Summary
Detta mål med detta protokoll är att producera chimära axolotls med haploida framben som härrör från Cas9-mutagena givare vävnad med embryonalvävnad ympning tekniker.
Abstract
En växande uppsättning genetiska tekniker och resurser gör det möjligt för forskare att undersöka de molekylära ursprunget till förmågan hos vissa arter av salamandrar, såsom axolotls, att regenerera hela lemmar som vuxna. Här beskriver vi tekniker som används för att generera chimära axolotls med Cas9-mutagena haploida framben som kan användas för att utforska genfunktion och trohet lem förnyelse. Vi kombinerar flera embryologiska och genetiska tekniker, inklusive haploid generation via in vitro aktivering, CRISPR/Cas9 mutagenesis, och vävnad ympning i ett protokoll för att producera ett unikt system för haploid genetisk screening i en modell organism av förnyelse. Denna strategi minskar antalet djur, utrymme och tid som krävs för funktionell analys av gener i lem förnyelse. Detta gör det också möjligt att undersöka regenereringsspecifika funktioner hos gener som kan krävas för andra viktiga processer, såsom organogenes, vävnadsmorfgenes och andra viktiga embryonala processer. Den metod som beskrivs här är en unik plattform för att genomföra haploid genetisk screening i en ryggradsdjur modellsystem.
Introduction
Historiskt sett har embryonal vävnad ympning i amfibier varit en viktig teknik för att utforska grundläggande mekanismer för utvecklingsbiologi och förnyelse. Axolotl, en art av salamander, har en imponerande förmåga att regenerera vävnader och komplexa strukturer som lemmar och organ efter skada eller amputation. På samma sätt kan de få, utan avslag, vävnadstransplantat från andra individer på embryonala, unga och vuxna stadier1,2,3. Regioner av embryon som producerar hela strukturer såsom lemmar, svansar, ögon och huvuden, och mer specifika vävnader, såsom neuroectoderm och somiter, kan ympas mellan embryon för att producera chimära djur1,2,4,5,6. I nästan ett sekel har studier av sådana chimärdjur gett avgörande insikter i förnyelse, vävnadsdifferentiering, storlekskontroll och mönster1,7,8.
Under det senaste decenniet har många transkriptionsstudier av regenererande vävnader gett insikter i de genetiska program som ligger till grund för salamanderförnyelse9,10,11,12,13. Dessa studier har lagt till en växande lista över kandidatgener som hittills till stor del är okarakteriserade i samband med förnyelse. Riktade mutagenestekniker, såsom CRISPR/Cas, tillåter nu undersökning av sådana gener, och sådana genetiska metoder underlättas i hög grad av den senaste tidens sekvensering och montering av den stora axolotlgenomet 14,15,16.
Vi försökte utveckla tekniker som kopplade klassisk utvecklingsbiologi med ny genetisk teknik i syfte att dissekera mekanismerna för förnyelse. Metoder för att generera haploida embryon från axolotler och andra salamandrar har fastställts i årtionden17. Även om dessa tekniker länge har noterats vara fördelarna med salamandrar som genetiska modellorganismer18,har få efterföljande genetiska studier införlivat haploida djur. Vi använder in vitro aktivering i axolotl att producera haploida embryon som fungerar som vävnadgivare för ympning19. Med hjälp av embryon som transporterar fluorescerande genetiska markörer har vi utarbetat tillförlitliga metoder för att generera lemmar som nästan helt härrör från donatorvävnader(figur 1A). Genom att kombinera dessa två tekniker har vi kringgått den sena embryonala dödligheten i samband med haploidisk, vilket möjliggör produktion av fullt utvecklade, ympade haploida lemmar(figur 1B, figur 1B'och figur 2).
Genom att genomföra CRISPR/Cas-medierad mutagenes i haploida embryon före ympning för att skapa chimära axolotls med mutanta haploid lemmar, kan vi undersöka genfunktion specifikt inom ramen för lem utveckling och förnyelse. Detta gör det möjligt att rädda lemmar från potentiellt embryonala-dödliga mutant fenotyper. Medan CRISPR / Cas microinjection kan generera djur som är mycket mutant, sådana djur är vanligtvis mycket mosaik, med en viss grad av retention av vildtyp alleler och en mängd olika mutationer på riktade platser14,20. CRISPR-baserade mutagenes i haploida celler ökar penetrans av enda allel förlust-of-function mutationer, eftersom de inte kan maskeras av kvar vildtyp alleler. Av denna anledning, CRISPR-baserad screening i haploid cellinjer används alltmer för att undersöka den genetiska grunden för många cellulära processer21,22,23. Genom att kombinera CRISPR-baserade härstamning spårning med våra haploid lem knopp ympning protokoll, den strategi som beskrivs här kan fungera som en plattform för haploid genetiska skärmar hos levande djur20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentella förfaranden som används i detta protokoll godkändes av Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017–10557) och var förenliga med alla federala riktlinjer och riktlinjer för användning av ryggradsdjur. Alla djurförsök utfördes på Ambystoma mexicanum (axolotls) i anläggningar vid Yale University.
1. Diploid Embryo Generation
- Få GFP + diploid embryon att fungera som moderplantor värdar genom naturlig parning med en eller två GFP föräldrar24.
- Samla nylagda diploid ägg och placera dem i en metall sikt.
- Skölj äggen noggrant med 40% Holtfreterlösning (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH till 7,4).
- Placera äggen i färsk 40% Holtfreters lösning och förvara vid 12 °C.
OBS: Diploidembryon bör alltid erhållas innan de går vidare till haploid embryogenerering.
2. Haploid Embryo Generation
- Kvinnlig gamete givare förberedelse
- 48 h innan du utför in vitro aktivering, bedöva en sexuellt mogen vit eller vit / RFP kvinnliga axolotl genom nedsänkning i 1 g / L HEPES-buffrad MS-222 i 40% Holtfreter lösning25.
- Se till att djuret är helt anestesiat efter cirka 30 min nedsänkning genom att ordentligt nypa svansen mellan tummen och pekfingret. Helt söcerade djur kommer inte fysiskt att svara på någon nypa.
- Förbered en lösning av humant koriongonadotropin (HCG) innehållande 10 000 E/ml i steril salin.
- Använd en insulinspruta på 30 G injicera, injicera 0,15 CC HCG (1 500 enheter) i muskulaturdorsala till den ymnade honans bakben vid 45° vinkel till mittlinjen för att undvika kontakt med ryggmärgen.
- Återför honan till färsk 40% Holtfreters lösning och placera i ett kylskåp på 8−12 °C.
- Efter 48 h, återför a-kvinnan till rumstemperatur. Placera några stenar eller plastväxter i hennes behållare som ytor för äggläggning.
OBS: Honor injiceras med HCG kommer ofta deponera tomma gelé fall i flera timmar innan ägg. - Ta bort stenar eller plastväxter efter att honan har börjat konsekvent lägga ägg.
- Låt honan sitta i den tomma tanken i 30 min till 1 tim.
OBS: Källmaterial för djuret att lägga ägg på kommer att möjliggöra hårdare kontroll av oocyte insamling.
- Manlig gamete samling
- Medan kvinnans ägg läggning är avstannat, anestesi en sexuellt mogen GFP + manliga axolotl att fungera som en spermadonator, som i steg 2.1.1.
- Placera den helt sfuktade hanen på ryggen på fuktiga pappershanddukar under ett dissekerande mikroskop.
- Om experimentet är högerhänt, placera spetsen på en P1000 pipett vid basen av cloaca med höger hand.
- Placera vänster pekfinger och tumme på vänster hand 2−3 cm rostral till bäckenet. Pressa försiktigt djuret medan du flyttar fingrarna mot bakbenen för att spola ut spermieurinprover.
- Samla varje som spolas ut ur klinnan i en enskild mikrocentrifug röret. Upprepa den här processen för att samla in 6 till 10 prover.
- Pipette 5,0 μL från varje prov på en petriskål för att inspektera spermiernas kvalitet med hjälp av ett inverterat mikroskop.
OBS: Koncentrerade spermier prover är en mjölkvit färg, vanligtvis varierar från 5 till 20 μL, och vanligtvis hämtas efter flera, högre volym spermieurin prover extraheras. Spermier kommer att samlas längst ner i rören i högre volym prover när de lämnas ostört. Koncentrerade prover av friska spermier är mycket rörliga och förlorar aktivitet som deras koncentration minskar. Friska män kan producera upp till 50 μl koncentrerad sperma.
- Kvinnlig gamete samling
- Efter att ha erhållit och bekräftat ett hälsosamt spermieprov, anestesi den HCG-injicerade kvinnliga axolotl som i steg 2.1.1.
- Placera den helt bedövade kvinnan på fuktiga pappershanddukar på ryggen.
- Extrahera obefruktade ägg från honan med hjälp av en handrörelse som liknar den i steg 2.2.4.
- Samla äggen med hjälp av våta pincett och överföra dem till en 10 cm petriskål. Behandla ägg med bestrålad sperma inom 15 min från samlingen.
- Manlig gamete förberedelse och in vitro aktivering
- Använd en P10 eller P20 pipett för att pipetta spermierna upp och ner, bryta isär klumpar för att bilda en homogen suspension.
- Ungefär andelen mald sperma genom att placera en 0,5 μL droppe outspädd spermiesuspension på ett petriskållock eller glasglas och undersöka med ett inverterat mikroskop.
- Tillsätt 9,5 μL 0,1 x Marcs modifierade Ringsignals lösning (MMR; Materialförteckning) detta prov för att göra en 20x spermieutspädning. Försiktigt pipettupp och ner för att blanda.
- Med ett inverterat mikroskop, räkna spermierna i tre 1,0 μL droppar av 20x utspädd alikvot på en petriskål täcka eller hemocytometer för att uppskatta spermier koncentrationen av outspädd suspension.
- Förbered spermierna för bestrålning genom att späda ut en alikvot av det ursprungliga spermieprovet till cirka 80 000 rörliga celler/ml i sterila 0,1 x MMR.
- Räkna antalet ägg som erhållits under de senaste 15 min. Tillsätt 0,5 μL av den nyutspädda spermierna från steg 2.4.5 per ägg till en petriskål. Använd pipettspetsen för att sprida denna suspension till ett 1 mm tjockt lager.
- Använd en plastlyft, placera provet 4 cm från lamporna på en 254 nm crosslinker. Genetiskt inaktivera spermierna genom att bestråla provet med 800 000 uJ/mm2.
- Med hjälp av en P10 pipett, pipette suspensionen på obefruktade ägg, beläggning varje ägg med 0,25−0,5 μL bestrålade spermier. Låt äggen sitta i rumstemperatur i 30 min.
- Efter 30 min, översvämma äggen med 0,1 x MMR. Placera omedelbart äggen i en inkubator på 8–10 °C för injektionsvätskor nästa dag eller vid 18 °C för injektionsvätskor inom 7 timmar efter aktivering (hpa).
- Dejelly haploider med vassa pincett 30 min efter hydrering. Placera omedelbart äggen i en inkubator på 8–10 °C för injektionsvätskor nästa dag eller vid 18 °C för injektionsvätskor samma dag.
3. Haploid Mutagenes och underhåll
- CRISPR/Cas9 mikroinjektioner
- Design sgRNAs med CRISPRscan och synthesize26,27.
- För multiplexmutagenes, förbered ett lager av 5 sgRNAs (10 ng/μL för varje sgRNA) och Cas9-protein (1 μg/μL). Förbered en 100-faldig utspädning av detta bestånd (0,1 ng/μL per sgRNA, 10 ng/μL Cas9) för injektion. För enkel gen, hög mutationfrekvens mutagenes, följ protokollet beskrivs tidigare28.
- Injicera haploida embryon i encellsstadiet 7 hpa om den förvaras vid 18 °C eller injicera embryon nästa dag vid 2–8-cellstadiet om de förvaras vid 8–10 °C.
- Överför embryona till 1,0x MMR med 20% polysackaros 400.
- Om encelliga celler injicerar varje embryo med en 5 nL-droppe av injektionslösningen (äggets cirka 1/4-radie) som innehåller en total massa på 0,5 pg/sgRNA och 50 pg Cas9-protein. Om multicellulära, distribuera denna massa genom att injicera mindre volymer i flera celler.
- Låt embryona läka i polysackaros 400 i minst 4 timmar och högst 18 timmar vid 18 °C.
- Haploid embryobostäder
- Överför embryona till 0,1 x MMR med antibiotika-antimykotiska.
- Hus varje embryo i en enskild brunn av en 24-brunn tallrik, eftersom vissa kommer att dö eller utvecklas onormalt. Underhåll vid 16−18 °C. Lägre temperaturer kan användas för att förlänga utvecklingen, om det behövs.
- Byt ut media med färsk 0,1 x MMR med antibiotikaantimykotisk varannan dag.
4. Diploid Host Embryo Beredning
- Underhåll embryon i gelébeläggningen vid 12 till 16 °C tills de når steg 22 till 26.
- Samla in de embryon som är redo för ympning, placera dem i en sikt (4 mm maskstorlek), och skölj dem försiktigt med 40% Holtfreter lösning.
- Överför embryona till filtersteriliserad 0,1 x MMR som innehåller 1,5% blekmedel i upp till 2 min. Helt dränka embryona i blekmedellösningen och snurra dem försiktigt för att säkerställa att gelébeläggningen ger full kontakt med blekmedelslösningen för att döda mikroberna på embryona.
- Efter 2 min, späd blekmedelslösningen som innehåller embryona med en lika stor mängd filtersteriliserad 0,1 x MMR.
- Häll försiktigt embryona i en blekmedelsanerad sikt (4 mm maskstorlek) och skölj embryona fem gånger med filtersteriliserad 0,1 x MMR.
- Placera embryona i sterila 10 cm petriskålar med 0,1 x MMR med antibiotika för dejellying (penicillin 100 enheter/ml, streptomycin 100 μg/μL, 0,25 μg/ml, gentamicin 25 μg/ml).
- Under ett fluorescerande stereomikroskop, ta bort gelérockar och vitellinemembran från GFP+ embryon med vassa pincett (spetsmått 0,05 x 0,01 mm2).
- Överför GFP+-embryona till en ny petriskål. Minimera mängden vätska som överförs från petriskålen där de dejellied.
- Skölj GFP+ värdembryona med steril 0,1 x MMR med antibiotika fyra till sex gånger för att avlägsna föroreningar.
- Placera de rena embryona vid 4 °C över natten före ympning.
OBS: Kylning av embryona gör dem styvare och rena separationen av mesodermen från endoderm möjligt.
5. Haploid-diploid Chimera Generation
- Kirurgisk autent och mediaberedning
- Förbered sterila kirurgiska operationsrätter genom att hälla autoklaverade 2% agarose i 0,1 x MMR i sterila 35 mm lättgreppiga petriskålar. Fyll petriskålarna halvvägs med agarose.
- När agarose kyls, använd en steril skalpell för att skära en 25 mm lång, lutande tråg i agarose att hålla embryona på plats.
- Fyll skålen med sterila kirurgiska medier (0,1 x MMR med antimykoplasma 2,5 μg/ml, amphotericin B 0,25 μg/ml och ciprofloxacin 10,0 μg/ml) och kylskåp vid 4 °C.
- Embryoympningförfarande
- Placera en frisk haploid givare med en eller två steg-matchade GFP + diploid värd embryon inuti tråg av prekyld operationsskålen som innehåller kirurgiska medier(figur 3).
OBS: Utför proceduren på ett kylstadium (10 °C eller lägre) om möjligt. - Använd två ultrafina, autoklavade pincett (rakt spets, spetsmått 0,05 x 0,02 mm2) för att ta bort ectoderm- och mesodermskikten från värden med lemknoppen nära mitten (figur 4).
OBS: Den rektangulära vävnadmoderplantor regionen omfattar lem knopp och sträcker sig från nionde somit till den bakre halvan av gäl utbuktningen, ca 2 mm, längs främre bakre axeln. Längs dorsoventral axeln sträcker sig den ympade regionen cirka 1,5 mm, inklusive somiterna till strax utanför ventrala kanten av gälutbuktningen. Den ympade regionen innehåller alla laterala plattan mesoderm och laterala halvor av somiterna, utan att störa underliggande endoderm. Se figur 4 och tillhörande video för mer information. - Ställ undan värdvävnaden och ta bort ett mjukpappersark i motsvarande storlek från haploidgivaren med samma metoder.
- Placera haploid givaren vävnadblad på motsvarande region av givaren embryo.
- Säkra vävnaden genom att täcka den med en autoklav, rektangulär glasskärva från ett krossat mikroskoplockglas och tryck försiktigt in den i värdembryokroppen.
- Vänd haploid givare embryo på sin andra sida för att skörda lem knopp för den andra värd embryo. Upprepa steg 5.2.2 till 5.2.5.
- Ta försiktigt bort de återstående överskjutande värdvävnaderna och donatorembryot från skålen.
- Lämna ympkvistarna med glasskäran på plats i 60-75 min, kontrollera varje 20 min för att säkerställa att glaset inte har glidit av.
- När vävnadstransplantaten helt fäster, använd pincetten för att långsamt skala av glasskärvanankare.
- Placera en frisk haploid givare med en eller två steg-matchade GFP + diploid värd embryon inuti tråg av prekyld operationsskålen som innehåller kirurgiska medier(figur 3).
- Chimera underhåll
- Överför de engrafted embryontill färska kirurgiska medier och behålla dem vid 8−12 °C över natten för att läka. Individuellt hus engrafted embryon i 12 eller 24-brunnsplattor.
- Efter 36−48 h, överför de enyuslade embryona till sterila 0,1 x MMR-antimykotiska medel. De starka antibiotikai kirurgiska medierna orsakar toxicitet hos engrafted embryon efter 3 dagar.
- Byt ut media med färsk 0,1 x MMR och antibiotika var 2−3 dag.
- Håll de engrafted embryona vid 18 °C tills de kan mata28.
- Efter 1 till 2 månaders utveckling och vård, haploid lemmar kan poängsättas för renhet av transplantatet med hjälp av en fluorescerande dissekering mikroskop.
OBS: Förekomsten av icke-neurala eller icke-blod värd-härledda GFP-vävnad i armar och ben är en indikator på oren ympning och är ofta förknippad med onormal lem utveckling. Dessa djur bör uteslutas från ytterligare analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utveckla haploida embryon kan skiljas från diploidembryon genom deras "haploida syndrom" fenotyp29. I transplantatstadiet uppvisar haploida embryon minskad krökning längs den främre posterioraxeln och ofullständig kapsling av äggulans plugg (figur 3A). Ett fluorescerande mikroskop kan användas för att säkerställa att haploida embryon är fria från faderiskt framställda GFP-uttryck(figur 3B).
När ympkvistar är rena bör GFP-uttrycket begränsas främst till brachial plexus, neurala nätverk som härrör från värdens ryggmärg, som kan ses i figur 2. Punktat GFP uttryck kommer också att finnas i enstaka celler som verkar vara sensoriska nervceller och blod-derived värdceller, som migrerar in i den utvecklande lem. När RFP+-donatorer används kommer haploida moderplantor att uppvisa universella uttryck för RFP (figur 1B"). Under hela utvecklingen är icke-mutagena haploida lemmar betydligt kortare än de motsatta diploidframbenen i storleksmatchade chimärdjur(figur 1B, figur 1B"och figur 5, n = 16 extremiteter, haploid medelvärde = 0,522 cm, SD = ± 0,087 cm, diploid medelvärde = 0,667 cm, SD = ± 0,069 m, ihopkopplad T-test p-värde < 0,0001, medelvärde s = 0,784, SD = ± 0,113). Icke-mutagena haploid lemmar också helt regenerera (4 / 4 haploid och 4 / 4 diploid fullständig förnyelse, figur 6), även om de visar en liten fördröjning i att nå den digitala utväxt skede jämfört med diploids (n = 4 haploid, n = 4 diploid; 23 dagar efter amputation: haploids = 3 palett och 1 digital utväxt skede lemmar; diploids = 4 digitala utväxt lemmar).
Framgångsrik ympning kräver övning, och konsistens en varierar beroende på teknikerns mikromanipulation färdigheter och steril teknik. Misslyckade och orena ympkvistar producerar en mängd olika fenotyper, som framgår av figur 7 och figur 8. I våra händer, cirka 38,7% (SD = ± 8,78%) oocyter utvecklas till normalt utvecklade haploida embryon och 11,1 % (SD = ± 5,46 %) av alla haploida diploidympkvistar producerar livskraftiga djur med normalt utvecklade, rent ympade haploida lemmar(figur 9).
Figur 1: Översikt över protokoll och ett exempel på en chimär axolotl. (A)Schematisk beskrivning av den relativa tidpunkten för de åtgärder som vidtagits för att få diploid värd embryon, spermier och ägg för att generera haploider och chimära embryon. (B) Sammansatt ljus bild av en ung axolotl som framställs genom embryonala extremitetsknoppympning från ett RFP+ haploidembryo till en GFP+ diploidvärd (B') Överlägg av gröna och röda lysrörsbilder av samma 8 cm unga axolotl. Den haploida extremiteten är grovt normal, men kortare än den motsatta diploid lem. Skalbar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fluorescerande bild av en normalt utvecklad och rent ympade haploid lem. GFP- haploid lem ympade till en GFP + diploid värd visar GFP uttryck mönster som verkar vara begränsad till spinal nerver innervating lemmen (gul pil) och enskilda sensoriska nervceller och blod-derived celler (vita pilar). Lemmen på bilden tillhörde en 4 cm ung. Skalbar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av diploid- och haploida embryon. (A) Ljus bild av diploids (vänster) och haploider (höger). Notera den reducerade AP-axelnkrökning och utskjutande endoderm av haploida embryon (vita pilar). (B) Grön fluorescerande bild av samma embryon. GFP- haploider genererades med ägg från en GFP- hona och bestrålade spermier från en GFP+. Diploids är GFP+. Embryon på bilden är ungefär steg 2530. Mellanlagringsserie. Skalbar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk beskriver omfattningen av en haploid lem knopp moderplantor. (A)Sidovy över ett haploidembryo i steg 25. De streckade linjerna visar det ungefärliga område som bör transplanteras, i förhållande till gälutbuktningen och lemknoppen. (B) Tvärgående schematisk av etapp 25. De streckade linjerna visar de ungefärliga area- och vävnadstyper som ska tas bort från värden och ersättas med motsvarande haploiddonatorvävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Jämförelse av haploida och diploid lem längder. (ASpridningstäpp av längden på haploida lemmar (rosa) och motsatta diploidlemmar (grön) av 16 chimärdjur i samma storlek (haploidmedelvärde = 0,522 cm, SD = ± 0,087 cm, diploidmedelvärde = 0,667 cm, SD = ± 0,069 cm). Lemmar mättes från basen av zeugopodtill korsningen av siffror 2 och 3. (BSpridningsytan för haploidextremitetens längd till diploidextremiteter för de 16 djuren (medelförhållande = 0,784, SD = ± 0,113 cm). (CSpridningsdrag av karosslängderna (cm) av de 16 uppmätta chimärerna (genomsnittlig djurlängd = 8,72 cm ± 0,456 cm). Djuren mättes från spetsen på snaran till svansspetsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Jämförelse av regenerering i haploida och diploid lemmar. (A) Haploid lem före amputation. (B)Samma haploida lem efter regenerering. (C) Diploid lem före amputation. (D)Samma diploidlem efter regenerering. 4/4 haploida lemmar och 4/4 diploid lemmar regenererade med normal morfologi. Svarta prickade linjer indikerar amputationsplanet. Skalstänger = 1 mm. Amputationer utfördes på storleksmatchade ungdjur (8,5 cm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Exempel på normal och onormal utveckling av haploida lemmar. (A)En haploid lem med grovt normal morfologi. -(B-E) Exempel på transplantat som inte kunde stödja fullständig utveckling av haploid. (B)Oligodactyly. (C) Allvarligare oligodactyly. (D)Det finns inga distinkta digitala strukturer. (E)Ingen lem. De avbildade extremiteterna tillhör liknande unga (8,0 till 10 cm). Skalstänger = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Exempel på GFP+-celler i orena haploida lemympkvistar. (A, A") Morfologiskt normala haploid moderplantor lem med GFP + diploid celler i huden och dermis (vit streckad kontur) avslöjas av fluorescerande mikroskopi. (B, B") En ympade onormal haploid lem med GFP + diploid celler bidrar i stor utsträckning till dermis och hud (vit kontur). (C, C ") En ympade onormala haploida lem där epidermis har ersatts med GFP + diploid celler (vit kontur). De avbildade extremiteterna tillhör liknande unga (8,0 till 10,0 cm). Skalbar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Framgångsgraden för haploidembryo och haploid lem generation. (A) Procent av livskraftiga haploida embryon som genereras med in vitro-aktivering. Data samlades in från fem oberoende in vitro aktiveringsexperiment. Grönt indikerar den del av ägg som producerade steg 25 haploida embryon som kan användas för ympning (medelvärde = 38,7 %, SD = ± 8,78 %). Grå indikerar den del av ägg som inte visade tecken på klyvning, var icke-livskraftiga, eller var normala under utveckling. (B) Procent av normalt utvecklade, rent ympade haploida lemmar. Lila indikerar den fraktion av transplantat som gav rena, normalt utvecklade haploida lemmar (medelvärde = 11,1%, SD = ± 5,46%). Grön indikerar lemmar som utvecklats normalt men hade förorenande GFP + värdvävnader (medelvärde = 11,3%, SD = ± 8,64%). Rött indikerar moderplantor som inte utvecklades normalt (medelvärde = 27,1%, SD = ± 30,3%). Blått indikerar alla ympade embryon och djur som inte överlevde till fullständig lemutveckling (medelvärde = 50,5 %, SD = ± 31,2 %). Förlust av ympade djur fördelades över sena embryonala och larvstadier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns några kritiska steg i vårt protokoll för att generera haploid-diploid chimärer som driftteknikerbör överväga för konsekvent ympning resultat.
Den mest sannolika orsaken till haploid generation att misslyckas beror på dåliga in vitro aktiveringsförhållanden. De lämpliga mängderna malsperma måste användas för att aktivera ägg. För att förlänga motiliteten bör spermieprover alltid hållas vid 4 °C. Innan du applicerar spermaprov på ägg, kontrollera spermiernas livskraft med hjälp av ett inverterat mikroskop. Helt icke-motile spermier bör aldrig användas, och koncentrationen bör justeras till 80.000 rörliga celler /ml. För mycket spermier i aktiveringssteget kan också förhindra normal äggutveckling. Spermagropar, som visas som små, mörka fördjupningar på ytan av ägget, är en fysisk indikation på att en spermiecell har trängt in i ägget och vanligtvis visas 20 till 60 min efter applicering av spermier. Ägg med tio eller fler spermagropar får inte aktiveras på rätt sätt.
Obefruktade ägg kan aktiveras om de samlas in inom 15 min efter att ha lagts under vatten, placeras i en torr petriskål, och torkas noggrant med pappershanddukar före spermieapplicering. Alternativt, som visas i videon, ägg kan pressas från en hormon-injiceras hona. Vi finner att dessa "torra" ägg ger mer konsekventa resultat, även om vi regelbundet använder båda metoderna.
Framgångsrik ympning kräver korrekt koppling av diploid embryon med lämpligt iscensatta haploid lem knopp vävnad. Detta protokoll innehåller ett antal åtgärder för att säkerställa scenmatchning. Eftersom naturlig parning inte alltid resulterar i äggläggning, HCG injektion för att få haploid oocyter bör inte utföras förrän naturligt parat hona börjar lägga diploid ägg. Efter denna injektion ska den inducerade honan hållas vid reducerad temperatur (8 till 12 °C), vilket minskar äggläggningshastigheten. Bostäder hormonstimulerade hona vid normala temperaturer kan resultera i de flesta av äggen läggs på kort tid. Uppkomsten av ägg läggning i en kyld hona indikerar att honan är redo för anestesi och oocyte extraktion. Oocyte aktivering måste uppstå inom 15 min oocyte extraktion. Eftersom aktiverade haploida embryon kommer att ligga flera dagar efter de naturligt producerade diploidembryona under utveckling rekommenderar vi att diploidembryon inkuberas vid 12 °C samtidigt som den relativa utvecklingstakten för haploider ökar genom att inkubera dem vid 18 °C. Eftersom det kommer att finnas en viss variation i intervallet mellan HCG-injektion och ägg läggning av inducerade honor, små justeringar i inkubationstemperaturer av antingen haploider eller diploids kan vara nödvändigt så att iscensättningen av värd och givare embryon paras ihop vid tidpunkten för ympning. Embryon bör kylas till 4 °C i flera timmar före ympning, och detta nästan arresterar utvecklingen. Skiljer sig åt tiden för uppkomsten av kylning haploid och diploid embryon före ympning kan möjliggöra scenmatchning. Medan haploid embryon skiljer morfologiskt från diploids, både haploider och diploids nå steg 21 efter neurala veck nära och embryona ligger en deras sidor. Liksom diploids, steg 25 haploid embryon har framträdande gäl och pronephric utbuktningar. Det stora huvudet sticker ut i en vinkel i förhållande till kroppen i haploider, även om detta kraftigt reduceras i förhållande till steg 25 diploid embryon, vars huvuden sticker ut från kroppen i nästan en rät vinkel30.
Steril teknik är absolut avgörande för framgångsrik vävnad ympning. Sterila förhållanden bör upprätthållas genom hela experimentet från haploid generation genom chimärer embryonala utveckling. Vi rekommenderar att alla föräldradjur håller i rena vattenförhållanden utanför systemet under äggläggningsperioden för att minimera mängden förorenande organiskt material i början av förfarandet. Konsekvent, dagligt avlägsnande av avlidna eller döende embryon genom hela processen är viktigt för att upprätthålla hälsan hos de andra embryona. Vi rekommenderar individuellt bostäder alla haploid och chimära embryon för att minimera korskontaminering.
Embryonala microdissektion och vävnadstransplantationfärdigheter förvärvas genom praktiken. Under ympningsprocessen är det viktigt att inte punktera eller riva lemknoppen själv. Vävnader tas bort från värden och embryon givare bör sträcka sig utanför lem knopp, som bilden, för att ge en buffertzon. Om för liten av ett område av vävnad ympas, kommer haploida lemmar infiltreras av GFP + diploid hud och andra vävnader.
En av begränsningarna i denna ympning teknik är att neuralvävnad och blod i armar och ben härrör från värdkroppen. I några sällsynta fall har vi kunnat generera ympade haploida lemmar som helt saknar alla tecken på GFP + uttrycka nerver. I dessa fall kunde vi ersätta tillräckligt av neural vävnad i värddjuret med givaren. Men sådan omfattande ympning är svårt, otillförlitligt, och ofta producerar utvecklingsmässiga avvikelser utanför lemmen.
Haploidy är embryonal axolotl. På samma sätt är mutationer i många gener potentiellt nödvändiga för lem utveckling och förnyelse också tidigembryonal aska. Vårt protokoll kringgår den embryonala dödligheten i haploidy för produktion av experimentella lemmar och kan också användas i fall där mutation av en kandidat förnyelse gen producerar en embryonal dödlig fenotyp. Vår lem knopp ympning teknik ger en fördel för att åstadkomma detta jämfört med tidigare beskrivna metoder för lem knopp och bidragande vävnad ympning, eftersom det utförs under tidig embryonal utveckling och innebär transplantation av komplett ektoderm och mesoderm lager1,2.
Haploid lem knopp ympning har beskrivits tidigare; I denna tidigare studie ympades dock haploid lemknoppar ectopically31. Mikroskopisk nukleär analys av utomkvedshavandeskap som härrör från dessa transplantat visade omfattande bidrag av diploid vävnad. Medan dessa lemmar utvecklats onormalt, kunde de regenerera31. Hellre än att ympa utomkvedshavandeskap knoppar, ersätter vi hela endogena lem knopp med motsvarande haploid vävnader. Genom användning av fluorescerande markörer kan vi visuellt identifiera haploida lemmar som är fria från diploidbidrag, med undantag för nerv- och blodkroppar, utan att offra själva haploidlemmen. Vi finner att haploid lemmar utvecklas och regenerera normalt. Emellertid, lemmar där GFP + värdar bidra till andra vävnader än neurala och blod-derived celler visar ofta avvikelser. När man undersöker genfunktion i haploida lemmar måste de med överdrivna värdbidrag uteslutas från analysen innan en genotyp kan associeras med någon fenotyp som observerats i mutanta haploidlemmar.
Nya innovationer, som montering av axolotl genomet och senaste CRISPR/Cas-baserade insättande metoder15,16,32, har dramatiskt utökat den genetiska formbarheten av axolotl. Metoder för att begränsa genetiska manipulationer tidsmässigt och rumsligt hålla stort löfte, men deras nuvarande tillämpningar begränsas av de resurser som behövs för att generera, hus och distribuera djur linjer. Protokollet som beskrivs här påskyndar den process genom vilken konsekvenserna av genetiska störningar av gener kan undersökas i lem utveckling och förnyelse. Det har varit liten karakterisering av många av de gener som befunnits vara upregulated i regenererande lemmar, och dessa gener kan vara inblandade i en mängd viktiga utvecklings- och cellulära processer. Även om vi räknar med att många gener som krävs för lem förnyelse kommer också att krävas för lem utveckling, kan denna metod avslöja om några gener inblandade i förnyelse har förlust av funktion fenotyper som är förnyelse-specifika. CRISPR/Cas mutagenesis i axolotler producerar vanligtvis allelic mosaicism som inkluderar bevarade vildtypallar, och denna mosaicism i sig kan betraktas som en kvantifierbar fenotyp20. Med hjälp av nästa generations sekvensering av amputerade original och regenererade lemmar kan forskare kvantifiera om haploida celler med mutationer i en gen av intresse går förlorade efter förnyelse. Detta tillvägagångssätt kan möjliggöra undersökning av regenereringfenotyper som produceras genom störning av annars viktiga utvecklingsgener.
Haploid förlust av funktion genetiska skärmar underlätta undersökningen av den genetiska ursprunget till många biologiska processer utan att behöva fastställa biallelic mutant cel linjer. Genom att kombinera haplogenesis, CRISPR/Cas9 mutagenes och lem knopp ympning, ger vi en ny plattform för en haploid genetisk skärm utforska lem utveckling och förnyelse i ett levande djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Katherine Roberts för hennes vård av axolotlkolonin. Finansiering för detta arbete tillhandahölls av Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 och 15-RMB-YALE-01) och Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Fellowship F32HD086942).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J.
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J.
- Armstrong, B.
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
