Summary
מטרה זו של פרוטוקול זה היא לייצר כימאריק axo, עם פלואידי forelimbs נגזר מרקמת תורם Cas9-מוטוניים באמצעות שיטות השתלת רקמות עובריים.
Abstract
קבוצה ההולכת וגדלה של טכניקות גנטיות ומשאבים מאפשרים לחוקרים לחקור את המקורות המולקולריים של היכולת של מינים מסוימים של סלמנדרות, כגון axo ls, לחדש את הגפיים כולו כמבוגרים. כאן, אנו טכניקות המתאר המשמש כדי ליצור כימאריק axo, עם Cas9-מוטאואיד פלואידי שניתן להשתמש בהם לחקר תפקוד גנים ונאמנות של התחדשות הגפיים. אנו משלבים מספר טכניקות embryological וגנטיות, כולל הדור פלואידי באמצעות הפעלת חוץ גופית, crispr/Cas9 מוטארסיס, והשתלת רקמות לפרוטוקול אחד כדי לייצר מערכת ייחודית עבור ההקרנה גנטית הפלואיד באורגניזם מודל של התחדשות. אסטרטגיה זו מקטינה את מספר בעלי חיים, מרחב, וזמן הנדרש ניתוח פונקציונלי של גנים התחדשות גפיים. זה גם מאפשר את החקירה של פונקציות ספציפיות להתחדשות של גנים שעשויים להידרש לתהליכים חיוניים אחרים, כגון אורגאוגנזה, רקמה מורפולגנזה, ותהליכים עובריים חיוניים אחרים. השיטה המתוארת כאן היא פלטפורמה ייחודית לניהול ההקרנה הגנטית של הפלואיד במערכת מודל בעלי חוליות.
Introduction
מבחינה היסטורית, השתלת רקמות עובריים בדו-חיים הייתה טכניקה חשובה לחקר מנגנונים בסיסיים של ביולוגיה והתחדשות התפתחותית. האקנוספל, זן של סלמנדרה, בעל יכולת מרשימה להתחדש רקמות ומבנים מורכבים כגון גפיים ואיברים לאחר פציעה או קטיעה. כמו כן, הם יכולים לקבל, ללא דחייה, שתלי רקמות מאנשים אחרים בשלבי עובריים, קטינים ובוגרים1,2,3. מחוזות עוברים המייצרים מבנים שלמים כגון גפיים, זנבות, עיניים וראשים, ורקמות ספציפיות יותר, כגון neuroectoderm ומסוענים, ניתן ליצור מושתל בין העוברים כדי לייצר בעלי חיים כימריים1,2,4,5,6. במשך כמעט מאה, מחקרים של בעלי חיים כאלה בצ סיפקו תובנות מכרעת להתחדשות, רקמת בידול, גודל בקרת, והפרנינג1,7,8.
במהלך העשור האחרון, מחקרים מאוד מעבר להתחדשות רקמות הפיקו תובנות לתוכניות גנטיות בבסיס סלמנדרה התחדשות9,10,11,12,13. מחקרים אלה הוסיפו לרשימה המתרחבת של גנים מועמדים אשר, עד כה, אינם מאופיינים במידה רבה בהקשר של התחדשות. טכניקות ממוקדות של מוטאוזיס, כגון crispr/Cas, עכשיו לאפשר את החקירה של גנים כאלה, וגישות גנטיות כאלה מאוד הקלה על ידי ברצף האחרונות והרכבה של הגנום axol גדול14,15,16.
ביקשו לפתח טכניקות שיחד עם הביולוגיה ההתפתחותית הקלאסית עם טכנולוגיה גנטית חדשה למטרת ניתוח מנגנוני ההתחדשות. שיטות ליצירת עוברי הפלואיד וסלמנדרות אחרים הוקמו במשךעשרותשנים. בעוד טכניקות אלה כבר זמן רב ציין להיות יתרונות של סלמנדרות כמו אורגניזמים מודל גנטי18, כמה מחקרים גנטיים עוקבות שילבו חיות פלואידי. אנו משתמשים בפעילות חוץ גופית באקסון כדי לייצר עוברי החדואיד המשמשים כתורמי רקמות להשתלת19. באמצעות עוברים הנושאים סמנים גנטיים פלורסנט, המציאו שיטות אמינות ליצירת איברים הנגזרים כמעט לחלוטין מרקמותהתורמים(איור 1א). על-ידי שילוב שתי הטכניקות הללו, נעלנו את הטבליות העובריים המאוחרת הקשורות להפלואידיות, ומאפשרת ייצור של איברים מפותחים לחלוטין, מושתלים הפלודואיד (איור 1ב', איור 1ב', איור 2).
על-ידי ביצוע CRISPR/Cas-תיווך מוטגנזה בעוברי הדואיד לפני השתלה כדי ליצור כימאריק axo, עם הגפיים מוטציה המטה, אנו עשויים לחקור את הפונקציה גנים במיוחד בהקשר של פיתוח גפיים והתחדשות. זה מאפשר הצלה של איברים של פנוטיפים מוטנטים קטלני להיות עובריים. בעוד crispr/Cas מיקרוהזרקה יכול ליצור בעלי חיים שהם מאוד מוטנטים, בעלי חיים כאלה הם בדרך כלל פסיפס מאוד, עם מידה מסוימת של החזקת אללים ומגוון של מוטציות נפרדות באתרים ייעודיים14,20. Crispr מבוססי מוטגנזה בתאי פלואידי מגביר את החדירה של אלל אובדן מוטציות בודדות של הפונקציה, כפי שהם לא יכולים להיות רעולי פנים על ידי שמור אלל קלד אלטלס. מסיבה זו, הקרנת מבוסס crispr בקווי התא הפלואיד משמש יותר ויותר לחקור את הבסיס הגנטי של תהליכים סלולריים רבים21,22,23. על ידי שילוב crispr מבוסס שושלת היוחסין עם האיבר הגוף שלנו ניצן השתלת פרוטוקולים, הגישה המתוארת כאן יכול לשמש פלטפורמה עבור מסכי גנטיות פלואידי בחיות חיים20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכים ניסיוניים המשמשים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת ייל (IACUC, 2017 – 10557) והיו בהתאם לכל המדיניות וההנחיות הפדרליות השולטות בשימוש בבעלי חוליות. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על גבי אמסטומה מקסינום במתקני אוניברסיטת ייל.
1. הדור העובר של דיפלואיד
- השג העוברים GFP + דיפלואידי לשמש מארחי השתל באמצעות ההזדווגות הטבעית באמצעות אחד או שני הורים GFP של24.
- לאסוף ביצים טריים הונחו ביצה ומניחים אותם בתוך מסננת מתכת.
- לשטוף את הביצים ביסודיות עם 40% הפתרון של Holtfreter (20 מ"מ היאl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM נחקו3, 0.2 Mm cacl2, 4 מ"מ mgso4, pH כדי 7.4).
- הניחו את הביצים בתמיסת הולטסטר ה40 טרייה והחנות ב-12 ° c.
הערה: העוברים Diploid צריך תמיד להיות מושגת לפני המעבר לדור העובר ההפלואיד.
2. דור העובר של הפלואיד
- הכנה לתורמים מגיים נשית
- 48 h לפני ניצוח על הפעלת חוץ גופית, מורדם בוגרת מינית לבן או לבן/RFP נקבה האקסון על ידי הטבילה ב 1 g/L HEPES-באגירה MS-222 ב 40% הולטסטר פתרון25.
- ודא כי בעל החיים מורדם לחלוטין לאחר כ 30 דקות של טבילה על ידי צובט בחוזקה זנבו בין האגודל לאצבע. בעלי חיים מורדם לחלוטין. לא יגיבו פיזית לצביטה
- הכינו פתרון של גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG) המכיל 10,000 U/mL ב תמיסת מלח סטרילית.
- באמצעות 30 גרם אינסולין מזרק, להזריק 0.15 CC של HCG (1,500 יחידות) לתוך השרירים האחוריים של הגוף המורדם בזווית 45 ° על קו האמצע כדי למנוע מגע עם חוט השדרה.
- החזר את הנקבה לרענן 40% את הפתרון של הולטסטר ומקום במקרר של 8 עד 12 ° c.
- לאחר 48 h, החזר את הנקבה לטמפרטורת החדר. מניחים כמה אבנים או מפעלי פלסטיק במיכל שלה כמשטחים עבור הנחת ביצים.
הערה: הנקבות הזריקו עם HCG לעתים קרובות הפקדות מקרים ג'לי ריקים במשך מספר שעות לפני הנחת הביצים. - להסיר את האבנים או צמחי פלסטיק לאחר הנקבה החלה בעקביות הנחת ביצים.
- לאפשר לנקבה לשבת במיכל הריק במשך 30 דקות עד 1 h.
הערה: הסתרת חומרים בעלי החיים להטיל ביצים תאפשר השליטה הדוקה יותר של אוסף oocyte.
- אוסף מגיים לגברים
- בעוד הביצית של הנקבה מונח נתקע, מורדם בוגרת מינית GFP + הגברי לשמש כתורם זרע, כמו בשלב 2.1.1.
- על גבו מגבות נייר לח. מתחת למיקרוסקופ מבתר
- אם הניסויים מrighthanded, הצב את קצהו של הפיפטה הP1000 בבסיס הסוגר בידו הימנית.
- הנח את האצבע השמאלית ואת האגודל של יד שמאל 2-3 ס מ rostral לאגן. לסחוט בעדינות את החיה תוך הזזת האצבעות לעבר הרגליים האחוריות כדי לשטוף דגימות שתן ספרמיק.
- לאסוף כל אחד שנשטף מתוך קלואקה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בודדים. חזור על תהליך זה כדי לאסוף 6 כדי 10 דגימות.
- פיפטה 5.0 μL מכל מדגם על צלחת פטרי כדי לבדוק את איכות הזרע באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
הערה: דגימות זרע מרוכז הם צבע לבן חלבי, בדרך כלל נע בין 5 עד 20 μL, ומאוחזרים בדרך כלל לאחר כמה, דגימות השתן של נפח גדול יותר של מיקרופון מופק. זרע יאסוף בתחתית הצינורות בדגימות נפח גבוה יותר כאשר הוא נותר ללא הפרעה. דגימות מרוכז של זרע בריא הם מאוד נעים ולאבד פעילות כמו הריכוז שלהם פוחתת. זכרים בריאים יכולים לייצר עד 50 μL של זרע מרוכז.
- אוסף מגיים נשי
- לאחר השגת ומאשרת דגימת זרע בריא, מורדם את האקסון הנשי HCG-מוזרק כמו בשלב 2.1.1.
- הניחו את הנקבה המומנת במלואה על מגבות נייר לח על גבה.
- לחלץ ביצים מופרות מן הנקבה באמצעות תנועה ביד דומה לזה בשלב 2.2.4.
- לאסוף את הביצים באמצעות מלקחיים רטוב ולהעביר אותם 10 ס מ צלחת פטרי. מתייחסים לביצים עם זרע שוקרן לקרינה בתוך 15 דקות של אוסף.
- הכנה למשחק גברי והפעלת חוץ גופית
- השתמשו בP10 או בפיפטה P20 לצינורות הזרע למעלה ולמטה, ולפרק את הגושים כדי ליצור השעיה הומוגנית.
- משוער את אחוז הזרע נעים על ידי הצבת מ0.5 μl שחרור של השעיית זרע לא מדולל על מכסה צלחת פטרי או שקופית זכוכית ובדיקה עם מיקרוסקופ הפוך.
- הוסף 9.5 μL של הפתרון של הצלצול המתוקן של 0.1 x של מארק (MMR; רשימת חומרים) לדוגמה הזאת כדי ליצור דילול זרע של 20x. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב.
- עם מיקרוסקופ הפוך, לספור את הזרע בשלושה 1.0 μL טיפות של 20x מדולל מדלל על כיסוי צלחת פטרי או הומוציטומטר כדי לאמוד את ריכוז הזרע של ההשעיה ללא מדולל.
- הכינו את הזרע להקרנה על ידי דילול של מדגם הזרע המקורי על 80,000 מואריח תאים/mL בסטרילי 0.1 x MMR.
- לספור את מספר הביצים שהתקבלו בתוך 15 דקות האחרונות. הוסף 0.5 μL של הזרע הטרי מדולל משלב 2.4.5 לכל ביצה לצלחת פטרי. השתמש בעצת הפיפטה כדי לפזר השעיה זו לשכבה עבה 1 מ"מ.
- באמצעות מתיחת פלסטיק, למקם את המדגם 4 ס מ מתוך נורות של 254 ננומטר החוצה. מבחינה גנטית להפעיל את הזרע על ידי הקרנת המדגם עם 800,000 uJ/mm2.
- שימוש בפיפטה P10, מצנף את התליה על הביצים הבלתי מופרות, ציפוי כל ביצה באמצעות 0.25-0.5 ליטר של זרע לקרינה. הניחו לביצים לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- לאחר 30 דקות, להציף את הביצים עם 0.1 x MMR. מיד הניחו את הביצים בחממה של 8 עד 10 ° c לזריקות למחרת או ב -18 ° c לזריקות בתוך 7 שעות הפעלת ההודעה (hpa).
- שימוש במלקחיים חדים 30 דקות לאחר הידרציה. מיד הניחו את הביצים בחממה של 8 עד 10 ° c לזריקות למחרת או ב -18 ° c לזריקות באותו היום.
3. הפלואיד מוטגנזה ואחזקה
- הזרקת מיקרו/Cas9
- עיצוב sgrnas באמצעות קריספרסריקה וסינתזה26,27.
- למגה-פלקס, הכינו מלאי של 5 sgRNAs (10 ng/μL עבור כל Sgrnas) ו Cas9 חלבון (1 μg/μL). להכין דילול 100-קיפול של מלאי זה (0.1 ng/μL עבור sgRNA, 10 ng/μL Cas9) עבור הזרקה. עבור גן יחיד, מוטזיס תדר מוטציה גבוהה, בצע את הפרוטוקול המתואר בעבר28.
- הכנס את העוברים בשלב תא בודד 7 hpa אם הוא מאוחסן ב 18 ° c או להזריק עוברים למחרת בשלב 2-8 תא אם הם מאוחסנים ב 8:10 ° c.
- העבר את העוברים ל-1.0 x MMR עם 20% פוליסוכרוז 400.
- אם תא בודד, להזריק כל העובר עם ירידה 5 nL של פתרון ההזרקה (כ 1/4 רדיוס של הביצה) המכיל מסה כוללת של 0.5 pg/sgRNA ו 50 pg Cas9 חלבון. אם רב-תאיים, הפץ מסה זו על-ידי הזרקת אמצעי אחסון קטנים יותר לתאים מרובים.
- לאפשר לעוברים להחלים ב polyסוכות 400 לפחות 4 h ומקסימום 18 h ב 18 ° c.
- הפלואיד מגורים העובר
- להעביר את העוברים ל 0.1 x MMR עם אנטיביוטיקה-antimycotic.
- הבית כל עובר בבאר הפרט של הצלחת 24-באר, כמו כמה ימותו או להתפתח באופן חריג. שמרו על 16/18 ° c. טמפרטורות נמוכות יותר יכולות לשמש כדי להאריך את ההתפתחות, במידת הצורך.
- החלף את המדיה עם חדש 0.1 x MMR עם אנטיביוטיקה-antimycotic בכל יום אחר.
4. הכנה לעובר מארח diploid
- שמרו על עוברים בציפוי ג'לי ב-12 עד 16 ° צ' עד שיגיעו לשלב 22 עד 26.
- לאסוף את העוברים המוכנים השתלה, למקם אותם בתוך מסננת (4 מ"מ גודל הרשת), ולשטוף בעדינות אותם עם 40% הפתרון של הולטסקטר.
- העבר את העוברים לתוך מסנן מסוננים 0.1 x MMR המכיל 1.5% אקונומיקה עבור עד 2 דקות. לחלוטין להטביע את העוברים בתמיסה אקונומיקה ומערבולת אותם בעדינות כדי להבטיח את ציפוי ג'לי עושה מגע מלא עם פתרון אקונומיקה להרוג את החיידקים נוכח העוברים.
- לאחר 2 דקות, לדלל את פתרון אקונומיקה המכיל את העוברים עם נפח שווה של מסנן-מעוקר 0.1 x MMR.
- בעדינות לשפוך את העוברים לתוך מסננת מחוטא (4 מ"מ גודל הרשת) ולשטוף את העוברים חמש פעמים עם מסנן-מעוקר 0.1 x MMR.
- מקום העוברים לתוך סטרילי 10 ס מ מנות פטרי עם 0.1 x MMR עם אנטיביוטיקה עבור דיכאליינג (פניצילין 100 יחידות/mL, סטרפטומיצין 100 μg/μL, 0.25 μg/mL, gentamicin 25 μg/mL).
- תחת stereomicroscope פלורסנט, להסיר את מעילים ג'לי וממברנות vitelline מ-GFP + עוברים באמצעות מלקחיים חדים (טיפ מידות 0.05 x 0.01 מ"מ2).
- העבר את עוברי ה-GFP לצלחת פטרי חדשה. מזער את כמות הנוזל המועבר מצלחת פטרי שבה הם היו מדוכא.
- לשטוף את העוברים המארחים GFP עם סטרילי 0.1 x MMR עם אנטיביוטיקה ארבע עד שש פעמים על מנת להסיר מזהמים.
- מניחים את העוברים הנקיים ב -4 ° c בלילה לפני השתלה.
הערה: קירור העוברים הופך אותם הפרדה נוקשה ונקייה יותר של מזועור מאשר בר העור אפשרי.
5. הפלואיד-דיפלואיד כמירה
- הכנה לכלי כירורגי ומדיה
- להכין מנות הפעלה סטרילי כירורגי על ידי שפיכת בלוק 2% העלה ב 0.1 x mmr לתוך סטרילי 35 מ"מ מנות פטרי קל לאחוז. מלאו את מנות הפטרי באמצע הדרך עם הצמח.
- לאחר שהאגדה מתקררת, השתמש באזמל סטרילי כדי לקצץ באורך של 25 מ"מ, שוקת משופע בתוך הצמח כדי להחזיק את העוברים במקומם.
- למלא את הצלחת עם מדיה כירורגית סטרילי (0.1 x MMR עם anti-mycoplasma 2.5 μg/mL, אמפוריטיצין B 0.25 μg/mL, ו ציפרופלוקסאצין 10.0 μg/mL) ולהכניס למקרר ב 4 ° c.
- השתלת עובר
- מקום אחד בריא תורם הדואיד עם אחד או שניים בהתאמה בשלב מארח gfp + דיפלואידי העוברים בתוך שוקת של צלחת ההפעלה מקורר המכיל מדיה כירורגית (איור 3).
הערה: בצע את ההליך בשלב קירור (10 ° צ' או נמוך) אם אפשר. - השתמש שני עדינים במיוחד, מלקחייםאוטוקלתיים(טיפ ישר, טיפ מידות 0.05 x 0.02 mm 2) כדי להסיר את השכבות אאקטודרם מזועור מהמארח עם ניצן הגפיים ליד המרכז (איור 4).
הערה: האזור השתלת רקמה מלבנית כוללת את ניצן הגפיים ולהאריך מן somite התשיעי אל החצי האחורי של הבליטה הזימים, על 2 מ"מ, לאורך הציר האחורי הקדמי. לאורך הציר הגסודורי, האזור הושתל משתרע על כ-1.5 מ"מ, כולל הסומטים אל מעבר לקצה הגחוני של בליטה הזימים. האזור מושתל כולל את כל לוחית לרוחב מזועור ואת החצאים לרוחב של הסומטים, ללא מפריע מתחת לעור. ראה איור 4 והווידאו הנלווה לקבלת פרטים. - להניח בצד את הרקמה המארחת ולהסיר גיליון רקמה אופן בגודל מתוך תורם פלואידי באמצעות אותן שיטות.
- מניחים את גיליון רקמת התורמים של הפלואיד על האזור המקביל של העובר התורם.
- לאבטח את הרקמה על ידי כיסוי אותו עם אוטוקלבד, זכוכית מלבנית השבר מזכוכית מכסה כתוש מיקרוסקופ ולחיצה עדינה לתוך גוף העובר מארח.
- הפוך את העובר תורם פלואידי על הצד השני שלה כדי לקצור את ניצן הגפיים עבור העובר הפונדקאי השני. חזור על שלבים ה5.2.2 באמצעות 5.2.5.
- הסר בזהירות את הרקמות המארחות הנותרות והעובר תורם ממנה.
- השאר את השתלים עם מעגן זכוכית במקום עבור 60-75 דקות, בדיקת כל 20 דקות כדי להבטיח כי הזכוכית לא חמק.
- לאחר שתלי רקמות לדבוק במלואו, להשתמש מלקחיים כדי לקלף לאט להסיר את העוגנים זכוכית השבר.
- מקום אחד בריא תורם הדואיד עם אחד או שניים בהתאמה בשלב מארח gfp + דיפלואידי העוברים בתוך שוקת של צלחת ההפעלה מקורר המכיל מדיה כירורגית (איור 3).
- תחזוקת כמירה
- העבירו את העוברים המנופה לתקשורת כירורגית טרייה ושמרו אותם ב -8 עד 12 ° צ' למשך הלילה כדי להחלים. בית בנפרד חרט עוברים מנופה בתוך 12 או 24 צלחות.
- אחרי 36-48 שעות, העבירו את העוברים המנופה לantimycotic סטרילי 0.1 x MMR לאנטיביוטיקה. האנטיביוטיקה החזקה בתקשורת הכירורגית גורמת לרעילות בעוברים מנופה לאחר 3 ימים.
- החלף את המדיה באמצעות מרענן 0.1 x ואנטיביוטיקה כל 2 עד 3 ימים.
- שמרו על העוברים המנופה ב -18 ° c עד שיוכלו להזין28.
- לאחר 1 כדי 2 חודשים של פיתוח וטיפול, הגפיים החדואיד ניתן להבקיע עבור טוהר השתל באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה פלורסנט.
הערה: הנוכחות של שאינם עצביים או שאינם דם שמקורם מארח GFP-רקמה בגפיים הוא מחוון של השתלה טמאה והוא קשור לעיתים קרובות עם התפתחות הגפיים נורמלי. החיות האלה צריכות להיות. מושמצות מניתוח נוסף
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיתוח עוברי פלואידי יכול להיות נבדל מן העוברים דיפלואידי על ידי התסמונת החפלואיד שלהם פנוטיפ29. בשלב ההשתלה, עוברי הפלואיד מציגים עקמומיות מופחתת לאורך הציר האחורי הקדמי והמארז השלם של תקע החלמון (איור 3א). מיקרוסקופ פלורסנט יכול לשמש כדי להבטיח כי עוברי הפנים הם חופשיים של ביטוי GFP הנגזר בלבד (איור 3ב).
כאשר השתלים נקיים, ביטוי GFP צריך להיות מוגבל בעיקר מקלעת ה, הרשת העצבית הנגזרת מחוט השדרה של המארח, כפי שניתן לראות באיור 2. ביטוי GFP בודד יהיה גם להיות נוכח בתאים בודדים הנראים נוירונים חושי תאים מארחים נגזר דם, אשר להגר לתוך האיבר המתפתח. כאשר RFP + תורמים משמשים, השתלת הגפיים האיברים תציג ביטוי אוניברסלי של RFP (איור 1B). במהלך הפיתוח, הגפיים הלא מוטניים האיברים הם קצרים באופן משמעותי מאשר דיפלואידי היריבה בגודל המתאים בעלי חיים מתאימים (איור 1B, איור 1B, ואיור 5, n = 16 זוגות הגפיים, ממוצע הפלואיד = 0.522 ס"מ, sd = ± 0.087 ס"מ, דיפלואידי ממוצע = 0.667 ס"מ, sd = ± 0.069 m, לזווג T-test p-ערך < 0.0001, היחס הממוצע = 0.784, SD = ± 0.113). שאינם מוטניים הגפיים החדואיד גם במלואו להתחדש (4/4 פלואידי ו 4/4 דיפלואידי להשלים התחדשות, איור 6), למרות שהם מראים עיכוב קל להגיע לשלב מוצלח דיגיטלי לעומת דיפלואידי (n = 4 הדופייאיד, n = 4 דיפלואידי; 23 ימים לאחר קטיעה: פלואידי = 3 צבעים ו 1 מעבר בשלב האיברים הדיגיטליים; דיפלואידי = 4 האיברים הדיגיטליים של השלב החיצוני).
השתלה מוצלחת דורשת תרגול, ועקביות תשתנה בהתאם לכישורי המיקרומניפולציה של הטכנאי ולטכניקה הסטרילית. שתלי שנכשלו וטהורים מייצרים מגוון פנוטיפים, כפי שניתן לראות באיור 7 ובאיור 8. בידינו, כ 38.7% (SD = ± 8.78%) של oocytes להתפתח עוברי החדואיד מפותח בדרך כלל 11.1% (SD = ± 5.46%) של כל שתלי הפלואיד-diploid לייצר חיות קיימא עם גפיים מפותחות בדרך כלל, מושתל בצורה נקייה (איור 9).
איור 1: מבט כולל על הפרוטוקול ודוגמה של כלאריק axol. (א) סכמטי מתאר את העיתוי היחסי של צעדים שננקטו כדי להשיג עוברי מארח דיפלואידי, זרע, וביצים כדי ליצור הפלואידים ועוברי הצ. (ב) תמונה בהירה מורכבת של האקסון קטין המיוצר על ידי השתלה האיבר עובריים השתלת rfp + פלואידי העובר gfp + דיפלואידי (ב) כיסוי של תמונות פלורסנט ירוק ואדום של אותו 8 ס מ לנוער האקסון. האיבר הפלואיד הוא נורמלי למדי, אבל קצר יותר מאשר האיבר הנגדי היריב. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונת פלורסנט של האיבר המפותח והנקי בצורה בדרך כלל. Gfp-פלואידי האיבר הושתל מארח gfp + דיפלואידי מציג דפוס gfp ביטוי שנראה מוגבל לעצבי השדרה innervating האיבר (החץ הצהוב) והנוירונים החושים בודדים ותאים נגזר דם (חיצים לבנים). האיבר בתמונה שייך 4 ס מ קטין. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואת דיפלואיד ועוברי החדואיד. (A) תמונת אור של דיפלואידים (משמאל) ו הפלואידים (מימין). שים לב לעקמומיות ציר ה-AP הקטן ולעור הטיפולי הבולטת של עוברי הפלואיד (חיצים לבנים). (ב) תמונה פלואורסצנטית ירוקה של העוברים אותם. GFP-haploids נוצרו באמצעות ביצים מ-GFP-נקבה וזרע לקרינה מתוך GFP +. הדיפלואידים הם GFP +. עוברים בתמונה הם בקירוב לשלב 2530. . סידרה מספר שורה סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סכמטי מתאר את היקף השתל האיבר החדואיד. (א) מבט לרוחב של העובר שלב 25 הפלואיד. קווים מנוקדים להראות את האזור המשוער כי צריך להיות מושתלים, ביחס הבליטה הגיל ואת ניצן הגפיים. (ב) סכימטי רוחבי של שלב 25. הקווים המנוקדים מציגים את האזור וסוגי הרקמה המקבילים שיש להסירו מהמארח ולהחליף את רקמת התורם המתאימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השוואת החדואיד ואורכי הגפיים הדיאטטוריים. (א) פיזור העלילה של אורכי הגפיים החדואיד (ורוד) וגפיים מנוגדות דיפלואידי (ירוק) של 16 בעלי חיים בגודל כימריים (פלואידי ממוצע = 0.522 ס"מ, sd = ± 0.087 ס"מ, דיפלואידי ממוצע = 0.667 ס"מ, SD = ± 0.069 ס"מ). הגפיים נמדדה מבסיס הזיוגופוד ועד לצומת של ספרות 2 ו -3. (ב) פיזור העלילה של אורך האיבר פלואידי ליחסי אורך האיבר דיפלואידי של 16 בעלי חיים (ממוצע היחס = 0.784, SD = ± 0.113 ס"מ). (ג) פיזור מגרש של אורכי הגוף (cm) של 16 התקופות שנמדדו (ממוצע אורך החיים = 8.72 ס"מ ± 0.456 ס"מ). בעלי חיים נמדדו מקצה החוטם לקצה הזנב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: השוואת התחדשות בהפלואיד ובאברי הדיפלואיד. (א) איבר הדודואיד שלפניכריתה. (ב) אותו איבר הפלואיד לאחר התחדשות. (ג) דיפלואיד האיבר מראש כריתה. (ד) אותו איבר הדיפלואיד לאחר התחדשות. 4/4 גפיים החדואיד ו 4/4 הגפיים דיפלואידי מחדש עם מורפולוגיה נורמלית. קווים מנוקדים שחורים מציינים את מישור הקטיעה. שינוי קנה מידה = 1 מ"מ. הקטיעות נערכו על בעלי גודל בעלי מידות בעלי חיים קטינים (8.5 ס מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: דוגמאות להתפתחות נורמלית ובלתי נורמלית של הגפיים החדואיד. (א) איבר הפלואיד עם מורפולוגיה נורמלית ביותר. (ב-ה) דוגמאות של שתלים שנכשלו לתמוך התפתחות מלאה של haploid. (ב) אוליגואכקלי. (ג) הרבה יותר חמור. (ד) לא קיימים מבנים דיגיטליים ברורים. (ה) אין גפיים. הגפיים בתמונה שייכות לנוער בגודל דומה (8.0 עד 10 ס מ). שינוי קנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: דוגמאות של תאים GFP בתוך שתלי הגפיים הטמאים. (A, A) האיבר הרגיל השתלת מורפולוגית עם תאים gfp + דיפלואידי בעור ו דרמיס (לבן מקווקו המתאר) נחשף על ידי מיקרוסקופ פלורסנט. (ב, ב) האיבר חריג המעטפת החדוראיד עם התאים gfp + דיפלואידי תורמים בהרחבה כדי דרמיס והעור (לבן מיתאר). (ג, ג ') מושתל האיבר נורמלי הדואיד שבו האפידרמיס הוחלף עם gfp + דיפלואידי תאים (לבן מיתאר). הגפיים בתמונה שייכות לנוער בגודל דומה (8.0 עד 10.0 ס מ). סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: שיעורי הצלחה של העובר ההפלואיד ודור הגפיים של הפלואיד. (A) אחוז של עוברי קיימא החדואיד שנוצרו באמצעות הפעלת חוץ גופית. הנתונים נאספו מחמישה עצמאיים. בניסויי הפעלת מבחנה ירוק מציין את שבריר של ביצים שיוצרו שלב 25 הדופייאיד העוברים שניתן להשתמש בהם עבור השתלה (ממוצע = 38.7%, SD = ± 8.78%). אפור מציין את שבריר של ביצים שלא הראו סימנים של מחשוף, היו לא קיימא, או היו נורמליים בפיתוח. (ב) אחוז מהאברים המפותחים בדרך כלל, מושתלים בצורה נקייה. סגול מציין את שבריר של שתלי שהניבו נקי, בדרך כלל מפותח הגפיים האיברים (ממוצע = 11.1%, SD = ± 5.46%). ירוק מציין גפיים שפותחו בדרך כלל אבל היו מזהם GFP + רקמות מארח (ממוצע = 11.3%, SD = ± 8.64%). אדום מציין גפיים השתל כי לא להתפתח כרגיל (ממוצע = 27.1%, SD = ± 30.3%). כחול מציין את כל העוברים מושתלים בעלי חיים שלא שרדו כדי להשלים את התפתחות הגפיים (ממוצע = 50.5%, SD = ± 31.2%). אובדן של בעלי חיים מושתלים הופץ על פני שלבים עובריים ושלבי זחל מאוחרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול שלנו ליצירת הפלואיד-diploid שטכנאי ההפעלה צריך לשקול תוצאות השתלה עקבית.
הסיבה הסבירה ביותר עבור דור הפלואיד להיכשל היא עקב העניים בתנאי ההפעלה החוץ גופית. יש להשתמש בכמויות המתאימות של זרע המרצפת כדי להפעיל ביצים. כדי להאריך את התנועתיות, יש לשמור על דגימות זרע ב -4 ° c. לפני החלת דגימת זרע על ביצים, לבדוק את הכדאיות של הזרע באמצעות מיקרוסקופ הפוך. אין להשתמש בזרע לחלוטין ללא משבצת, והריכוז צריך להיות מותאם ל 80,000 נעים תאים/mL. יותר מדי זרע בשלב ההפעלה יכול גם למנוע פיתוח ביצים רגיל. בורות הזרע, אשר מופיעות כניסות קטנות, כהה על פני השטח של הביצה, הם אינדיקציה פיזית תא זרע חדרה את הביצה ובדרך כלל מופיעים 20 עד 60 דקות לאחר החלת זרע. ביצים עם עשרה בורות זרע או יותר לא יכול להפעיל כראוי.
ביצים מופרות ניתן להפעיל אם נאסף בתוך 15 דקות לאחר שהוא הניח מתחת למים, ממוקם בצלחת פטרי יבש, מיובש ביסודיות עם מגבות נייר לפני בקשת זרע. לחילופין, כפי שמוצג בסרטון, ניתן לסחוט ביצים מנקבה המוזרקת הורמונים. אנו מוצאים כי אלה "יבש" ביצים לתת תוצאות עקביות יותר, למרות שאנו מעסיקים באופן קבוע את שתי השיטות.
השתלה מוצלחת דורש את הזיווג הנכון של עוברי דיפלואידי עם רקמת ניצן האיבר מבוים כראוי. פרוטוקול זה מכיל מספר צעדים להבטחת התאמת השלבים. כמו ההזדווגות הטבעית לא תמיד גורם הנחת ביצה, הזרקה HCG להשיג פלואידי oocytes לא צריך להתבצע עד הנקבה מזדווג מתחיל להטיל ביצים דיפלואידי. לאחר ההזרקה, הנקבה הנגרמת צריכה להיות שוכנת בטמפרטורה מופחתת (8 עד 12 ° c), אשר תפחית את שיעור הנחת הביצים. הדיור הנשי מגורה הורמון בטמפרטורות נורמלי עלול לגרום לרוב הביצים להיות הניח בתקופה קצרה של זמן. תחילתה של ביצה הנחת נקבה מקורר מעיד כי הנקבה מוכנה הרדמה החילוץ oocyte. ההפעלה oocyte חייב להתרחש בתוך 15 דקות של חילוץ oocyte. מכיוון העוברים מופעל פלואידי יהיה מספר ימים מאחורי העוברים באופן טבעי דיפלואידי בפיתוח, אנו ממליצים על עוברי הדידואיד דיפלואידי ב 12 ° צ' תוך הגדלת שיעור יחסי של התפתחות ההדואידים על ידי הדגירה אותם ב 18 ° c. בגלל שיהיו כמה וריאציה במרווח בין הזרקה HCG והנחת ביצה של נקבות המושרה, התאמות קלות בטמפרטורת הדגירה של haploids או diploids עשוי להיות נחוץ, כך ההיערכות של עוברי מארח ותורם משויכים בזמן השתלה. העוברים אמורים להיות צוננים ל -4 ° c במשך מספר שעות לפני השתלה, והתפתחות כמעט מעצרי. שונות הזמן של התחלתה של העוברים מצמררת ועוברי הדיפלואיד לפני השתלה יכול לאפשר התאמת הבמה. בעוד העוברים שונים מורפולוגית מדיפלואידים, שני הפלואידים ודיפלואידים מגיעים לשלב 21 אחרי שהקפלים העצביים נסגרים והעוברים משקרים אחד לשני. כמו דיפלואידים, העוברים שלב 25 פלואידי יש גיל בולט ובליטות. הראש הגדול בולט בזווית יחסית לגוף בהפלואידים, אם כי זה מופחת מאוד יחסית לשלב 25 דיפלואידי, שראשיהם בולטים מהגוף בזווית כמעט ימינה30.
טכניקה סטרילית היא קריטית לחלוטין. להשתלת רקמות מוצלחת תנאים סטריליים יש לשמור באמצעות כל הניסוי מדור פלואידי דרך ההתפתחות העובריים של התקופות. אנו ממליצים לשמור על כל חיות ההורה במצב נקי, שאינו מערכת המים בזמן הטלת הביצה כדי למזער את כמות החומר האורגני מזהם בתחילת ההליך. באופן עקבי, הסרה יומית של עוברים מתים או גוססים דרך התהליך כולו חשובה לשמירה על בריאותם של העוברים האחרים. אנו ממליצים על דיור בנפרד כל פלואידי וכמירה עוברים כדי למזער את הזיהום הצולב.
כישורי מיקרו-ניתוח עובריים והשתלת רקמות נרכשים באמצעות תרגול. במהלך תהליך ההשתלת, חשוב לא לנקב או לקרוע את ניצן הגפיים עצמו. רקמות הוסרו מן העוברים המארחת ותורם צריך להאריך מעבר ניצן הגפיים, כמו בתמונה, כדי לספק אזור אגירה. אם קטן מדי של אזור של רקמה הוא מושתל, הגפיים החדואיד יהיה לחדור על ידי העור gfp + דיפלואידי ורקמות אחרות.
אחת המגבלות של טכניקת השתלה זו היא שהרקמה העצבית והדם בגפיים נגזרות מהגוף הפונדקאי. בכמה מקרים נדירים, הצלחנו ליצור האיברים החדותים מושתלים אשר לחלוטין חסר כל סימנים של GFP + הבעת עצבים. במקרים אלה, הצלחנו להחליף מספיק את הרקמה העצבית בחיה המארחת עם התורם. עם זאת, השתלה נרחבת כזו קשה, לא מהימנה, ולעתים קרובות מייצרת חריגות התפתחותיות מחוץ לגפיים.
. הפלואידיות קטלנית באקסון באופן דומה, מוטציות בגנים רבים שעלולים להיות חיוניים לפיתוח גפיים והתחדשות הם גם קטלני מוקדם של התפתחות. הפרוטוקול שלנו עוקף את הלאליות עובריים של הפלואידיות לייצור של איברים ניסיוניים יכול לשמש גם במקרים שבהם מוטציה של גן התחדשות מועמד מייצרת פנוטיפ מעובריים קטלני. הגוף שלנו ניצן השתלת טכניקה מספק יתרון להשגת זה לעומת שיטות שתוארו קודם לכן של ניצן איבר והשתלת רקמת תורם, כפי שהוא מבוצע במהלך פיתוח מוקדם של העובריים וכרוך השתלת מלאה עור ושכבות מזועור1,2.
השתלה האיבר הפלואיד תוארה בעבר; עם זאת, במחקר מוקדם זה, ניצנים הגפיים פלואידי היו מושתליםלמריחה עלהגוף. ניתוח גרעיני מיקרוסקופיים של הגפיים חוץ רחמי שנגזר שתלי אלה חשף תרומות נרחבות של רקמת דיפלואידי. בעוד גפיים אלה פיתחו באופן חריג, הם הצליחו להתחדש31. במקום השתלה של ניצנים הגפיים חוץ רחמי, אנו מחליפים את ניצן האיבר האנדוגניים כולו עם רקמות פלואידי שווה ערך. באמצעות סמנים פלורסנט, אנחנו מסוגלים חזותית לזהות הגפיים החדואיד, כי הם חופשיים של תרומות דיפלואידי, למעט בתאי העצב והדם, מבלי להקריב את האיבר פלואידי עצמו. אנו מוצאים כי הגפיים לפתח ולהתחדש כרגיל. עם זאת, הגפיים בהם GFP + מארחים תורמים לרקמות שאינן תאים עצביים בדם נגזר לעתים קרובות להציג חריגות. כך, כאשר חקירת פונקציה גנטית הגפיים, אלה עם תרומות מארח מופרז חייב להיות מחוץ לניתוח לפני גנוטיפ יכול להיות משויך כל פנוטיפים שנצפו הגפיים המוטציות.
חידושים האחרונים, כמו האסיפה של הגנום axol והאחרונה crispr/Cas מבוססי insertional שיטות15,16,32, יש הרחיב באופן דרמטי את הmalleability הגנטית של axo l. שיטות להגבלת מניפולציות גנטיות באופן זמני והבטחה מרבית, אך היישומים הנוכחיים שלהם מוגבלים על ידי המשאבים הדרושים להפקת, בית והפצת קווי בעלי חיים. הפרוטוקול מפורט כאן מאיצה את התהליך שבו ההשלכות של רטבאליות גנטי של גנים עשויים להיות נחקר פיתוח גפיים והתחדשות. הייתה אפיון קטן של רבים מהגנים שנמצאו בתהליך התחדשות הגפיים, וגנים אלה עשויים להיות מעורבים במגוון תהליכים התפתחותיים וסלולריים חיוניים. בעוד אנו צופים כי גנים רבים הדרושים התחדשות איבר יהיה גם נדרש עבור פיתוח גפיים, שיטה זו עשויה לגלות אם כל הגנים מעורבים התחדשות יש פנוטיפים אובדן פונקציה כי הם התחדשות ספציפיים. CRISPR/Cas מוטגנזה ב axoallelic בדרך כלל מייצרת הפסיפס כי כולל שמור alleles האלולים, והפסיפס עצמו עשוי להיחשב ככמת פנוטיפ20. שימוש ברצף הדור הבא של הגפיים המקורי מחדש ומחדש, החוקרים יכולים לכמת אם תאים פלואידי עם מוטציות בגן של עניין מעדיפים לאיבוד לאחר התחדשות. גישה זו עשויה לאפשר את החקירה של פנוטיפים התחדשות המיוצרים על ידי הפרטורציה של גנים חיוניים אחרת התפתחותיים.
Haploid אובדן של תפקוד מסכי גנטיות להקל על החקירה של המקורות הגנטיים של תהליכים ביולוגיים רבים ללא צורך להקים קווי תא biallelic וטציה. על ידי שילוב haplogenesis, CRISPR/Cas9 מוטגנזה, ו ניצן איבר השתלה, אנו מספקים פלטפורמה הרומן עבור מסך גנטי haplogenesis לחקור פיתוח האיבר והתחדשות בחיה חי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
היינו רוצים להודות לקתרין רוברטס. על שטיפלה במושבה האקסון מימון עבור עבודה זו סופק על ידי הקרן החידוש של מקונטיקט חדשנות מחקר הרפואה (15RMA-ייל-09 ו 15-RMB-ייל-01) ו-יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד ופיתוח האדם (הפרט פוסט-דוקטורט מלגת F32HD086942).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J.
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J.
- Armstrong, B.
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
