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Genetics

Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

Published: January 29, 2020 doi: 10.3791/60156
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

Summary

Dieses Ziel dieses Protokolls ist es, chimäre Axolotle mit haploiden Vorderbeinen aus Cas9-mutagenisiertem Spendergewebe unter Verwendung embryonaler Gewebetransplantationstechniken zu produzieren.

Abstract

Eine wachsende Reihe von genetischen Techniken und Ressourcen ermöglichen es Forschern, die molekularen Ursprünge der Fähigkeit einiger Salamanderarten, wie Axolotls, ganze Gliedmaßen als Erwachsene zu regenerieren, zu erforschen. Hier skizzieren wir Techniken zur Erzeugung von chimerischen Axolotls mit Cas9-mutagenisierten haploiden Vorderbeinen, die zur Erforschung der Genfunktion und der Genauigkeit der Gliedmaßenregeneration verwendet werden können. Wir kombinieren mehrere embryologische und genetische Techniken, einschließlich der haploiden Erzeugung mittels In-vitro-Aktivierung, CRISPR/Cas9-Mutagenese und Gewebetransplantation in einem Protokoll, um ein einzigartiges System für haploidgenetisches Screening in einem Modellorganismus der Regeneration zu produzieren. Diese Strategie reduziert die Anzahl der Tiere, den Raum und den Zeitaufwand für die funktionelle Analyse von Genen bei der Regeneration der Gliedmaßen. Dies ermöglicht auch die Untersuchung von regenerationsspezifischen Funktionen von Genen, die für andere wesentliche Prozesse wie Organogenese, Gewebemorphogenese und andere wesentliche embryonale Prozesse erforderlich sein können. Die hier beschriebene Methode ist eine einzigartige Plattform für die Durchführung haploider genetischer Screenings in einem Wirbeltiermodellsystem.

Introduction

Historisch gesehen war die embryonale Gewebetransplantation in Amphibien eine wichtige Technik zur Erforschung grundlegender Mechanismen der Entwicklungsbiologie und Regeneration. Das Axolotl, eine Salamanderart, besitzt eine beeindruckende Fähigkeit, Gewebe und komplexe Strukturen wie Gliedmaßen und Organe nach Verletzungen oder Amputationen zu regenerieren. Ebenso beeindruckend können sie ohne Abstoßung Gewebetransplantate von anderen Individuen in embryonalen, juvenilen und erwachsenen Stadien1,2,3erhalten. Regionen von Embryonen, die ganze Strukturen wie Gliedmaßen, Schwänze, Augen und Köpfe produzieren, und spezifischere Gewebe, wie Neuroektoderm und Soden, können zwischen Embryonen gepfropft werden, um chimäre Tiere zu produzieren1,2,4,5,6. Seit fast einem Jahrhundert liefern Studien an solchen chimertieren den entscheidenden Einblicken in Regeneration, Gewebedifferenzierung, Größenkontrolle und Musterung1,7,8.

In den letzten zehn Jahren haben zahlreiche transkriptionelle Studien an regenerierenden Geweben Einblicke in die genetischen Programme der Salamanderregeneration9,10,11,12,13. Diese Studien haben zu einer wachsenden Liste von Kandidatengenen hinzugefügt, die bis heute im Kontext der Regeneration weitgehend uncharakterisiert sind. Gezielte Mutagenesetechniken wie CRISPR/Cas ermöglichen nun die Untersuchung solcher Gene, und solche genetischen Ansätze werden durch die kürzliche Sequenzierung und Montage des großen Axolotl-Genoms14,15,16erheblich erleichtert.

Wir versuchten, Techniken zu entwickeln, die klassische Entwicklungsbiologie mit neuer Gentechnologie koppelten, um die Mechanismen der Regeneration zu sezieren. Methoden zur Erzeugung haploider Embryonen von Axolotls und anderen Salamandern sind seit Jahrzehnten etabliert17. Während diese Techniken seit langem als Vorteile von Salamandern als genetische Modellorganismen18bezeichnet werden, haben nur wenige nachfolgende genetische Studien haploide Tiere aufgenommen. Wir verwenden In-vitro-Aktivierung im Axolotl, um haploide Embryonen zu produzieren, die als Gewebespender für die Transplantation dienen19. Mit Embryonen, die fluoreszierende genetische Marker tragen, haben wir zuverlässige Methoden zur Erzeugung von Gliedmaßen entwickelt, die fast ausschließlich aus Spendergeweben gewonnen wurden (Abbildung 1A). Durch die Kombination dieser beiden Techniken haben wir die späte embryonale Letalität im Zusammenhang mit der Haploidie umgangen, die die Produktion voll entwickelter, transplantierter haploider Gliedmaßen ermöglicht (Abbildung 1B, Abbildung 1B"und Abbildung 2).

Durch die Durchführung von CRISPR/Cas-vermittelter Mutagenese in haploiden Embryonen vor der Transplantation zur Herstellung von chimerischen Axolotlen mit mutierten haploiden Gliedmaßen können wir die Genfunktion speziell im Kontext der Gliedmaßenentwicklung und -regeneration untersuchen. Dies ermöglicht die Rettung von Gliedmaßen von potenziell embryonal-tödlichen mutierten Phänotypen. Während CRISPR/Cas Mikroinjektion Tiere erzeugen kann, die stark mutiert sind, sind solche Tiere in der Regel sehr mosaikartig, mit einem gewissen Grad an Retention von Wildtyp-Allelen und einer Vielzahl von unterschiedlichen Mutationen an den Zielstellen14,20. CRISPR-basierte Mutagenese in haploiden Zellen erhöht die Penetranz einzelner Allelverlust-der-Funktionsmutationen, da sie nicht durch zurückgehaltene Wildtyp-Allele maskiert werden können. Aus diesem Grund wird DAS CRISPR-basierte Screening in haploiden Zelllinien zunehmend zur Untersuchung der genetischen Grundlagen vieler zellulärer Prozesse21,22,23verwendet. Durch die Kombination von CRISPR-basierter Linienverfolgung mit unseren haploiden Gliedmaßenknospen-Pfropfprotokollen kann der hier beschriebene Ansatz als Plattform für haploide genetische Screens bei lebenden Tieren dienen20.

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Protocol

Experimentelle Verfahren, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden vom Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017–10557) genehmigt und entsprachen allen Bundesrichtlinien und Richtlinien für die Verwendung von Wirbeltieren. Alle Tierversuche wurden am Ambystoma mexicanum (Axolotls) in Einrichtungen der Yale University durchgeführt.

1. Diploid Embryo Generation

  1. Erhalten Sie GFP+ diploide Embryonen, um als Transplantatwirte durch natürliche Paarung mit einem oder zwei gfp Eltern 24zu dienen.
  2. Sammeln Sie frisch gelegte diploide Eier und legen Sie sie in ein Metallsieb.
  3. Spülen Sie die Eier gründlich mit 40% Holtfreter Lösung (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH bis 7,4).
  4. Die Eier in frische 40% Holtfreter-Lösung geben und bei 12 °C lagern.
    HINWEIS: Diploide Embryonen sollten immer erhalten werden, bevor sie zur haploiden Embryoerzeugung übergehen.

2. Haploid Embryo Generation

  1. Weibliche Gamete Spender Vorbereitung
    1. 48 h vor Der in vitro Aktivierung, anästhetisieren Sie ein geschlechtsreifes weißes oder weißes/RFP weibliches Axolotl durch Eintauchen in 1 g/L HEPES-gepufferte MS-222 in 40% Holtfreters Lösung25.
    2. Stellen Sie sicher, dass das Tier nach ca. 30 min Eintauchen vollständig beäpft wird, indem Sie den Schwanz fest zwischen Daumen und Zeigefinger kneifen. Voll anästhesierte Tiere reagieren nicht physisch auf eine Prise.
    3. Bereiten Sie eine Lösung des menschlichen Choriongonadotropins (HCG) mit 10.000 U/ml in steriler Saline vor.
    4. Mit einer 30 G Insulinspritze 0,15 CC HCG (1.500 Einheiten) in die Muskulatur dorsal in die Hinterseite des anästhesierten Weibchens in 45° Winkel zur Mittellinie injizieren, um den Kontakt mit dem Rückenmark zu vermeiden.
    5. Das Weibchen auf frische 40% Holtfreter-Lösung zurückgeben und in einen 8-12 °C-Kühlschrank geben.
    6. Nach 48 h das Weibchen auf Raumtemperatur zurückbringen. Legen Sie ein paar Steine oder Plastikpflanzen in ihren Behälter als Oberflächen für die Eiablage.
      HINWEIS: Weibchen, die mit HCG injiziert werden, legen oft leere Gelee-Hüllen für mehrere Stunden ab, bevor sie Eier legen.
    7. Entfernen Sie die Steine oder Kunststoffpflanzen, nachdem das Weibchen begonnen hat, konsequent Eier zu legen.
    8. Lassen Sie das Weibchen 30 min bis 1 h im leeren Tank sitzen.
      HINWEIS: Das Zurückhalten von Materialien, auf die das Tier Eier legen kann, ermöglicht eine strengere Kontrolle der Eizellensammlung.
  2. Männliche Gamete-Sammlung
    1. Während die Eiablage des Weibchens ins Stocken gerät, befeuchten Sie ein geschlechtsreifes GFP+ männliches Axolotl, um als Samenspender zu dienen, wie in Schritt 2.1.1.
    2. Legen Sie das voll befruchtete Männchen auf den Rücken auf feuchte Papiertücher unter einem Sezierendes Mikroskop.
    3. Wenn der Experimentator rechtshändig ist, positionieren Sie die Spitze einer P1000 Pipette mit der rechten Hand an der Basis der Kloake.
    4. Legen Sie den linken Zeigefinger und Daumen der linken Hand 2 x 3 cm rostral auf das Becken. Drücken Sie das Tier vorsichtig, während Sie die Finger in Richtung der Hinterbeine bewegen, um Spermien-Urinproben auszuspülen.
    5. Sammeln Sie jeden, der aus der Kloake gespült wird, in ein einzelnes Mikrozentrifugenrohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um 6 bis 10 Proben zu sammeln.
    6. Pipette 5,0 l von jeder Probe auf eine Petrischale, um die Qualität des Spermas mit einem invertierten Mikroskop zu überprüfen.
      HINWEIS: Konzentrierte Spermienproben sind eine milchige weiße Farbe, in der Regel reichen von 5 bis 20 L, und werden in der Regel nach mehreren, höhervolumigen Sperma Urinproben extrahiert extrahiert. Sperma sammelt sich an der Unterseite der Rohre in Proben mit höherem Volumen, wenn sie ungestört gelassen werden. Konzentrierte Proben von gesunden Spermien sind stark motil und verlieren Aktivität, wenn ihre Konzentration abnimmt. Gesunde Männchen können bis zu 50 l konzentrierte Spermien produzieren.
  3. Weibliche Gamete-Sammlung
    1. Nach Erhalt und Bestätigung einer gesunden Spermienprobe, befeuchten Sie das HCG-injizierte weibliche Axolotl wie in Schritt 2.1.1.
    2. Legen Sie das voll befruchtete Weibchen auf feuchte Papiertücher auf ihren Rücken.
    3. Extrahieren Sie unbefruchtete Eier aus dem Weibchen mit einer Handbewegung ähnlich der in Schritt 2.2.4.
    4. Sammeln Sie die Eier mit nassen Zangen und übertragen Sie sie in eine 10 cm Petrischale. Behandeln Sie Eier mit bestrahlten Spermien innerhalb von 15 min nach der Sammlung.
  4. Männliche Gametenvorbereitung und In-vitro-Aktivierung
    1. Verwenden Sie eine P10- oder P20-Pipette, um das Sperma nach oben und unten zu pipette, indem Sie die Klumpen auseinanderbrechen, um eine homogene Suspension zu bilden.
    2. Ungefährden Prozentsatz der motilen Spermien, indem sie einen 0,5-L-Tropfen unverdünnter Spermiensuspension auf einen Petrischalendeckel oder glasschiebeleiter legen und mit einem invertierten Mikroskop untersuchen.
    3. Fügen Sie 9,5 l von 0,1x Marcs modifizierter Ringer-Lösung (MMR; Materialtabelle) zu dieser Probe, um eine 20-fache Spermienverdünnung zu machen. Sanfte Pipette nach oben und unten zu mischen.
    4. Mit einem invertierten Mikroskop zählen Sie das Sperma in drei 1,0 L Tropfen des 20x verdünnten Aliquots auf einer Petrischalenabdeckung oder einem Hämozytometer, um die Spermienkonzentration der unverdünnten Suspension abzuschätzen.
    5. Bereiten Sie das Sperma für die Bestrahlung vor, indem Sie ein Aliquot der ursprünglichen Spermienprobe auf etwa 80.000 motile Zellen/ml in sterilen 0,1x MMR verdünnen.
    6. Zählen Sie die Anzahl der Innerhalb der letzten 15 min erhaltenen Eier. Fügen Sie 0,5 l des frisch verdünnten Spermas aus Schritt 2,4,5 pro Ei in eine Petrischale ein. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um diese Aufhängung in eine 1 mm dicke Schicht zu verteilen.
    7. Mit einem Kunststofflift die Probe 4 cm von den Glühbirnen eines 254 nm Verklinkers abstellen. Die Spermien werden genetisch inaktiviert, indem die Probe mit 800.000 uJ/mm2bestrahlt wird.
    8. Mit einer P10-Pipette die Suspension auf die unbefruchteten Eier zu pipette, wobei jedes Ei mit 0,25 bis 0,5 L bestrahlten Spermien beschichtet wird. Lassen Sie die Eier bei Raumtemperatur für 30 min sitzen.
    9. Nach 30 min die Eier mit 0,1x MMR überfluten. Legen Sie die Eier sofort in einen 8-10 °C-Inkubator für Injektionen am nächsten Tag oder bei 18 °C für Injektionen innerhalb von 7 Stunden nach der Aktivierung (hpa).
    10. Dejelly Haploide mit scharfen Zangen 30 min nach Hydratation. Die Eier sofort in einen 8-10 °C-Inkubator für Injektionen am nächsten Tag oder bei 18 °C für Injektionen am selben Tag legen.

3. Haploid Mutagenese und Wartung

  1. CRISPR/Cas9 Mikroinjektionen
    1. Entwerfen Sie sgRNAs mit CRISPRscan und synthetisierenSie 26,27.
    2. Für Multiplex-Mutagenese einen Vorrat von 5 sgRNAs (10 ng/l für jede sgRNA) und Cas9-Protein (1 g/ l) zubereiten. Bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung dieses Vorrats (0,1 ng/L pro sgRNA, 10 ng/L Cas9) zur Injektion vor. Für einzelne Gene, hochmutationsreiche Mutagenese, folgen Sie dem zuvor beschriebenen Protokoll28.
    3. Injizieren Sie haploide Embryonen im Einzelzellstadium 7 hpa, wenn sie bei 18 °C gelagert werden, oder injizieren Sie Embryonen am nächsten Tag im Stadium von 2 x 8 Zellen, wenn sie bei 8 bis 10 °C gelagert werden.
    4. Übertragen Sie die Embryonen auf 1,0x MMR mit 20% Polysucrose 400.
    5. Wenn Einzelzelle, injizieren Sie jeden Embryo mit einem 5 nL Tropfen der Injektionslösung (ca. 1/4 Radius der Eizelle), die eine Gesamtmasse von 0,5 pg/sgRNA und 50 pg Cas9-Protein enthält. Wenn multizellulär, verteilen Sie diese Masse, indem Sie kleinere Volumes in mehrere Zellen injizieren.
    6. Lassen Sie die Embryonen in der Polysukrose 400 für mindestens 4 h und maximal 18 h bei 18 °C heilen.
  2. Haploid Embryo Gehäuse
    1. Übertragen Sie die Embryonen auf 0,1x MMR mit Antibiotikum.
    2. Beherbergen Sie jeden Embryo in einem individuellen Brunnen einer 24-Well-Platte, da einige absterben oder sich ungewöhnlich entwickeln. Bei 16 bis 18 °C aufbewahren. Niedrigere Temperaturen können bei Bedarf verwendet werden, um die Entwicklung zu verlängern.
    3. Ersetzen Sie die Medien jeden zweiten Tag durch frische0,1x MMR durch Antibiotika-Antimykotik.

4. Diploid Host Embryo Vorbereitung

  1. Halten Sie Embryonen in der Geleebeschichtung bei 12 bis 16 °C, bis sie Stufe 22 bis 26 erreichen.
  2. Sammeln Sie die embryonen, die für die Transplantation bereit sind, legen Sie sie in ein Sieb (4 mm Maschenweite), und spülen Sie sie vorsichtig mit 40% Holtfreters Lösung.
  3. Übertragen Sie die Embryonen in filtersterilisierte 0,1x MMR mit 1,5% Bleichmittel für bis zu 2 min. Tauchen Sie die Embryonen vollständig in die Bleichlösung und wirbeln Sie sie sanft, um sicherzustellen, dass die Geleebeschichtung vollen Kontakt mit der Bleichlösung herstellt, um die Mikroben abzutöten an den Embryonen vorhanden sind.
  4. Nach 2 min die Bleichlösung, die die Embryonen enthält, mit einem gleichen Volumen von filtersterilisierten 0,1x MMR verdünnen.
  5. Gießen Sie die Embryonen vorsichtig in ein bleiches Sieb (4 mm Maschenweite) und spülen Sie die Embryonen fünfmal mit filtersterilisiert0,1x MMR.
  6. Die Embryonen in sterile 10 cm Petrischalen mit 0,1x MMR mit Antibiotika zur Entjellytung (Penicillin 100 Einheiten/ml, Streptomycin 100 g/l, 0,25 g/ml, Gentamicin 25 g/ml) geben.
  7. Entfernen Sie unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop die Geleemäntel und Vitelline-Membranen von GFP+-Embryonen mit scharfen Zangen (Spitzenmaße 0,05 x 0,01 mm2).
  8. Übertragen Sie die GFP+ Embryonen auf eine neue Petrischale. Minimieren Sie die Menge an Flüssigkeit, die von der Petrischale übertragen wurde, wo sie dejellied wurden.
  9. Spülen Sie die GFP+ Wirtsembryonen mit sterilen 0,1x MMR mit Antibiotika vier- bis sechsmal, um Verunreinigungen zu entfernen.
  10. Die sauberen Embryonen vor der Pfropfung auf 4 °C legen.
    HINWEIS: Das Abkühlen der Embryonen macht sie steifer und sauberer, das Mesoderm vom Endoderm zu trennen.

5. Haploid-diploid Chimäre Generation

  1. Chirurgische Schale und Medienzubereitung
    1. Bereiten Sie sterile chirurgische Operationsschalen vor, indem Sie autoklavierte 2% Agarose in 0,1x MMR in sterile 35 mm leicht griffige Petrischalen gießen. Füllen Sie die Petrischalen auf halbem Weg mit Agarose.
    2. Nachdem die Agarose abgekühlt ist, verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen 25 mm langen, schrägen Trog in der Agarose zu schneiden, um die Embryonen an Ort und Stelle zu halten.
    3. Füllen Sie die Schale mit sterilen chirurgischen Medien (0,1x MMR mit Antimykoplasma 2,5 g/ml, Amphotericin B 0,25 g/ml und Ciprofloxacin 10,0 g/ml) und kühlen Sie bei 4 °C.
  2. Embryo-Transplantationsverfahren
    1. Legen Sie einen gesunden haploiden Spender mit einem oder zwei stufengleichen GFP+ diploiden Wirtsembryonen in den Trog der vorgekühlten Operationsschale, die chirurgische Medien enthält (Abbildung 3).
      HINWEIS: Führen Sie das Verfahren nach Möglichkeit auf einer Kühlstufe (10 °C oder niedriger) durch.
    2. Verwenden Sie zwei ultrafeine, autoklavierte Zangen (gerade Spitze, Spitzenmaße 0,05 x 0,02 mm2), um die Ektoderm- und Mesodermenschichten vom Wirt mit der Gliedmaßenknospe in der Nähe der Mitte zu entfernen (Abbildung 4).
      HINWEIS: Der rechteckige Gewebetransplantatbereich umfasst die Gliedmaßenknospe und erstreckt sich von der neunten Sospe bis zur hinteren Hälfte der Kiemenwölbung, etwa 2 mm, entlang der vorderen hinteren Achse. Entlang der dorsoventralen Achse erstreckt sich der transplantierte Bereich über ca. 1,5 mm, einschließlich der Soden bis knapp über den ventralen Rand der Kiemenwölbung. Der transplantierte Bereich umfasst alle seitlichen Plattenmesoderm und die seitlichen Hälften der Sos, ohne die zugrunde liegende Endoderm zu stören. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 4 und im dazugehörigen Video.
    3. Legen Sie das Wirtsgewebe beiseite und entfernen Sie ein gleichwertig großes Gewebeblatt aus dem haploiden Spender mit den gleichen Methoden.
    4. Legen Sie das haploide Spendergewebeblatt auf den entsprechenden Bereich des Spenderembryons.
    5. Sichern Sie das Gewebe, indem Sie es mit einer autoklavierten, rechteckigen Glasscherbe aus einem zerkleinerten Mikroskop bedecken Glas bedecken und sanft in den Wirtsembryonkörper drücken.
    6. Drehen Sie den haploiden Spender-Embryo auf seine andere Seite, um die Gliedmaßenknospe für den zweiten Wirtsembryon zu ernten. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.2 bis 5.2.5.
    7. Entfernen Sie vorsichtig das verbleibende überschüssige Wirtsgewebe und den Spenderembryon aus der Schale.
    8. Lassen Sie die Transplantate mit den Glasscherben an Ort und Stelle für 60 bis 75 min, überprüfen Sie alle 20 min, um sicherzustellen, dass das Glas nicht abgerutscht ist.
    9. Nachdem die Gewebetransplantate vollständig haften, verwenden Sie die Zange, um die Glasscherben ankert langsam abzuziehen.
  3. Chimäre Wartung
    1. Übertragen Sie die transplantierten Embryonen auf frische chirurgische Medien und halten Sie sie über Nacht bei 8 bis 12 °C, um zu heilen. Individuell hausierte embryonale Embryonen in 12 oder 24-Well-Platten.
    2. Übertragen Sie die transplantierten Embryonen nach 36 bis 48 h auf steriles 0,1x MMR-Antimykotikum. Die starken Antibiotika in den chirurgischen Medien verursachen Toxizität bei transplantierten Embryonen nach 3 Tagen.
    3. Ersetzen Sie die Medien alle 2 bis 3 Tage durch frische 0,1x MMR und Antibiotika.
    4. Bewahren Sie die transplantierten Embryonen bei 18 °C auf, bis sie28füttern können.
    5. Nach 1 bis 2 Monaten Entwicklung und Pflege können haploide Gliedmaßen mit einem fluoreszierenden Dissektionsmikroskop auf Reinheit des Transplantats bewertet werden.
      HINWEIS: Das Vorhandensein von nicht-neuralen oder nicht-Blut-Wirt-abgeleiteten GFP-Gewebe in Gliedmaßen ist ein Indikator für unreine Transplantation und ist oft mit abnormaler Gliedmaßenentwicklung verbunden. Diese Tiere sollten von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden.

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Representative Results

Die Entwicklung von haploiden Embryonen kann von diploiden Embryonen durch ihren "haploiden Syndrom"-Phänotyp29unterschieden werden. Im Transplantatstadium weisen haploide Embryonen eine reduzierte Krümmung entlang der vorderen-hinteren Achse und ein unvollständiges Gehäuse des Dottersteckers auf (Abbildung 3A). Ein Fluoreszenzmikroskop kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass haploide Embryonen frei von väterlich abgeleiteter GFP-Expression sind (Abbildung 3B).

Wenn Transplantate sauber sind, sollte die GFP-Expression in erster Linie auf den Brachialplexus beschränkt werden, das neuronale Netzwerk, das vom Rückenmark des Wirts abgeleitet wird, wie in Abbildung 2dargestellt. Punctate GFP-Expression wird auch in einzelnen Zellen vorhanden sein, die sensorische Neuronen und blutabgeleitete Wirtszellen zu sein scheinen, die in die sich entwickelnde Gliedmaße wandern. Wenn RFP+-Spender verwendet werden, zeigen haploide Transplantat-Glieder einen universellen Ausdruck von RFP (Abbildung 1B'). Während der gesamten Entwicklung sind nicht-mutagenisierte haploide Gliedmaßen deutlich kürzer als die gegnerischen diploiden Vorderbeine in größenangepassten chimer Tieren(Abbildung 1B, Abbildung 1B"und Abbildung 5, n = 16 Gliedmaßenpaare, haploid Mittelwert = 0,522 cm, SD = 0,087 cm, diploider Mittelwert = 0,667 cm, SD = 0,069 m, gepaarter T-Test-p-Wert < 0,0001, Mittelwert = 0,784, SD = 0,113). Nicht-mutagenisierte haploide Gliedmaßen regenerieren sich ebenfalls vollständig (4/4 haploid und 4/4 diploid vollständige Regeneration, Abbildung 6), obwohl sie eine leichte Verzögerung beim Erreichen des digitalen Auswuchsstadiums im Vergleich zu Diploiden zeigen (n = 4 haploid, n = 4 diploid; 23 Tage nach der Amputation: Haploide = 3 Palette nund 1 digitale Auswuchsstufe Gliedmaßen; Diploiden = 4 digitale Auswuchsstufen).

Erfolgreiche Sroperzierung erfordert Übung, und die Konsistenz variiert je nach den Mikromanipulationsfähigkeiten und der sterilen Technik des Technikers. Gescheiterte und unreine Transplantate produzieren eine Vielzahl von Phänotypen, wie in Abbildung 7 und Abbildung 8zu sehen ist. In unseren Händen, ca. 38,7% (SD = 8,78%) eidisentstehen zu normal entwickelten haploiden Embryonen und zu 11,1% (SD = 5,46%) aller haploid-diploiden Transplantate produzieren lebensfähige Tiere mit normal entwickelten, sauber transplantierten haploiden Gliedmaßen (Abbildung 9).

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht des Protokolls und ein Beispiel für ein chimäres Axolotl. (A) Schematisch, der den relativen Zeitpunkt der Schritte zur Gewinnung von diploiden Wirtsembryonen, Spermien und Eiern zur Erzeugung von Haploiden und chimer Embryonen umreißt. (B) Zusammengesetztes helles Bild eines juvenilen Axolotls, das durch embryonale Gliedmaßenknospentransplantation von einem RFP+ haploiden Embryo zu einem GFP+ diploiden Wirt (B') Überlagerung von grünen und roten fluoreszierenden Bildern desselben 8 cm juvenilen Axolotls erzeugt wird. Die haploide Gliedmaße ist grob normal, aber kürzer als die gegnerische diploide Gliedmaße. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Fluoreszierendes Bild einer normal entwickelten und sauber transplantierten haploiden Gliedmaße. GFP- haploid Limbe an einen GFP+ diploiden Wirt gepfropft zeigt GFP-Expressionsmuster, das auf Spinalnerven beschränkt zu sein scheint, die die Gliedmaße (gelber Pfeil) und einzelne sensorische Neuronen und blutabgeleitete Zellen (weiße Pfeile) innervierbar machen. Das abgebildete Glied gehörte zu einem 4 cm großen Jungtier. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Vergleich von diploiden und haploiden Embryonen. (A) Lichtbild von Diploiden (links) und Haploiden (rechts). Beachten Sie die reduzierte AP-Achsenkrümmung und das hervorstehende Endoderm der haploiden Embryonen (weiße Pfeile). (B) Grünes fluoreszierendes Bild der gleichen Embryonen. GFP- Haploide wurden mit Eiern aus einem GFP-Weibchen und bestrahlten Spermien aus einem GFP+ erzeugt. Diploide sind GFP+. Die abgebildeten Embryonen sind ungefähr Stufe 2530. Staging-Serie. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Schematisch, der das Ausmaß eines haploiden Gliedmaßenknostransplantats umreißt. (A) Seitenansicht eines haploiden Embryos der Stufe 25. Die gepunkteten Linien zeigen den ungefähren Bereich, der transplantiert werden sollte, relativ zur Kiemenwölbung und Gliedmaßenknospe. (B) Transversalschaltplan der Stufe 25. Die gepunkteten Linien zeigen die ungefähren Flächen- und Gewebetypen, die aus dem Wirt entfernt und durch das entsprechende haploide Spendergewebe ersetzt werden sollten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Vergleich der haploiden und diploiden Gliedmaßenlängen. (A) Streudiagramm der Längen der haploiden Gliedmaßen (rosa) und der gegenüberliegenden diploiden Gliedmaßen (grün) von 16 ähnlich großen chimerischen Tieren (haploider Mittelwert = 0,522 cm, SD = 0,087 cm, diploider Mittelwert = 0,667 cm, SD = 0,069 cm). Die Gliedmaßen wurden von der Basis des Zeugopods bis zum Knotenpunkt der Ziffern 2 und 3 gemessen. (B) Streudiagramm der haploiden Gliedmaßenlänge zu den diploiden Gliedmaßenlängenverhältnissen der 16 Tiere (Mittelwert = 0,784, SD = 0,113 cm). (C) Streudiagramm der Körperlängen (cm) der 16 gemessenen Chimären (mittlere Tierlänge = 8,72 cm x 0,456 cm). Die Tiere wurden von der Schnisspitze bis zur Schwanzspitze gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Vergleich der Regeneration in haploiden und diploiden Gliedmaßen. (A) Haploid Gliedmaßen vor der Amputation. (B) Die gleiche haploide Gliedmaße nach der Regeneration. (C) Diploid Gliedmaßen vor der Amputation. (D) Die gleiche diploide Gliedmaße nach der Regeneration. 4/4 haploide Gliedmaßen und 4/4 diploide Gliedmaßen regeneriertmit normaler Morphologie. Schwarze gepunktete Linien zeigen die Amputationsebene an. Schuppenstäbe = 1 mm. Amputationen wurden an größenangepassten Jungtieren (8,5 cm) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Beispiele für die normale und abnormale Entwicklung haploider Gliedmaßen. (A) Eine haploide Gliedmaße mit grob normaler Morphologie. (B-E) Beispiele für Transplantate, die die vollständige Entwicklung von Haploid nicht unterstützen. (B) Oligodactyly. (C) Schwereroligodactyly. (D) Es sind keine unterschiedlichen digitalen Strukturen vorhanden. (E) Keine Gliedmaße. Die abgebildeten Gliedmaßen gehören ähnlich großen Jungtieren (8,0 bis 10 cm). Skalenbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Beispiele für GFP+-Zellen in unreinen haploiden Gliedmaßentransplantaten. (A,A') Morphologisch normale haploide Transplantat-Glieder mit GFP+ Diploidenzellen in der Haut und Dermis (weiß gestrichelte Kontur) durch fluoreszierende Mikroskopie aufgedeckt. (B,B') Eine transplantierte abnorme haploide Gliedmaße mit GFP+ Diploid-Zellen, die ausgiebig zur Dermis und Haut beitragen (weißer Umriss). (C,C') Eine transplantierte abnorme haploide Gliedmaße, bei der die Epidermis durch GFP+ Diploidzellen (weißer Umriss) ersetzt wurde. Die abgebildeten Gliedmaßen gehören ähnlich großen Jungtieren (8,0 bis 10,0 cm). Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Erfolgsraten der haploiden Embryo- und Haploid-Gliedererzeugung. (A) Prozent der lebensfähigen haploiden Embryonen, die mit In-vitro-Aktivierung erzeugt werden. Die Daten wurden aus fünf unabhängigen In-vitro-Aktivierungsexperimenten gesammelt. Grün gibt den Anteil der Eier an, die haploide Embryonen der Stufe 25 produzierten, die für die Transplantation verwendet werden konnten (Mittelwert = 38,7 %, SD = 8,78 %). Grau zeigt den Anteil der Eier an, die keine Anzeichen einer Spaltung zeigten, nicht lebensfähig waren oder in der Entwicklung normal waren. (B) Prozent der normal entwickelten, sauber gepfropften haploiden Gliedmaßen. Purple gibt den Anteil der Transplantate an, die saubere, normalerweise entwickelte haploide Gliedmaßen ergeben haben (Mittelwert = 11,1 %, SD = 5,46 %). Grün zeigt Gliedmaßen an, die sich normal entwickelten, aber kontaminierendes GFP+-Wirtsgewebe aufwiesen (Mittelwert = 11,3 %, SD = 8,64 %). Rot zeigt Transplantatgliedmaßen an, die sich nicht normal entwickelt haben (Mittelwert = 27,1 %, SD = 30,3 %). Blau gibt alle verpfropften Embryonen und Tiere an, die nicht überlebt haben, um die Entwicklung der Gliedmaßen abzuschließen (Mittelwert = 50,5 %, SD = 31,2 %). Der Verlust von gepfropften Tieren wurde über die späten embryonalen und Larvenstadien verteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Es gibt einige kritische Schritte in unserem Protokoll zur Erzeugung von haploid-diploiden Chimären, die der Betriebstechniker für konsistente Pfropfergebnisse berücksichtigen sollte.

Der wahrscheinlichste Grund für haploid-Generation zu scheitern ist aufgrund schlechter In-vitro-AktivierungBedingungen. Die richtigen Mengen an motilen Spermien müssen verwendet werden, um Eier zu aktivieren. Um die Beweglichkeit zu verlängern, sollten Spermienproben immer bei 4 °C gehalten werden. Bevor Sie eine Spermienprobe auf Eier auftragen, überprüfen Sie die Lebensfähigkeit des Spermas mit einem invertierten Mikroskop. Völlig nicht-motile Spermien sollten nie verwendet werden, und die Konzentration sollte auf 80.000 motile Zellen/ml angepasst werden. Zu viel Sperma im Aktivierungsschritt kann auch die normale Eientwicklung verhindern. Spermiengruben, die als kleine, dunkle Einbuchtungen auf der Oberfläche der Eizelle erscheinen, sind ein physikalischer Hinweis darauf, dass eine Spermienzelle in die Eizelle eingedrungen ist und in der Regel 20 bis 60 min nach der Anwendung von Spermien erscheinen. Eier mit zehn oder mehr Spermien können nicht richtig aktiviert werden.

Unbefruchtete Eier können aktiviert werden, wenn sie innerhalb von 15 min nach dem Unterziehen unter Wasser gesammelt, in eine trockene Petrischale gelegt und vor der Spermienanwendung gründlich mit Papiertüchern getrocknet werden. Alternativ, wie im Video gezeigt, können Eier von einem hormoninjizierten Weibchen gepresst werden. Wir stellen fest, dass diese "trockenen" Eier konsistentere Ergebnisse liefern, obwohl wir regelmäßig beide Methoden anwenden.

Eine erfolgreiche Transplantation erfordert die richtige Kopplung von diploiden Embryonen mit entsprechend inszeniertem haploiden Limbknospengewebe. Dieses Protokoll enthält eine Reihe von Maßnahmen, um die Stufenabgleich zu gewährleisten. Da die natürliche Paarung nicht immer zu Einer Eiablage führt, sollte die HCG-Injektion zur Gewinnung von haploiden Eizellen erst durchgeführt werden, wenn das natürlich gepaarte Weibchen beginnt, diploide Eier zu legen. Nach dieser Injektion sollte das induzierte Weibchen bei reduzierter Temperatur (8 bis 12 °C) untergebracht werden, was die Rate der Eiablage reduziert. Die Unterbringung des hormonstimulierten Weibchens bei normalen Temperaturen kann dazu führen, dass die meisten Eier in kurzer Zeit gelegt werden. Der Beginn der Eiablage in einem gekühlten Weibchen zeigt an, dass das Weibchen bereit für Anästhesie und Eizellextraktion ist. Die Oozytenaktivierung muss innerhalb von 15 min der Oozytenextraktion erfolgen. Da aktivierte haploide Embryonen mehrere Tage hinter den natürlich produzierten diploiden Embryonen in der Entwicklung liegen werden, empfehlen wir, diploide Embryonen bei 12 °C zu inkubieren und gleichzeitig die relative Entwicklungsrate der Haploide zu erhöhen, indem sie bei 18 °C inkubiert werden. Da es einige Abweichungen im Intervall zwischen HCG-Injektion und Eiablage von induzierten Weibchen geben wird, können leichte Anpassungen der Inkubationstemperaturen von Haploiden oder Diploiden notwendig sein, so dass die Inszenierung von Wirts- und Spenderembryonen zum Zeitpunkt der Pfropfung gepaart wird. Embryonen sollten vor der Pfropfung mehrere Stunden auf 4 °C gekühlt werden, was die Entwicklung fast unterlässt. Unterschiedliche Zeiten des Beginns von kühlenden haploiden und diploiden Embryonen vor der Pfropfung können das Stadium-Matching ermöglichen. Während haploide Embryonen morphologisch von Diploiden abweichen, erreichen sowohl Haploide als auch Diploide das Stadium 21, nachdem sich die neuronalen Falten schließen und die Embryonen an ihren Seiten liegen. Wie Diploide haben die haploiden Embryos im Stadium 25 prominente Kiemen- und pronephrische Wölbungen. Der große Kopf ragt in einem Winkel relativ zum Körper in Haploiden, obwohl dieser stark reduziert ist im Vergleich zu Stadium 25 diploid Embryonen, deren Köpfe aus dem Körper in fast einem rechten Winkel30hervorragen.

Sterile Technik ist absolut entscheidend für eine erfolgreiche Gewebetransplantation. Sterile Bedingungen sollten während des gesamten Experiments von der haploiden Generation bis zur embryonalen Entwicklung der Chimären aufrechterhalten werden. Wir empfehlen, alle Elterntiere während der Eiablagezeit in sauberen, nicht systemfreien Wasserbedingungen zu halten, um die Menge an kontaminiertem organischem Material zu Beginn des Verfahrens zu minimieren. Eine konsequente, tägliche Entfernung verstorbener oder sterbender Embryonen durch den gesamten Prozess ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Gesundheit der anderen Embryonen. Wir empfehlen, alle haploiden und Chimären-Embryonen einzeln zu beherbergen, um die Kreuzkontamination zu minimieren.

Embryonale Mikrodissektion und Gewebetransplantation Fähigkeiten werden durch die Praxis erworben. Während des Pfropfvorgangs ist es wichtig, die Gliederknospe selbst nicht zu punktieren oder zu zerreißen. Gewebe, das aus dem Wirt entfernt wird, und Spenderembryonen sollten, wie abgebildet, über die Gliedmaßenknospe hinausgehen, um eine Pufferzone zu schaffen. Wenn zu wenig Gewebebereich veredft wird, werden die haploiden Gliedmaßen durch GFP+ diploide Haut und andere Gewebe infiltriert.

Eine der Einschränkungen dieser Transplantationstechnik ist, dass das Neuronale Gewebe und blutindere Gliedmaßen vom Wirtskörper abgeleitet werden. In einigen seltenen Fällen konnten wir transplantierte haploide Gliedmaßen erzeugen, denen völlig alle Anzeichen von GFP+-Ausdrucksnerven fehlen. In diesen Fällen konnten wir genügend Neuronalgewebe im Wirtstier durch das des Spenders ersetzen. Eine solche umfangreiche Transplantation ist jedoch schwierig, unzuverlässig und führt oft zu Entwicklungsanomalien außerhalb der Gliedmaßen.

Haploidie ist embryonal tödlich im Axolotl. In ähnlicher Weise sind Mutationen in vielen Genen, die für die Entwicklung und Regeneration der Gliedmaßen potenziell unerlässlich sind, ebenfalls früh embryonal es. Unser Protokoll umgeht die embryonale Letalität der Haploidie für die Produktion experimenteller Gliedmaßen und könnte auch in Fällen verwendet werden, in denen die Mutation eines Kandidatenregenerationsgens einen embryonalen tödlichen Phänotyp produziert. Unsere Gliederknospen-Pfropftechnik bietet einen Vorteil für die Erreichung dieser im Vergleich zu zuvor beschriebenen Methoden der Gliedmaßenknospe und der beitragenden Gewebetransplantation, da sie während der frühen embryonalen Entwicklung durchgeführt wird und die Transplantation von kompletten Ektoderm- und Mesodermschichten1,2umfasst.

Haploid Gliedmaßen Knospe pfropfung wurde zuvor beschrieben; in dieser früheren Studie wurden haploide Gliedmaßenknospen jedoch ektopisch gepfropft31. Die mikroskopische Kernanalyse der aus diesen Transplantaten abgeleiteten ektopischen Gliedmaßen ergab umfangreiche Beiträge von Diploidgewebe. Während sich diese Gliedmaßen ungewöhnlich entwickelten, konnten sie31regenerieren. Anstatt ektopische Gliedmaßenknospen zu verpflanzen, ersetzen wir die gesamte endogene Gliedmaßenknospe durch gleichwertige haploide Gewebe. Durch die Verwendung von fluoreszierenden Markern sind wir in der Lage, haploide Gliedmaßen, die frei von diploiden Beiträgen sind, mit Ausnahme von Nerven- und Blutzellen visuell zu identifizieren, ohne die haploide Gliedmaße selbst zu opfern. Wir stellen fest, dass sich haploide Gliedmaßen normal entwickeln und regenerieren. Jedoch, Gliedmaßen, in denen GFP+ Wirte zu anderen Geweben als neuronale und blutabgeleitete Zellen tragen oft Anomalien. Daher müssen bei der Untersuchung der Genfunktion in haploiden Gliedmaßen diejenigen mit übermäßigen Wirtsbeiträgen von der Analyse ausgeschlossen werden, bevor ein Genotyp mit einem Phänotyp in mutierten haploiden Gliedmaßen in Verbindung gebracht werden kann.

Jüngste Innovationen, wie die Zusammenstellung des Axolotl-Genoms und die jüngsten CRISPR/Cas-basierten Insertionsmethoden15,16,32, haben die genetische Formbarkeit des Axolotls dramatisch erweitert. Methoden zur zeitlichen und räumlichen Einschränkung genetischer Manipulationen versprechen große Aussichten, aber ihre aktuellen Anwendungen werden durch die Ressourcen eingeschränkt, die zum Generieren, Beherbergen und Verteilen von Tierlinien benötigt werden. Das hier beschriebene Protokoll beschleunigt den Prozess, durch den die Folgen genetischer Störungen von Genen bei der Entwicklung und Regeneration der Gliedmaßen untersucht werden können. Es gab wenig Charakterisierung vieler Gene, die in regenerierenden Gliedmaßen hochreguliert wurden, und diese Gene können an einer Vielzahl von wesentlichen Entwicklungs- und Zellprozessen beteiligt sein. Während wir davon ausgehen, dass viele Gene, die für die Regeneration der Gliedmaßen benötigt werden, auch für die Entwicklung der Gliedmaßen erforderlich sein werden, kann diese Methode aufdecken, ob Gene, die an der Regeneration beteiligt sind, funktionsspezifische Phänotypen haben, die regenerationsspezifisch sind. CRISPR/Cas Mutagenesis in Axolotls produziert typischerweise allel Mosaik, der beibehaltene Wildtyp-Allele enthält, und dieser Mosaikismus selbst kann als quantifizierbarer Phänotyp20angesehen werden. Mithilfe der Next Generation Sequencing von amputierten originalen und regenerierten Gliedmaßen können Forscher quantifizieren, ob haploide Zellen mit Mutationen in einem Gen von Interesse bevorzugt nach der Regeneration verloren gehen. Dieser Ansatz kann die Untersuchung von Regenerationsphänotypen ermöglichen, die durch Störung von ansonsten essentiellen Entwicklungsgenen erzeugt werden.

Haploid Verlust-der-Funktion genetische Nppchen erleichtern die Untersuchung der genetischen Ursprünge vieler biologischer Prozesse, ohne die Notwendigkeit, biallelic mutierte Zelllinien zu etablieren. Durch die Kombination von Haplogenese, CRISPR/Cas9-Mutagenese und Gliedmaßenknospen-Veredelung bieten wir eine neuartige Plattform für einen haploiden genetischen Bildschirm, der die Entwicklung und Regeneration der Gliedmaßen bei einem lebenden Tier erforscht.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Katherine Roberts für ihre Pflege der Axolotl-Kolonie. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde vom Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 und 15-RMB-YALE-01) und dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral) bereitgestellt. Stipendium F32HD086942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#55 Dumont Forceps Fine Science Tools 11295-1 Only use Dumostar material (can be autoclaved)
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML 20 mL
Antibiotic-Antimycotic 100x Thermo Fisher 15240062
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400) bioworld 40600032-3 Ficoll 400
Gentamicin Sigma Aldrich G1914-250MG
Heating/Cooling Incubator RevSci RS-IF-233
Human Chorionic Gonadotropin Merk Chorulon
Megascript T7 Transcription Kit Thermo Fisher AM1334 40 reactions
Miroscope Cooling Stage Brook Industries Custom Custom
NLS Cas9 Protein PNAbio CP01-200 4 vials of 50 µg protein each
Plasmocin Invivogen ant-mpt-1 Treatment level
Recipes
1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Holtfreter's solution 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4

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References

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Genetik Ausgabe 155 Axolotl Haploid Gewebetransplantation Transplantation Regeneration Gliedmaßen Gliedmaßenknospe Chimäre CRISPR Cas9 Multiplex-Mutagenese
Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting
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Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, C. M. Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting. J. Vis. Exp. (155), e60156, doi:10.3791/60156 (2020).

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