Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Embriyonik Greftleme Yoluyla Mutant Haploid Ekstremiteler ile Şemerik Axolotls Üretimi

Published: January 29, 2020 doi: 10.3791/60156
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

Summary

Bu protokolün amacı, embriyonik doku aşılama teknikleri kullanılarak Cas9-mutajenize donör dokusundan elde edilen haploid forelimbs ile şimerik axolotls üretmektir.

Abstract

Genetik teknikler ve kaynaklar büyüyen bir dizi araştırmacılar semender bazı türlerin moleküler kökenleri araştırmak için izin, aksitolar gibi, yetişkin olarak tüm uzuvları yeniden. Burada, gen fonksiyonunu ve ekstremite rejenerasyonunun sadakatini keşfetmek için kullanılabilecek Cas9-mutajenizeize haploid forelimbs ile şimerik axolotls oluşturmak için kullanılan teknikleri anahat. İn vitro aktivasyon yoluyla haploid üretimi, CRISPR/Cas9 mutagenezi ve doku greftleme gibi çeşitli embriyolojik ve genetik teknikleri birleştirerek yenilenmenin model organizmasında haploid genetik tarama için benzersiz bir sistem üretiyoruz. Bu strateji, ekstremite rejenerasyonundaki genlerin fonksiyonel analizi için gerekli olan hayvan, alan ve zaman sayısını azaltır. Bu aynı zamanda organogenez, doku morfogenezi ve diğer temel embriyonik süreçler gibi diğer temel süreçler için gerekli olabilecek genlerin rejenerasyona özgü fonksiyonlarının araştırılmasına izin verir. Burada açıklanan yöntem bir omurgalı model sisteminde haploid genetik tarama yapmak için benzersiz bir platformdur.

Introduction

Tarihsel olarak, amfibiler embriyonik doku greftleme gelişim biyolojisi ve rejenerasyon temel mekanizmaları keşfetmek için önemli bir teknik olmuştur. Semender bir tür olan aksolotl, yaralanma veya ampütasyon dan sonra dokuları ve uzuvlar ve organlar gibi karmaşık yapıları yenilemek için etkileyici bir yeteneğe sahiptir. Benzer şekilde etkileyici, onlar alabilirsiniz, reddi olmadan, embriyonik diğer bireylerden doku greftleri, juvenil, ve yetişkin aşamaları1,2,3. Uzuvlar, kuyruklar, gözler ve kafalar gibi bütün yapıları üreten embriyo bölgeleri ve nöroektoderm ve somitler gibi daha spesifik dokular, şeymerik hayvanlar üretmek için embriyolar arasında aşılanabilir1,2,4,5,6. Yaklaşık bir yüzyıl boyunca, bu tür şemerik hayvanların çalışmaları rejenerasyon içine önemli anlayışlar sağlamıştır, doku farklılaşması, boyut kontrolü, ve desenleme1,7,8.

Son on yılda, dokuların çok sayıda transkripsiyonel çalışmalar salamander rejenerasyon9,10,11,12,13altında yatan genetik programlar içine anlayışlar üretti . Bu çalışmalar, bugüne kadar, büyük ölçüde rejenerasyon bağlamında karakterize edilmeyen aday genlerin genişleyen bir listeye ekledik. CRISPR / Cas gibi Hedefmutage teknikleri, şimdi bu tür genlerin araştırılmasına izin, ve bu tür genetik yaklaşımlar büyük ölçüde son sıralama ve büyük axolotl genom14,15,16montaj tarafından kolaylaştırılır .

Klasik gelişim biyolojisini yeni genetik teknolojiyle birleştirerek yenilenme mekanizmalarını incelemek amacıyla teknikler geliştirmeye çalıştık. Axolotls ve diğer semenderler haploid embriyolar oluşturmak için yöntemler on yıllardır kurulmuştur17. Bu teknikler uzun genetik model organizmalar olarak semenderlerin avantajları olduğu belirtilmiştiriken 18, birkaç sonraki genetik çalışmalar haploid hayvanlar dahil var. Biz19aşılama için doku donör olarak hizmet haploid embriyolar üretmek için axolotl in vitro aktivasyon kullanın. Floresan genetik belirteçler taşıyan embriyolar kullanarak, neredeyse tamamen donör dokulardan elde edilen uzuvlar üretmek için güvenilir yöntemler tasarladık(Şekil 1A). Bu iki tekniği birleştirerek, haploidile ilişkili geç embriyonik öldürücülüğü atladık, tam gelişmiş, aşılı haploid ekstremitelerin üretimine izin verdik (Şekil 1B, Şekil 1B've Şekil 2).

Mutant haploid ekstremiteler ile şimerik aksokolotls oluşturmak için aşılama dan önce haploid embriyolarda CRISPR/Cas aracılı mutagenez yaparak, özellikle ekstremite gelişimi ve rejenerasyonu bağlamında gen fonksiyonlarını inceleyebiliriz. Bu potansiyel embriyonik öldürücü mutant fenotiplerden uzuvların kurtarılmasını sağlar. CRISPR / Cas mikroenjeksiyon son derece mutant hayvanlar üretebilir iken, bu tür hayvanlar genellikle son derece mozaik, yabani tür alel tutma bir dereceye kadar ve hedeflenen sitelerde farklı mutasyonlar çeşitli14,20. Haploid hücrelerde CRISPR tabanlı mutagenez, tutulan yabani tip aleller tarafından maskelenemedikleri için tek alel kaybı-fonksiyon mutasyonlarının penetrasyonunu artırır. Bu nedenle, haploid hücre hatlarında CRISPR tabanlı tarama giderek birçok hücresel süreçlerin genetik temelini araştırmak için kullanılır21,22,23. Bizim haploid ekstremite tomurcuk aşılama protokolleri ile CRISPR tabanlı soy izleme birleştirerek, burada açıklanan yaklaşım canlı hayvanlarda haploid genetik ekranlar için bir platform olarak hizmet verebilir20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokolde kullanılan deneysel prosedürler Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC, 2017-10557) tarafından onaylanmış ve omurgalı hayvanların kullanımına ilişkin tüm federal politika ve yönergelere uygun olarak uygulanmaktadır. Tüm hayvan deneyleri Ambystoma mexicanum (aksiyotl) üzerinde Yale Üniversitesi'ndeki tesislerde yapılmıştır.

1. Diploid Embriyo Üretimi

  1. Bir veya iki gfp ebeveyn24kullanarak doğal çiftleştirme yoluyla greft konakları olarak hizmet vermek için GFP + diploid embriyolar edinin.
  2. Taze döşenmiş diploid yumurta toplamak ve metal bir elek yerleştirin.
  3. Yumurtaları %40 Holtfreter çözeltisi ile iyice durulayın (20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH 7.4).
  4. Yumurtaları taze %40 Holtfreter çözeltisi içinde yerleştirin ve 12 °C'de saklayın.
    NOT: Diploid embriyolar her zaman haploid embriyo üretimine geçmeden önce alınmalıdır.

2. Haploid Embriyo Üretimi

  1. Kadın gamet donör hazırlık
    1. 48 h in vitro aktivasyon yapmadan önce, 1 g / L HEPES-tamponlu MS-222 daldırma tarafından cinsel olgun beyaz veya beyaz / RFP kadın aksiyotl anestezi küçlükte 40% Holtfreter çözeltisi25.
    2. Başparmağın ve işaret parmağının arasına kuyruğunu sıkıca sıkıştırarak yaklaşık 30 dakika daldırmadan sonra hayvanın tamamen anestezi altında olduğundan emin olun. Tamamen anesteziedilmiş hayvanlar herhangi bir çimdik için fiziksel olarak yanıt vermez.
    3. Steril salinde 10.000 U/mL içeren insan koryonik gonadotropin (HCG) çözeltisi hazırlayın.
    4. 30 G insülin şırıngası kullanarak, omurilikle temasından kaçınmak için 45° açıyla anestezili dişinin arka ekstremitesine 0.15 CC HCG (1.500 ünite) enjekte edin.
    5. Dişiye taze %40 Holtfreter çözeltisi getirin ve 8−12 °C'lik bir buzdolabına yerleştirin.
    6. 48 saat sonra, oda sıcaklığına kadın geri dönün. Yumurtlama yüzeyleri olarak onu konteyner birkaç taş veya plastik bitkiler yerleştirin.
      NOT: HCG enjekte edilen dişiler genellikle yumurta bırakmadan önce birkaç saat boyunca boş jöle kutularını yatırır.
    7. Dişi sürekli yumurtlama başladıktan sonra taşlar veya plastik bitkiler çıkarın.
    8. Dişinin boş tankta 30 dk ile 1 saat arasında oturmasını bekleyin.
      NOT: Hayvanın yumurtlayabilmesi için malzemelerin saklanmasını yumurta toplamanın daha sıkı kontrol edilmesine olanak sağlar.
  2. Erkek gamet koleksiyonu
    1. Dişinin yumurtlama durdu iken, bir cinsel olgun GFP + erkek aksitotize bir sperm donör olarak hizmet etmek, adım 2.1.1 gibi.
    2. Tamamen anestezi altındaki erkeği, diseksiyon mikroskobunun altında nemli kağıt havluların üzerine sırtına yerleştirin.
    3. Deneyci sağ el kullanıyorsa, p1000 pipetin ucunu sağ elinizle cloaca'nın tabanına yerleştirin.
    4. Sol elin sol işaret parmağını ve baş parmağını pelvis'e 2−3 cm rostral yerleştirin. Spermik idrar örneklerini temizlemek için parmakları arka bacaklara doğru hareket ettirirken hayvanı hafifçe sıkın.
    5. Tek bir mikrosantrifüj tüp içine cloaca dışarı atılır her toplamak. 6 ila 10 örnek toplamak için bu işlemi tekrarlayın.
    6. Pipet 5.0 μL ters bir mikroskop kullanarak sperm kalitesini incelemek için bir petri kabı üzerine her örnekten.
      NOT: Konsantre sperm örnekleri süt beyazı rengidir, genellikle 5 ila 20 μL arasında değişir ve genellikle birkaç, daha yüksek hacimli spermik idrar örnekleri alındıktan sonra alınır. Sperm, rahatsız edilmeden bırakıldığında daha yüksek hacimli numunelerde tüplerin alt kısmında toplanır. Sağlıklı sperm konsantre örnekleri son derece hareketli ve konsantrasyonu azaldıkça aktivite kaybedersiniz. Sağlıklı erkekler 50 μL'ye kadar konsantre sperm üretebilirler.
  3. Kadın gamet koleksiyonu
    1. Sağlıklı bir sperm örneği elde ettikten ve doğruladıktan sonra, adım 2.1.1'deki gibi HCG enjekte edilen dişi aksolotl'ı anesteziedin.
    2. Tamamen anestezili dişiyi sırtındanemli kağıt havlulara yerleştirin.
    3. Adım 2.2.4 benzer bir el hareketi kullanarak dişiden döllenmemiş yumurta ayıklayın.
    4. Islbeyaz forceps kullanarak yumurta toplamak ve 10 cm petri çanak aktarın. Toplama 15 dakika içinde ışınlanmış sperm ile yumurta tedavi.
  4. Erkek gamet hazırlama ve in vitro aktivasyon
    1. Spermi yukarı ve aşağı pipetlemek için P10 veya P20 pipeti kullanın, homojen bir süspansiyon oluşturmak için kümeleri ayırın.
    2. Bir petri kabı kapağına veya cam kaydırağa seyreltilmemiş sperm süspansiyonunun 0,5 μL'lik bir damlasını yerleştirerek ve ters bir mikroskopla inceleyerek hareketli sperm yüzdesini yaklaşık olarak tahmin edin.
    3. 0.1x Marc'ın modifiye Ringer çözeltisi (MMR; Malzeme Tablosu) 20x sperm seyreltme yapmak için bu örnek. Yavaşça pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için.
    4. Ters bir mikroskopla, seyreltilmemiş süspansiyonun sperm konsantrasyonunu tahmin etmek için spermi petri kabı kapağıveya hemositometre üzerinde 20x seyreltilmiş aliquot'un üç 1.0 μL damlasında sayar.
    5. Orijinal sperm örneğinin bir aliquot'unu steril 0.1x MMR'de yaklaşık 80.000 hareketli hücre/mL'ye seyrelterek spermi ışınlama için hazırlayın.
    6. Son 15 dk içinde elde edilen yumurta sayısını sayın. Yumurta başına 2,4,5 adımdan petri kabına taze seyreltilmiş spermin 0,5 μL'sini ekleyin. Bu süspansiyonu 1 mm kalınlığında bir tabaka içine yaymak için pipet ucunu kullanın.
    7. Plastik bir asansör kullanarak, 254 nm crosslinker ampuller örnek 4 cm yerleştirin. 800.000 uJ/mm2ile numuneyi ışınlayarak spermi genetik olarak inaktive edin.
    8. P10 pipeti kullanarak, döllenmemiş yumurtaların üzerine süspansiyon uyguluyor, her yumurtayı 0,25−0,5 μL ışınlanmış spermle kaplayın. Yumurta 30 dakika oda sıcaklığında oturup bekleyin.
    9. 30 dk sonra, 0.1x MMR ile yumurta sel. Yumurtaları hemen ertesi gün enjeksiyonlar için 8−10 °C'lik bir kuluçka makinesine veya aktivasyon sonrası 7 saat (hpa) içinde enjeksiyonlar için 18 °C'ye yerleştirin.
    10. Dejelly haploids hidrasyon sonra keskin forceps 30 dk kullanarak. Yumurtaları hemen ertesi gün enjeksiyonlar için 8−10 °C'lik bir kuluçka makinesine veya aynı gün enjeksiyonlar için 18 °C'ye yerleştirin.

3. Haploid Mutagenez ve Bakım

  1. CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyonları
    1. CRISPRscan kullanarak sgRNA'lar tasarla ve26,27sentezleyin.
    2. Multipleks mutagenez için 5 sgRNA (her sgRNA için 10 ng/μL) ve Cas9 proteini (1 μg/μL) stokhazırlayın. Enjeksiyon için bu stoğun 100 kat seyreltilmesini (sgRNA başına 0,1 ng/μL, 10 ng/μL Cas9) hazırlayın. Tek gen için, yüksek mutasyon sıklığı mutagenez, daha önce özetlenen protokolü izleyin28.
    3. Haploid embriyoları tek hücre evresinde enjekte edin 7 hpa eğer 18 °C'de depolanırsa veya ertesi gün 8−10 °C'de depolanırsa 2−8 hücreli evrede embriyo enjekte edin.
    4. Embriyoları %20 polisökroz 400 ile 1.0x MMR'ye aktarın.
    5. Tek hücreliise, her embriyoya toplam 0,5 pg/sgRNA ve 50 pg Cas9 proteini içeren enjeksiyon çözeltisinin 5 nL damlasını (yumurtanın yaklaşık 1/4 yarıçapı) enjekte edin. Çok hücreli ise, birden fazla hücreiçine küçük hacimler enjekte ederek bu kitle dağıtmak.
    6. Embriyoların en az 4 saat ve 18 °C'de en fazla 18 saat boyunca polikroz 400'de iyileşmesini bekleyin.
  2. Haploid embriyo konut
    1. Embriyoları antibiyotik antimikotik ile 0.1x MMR'ye aktarın.
    2. House her embriyo 24-well plaka bireysel bir kuyuda, bazı ölecek ya da anormal gelişir gibi. 16−18 °C'de koruyun. Daha düşük sıcaklıklar, gerekirse gelişimi uzatmak için kullanılabilir.
    3. Her gün yeni 0.1x MMR ile antibiyotik antimikotik ortamı değiştirin.

4. Diploid Konak Embriyo Hazırlama

  1. Embriyoları jöle kaplamada 22-26 evreye ulaşana kadar 12 ila 16 °C'de saklayın.
  2. Aşılamaya hazır embriyoları toplayın, bir elek (4 mm örgü boyutu) içine yerleştirin ve %40 Holtfreter çözeltisi ile hafifçe durulayın.
  3. Embriyoları 2 dakikaya kadar %1,5 çamaşır suyu içeren filtre sterilize edilmiş 0,1x MMR'ye aktarın. embriyolar üzerinde mevcut.
  4. 2 dakika sonra, eşit miktarda filtre sterilize edilmiş 0,1x MMR ile embriyoları içeren çamaşır suyu çözeltisini seyreltin.
  5. Embriyoları yavaşça çamaşır suyu temizlenmiş bir eleve dökün (4 mm örgü boyutu) ve embriyoları filtre ile sterilize edilmiş 0,1x MMR ile beş kez durulayın.
  6. Embriyoları dejellying için antibiyotiklerle 0.1x MMR ile steril 10 cm petri kaplarına yerleştirin (penisilin 100 ünite/mL, streptomisin 100 μg/μL, 0.25 μg/mL, gentamicin 25 g/mL).
  7. Floresan stereomikroskop altında, gfp + embriyolardan jöle kat ve vitellin membranları keskin forceps (uç boyutları 0.05 x 0.01 mm2)kullanarak çıkarın.
  8. GFP+ embriyolarını yeni bir petri kabına aktarın. Dejellied edildi petri kabından transfer sıvı miktarını en aza indirin.
  9. GFP+ konak embriyolarını steril 0.1x MMR ile 4-6 kez antibiyotikle durulayın.
  10. Aşılamadan önce temiz embriyoları bir gecede 4 °C'ye yerleştirin.
    NOT: Embriyoların soğutularak mezodermin endodermden daha sert ve temiz ayrılması nı mümkün kınıkyapar.

5. Haploid-diploid Chimera Üretimi

  1. Cerrahi yemek ve ortam hazırlığı
    1. Steril 35 mm kolay kavramalı petri kaplarına 0,1x MMR'de otoklav %2 agarose dökerek steril cerrahi ameliyat tabakları hazırlayın. Petri tabaklarını agarose ile yarıyolda doldurun.
    2. Agarose soğuduktan sonra, embriyoları yerinde tutmak için agarose'da 25 mm uzunluğunda, eğimli bir çukuru kesmek için steril bir neşter kullanın.
    3. Yemeği steril cerrahi ortamla doldurun (0.1x MMR anti-mikoplazma 2.5 g/mL, amphotericin B 0.25 g/mL ve siprofloksasin 10.0 g/mL) ve 4 °C'de buzdolabında bekletin.
  2. Embriyo aşılama prosedürü
    1. Bir veya iki aşamalı GFP + diploid konak embriyoları ile bir sağlıklı haploid donör cerrahi ortam içeren prechilled işletim çanak yalak içine yerleştirin(Şekil 3).
      NOT: İşlemi mümkünse soğutma aşamasında (10 °C veya daha düşük) gerçekleştirin.
    2. İki ultra ince, otoklavlı forceps kullanın (düz uç, uç boyutları 0.05 x 0.02 mm2) merkeze yakın ekstremite tomurcuk ile ana konaktan ektoderm ve mezoderm katmanları kaldırmak için(Şekil 4).
      NOT: Dikdörtgen doku grefti bölge ekstremite tomurcuk kapsar ve dokuzuncu somite solungaç şişkinlik arka yarısına kadar uzanır, yaklaşık 2 mm, ön posterior eksen boyunca. Dorsoventral eksen boyunca, aşılanmış bölge yaklaşık 1,5 mm'ye yayılır, solungaç çıkıntısının hemen ötesine kadar somitler de dahil olmak üzere. Aşılı bölge altta yatan endoderm rahatsız etmeden, tüm lateral plaka mezoderm ve somitlerin lateral yarıları içerir. Ayrıntılar için Şekil 4 ve beraberindeki videoya bakın.
    3. Konak dokusunu bir kenara koyun ve aynı yöntemleri kullanarak haploid donörden eşit büyüklükte bir doku tabakasını çıkarın.
    4. Donör embriyonun ilgili bölgesine haploid donör doku sayfasını yerleştirin.
    5. Ezilmiş bir mikroskop kapağı camından otoklavlı, dikdörtgen cam la kaplayarak ve yavaşça konak embriyo vücuduna bastırarak dokuyu sabitlayın.
    6. İkinci konak embriyo için ekstremite tomurcuk hasat için diğer tarafına haploid donör embriyo çevirin. 5.2.2 ile 5.2.5 adımlarını yineleyin.
    7. Dikkatle çanak kalan aşırı konak dokuları ve donör embriyo kaldırın.
    8. 60−75 dk boyunca cam kırık çapaları ile greftleri yerinde bırakın, camın kaydığından emin olmak için her 20 dakikada bir kontrol edin.
    9. Doku greftleri tamamen yapışdıktan sonra, yavaş yavaş cam kırık çapa soymak için çalgılar kullanın.
  3. Chimera bakım
    1. Engrafted embriyoları taze cerrahi ortama aktarın ve iyileşmek için bir gecede 8−12 °C'de muhafaza edin. Tek tek 12 veya 24-iyi plakalar engrafted embriyolar ev.
    2. 36−48 h sonra, engrafted embriyolar steril 0.1x MMR antibiyotik-antimikotik transfer. Cerrahi ortamdaki güçlü antibiyotikler 3 gün sonra engrafted embriyolarda toksisiteye neden olur.
    3. Her 2−3 günde bir ortamı taze 0,1x MMR ve antibiyotiklerle değiştirin.
    4. Engrafted embriyolar 18 °C'de28'ibesleyene kadar koruyun.
    5. Geliştirme ve bakım 1 ila 2 ay sonra, haploid uzuvlar floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak greft saflığı için puan olabilir.
      NOT: Ekstremitelerde nöral olmayan veya kan dışı konak kaynaklı GFP-dokusunun varlığı saf olmayan greftlemenin bir göstergesidir ve genellikle anormal ekstremite gelişimi ile ilişkilidir. Bu hayvanlar daha fazla analiz dışında tutulmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gelişmekte olan haploid embriyolar diploid embriyolardan 'haploid sendrom' fenotip29ile ayırt edilebilir. Greft aşamasında, haploid embriyolar anterior-posterior ekseni boyunca azaltılmış eğrilik ve sarısı fişinin eksik muhafazası sergilerler(Şekil 3A). Bir floresan mikroskop haploid embriyolar baba kaynaklı GFP ekspresyonu ücretsiz olduğundan emin olmak için kullanılabilir (Şekil 3B).

Greftler temiz olduğunda, GFP ekspresyonu öncelikle brakiyal pleksus ile sınırlandırılmalıdır, şekil 2'degörüldüğü gibi konağın omuriliğinden türetilen sinir ağı. Punctate GFP ekspresyonu da duyusal nöronlar ve kan kaynaklı konak hücreleri gibi görünen tek hücrelerde mevcut olacak, gelişmekte olan ekstremite içine göç. RFP+ donörleri kullanıldığında, haploid greft uzuvları RFP'nin evrensel ekspresyonunu gösterir (Şekil 1B'). Gelişim boyunca, mutajenize olmayan haploid uzuvlar boyut uyumlu şimerik hayvanlardaki karşıt diploid forelimblerden anlamlı olarak daha kısadır (Şekil 1B, Şekil 1B've Şekil 5, n = 16 uzuv çiftleri, haploid ortalama = 0,522 cm, SD = ± 0,087 cm, diploid ortalama = 0,667 cm, SD = ± 0,069 m, eşleştirilmiş T-test p-değeri < 0,0001, ortalama oran = 0,784, SD = ± 0,113). Non-mutajenize olmayan haploid ekstremiteler de tamamen yenilenir (4/4 haploid ve 4/4 diploid komple rejenerasyon, Şekil 6), diploidlere göre dijital büyüme aşamasına ulaşmada hafif bir gecikme gösterseler de (n = 4 haploid, n = 4 diploid; ampütasyondan 23 gün sonra: haploidler = 3 palet ve 1 dijital büyüme evre uzuvları; diploidler = 4 dijital büyüme evre uzuvları).

Başarılı aşılama uygulama gerektirir ve tutarlılık teknisyenin mikromanipülasyon becerilerine ve steril tekniğine bağlı olarak değişir. Başarısız ve saf olmayan greftler Şekil 7 ve Şekil 8'degörüldüğü gibi çeşitli fenotipler üretirler. Elimizde yaklaşık %38.7 (SD = ± %8.78) yumurtaların normal gelişmiş haploid embriyolara ve %11.1'ine (SD = ± %5,46) gelişir. tüm haploid-diploid greftler normalde gelişmiş, temiz aşılanmış haploid ekstremiteler ile canlı hayvanlar üretirler(Şekil 9).

Figure 1
Şekil 1: Protokole genel bakış ve bir şimerik axolotl örneği. (A) Şematik haploidler ve simerik embriyolar oluşturmak için diploid konak embriyolar, sperm ve yumurta elde etmek için atılan adımların göreceli zamanlama özetleyen. (B) Bir RFP+ haploid embriyodan GFP+ diploid konak(B') Aynı 8 cm juvenil aksolotl'un yeşil ve kırmızı floresan görüntülerinin yerleştirilmesine embriyonik ekstremite tomurcuk greftleme ile üretilen bir juvenil aksolotl'un kompozit parlak görüntüsü. Haploid ekstremite brüt normal, ama karşıt diploid ekstremiteden daha kısadır. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Normalde gelişmiş ve temiz aşılanmış haploid ekstremitenin floresan görüntüsü. GFP- haploid ekstremite GFP + diploid konak aşılanmış spinal sinirler ekstremite innerve ile sınırlı gibi görünen GFP ifade deseni gösterir (sarı ok) ve bireysel duyusal nöronlar ve kan türetilmiş hücreler (beyaz oklar). Resimdeki uzuv 4 cm'lik bir yavruya aitti. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Diploid ve haploid embriyoların karşılaştırılması. (A) Diploidlerin (solda) ve haploidlerin (sağda) ışık görüntüsü. Azaltılmış AP ekseni eğriliği ve haploid embriyoların çıkıntılı endoderm (beyaz oklar) dikkat edin. (B) Aynı embriyoların yeşil floresan görüntüsü. GFP- haploidler gfp-dişi ve ışınlanmış sperm bir GFP + yumurta kullanılarak oluşturuldu. Diploidler GFP+'dır. Resimdeki embriyolar yaklaşık evre 2530'dır. Evreleme serisi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Bir haploid ekstremite tomurcuk greftinin kapsamını özetleyen şematik. (A) Evre 25 haploid embriyonun lateral görünümü. Noktalı çizgiler, solungaç şişkinliği ve ekstremite tomurcuk göre, nakledilmesi gereken yaklaşık alanı gösterir. (B) 25. Noktalı çizgiler, konaktan alınması ve ilgili haploid donör dokusu ile değiştirilmesi gereken yaklaşık alan ve doku tipleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Haploid ve diploid ekstremite uzunluklarının karşılaştırılması. (A) Benzer büyüklükteki 16 şimofik hayvanın haploid uzuvlarının (pembe) ve karşıt diploid uzuvlarının (yeşil) uzunluklarının dağılım konusu (haploid ortalama = 0,522 cm, SD = ± 0,087 cm, diploid ortalama = 0,667 cm, SD = ± 0,069 cm). Uzuvlar zeugopod tabanından 2 ve 3 basamaklı birleştiğine kadar ölçüldü. (B) Haploid ekstremite uzunluğunun 16 hayvanın diploid ekstremite uzunluk oranlarına dağılım konusu (ortalama oran = 0,784, SD = ± 0,113 cm). (C) Ölçülen 16 kimeranın vücut uzunluklarının (cm) dağılım çizimi (ortalama hayvan uzunluğu = 8,72 cm ± 0,456 cm). Hayvanlar, snenin ucundan kuyruk ucuna kadar ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Haploid ve diploid ekstremitelerde rejenerasyon karşılaştırması. (A) Haploid ekstremite öncesi amputasyon. (B) Rejenerasyon sonrası aynı haploid ekstremite. (C) Diploid ekstremite öncesi amputasyon. (D) Rejenerasyon sonrası aynı diploid ekstremite. 4/4 haploid ekstremiteler ve 4/4 diploid ekstremiteler normal morfoloji ile rejenere. Siyah noktalı çizgiler ampütasyon düzlemini gösterir. Ölçek çubukları = 1 mm. Büyüklük uyumlu yavru hayvanlarda (8,5 cm) ampütasyonlar yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Haploid uzuvların normal ve anormal gelişimine örnekler. (A) Ağır normal morfolojisi olan bir haploid ekstremite. (B-E) Haploidin tam gelişimini desteklemeyen greft örnekleri. (B) Oligodactyly. (C) Daha şiddetli oligodactyly. (D) Farklı dijital yapılar bulunmamaktadır. (E) Uzuv yok. Resimdeki uzuvlar benzer büyüklükteki gençlere aittir (8.0-10 cm). Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Saf olmayan haploid ekstremite greftlerinde GFP+ hücrelerine örnekler. (A,A') Deride GFP+ diploid hücreler ve floresan mikroskopi ile ortaya çıkan dermis (beyaz kesikli anahat) ile morfolojik olarak normal haploid greft ekstremite. (B,B') GFP+ diploid hücreleri ile greftli anormal haploid ekstremite dermis ve deri (beyaz anahat) için yoğun katkıda bulunur. (C,C') Epidermisin GFP+ diploid hücrelerle değiştirildiği aşılanmış anormal haploid ekstremite (beyaz anahat). Resimdeki uzuvlar benzer büyüklükteki gençlere aittir (8.0 ila 10.0 cm). Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Haploid embriyo ve haploid ekstremite oluşumunun başarı oranları. (A) İn vitro aktivasyon kullanılarak üretilen canlı haploid embriyoların yüzdesi. Veriler beş bağımsız in vitro aktivasyon deneylerinden toplanmıştır. Yeşil, aşılama için kullanılabilecek evre 25 haploid embriyo (ortalama = %38.7, SD = ± %8.78) üretilen yumurta fraksiyonunu gösterir. Gri, bölünme belirtisi göstermeyen, canlı olmayan veya gelişme de normal olan yumurta ların fraksiyonunun olduğunu gösterir. (B) Normalde gelişmiş, temiz aşılanmış haploid uzuvların yüzdesi. Mor, temiz, normalde gelişmiş haploid uzuvlar (ortalama = %11,1, SD = ± %5,46) greftlerin fraksiyonunu gösterir. Yeşil, normal olarak gelişen ancak GFP+ konak dokularını kirleten ekstremiteleri gösterir (ortalama = %11.3, SD = ± %8.64). Kırmızı, normal gelişmemiş greft uzuvlarını gösterir (ortalama = %27.1, SD = ± %30.3). Mavi, ekstremite gelişimini tamamlamak için hayatta kalamayan tüm aşılanmış embriyoları ve hayvanları gösterir (ortalama = %50.5, SD = ± %31.2). Aşılı hayvanların kaybı geç embriyonik ve larva evrelerinde dağıtıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Haploid-diploid kimeralar üretmek için protokolümüzde, işletme teknisyeninin tutarlı aşılama sonuçları için göz önünde bulundurması gereken birkaç kritik adım vardır.

Haploid neslin başarısız olmasının en olası nedeni in vitro aktivasyon koşullarının zayıf olmasıdır. Hareketli sperm uygun miktarlarda yumurta etkinleştirmek için kullanılmalıdır. Hareketliliği uzatmak için sperm örnekleri her zaman 4 °C'de muhafaza edilmelidir. Yumurtalara herhangi bir sperm örneği uygulamadan önce, ters bir mikroskop kullanarak spermin canlılığını kontrol edin. Tamamen hareketli olmayan spermler asla kullanılmamalı ve konsantrasyon 80.000 hareketli hücre/mL'ye ayarlanmalıdır. Aktivasyon aşamasında çok fazla sperm de normal yumurta gelişimini önleyebilir. Yumurta yüzeyinde küçük, koyu girintiler olarak görünen sperm çukurları, bir sperm hücresinin yumurtaya nüfuz ettiğini ve genellikle sperm uygulandıktan sonra 20-60 dk göründüğünün fiziksel bir göstergesidir. On veya daha fazla sperm çukuru olan yumurtalar düzgün aktive olmayabilir.

Döllenmemiş yumurtalar, su altında yumurtlandıktan sonra 15 dakika içinde toplanıp kuru petri kabına yerleştirilirse ve sperm uygulamasından önce kağıt havlularla iyice kurutulursa aktif hale getirilebilir. Alternatif olarak, videoda gösterildiği gibi, yumurta bir hormon enjekte kadın sıkılmış olabilir. Biz düzenli olarak her iki yöntemi istihdam rağmen biz, bu "kuru" yumurta, daha tutarlı sonuçlar vermek bulabilirsiniz.

Başarılı aşılama uygun şekilde sahnelenen haploid ekstremite tomurcuk dokusu ile diploid embriyoların uygun kaplin gerektirir. Bu protokol, aşama eşleştirmesini sağlamak için bir dizi önlem içerir. Doğal çiftleşme her zaman yumurtlama ile sonuçlanmadığı için, haploid oosit elde etmek için HCG enjeksiyonu doğal olarak çiftleştirilmiş dişi diploid yumurta bırakmaya başlayana kadar yapılmamalıdır. Bu enjeksiyondan sonra, indüklenen dişi daha düşük sıcaklıkta (8 ila 12 °C) yerleştirilmelidir, bu da yumurtlama oranını azaltacaktır. Normal sıcaklıklarda hormon lu dişinin barınması yumurtaların çoğunun kısa sürede yumurtlanmasına neden olabilir. Soğutulmuş bir kadın da yumurtlama yumurta başlangıcı kadın anestezi ve yumurta çıkarma için hazır olduğunu gösterir. Oosit aktivasyonu, oosit ekstraksiyonundan sonraki 15 dk içinde gerçekleşmelidir. Aktif haploid embriyolar, doğal olarak üretilen diploid embriyoların birkaç gün gerisinde olacağından, diploid embriyoların 12 °C'de kuluçkaya yatırılmasını ve haploidlerin göreceli gelişim oranını 18 °C'de kuluçkaya yatırmanızı öneririz. HCG enjeksiyonu ile indüklenen dişilerin yumurtlanması arasındaki aralıkta bazı farklılıklar olacağından, aşılama sırasında konak ve donör embriyoların evrelemesinin eşleştirilmesi için haploid veya diploidlerin kuluçka sıcaklıklarında hafif ayarlamalar gerekebilir. Embriyolar aşılamadan önce birkaç saat boyunca 4 °C'ye soğutulmalıdır ve bu gelişmeyi neredeyse bozar. Aşılama dan önce soğuyen haploid ve diploid embriyoların başlangıç süresinin farklı olması evre eşleştirmeyi sağlayabilir. Haploid embriyolar morfolojik olarak diploidlerden farklılık gösterirken, nöral kıvrımlar kapandıktan ve embriyolar yanlarından biri yattıktan sonra hem haploidler hem de diploidler 21. Diploidler gibi evre 25 haploid embriyolarda da belirgin solungaç ve pronefilorik çıkıntılar vardır. Büyük baş haploidlerde vücuda göre bir açıda çıkıntı, bu büyük ölçüde evre göre azalır rağmen 25 diploid embriyolar, olan kafaları neredeyse dik açıda vücuttan çıkıntı30.

Steril teknik, başarılı doku greftleme için kesinlikle önemlidir. Steril koşullar haploid nesil den kimeraların embriyonik gelişimi ile deneyin tamamı boyunca muhafaza edilmelidir. İşlemin başlangıcında kirletici organik madde miktarını en aza indirmek için tüm ana hayvanları yumurta yatırma döneminde temiz ve sistem dışı su koşullarında tutmanızı öneririz. Tüm süreç boyunca ölen veya ölmekte olan embriyoların tutarlı, günlük olarak çıkarılması diğer embriyoların sağlığını korumak için önemlidir. Çapraz kontaminasyonu en aza indirmek için tüm haploid ve kimera embriyolarını ayrı ayrı barındırmasını öneriyoruz.

Embriyonik mikrodiseksiyon ve doku greftleme becerileri uygulama yoluyla kazanılır. Aşılama işlemi sırasında, uzuv tomurcuk kendini delmek veya yırtMak için değil önemlidir. Ev sahibi ve donör embriyolardan uzaklaştırılan dokular, tamponlama bölgesi sağlamak için, resimde olduğu gibi, ekstremite tomurcuk ötesine uzanmalıdır. Doku bir alan çok küçük aşılanmış ise, haploid uzuvlar GFP + diploid deri ve diğer dokular tarafından infiltrasyon olacaktır.

Bu aşılama tekniğinin sınırlamalarından biri, uzuvlarda nöral doku ve kan konak vücuttan türetilmiştir olmasıdır. Birkaç nadir durumlarda, biz tamamen GFP tüm belirtileri eksikliği aşılı haploid uzuvlar oluşturmak mümkün olmuştur + sinirleri ifade. Bu gibi durumlarda, ev sahibi hayvandaki nöral dokunun yeterlisini donörünkiyle değiştirmeyi başardık. Ancak, bu tür kapsamlı aşılama zor, güvenilmez, ve genellikle ekstremite dışında gelişimsel anormallikler üretir.

Haploidi axolotl embriyonik ölümcüldür. Benzer şekilde, ekstremite gelişimi ve yenilenmesi için potansiyel olarak gerekli olan birçok gendeki mutasyonlar da erken embriyonik ölümcüldür. Protokolümüz deneysel uzuvların üretimi için haploidin embriyonik öldürücülüğünü atlar ve aday rejenerasyon geninin mutasyonunun embriyonik öldürücü fenotip ürettiği durumlarda da kullanılabilir. Bizim ekstremite tomurcuk aşılama tekniği bu karşı daha önce açıklanan ekstremite tomurcuk ve katkıda doku greftleme yöntemleri gerçekleştirmek için bir avantaj sağlar, erken embriyonik gelişim sırasında yapılır ve tam ektoderm ve mezoderm katmanlarının nakli içerir1,2.

Haploid ekstremite tomurcuk greftleme daha önce tanımlanmıştır; ancak, bu önceki çalışmada, haploid ekstremite tomurcukları ektotik31aşılı edildi. Bu greftlerden elde edilen ektopik uzuvların mikroskobik nükleer analizi, diploid dokunun geniş katkılarını ortaya koymuştur. Bu uzuvlar anormal bir şekilde gelişirken,31'iniyeniden oluşturabildiler. Ektopik ekstremite tomurcuklarını aşılamak yerine, tüm endojen ekstremite tomurcuklarını eşdeğer haploid dokularla değiştiriyoruz. Floresan belirteçleri kullanımı sayesinde, biz görsel olarak diploid katkıları ücretsiz haploid uzuvları tespit edebiliyoruz, sinir ve kan hücreleri hariç, haploid ekstremite kendisi ödün vermeden. Haploid uzuvların normal bir şekilde geliştiğini ve yenilediğini görüyoruz. Ancak, GFP + konakladığı uzuvlar nöral ve kandan elde edilen hücreler dışındaki dokulara katkıda bulunurlar ve genellikle anormallikler gösterirler. Bu nedenle, haploid ekstremitelerde gen fonksiyonu araştırılırken, bir genotip mutant haploid ekstremitelerde gözlenen herhangi bir fenotip ile ilişkilendirilemeden önce aşırı konak katkıları olanlar analizden çıkarılmalıdır.

Son yenilikler, axolotl genom ve son CRISPR / Cas tabanlı ekleme yöntemleri15montaj gibi,16,32, önemli ölçüde axolotl genetik dövülebilirlik genişletti. Genetik manipülasyonları zamansal ve mekansal olarak kısıtlama yöntemleri büyük umut vaat eder, ancak mevcut uygulamaları hayvan hatları oluşturmak, barındırmak ve dağıtmak için gereken kaynaklarla sınırlıdır. Burada ayrıntılı protokol, genlerin genetik tedirginliklerinin sonuçlarının ekstremite gelişimi ve yenilenmesinde araştırılabilen süreci hızlandırır. Uzuvların yenilenmesinde güncellenmekte bulunan genlerin çoğunun çok az karakterizasyonu olmuştur ve bu genler çeşitli temel gelişimsel ve hücresel süreçlerde yer alabilir. Ekstremite yenilenmesi için gerekli olan birçok genin de ekstremite gelişimi için gerekli olacağını tahmin ederken, bu yöntem rejenerasyona karışan genlerin rejenerasyona özgü fonksiyon kaybı fenotiplerine sahip olup olmadığını ortaya çıkarabilir. Axolotls CRISPR / Cas mutagenez genellikle korunmuş yabani tip alelleri içeren allelik mozaik üretir, ve bu mozaik kendisi ölçülebilir bir fenotip olarak kabul edilebilir20. Amputatlı orijinal ve rejenere uzuvların Yeni Nesil Sıralamasını kullanan araştırmacılar, yenilenme den sonra tercihen kaybolan bir gendeki mutasyonlara sahip haploid hücrelerin kaybolup olmadığını ölçebilirler. Bu yaklaşım, aksi takdirde temel gelişimsel genlerin tedirginliği ile üretilen rejenerasyon fenotiplerinin araştırılmasına izin verebilir.

Haploid fonksiyon kaybı genetik ekranlar biallelik mutant hücre hatları kurmak için gerek kalmadan birçok biyolojik süreçlerin genetik kökenlerinin araştırılmasını kolaylaştırmak. Haplogenez, CRISPR/Cas9 mutagenezve ekstremite tomurcuk greftleme birleştirerek, yaşayan bir hayvanda ekstremite gelişimi ve rejenerasyonunu araştıran haploid genetik ekran için yeni bir platform sağlıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Katherine Roberts'a axolotl kolonisine baktığı için teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışmanın finansmanı Connecticut Innovations Rejeneratif Tıp Araştırma Fonu (15RMA-YALE-09 ve 15-RMB-YALE-01) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (Bireysel Doktora Sonrası Burs F32HD086942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#55 Dumont Forceps Fine Science Tools 11295-1 Only use Dumostar material (can be autoclaved)
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML 20 mL
Antibiotic-Antimycotic 100x Thermo Fisher 15240062
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400) bioworld 40600032-3 Ficoll 400
Gentamicin Sigma Aldrich G1914-250MG
Heating/Cooling Incubator RevSci RS-IF-233
Human Chorionic Gonadotropin Merk Chorulon
Megascript T7 Transcription Kit Thermo Fisher AM1334 40 reactions
Miroscope Cooling Stage Brook Industries Custom Custom
NLS Cas9 Protein PNAbio CP01-200 4 vials of 50 µg protein each
Plasmocin Invivogen ant-mpt-1 Treatment level
Recipes
1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Holtfreter's solution 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
  3. McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
  4. Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
  5. Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
  6. de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
  7. Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
  8. Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
  9. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
  10. Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
  11. Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  12. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  13. Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
  14. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  15. Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
  16. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
  17. Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
  18. Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
  19. Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  20. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
  21. Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  22. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  23. Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
  24. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
  25. Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
  26. Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  28. Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
  29. Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
  30. Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
  31. Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
  32. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).

Tags

Genetik Sayı 155 axolotl haploid doku greftleme transplantasyon rejenerasyon ekstremite ekstremite tomurcuk kimera CRISPR Cas9 multipleks mutagenez
Embriyonik Greftleme Yoluyla Mutant Haploid Ekstremiteler ile Şemerik Axolotls Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, … More

Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, C. M. Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting. J. Vis. Exp. (155), e60156, doi:10.3791/60156 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter