18°C에서 저장한 경우 단세포 7hpa에서 하플로이드 배아를 주입하거나 8-10°C에서 보관하는 경우 다음날 2-8 세포 단계에서 배아를 주입한다.
- 배아를 20% 폴리수크로오스 400으로 1.0x MMR로 옮김.
- 단세포인 경우, 총 질량0.5 pg/sgRNA 및 50 pg Cas9 단백질을 포함하는 주사 액(난자의 약 1/4 반경)을 5 nL 드롭으로 각 배아를 주입합니다. 다세포인 경우, 더 작은 볼륨을 여러 세포에 주입하여 이 질량을 분배하십시오.
- 배아가 최소 4시간 및 18°C에서 최대 18시간 동안 다수크로오스 400에서 치유되도록 한다.
- 하플로이드 배아 하우징
- 항생제 항균제로 배아를 0.1x MMR로 옮김.
- 몇몇은 정지하거나 비정상적으로 발전할 것이기 때문에, 24 우물 격판덮개의 개별 적인 우물에 각 태아를 집. 16-18 °C에서 유지합니다. 필요한 경우 저온을 사용하여 개발을 연장할 수 있습니다.
- 미디어를 매일 항생제 항균제로 0.1x MMR로 교체하십시오.
4. 디플로이드 숙주 배아 제제
- 배아를 12~16°C에서 12~26단계까지 유지한다.
- 이식 준비가 된 배아를 수집하고 체(4mm 메쉬 크기)에 놓고 40% Holtfreter용액으로 부드럽게 헹구십시오.
- 배아를 최대 2분 동안 1.5% 표백제를 함유한 필터 멸균 0.1x MMR로 옮기고, 배아를 표백액에 완전히 담그고 부드럽게 소용돌이치면 젤리 코팅이 표백제 용액과 완전히 접촉하여 미생물을 죽일 수 있습니다. 배아에 존재합니다.
- 2 분 후, 동일한 부피의 필터 살균 0.1x MMR로 배아를 함유하는 표백제를 희석하십시오.
- 배아를 표백제 살균 체(4mm 메쉬 크기)에 부드럽게 붓고 필터 멸균 0.1x MMR로 배아를 5회 헹구십시오.
- 탈젤리를 위한 항생제와 함께 0.1x MMR로 멸균 된 10cm 페트리 접시에 배아를 놓습니다 (페니실린 100 단위 / mL, 스트렙토 마이신 100 μg / μL, 0.25 μg / mL, gentamicin 25 μg / mL).
- 형광 입체 현미경에서 날카로운 집게 (팁 치수 0.05 x 0.01 mm2)를사용하여 GFP + 배아에서 젤리 코트와 비텔린 멤브레인을 제거하십시오.
- GFP+ 배아를 새로운 페트리 접시로 옮긴다. 데젤리가 있는 페트리 접시에서 옮겨지는 액체의 양을 최소화합니다.
- 오염 물질을 제거하기 위해 GFP+ 숙주 배아를 항생제로 0.1x MMR로 4~6회 헹구십시오.
- 이식하기 전에 깨끗한 배아를 밤새 4°C에 놓습니다.
참고 : 배아를 냉각하면 내배엽에서 중배엽을 보다 단단하고 깨끗하게 분리 할 수 있습니다.
5. 하플로이드 디플로이드 키메라 세대
- 수술 접시 및 미디어 준비
- 멸균 35mm 이지 그립 페트리 접시에 0.1x MMR에 2% 아가로스를 부어 멸균 수술 용 수술을 준비합니다. 아가로즈로 페트리 접시를 중간에 채웁니다.
- 아가로오스가 식은 후 멸균 메스를 사용하여 아가로스에서 25mm 길이의 경사진 트로프를 잘라 배아를 제자리에 고정시십시오.
- 멸균 수술 용지(안티 마이코플라즈마 2.5 μg/mL, 암포테리신 B 0.25 μg/mL, 시프로펠록사신 10.0 μg/mL)로 접시를 채우고 4°C에서 냉장 보관하십시오.
- 배아 이식 절차
- 1개의 건강한 하플로이드 공여체를 1~2단계 일치GFP+ 디플로이드 숙주 배아를 수술용 매체를 함유하는 수술용 접시의 트로프 내부에 놓는다(그림3).
참고: 가능하면 냉각 단계(10°C 이하)에서 절차를 수행하십시오. - 두 개의 초미세 오토클레이브 집게(직선 팁, 팁 치수 0.05 x 0.02 mm2)를사용하여 중심 부근의 사지 싹이 있는 호스트에서 이외 및 중배엽 층을 제거합니다(그림4).
참고 : 직사각형 조직 이식 영역은 사지 싹을 포함하고 앞쪽 후방 축을 따라 약 2mm, 아가미 벌지의 후방 절반에 아홉 번째 somite에서 확장합니다. dorsoventral 축을 따라 접목 된 영역은 약 1.5 mm에 걸쳐 있으며, 소미트를 포함하여 아가미 벌지의 복부 가장자리를 넘어서 다릅니다. 접목 된 영역은 기본 내배엽을 방해하지 않고 모든 측면 판 중배엽과 소미트의 측면 절반을 포함합니다. 자세한 내용은 그림 4 및 함께 비디오를 참조하십시오. - 숙주 조직을 제쳐두고 동일한 방법을 사용하여 haploid 공여자로부터 동등한 크기의 조직 시트를 제거하십시오.
- haploid 공여자 조직 시트를 공여자 배아의 해당 영역에 놓습니다.
- 분쇄된 현미경 커버 유리에서 오토클레이브된 직사각형 유리 조각으로 조직을 덮고 숙주 배아 몸체로 부드럽게 눌러 조직을 고정시다.
- 두 번째 숙주 배아에 대한 사지 싹을 수확하기 위해 다른 쪽에 haploid 공여자 배아를 뒤집습니다. 5.2.2단계부터 5.2.5단계까지 반복합니다.
- 나머지 과잉 숙주 조직과 기증자 배아를 접시에서 조심스럽게 제거하십시오.
- 유리 조각 앵커가 있는 접목을 60-75분 동안 제자리에 두고 20분마다 유리가 미끄러지지 않았는지 확인합니다.
- 조직 접목이 완전히 부착된 후 집게를 사용하여 유리 조각 앵커를 천천히 벗깁니다.
- 1개의 건강한 하플로이드 공여체를 1~2단계 일치GFP+ 디플로이드 숙주 배아를 수술용 매체를 함유하는 수술용 접시의 트로프 내부에 놓는다(그림3).
- 키메라 유지 보수
- 생착식 배아를 신선한 수술 매체로 옮기고 밤새 8-12°C에서 유지하여 치유합니다. 개별적으로 12 또는 24 웰 플레이트에 생착 배아를 수용.
- 36-48 h 후, 생착된 배아를 0.1x MMR 항생제 항균제로 옮김을 옮김시. 외과 매체에 있는 강한 항생제는 3 일 후에 생착한 태아에 있는 독성을 일으키는 원인이 됩니다.
- 미디어를 2-3일마다 신선한 0.1x MMR 및 항생제로 교체하십시오.
- 생착된 배아는 28°C를 먹일 수 있을 때까지18°C에서유지한다.
- 1 ~2 개월의 발달 과 관리 후, haploid 사지는 형광 해부 현미경을 사용하여 이식의 순도를 위해 채점 될 수 있습니다.
참고: 사지에 비 신경 또는 비 혈액 호스트 파생된 GFP 조직의 존재는 불순한 접목의 표시기이고 수시로 이상한 사지 발달과 연관됩니다. 이러한 동물은 추가 분석에서 제외되어야 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
발달하는 haploid 배아는 그들의 'haploid 증후군' 표현형29에의해 이형 배아와 구별될 수 있습니다. 이식 단계에서, haploid 배아는 노른자 플러그의 전방 후방 축 및 불완전한 인클로저를 따라 감소 된 곡률을 나타낸다(그림 3A). 형광 현미경은 haploid 배아가 친자 유래 GFP 발현의 자유롭다는 것을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다(그림 3B).
이식편이 깨끗할 때, GFP 표현은 그림 2에서볼 수 있듯이, 호스트의 척수에서 파생된 상아 신경총, 신경망에 주로 제한되어야 합니다. 반점 GFP 발현은 또한 발달 사지로 이동하는 감각 신경 및 혈액 유래 호스트 세포인 것처럼 보이는 단 하나 세포에서 나타날 것입니다. RFP+ 기증자가 사용될 때, haploid 이식편 사지는 RFP의 보편적인 표현을 보여줄 것이다(그림 1B'). 개발 전반에 걸쳐, 비 돌연변이 된 haploid 사지는 크기 일치 키메라 동물에서 반대 디플로이드 앞다리보다 상당히 짧다(그림 1B, 그림 1B',그림 5, n = 16 사지 쌍, haploid 평균 = 0.522 cm, SD = ± 0.087 cm, 디플로이드 평균 = 0.667 cm, SD = ± 0.069 m, 페어링 된 T 테스트 p 값 < 0.0001, 평균 비율 = 0.784, SD = ± 0.113). 비 돌연변이 haploid 사지는 또한 완전히 재생 (4/4 haploid 및 4/4 디플로이드 완전한 재생, 도 6은,디플로이드에 비해 디지털 아웃성장 단계에 도달하는 데 약간의 지연을 보이지만(n = 4 haploid, n= 4 diploid; 절단 후 23일: haploids = 3 팔레트 및 1 디지털 아웃성장 단계 사지; 디플로이드 = 4 디지털 아웃성장 단계 사지).
성공적인 접목은 연습이 필요하며, 기술자의 미세 조작 기술과 멸균 기술에 따라 일관성이 달라집니다. 실패하고 불순한 접목은 그림 7 및 그림 8에서볼 수 있듯이 다양한 표현형을 생성합니다. 우리의 손에, 약 38.7% (SD = ± 8.78%) 난모세포의 발달은 일반적으로 개발된 haploid 배아 및 11.1% (SD = ± 5.46%) 모든 haploid-diploid 이식편은 일반적으로 개발되고 깨끗하게 접목된 haploid 사지를 가진 실행 가능한 동물을 일으킵니다(그림 9).
그림 1: 프로토콜의 개요 및 키메라 액소틀의 예. (A)해혈성 배아및 키메라 배아를 생성하기 위해 디플로이드 숙주 배아, 정자 및 난자를 얻기 위해 취한 단계의 상대적 타이밍을 설명하는 도식. (B)RFP+ haploid 배아에서 GFP+ 디플로이드 숙숙(B')동일한 8 cm 의 녹색 및 적색 형광 이미지의 오버레이에 접목된 배아 사지 싹에 의해 생성된 청소년 축색소의 합성 밝은 이미지 8 cm 청소년 축색. haploid 사지는 심하게 정상입니다, 그러나 반대 디플로이드 사지 보다는 더 짧습니다. 배율 표시줄 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 일반적으로 개발되고 깨끗하게 이식된 하플로이드 사지의 형광 이미지. GFP- 이형 숙주에게 이식된 GFP-하플루이드 사지는 사지(노란색 화살표) 및 개별 감각 뉴런 및 혈액 유래 세포(흰색 화살표)를 내면을 자극하는 척추 신경에 제한되는 것으로 보이는 GFP 발현 패턴을 나타낸다. 사진의 팔다리는 4cm 청소년에 속했다. 배율 표시줄 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 디플로이드와 하플루이드 배아의 비교. (A)디플로이드(왼쪽)와 하플로이드(오른쪽)의 라이트 이미지. 감소된 AP축 곡률과 하플루이드 배아의 돌출된 내배(흰색 화살표)를 주목하십시오. (B)동일한 배아의 녹색 형광 이미지. GFP- haploids는 GFP- 여성 및 GFP+에서 조사된 정자에서 계란을 사용하여 생성되었습니다. 디플로이드는 GFP+입니다. 사진된 배아는 대략 25단계30단계이다. 준비 시리즈. 배율 표시줄 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: haploid 사지 꽃봉오리 이식의 정도를 설명하는 개략적. (A)단계 25 haploid 배아의 측면 보기. 점선은 아가미 벌지및 팔다리 싹을 기준으로 이식해야 하는 대략적인 영역을 표시합니다. (B)스테이지 25의 횡방향 도식. 점선은 숙주로부터 제거하고 상응하는 haploid 공여자 조직으로 대체되어야 하는 근사 영역 및 조직 유형을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 하플로이드와 디플로이드 사지 길이의 비교. (A)16개의 유사한 크기의 키메라 동물(haploid mean = 0.522 cm, SD = ±0.087 cm, 디플로이드 평균 = 0.667 cm, SD = ± 0.069 cm)의 하플로이드 사지(분홍색) 및 반대 쪽사지(녹색)의 길이의 산란플롯. 사지는 제고포드의 기저부로부터 숫자 2와 3의 접합부까지 측정되었다. (b)16마리의 사지 길이비(평균비 = 0.784, SD= ±0.113 cm)에 대한 해프로이드 사지 길이의 산란플롯. (c)16개의 측정된 키메라의 신체 길이(cm)의 산란플롯(평균 동물 길이 = 8.72 cm±0.456 cm). 동물은 주전자의 끝에서 꼬리 끝까지 측정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 하플로이드와 디플로이드 사지의 재생을 비교합니다. (A)하플루이드 사지 전 절단. (B)재생 후 같은 haploid 사지. (C)디플로이드 사지 전 절단. (D)재생 후 동일한 디플로이드 사지. 4/4 haploid 사지와 4/4 디플로이드 사지 정상적인 형태와 재생. 검은색 점선은 절단 평면을 나타냅니다. 스케일 바 = 1 mm. 절단은 크기 일치청소년 동물(8.5 cm)에서 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 정상 및 비정상적인 사지 발달의 예. (A)심하게 정상적인 형태를 가진 haploid 사지. (B-E) haploid의 완전한 발달을 지원하지 못한 접목의 예. (B)올리고드 (C)더 심한 올리고고트. (D)뚜렷한 디지털 구조가 없습니다. (E)팔다리가 없습니다. 사진된 팔다리는 비슷한 크기의 청소년(8.0~10cm)에 속합니다. 배율 늘이마 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 불순한 하플루이드 사지 이식편에서 GFP+ 세포의 예. (A, A') 형광 현미경 검사법에 의해 밝혀진 피부와 진피 (흰색 파선 윤곽선)에 있는 GFP+ 이질 세포를 가진 형태학적으로 일반적인 haploid 접목 사지. (B, B') 진피와 피부에 광범위하게 기여하는 GFP+ 이플로이드 세포가 있는 이식된 비정상적인 하플로이드 사지 (흰색 윤곽선). (C, C') 표피가 GFP + 디플로이드 세포 (흰색 윤곽선)로 대체 된 이식 된 비정상적인 haploid 사지. 사진된 팔다리는 비슷한 크기의 청소년(8.0~10.0cm)에 속합니다. 배율 표시줄 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 9: 하플로이드 배아 및 하플루이드 사지 생성의 성공률. (A)시험관 내 활성화를 사용하여 생성된 생존 가능한 하플루이드 배아의 백분율. 데이터는 5개의 독립적인 체외 활성화 실험으로부터 수집되었다. 녹색은 이식에 사용될 수 있는 단계 25 haploid 배아를 생성한 계란의 분율을 나타냅니다(평균 = 38.7%, SD = ± 8.78%). 회색은 분열의 흔적을 보여주지 않았거나, 실행 불가능했거나, 개발에서 정상이었던 계란의 분율을 나타냅니다. (B)일반적으로 개발된 퍼센트, 깨끗하게 이식된 하플로이드 사지. 보라색은 깨끗하고 일반적으로 개발된 haploid 사지(평균 = 11.1%, SD = ± 5.46%)를 생성한 이식편의 분율을 나타냅니다. 녹색은 정상적으로 발달되었지만 GFP+ 숙주 조직을 오염시킨 사지를 나타냅니다(평균 = 11.3%, SD = ± 8.64%). 빨간색은 정상적으로 발달하지 않은 이식사지를 나타냅니다(평균 = 27.1%, SD = ± 30.3%). 파란색은 사지 발달을 완료하기 위해 살아남지 못한 모든 이식된 배아 및 동물을 나타냅니다(평균 = 50.5%, SD = ± 31.2%). 이식된 동물의 손실은 후기 배아 및 애벌레 단계에 걸쳐 분포되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
운영 기술자가 일관된 접목 결과를 위해 고려해야 할 haploid-diploid 키메라를 생성하기 위한 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
haploid 생성이 실패하는 가장 가능성이 높은 이유는 시험관 내 활성화 조건이 좋지 기 때문입니다. 운동성 정자의 적당한 양은 계란을 활성화하기 위하여 이용되어야 합니다. 운동성을 연장하기 위해 정자 샘플은 항상 4 °C에서 유지되어야합니다. 계란에 어떤 정자 견본을 적용하기 전에, 반전한 현미경을 사용하여 정액의 생존가능성을 확인하십시오. 완전히 운동성 정자는 결코 사용해서는 안되며, 농도는 80,000 운동세포/mL로 조정되어야 합니다. 활성화 단계에 있는 너무 많은 정액은 또한 일반적인 계란 발달을 방지할 수 있습니다. 정자 구덩이, 계란의 표면에 작은, 어두운 들여 쓰기로 나타나는, 정자 세포가 계란을 관통하고 일반적으로 정자를 적용 한 후 20~60 분 나타나는 물리적 표시입니다. 10 개 이상의 정자 구덩이와 계란 제대로 활성화 되지 않을 수 있습니다.
수정되지 않은 계란은 물 밑에 놓은 후 15 분 이내에 수집하고 마른 페트리 접시에 넣고 정자 적용 전에 종이 타월로 철저히 건조하면 활성화 될 수 있습니다. 또는, 비디오에 도시 된 바와 같이, 계란은 호르몬 주입 여성에서 압착 될 수있다. 우리는 이 "건조한" 계란이 더 일관된 결과를 준다는 것을 것을을 발견합니다, 그러나 우리는 정규로 두 방법을 채택합니다.
성공적인 접목은 적절하게 준비된 haploid 사지 새싹 조직과 디플로이드 배아의 적절한 결합이 필요합니다. 이 프로토콜에는 스테이지 일치를 보장하기 위한 여러 가지 조치가 포함되어 있습니다. 자연 짝짓기는 항상 계란 누워 귀착되지 않기 때문에, HCG 주사는 자연적으로 결합 된 여성이 디플로이드 알을 낳기 시작할 때까지 수행되지 않아야합니다. 이 주입 후, 유도 된 여성은 감소 된 온도 (8 ~ 12 °C)에 보관되어야하며, 이는 계란 누워의 속도를 감소시게한다. 정상 온도에서 호르몬 자극 된 여성을 수용 하는 계란의 대부분은 시간의 짧은 기간에 누워 되 고 발생할 수 있습니다. 차가운 암컷에 누워 계란의 발병은 여성이 마취와 난모세포 추출을위한 준비가되어 있음을 나타냅니다. 난모세포 활성화는 난모세포 추출 후 15분 이내에 이루어져야 합니다. 활성화된 haploid 배아는 발달에서 자연적으로 생성된 디플로이드 배아뒤에 며칠이 될 것이기 때문에, 우리는 18°C에서 배양해서 haploids의 발달의 상대적인 비율을 증가시키면서 12°C에서 디플로이드 배아를 배양하는 것이 좋습니다. 유도된 암컷의 HCG 주입과 계란 부설 사이의 간격에 약간의 변화가 있을 것이기 때문에, 숙주 및 기증자 배아의 발판이 접목시에 짝을 이루게 되도록 haploids 또는 diploids의 배양 온도에 있는 경미한 조정이 필요할 지도 모릅니다. 배아는 이식하기 전에 몇 시간 동안 4 °C로 냉각되어야하며, 이것은 거의 발달을 체포합니다. 이식 하기 전에 냉각 haploid 및 diploid 배아의 발병 시간을 다른 단계 일치를 사용할 수 있습니다. haploid 배아는 diploids에서 형태학적으로 다르지만, 신경이 닫히고 배아가 한 쪽을 거짓말을 한 후에 haploids와 diploids는 단계 21에 도달합니다. 디플로이드와 마찬가지로, 25단계 haploid 배아는 눈에 띄는 아가미와 경향이 있는 부푼 것을 가지고 있습니다. 큰 머리는 haploids에 있는 바디에 상대적인 각도로 돌출됩니다, 그러나 이것은 거의 직각30에서바디에서 돌출하는 단계 25 디플로이드 태아에 비해 크게 감소됩니다.
멸균 기술은 성공적인 조직 이식에 절대적으로 중요합니다. 멸균 조건은 키메라의 배아 발달을 통해 haploid 생성에서 실험의 전체를 통해 유지되어야 합니다. 우리는 절차의 시작부분에 유기 물질을 오염의 양을 최소화하기 위해 계란 누워 기간 동안 깨끗하고 비 시스템 물 조건에 모든 부모 동물을 유지하는 것이 좋습니다. 전체 과정을 통해 사망하거나 죽어가는 배아를 일관되게 매일 제거하는 것은 다른 배아의 건강을 유지하는 데 중요합니다. 교차 오염을 최소화하기 위해 모든 haploid 및 키메라 배아를 개별적으로 수용하는 것이 좋습니다.
배아 미세 절제술 및 조직 이식 기술은 연습을 통해 획득됩니다. 접목 과정에서 팔다리 싹 자체를 뚫거나 찢지 않는 것이 중요합니다. 호스트및 기증자 배아에서 제거되는 조직은 완충 구역을 제공하기 위하여, 그림같이 사지 싹을 넘어 확장되어야 합니다. 조직의 영역의 너무 작은 이식 하는 경우, haploid 사지 GFP+ diploid 피부 와 다른 조직에 의해 침투 될 것 이다.
이 이식 기술의 한계 중 하나는 사지의 신경 조직과 혈액이 숙주 체에서 파생된다는 것입니다. 몇 가지 드문 경우에, 우리는 완전히 신경을 표현 하는 GFP +의 모든 징후가 부족 접목 haploid 사지를 생성할 수 있다. 이러한 경우에, 우리는 기증자의 호스트 동물에 있는 신경 조직의 충분히 대체할 수 있었습니다. 그러나 그러한 광범위한 접목은 어렵고 신뢰할 수 없으며 종종 사지 외부의 발달 이상을 일으킵니다.
Haploidy는 축색에서 배아 치명적입니다. 유사하게, 사지 발달과 재생을 위해 잠재적으로 필수적인 많은 유전자에 있는 돌연변이는 또한 초기 배아 치명적입니다. 우리의 프로토콜은 실험 사지의 생산을 위한 haploidy의 배아 치사성을 우회하고 또한 후보 재생 유전자의 돌연변이가 배아 치명적인 표현형을 생성하는 경우에 사용될 수 있었습니다. 우리의 사지 싹 이식 기술은 초기 배아 발달 중에 수행되고 완전한 ectoderm 및 mesoderm 층1,2의이식을 수반하기 때문에 앞에서 설명한 사지 싹 및 기여 조직 이식 방법에 비해 이를 달성하기위한 이점을 제공합니다.
Haploid 사지 싹 접목은 이전에 기술되었습니다; 그러나, 이 이전 연구에서, haploid 사지 싹은 ectopically31접목되었다. 이 이식편에서 파생된 자궁 외 사지의 현미경 핵 분석은 디플로이드 조직의 광범위한 기여를 밝혔습니다. 이 사지가 비정상적으로 발전하는 동안, 그(것)들은31를재생할 수 있었습니다. 자궁 외 사지 싹을 접목하는 대신, 우리는 전체 내인성 사지 싹을 동등한 haploid 조직으로 대체합니다. 형광 마커의 사용을 통해, 우리는 시각적으로 신경과 혈액 세포를 제외하고, diploid 기여가없는 haploid 사지를 식별 할 수 있습니다, haploid 사지 자체를 희생하지 않고. 우리는 haploid 사지가 일반적으로 발전하고 재생하는 것을 것을을 발견합니다. 그러나, GFP+ 호스트 신경 및 혈액 파생 된 세포 이외의 조직에 기여 하는 사지 종종 이상을 표시. 따라서, haploid 사지에 있는 유전자 기능을 조사할 때, 과도한 호스트 기여를 가진 사람들은 유전자형이 돌연변이 haploid 사지에서 관찰된 어떤 표현형과 연관될 수 있기 전에 분석에서 제외되어야 합니다.
최근 혁신, 액소로틀 게놈의 조립 및 최근 CRISPR/Cas 기반 삽입 방법15,16,32,극적으로 액소로틀의 유전 가단성을 확장했다. 유전 적 조작을 일시적으로 및 공간적으로 제한하는 방법은 큰 약속을 지니고 있지만, 현재의 응용 프로그램은 동물 라인을 생성, 집 및 배포하는 데 필요한 자원에 의해 제한됩니다. 여기에 상세한 프로토콜은 유전자의 유전 적 섭동의 결과가 사지 발달과 재생에서 조사 될 수있는 과정을 가속화합니다. 사지 재생에 upregulated 것으로 밝혀진 유전자의 많은 작은 특성이 있었다, 이러한 유전자는 필수 개발 및 세포 과정의 다양한에 관여 할 수있다. 우리는 사지 재생을 위해 요구되는 많은 유전자가 또한 사지 발달을 위해 요구될 것이라는 점을 예상하는 동안, 이 방법은 재생에 연루된 어떤 유전자든지 재생 특정인 기능의 손실 표현형이 있다는 것을 밝힐 수 있습니다. 액소로틀에서 CRISPR/Cas 돌연변이 발생은 전형적으로 유지된 야생형 대문자를 포함하는 종말 모방을 생성하며, 이러한 모자이크리즘 자체는 정량화 가능한 표현형20으로간주될 수 있다. 절단된 원래 및 재생된 사지의 차세대 염기서열 분석, 연구원은 관심 있는 유전자에 있는 돌연변이를 가진 haploid 세포가 재생 후에 우선적으로 분실되는지 정량화할 수 있습니다. 이 접근은 그렇지 않으면 필수적인 발달 유전자의 섭동에 의해 생성된 재생 표현형의 조사를 허용할 수 있습니다.
Haploid 기능 상실 유전 스크린은 이중 균체 돌연변이 세포주를 확립할 필요 없이 많은 생물학적 과정의 유전적 기원에 대한 조사를 용이하게 합니다. haplogenesis, CRISPR/Cas9 돌연변이 생성 및 사지 싹 이식을 결합해서, 우리는 살아있는 동물에 있는 사지 발달 그리고 재생을 탐구하는 haploid 유전 스크린을 위한 새로운 플랫폼을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 축색동 식민지의 그녀의 배려에 대한 캐서린 로버츠에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 기금은 코네티컷 혁신 재생 의학 연구 기금 (15RMA-YALE-09 및 15-RMB-YALE-01)과 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소 (개별 박사 후 박사 과정)에 의해 제공되었습니다. 펠로우십 F32HD086942).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J.
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J.
- Armstrong, B.
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
