Summary
Formålet med denne undersøgelse er at etablere og validere en dyremodel for forskning i genopretning og overdreven stadier af hjernen iskæmi ved at teste hjerneinfarkt og sensorimotor funktion efter mellemhjernens arterie okklusion/reperfusion (mcao/R) efter 1-90 dage i rotter.
Abstract
Formålet med denne undersøgelse var at etablere og validere en dyr hjerne iskæmi model i Recovery og overdreven stadier. En mellemcerebral arterie okklusion/reperfusion (MCAO/R) model i mandlige Sprague-Dawley rotter blev valgt. Ved at ændre rotte vægt (260 − 330 g), gevind bolt typen (2636/2838/3040/3043) og hjernens infarkt tid (2-3 h), en højere Longa score, en større infarkt volumen og en større model succes ratio blev screenet ved hjælp af Longa score og TTC farvning. Den optimale model betingelse (300 g, 3040 gevind Bolt, 3 h hjerneinfarkt tid) blev erhvervet og anvendt i en 1-90 dag observationsperiode efter reperfusion via vurdering af sensorimotorik funktioner og infarkt volumen. På disse betingelser, den bilaterale asymmetri test havde en betydelig forskel fra 1 til 90 dage, og gitter-Walking test havde en betydelig forskel fra 1 til 60 dage; begge forskelle kunne være en passende sensorimotor funktionel test. Således, den mest hensigtsmæssige tilstand af en roman rotte model i Recovery og overdreven stadier af hjernen iskæmi blev fundet: 300 g rotter, der gennemgik mcao med en 3040 gevind bolt for en 3 h hjerneinfarkt og derefter reperfbrugt. De relevante sensorimotoriske funktionelle tests var en bilateral asymmetri test og en gitter-Walking test.
Introduction
Hjernen iskæmi er opdelt i tre faser med forskellige post-Stroke indikatorer: den akutte fase (inden for 1 uge), inddrivelse fase (1 uge til 6 måneder), og sequelae fase (mere end 6 måneder). I øjeblikket, de fleste undersøgelser fokuserer på den akutte fase af hjernen iskæmi på grund af sin betydelige effekt og multi-relative forskningsmodeller1,2,3. Men, genopretning og sequelae stadier af hjernen iskæmi kan ikke ignoreres på grund af deres langsigtede komplikation af handicap. Derfor er formålet med denne undersøgelse er at udforske en stabil, pålidelig og relativt enkel dyremodel til forskning genopretning og overdreven stadier af hjernen iskæmi.
Blandt de mange eksperimentelle hjernen iskæmi modeller, vi bruger midterste cerebral arterie okklusion (MCAO) via gevind bolt indsættelse i højre midterste cerebral arterie (MCA). Denne model er magen til menneskelige slagtilfælde, som kan producere større infarkt volumener, resultere i mange adfærdsmæssige lidelser relateret til slagtilfælde, og kan tillade blod reperfusion (R) ved at fjerne tråden bolt4,5,6. MCAO/R er også betragtes som guld standard animalsk model af hjernen iskæmi7. Endvidere, sværhedsgraden af hjernen skaden afhænger af diameteren og indsættelsen længden af tråden Bolt, varigheden af hjernen iskæmi, og dyrets vægt (større rotter har større hjerner og tykkere cerebrale blodkar)8. Derfor, ved at ændre tråden bolt type, infarkt tid, og rotte vægt, en passende model kan findes for genopretning og overdreven stadier af hjernen iskæmi i mcao/R rotter. For at validere rotte model, vi udførte en 1-dag, 35-dag, 60-dag, og 90-dages undersøgelse af MCAO/R model ved hjælp af TTC farvning og sensorimotor funktion eksperimenter (en bilateral asymmetri test, en gitter-Walking test, en rotarod test og en løft reb test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Proceduren og anvendelsen af animalske emner er blevet godkendt af National Institute of Health for pleje og brug af forsøgsdyr. Denne protokol er specifikt justeret for test af mellemhjernens arterie okklusion/reperfusion (MCAO/R) og sensorimotor funktion.
1. eksperimentel udformning og gruppering
- Brug en rotte MCAO/R model til at screene en rotte hjernen iskæmisk modelmetode med mere alvorlig hjerneskade og større model succes ratio ved hjælp af Longa score og TTC farvning.
- Udfør eksperimentet på mandlige Sprague-Dawley-rotter, der vejer 260 − 330 g, som er 7 − 9 uger gamle. Den reelle rotte vægt er 275 ± 15 g for 275 g, 300 ± 10 g for 300 g og 320 ± 10 g for 320 g.
- Brug følgende syv grupperinger (vægt, gevind bolt type, infarkt tid): gruppe 1 med 15 rotter (275 g, 2636, 2 h); gruppe 2 med 15 rotter (275 g, 2636, 3 timer); gruppe 3 med 15 rotter (275 g, 2838, 2 timer); gruppe 4 med 15 rotter (275 g, 2838, 3 timer); gruppe 5 med 13 rotter (300 g, 3040, 3 timer); gruppe 6 med 10 rotter (320 g, 3040, 3 timer); gruppe 7 med 13 rotter (300 g, 3043, 3 timer).
- Studere hjernen opsving status ved TTC farvning, og bruge passende sensorisk funktion tests for at angive de langsigtede funktionelle underskud af den bilaterale asymmetri test, gitter-Walking test, rotarod test og løft reb test efter 1, 35, 60, 90 dage af MCAO/R.
- Brug mandlige Sprague-Dawley-rotter, der vejer 300 ± 10 g, som er 8 − 9 uger gamle.
- Brug følgende fem grupper: en kontrolgruppe (normal) med 20 rotter; en 1 dages gruppe med 16 rotter; en 35 dag gruppe med 16 rotter; en 60 dag gruppe med 17 rotter; og en 90 dages gruppe med 19 rotter.
- Efter Longa score i trin 1,1 eller sensorimotor funktionelle tests i trin 1,2, anæstetize og halshug alle rotter for TTC farvning.
2. etablering af en ensidig MCAO/R-model i rotter9
Bemærk: Brug mikropincet forsigtigt under operationen for at forhindre, at blodkar Pens brud. Undgå beskadigelse af nerverne og andre blodkar i halsen på rotter, når beholderen er isoleret. Der skal udvises forsigtighed for at fremvise passende aseptisk teknik til alle kirurgiske indgreb. Teknikken illustreret senere i videoen skal praktiseres gennem hele proceduren.
- Under hele operationen, opretholde kropstemperaturen af rotterne ved 37,0 ± 0,5 °C i en lille dyr termostat. Forbered fire 6 cm 5-0 suturer.
- Indstil iltstrømmen for en lille dyreanæstesi maskine (med en røggas behandlings anordning) ved 0,4 − 0,6 L/min og koncentrationen af isofluran til 5%. Placer rotten i anæstesi maskinen.
- Når dyret er besvimet, skal du anbringe rotten på en kirurgisk fastgørings tabel. Forbind mundingen af rotten til masken af anæstesi maskinen (ilttilførslen forbliver uændret; Juster koncentrationen af isofluran til 3%). Bekræft, at dyret har indtastet dyb anæstesi ved at observere en mangel på ekstremitet spændinger, cornea reflekser, og smerte.
- Fastgør dens lemmer til at ligge på operationsbordet med papir bandager (eller andre værktøjer).
- Fjern nakke belægningen med en elektrisk barbermaskine og Steriliser med 75% alkohol (Iodophor er bedre). Fastgør mundingen af rotten med en krog.
- Skær 2 − 3 cm langs den centrale længde form af halsen med oftalmisk saks.
- Adskil den almindeligt carotis-arterie. Adskil den subkutane muskel med oftalmologiske pincet. Brug hjemmelavet retraktor til fuldt ud at udsætte synsfeltet. Efter adskillelse af den forreste muskel i luftrør med oftalmologiske pincet, adskilt langs højre sternocleidomastoideus sene indtil den almindelige carotis arterien er synlig.
- Isoler den almindeligt carotidarterie, den eksterne carotidarterie og den indvendige carotidarterie med oftalmologiske pincet. Ligate den fælles carotis arterie (hårdknude), ekstern carotis arterier langt fra hjertet ende (hårdknude), og intern carotis arterie (løs knude) med 5-0 suturer. Line den eksterne carotis arterien nær hjertet ende med 5-0 suturer.
- Indsæt en gevind bolt. Skær en lille åbning i den eksterne carotis-arterie ved hjælp af oftalmisk saks, og Indsæt forsigtigt en gevind bolt. Ligate suturen af den eksterne carotidarterie, der har været i løs knude og afbrød den eksterne carotis arterie.
- Løsn den løse knude af den indvendige carotidarterie og Fortsæt med at indsætte gevind bolt til begyndelsen af den midterste cerebral arterie (sutur mærket). Skær derefter den eksponerede gevind bolt af.
- Efter den iskæmiske tid er nået (2-3 h), fastsætte fraktur af den eksterne carotis arterien med en mikropincet, og forsigtigt trække tråden ud med en anden micropincet. Når den forreste ende af tråden bolt er helt trukket tilbage fra den interne carotis arterie, ligere den eksterne carotis arterie, der var foret med 5-0 suturer, og træk derefter tråden bolt helt.
- Løsn den almindeligt carotidarterie, og Daub ~ 50.000 U af penicillin natrium pulver på overfladen af såret for at forhindre infektion. Sutur subkutane muskler og hud med 4 suturer.
- Giv ~ 0,2 mL steril saltvand til rotter oralt ved hjælp af en 1 mL sprøjte (SQ-PEN injektion er bedre) for at forhindre postoperative vandmangel efter at placere rotten tilbage til buret.
- Vælg dyrene efter 24 timers reperfusion i henhold til Longa score10. Vælg dyr med en Longa score på 1 − 3 for den næste TTC farvning i trin 1,1, og dyr med en Longa score på 2 − 3 score for 1, 35, 60, 90 dage undersøgelse i trin 1,2.
Bemærk: Longa score10: 0 score, ingen neurologiske underskud; 1 score, undladelse af at forlænge venstre prognose; 2 score, cirkkende til venstre; 3 score, falder til venstre; 4 score, kan ikke gå spontant og har en deprimeret bevidsthed. - Analysér Longa-scoren ved en-vejs ANOVA. De viste værdier repræsenterer middelværdien ± S.D. P < 0,05 angiver forskellen.
3. TTC farvning
Bemærk: rotte hjerne skive skimmel og klinge skal være forkølet i a-20 °C køleskab før brug for at forhindre vedhæftning forårsaget af en stor temperaturforskel. Under farvning, forhindre vedhæftning mellem hjernen skiver og kultur pladen, hvilket kan resultere i utilstrækkelig farvning.
- Bedøvelses rotter ved intraperitoneal injektion af 400 mg/kg kon densering chloralet hydrat efter Longa score i trin 1,1 eller sensorimotoriske funktionelle tests i trin 1,2.
- Decapitate rat med kirurgisk saks eller med en rotte hugning apparat. Fjern hjernen med kirurgisk saks og hæostatisk pincet.
- Sæt hjernen i køleskabet ved-20 °C i 30 min for at lette udskæring.
- Fjern hjernen fra køleskabet og Placer den i forkølet rotte hjerne skive skimmel. Skær hjernen i seks 2 mm tykke fortløbende sektioner med et forkølet blad.
- Plette afsnittene med 2% 5-triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC) i en 6-brønd kultur plade.
- Kultur sektionerne for 30 − 60 min ved 37 °C i en ryste seng. Flip sektionerne hver 10 min indtil hjernen iskæmi område og det normale område er klart hvid og rød.
- Line hjernen skiver lodret i rækkefølge fra bagsiden til forsiden af hjernen. Brug en lineal til at sikre, at den samlede længde af hver linje er den samme. Tag billeder med digital kamera.
- Analysere infarkt volumen.
- Forbehandling af fotoet med Photoshop-software
- Importer fotografiet ved hjælp af Photoshop CS6. 00:00-00:14
- Klik på Vælg for at vælge hjerne udsnit, klik på Vælg | Omvendt. 00:15-00:36
- Klik på forgrundsviden for at vælge sort, og klik på OK. 00:37-00:42
- Tryk på alt + delete for at udfylde baggrundsfarven og CTRL + D for at fravælge. 00:43-00:46
- Klik på filer | Gem på skrivebordet. 00:47-01:08
- Forbehandling fotoet med image Pro Plus software.
- Åbn image Pro plus 6,0-softwaren, og Importer fotoet. 01:09-01:24
- Ved defekt modifikation justeres lysstyrken med værktøjet kontrastforbedring , så baggrunden er sort. 01:25-01:37
- Brug median værktøjet i filter til at fjerne højdepunkter. 01:38-01:46
- Beregn det venstre (normale) hjerne område med image Pro Plus-software
- Vælg farve ved hjælp af segmentering, og Juster værdien af H/S/I, så hjerne skiverne adskilles fra den sorte baggrund. 01:47-02:12
- Vend tilbage til antal | Størrelse. 02:13-02:16
- Klik på Count | Opdel objekter i Rediger for at adskille hjernen fra midterlinjen. Softwaren vil automatisk skelne mellem venstre og højre hjerneområder. 02:17-02:49
- Beregn det rigtige infarkt hjerne område med image Pro Plus software
- Implementer trin 3.8.1-3.8.2. 02:50-03:14
- Vælg antal | Størrelse. 03:15-03:21
- Klik på Draw | Værktøjet Flet objekter i Rediger. Vælg det ischemiske område manuelt, og klik på Tæl for at beregne det iskæmiske område. 03:16-05:31
- Beregn sundhed Brain Area med image Pro Plus software
- Implementer trin 3.8.1-3.8.2. 05:32-06:44
- Vælg farve ved hjælp af segmentering og Juster værdien af H/S/I, så den normale del af hjerne skiver adskilles fra den sorte baggrund. 06:45-07:10
- Vend tilbage til antal | Størrelse og klik på Count for at beregne dette område. 07:11-07:21
- Klik på Opdel objekter i Rediger for at adskille hjernen fra midterlinjen. Softwaren vil automatisk skelne mellem venstre og højre hjerneområder. 07:22-08:08
- Forbehandling af fotoet med Photoshop-software
- Beregn infarkt volumen (%) og infarkt og krympe volumen (%):
Infarkt volumen (%) = [højre infarkt område/(2 x venstre hjerne område)] x 100.
Infarkt og krympe volumen (%) = [(venstre hjerne område-højre sundheds hjerne område)/(2 x venstre hjerne område)] x 100.
Bemærk: den rigtige hjerne er den skadede del. Dataene blev analyseret af en-vejs ANOVA. De viste værdier repræsenterer middelværdien ± S.D. P < 0,05 angiver forskellen.
4. vurdering af sensorimotor funktion
Bemærk: rotter (300 g, 3040 gevind Bolt, 3 h hjerneinfarkt tid) med en Longa score på 2 − 3 blev udvalgt til at udføre sensorimotor funktions eksperimenter fra 1-90 dage. Hold stille og Forstyr ikke dyrene i denne studieperiode. Dataene blev analyseret af to-vejs ANOVA. De viste værdier repræsenterer middelværdien ± S.D. P < 0,05 angiver forskellen.
- Bilateral asymmetri test11
- Wrap papir tape (5 cm lang, 0,8 cm bred) på saphena del af hver forlov af en rotte tre gange med lige tryk.
- For hver rotte, registrere antallet af gange hver prognose er kontaktet og tape fjernet i 5 min med kamera, herunder upåvirket pote gange og påvirket pote gange.
- Efter 30 minutter gentages trin 4.1.1 og 4.1.2 igen.
- Beregn den gennemsnitlige værdi af sensorimotorisk bias (%):
Sensorimotor bias (%) = (upåvirket Paw Times-påvirkede pote gange)/(upåvirket pote gange + påvirkede pote tider) x 100
- Gitter-Walking test
- Placer rotten i midten af en forhøjet gitter overflade platform (område: 1 m2; højde: 90 cm) med gitter åbninger på 2,5 cm2.
- Skub rotte hofter let for at opmuntre rotten til at krydse gitter overfladen.
- Registrer antallet af fodfejl, der er foretaget af de upåvirkede (højre) og påvirkede (venstre) lemmer og det samlede trin nummer i 1 min. med kameraet.
- Beregn fejl tider:
Fejl tider (%) = [upåvirket (højre) ekstremitets påvirkede (venstre) lemmer]/samlet trin nummer x 100.
Bemærk: det samlede antal trin under 20-trins data blev fjernet.
- Rotarod test12,13
- Indstil rat roterende bar udmattelses apparat (diameter 90 mm) af rotter ved hjælp af den understøttende software til en hastighed på 13 rpm over en 5 min periode på computeren.
- Start computeren programmer og placere rotten på rotarod trin på samme tid.
- Afslut en prøveversion, hvis rotten falder ned fra det rungende eller fortsætter med at gå i 5 minutter og registrerer rotations tiden.
- Har rotten hvile i 30 min.
- Gentag trin 4.3.2 − 4.3.4 to gange mere, og vælg den maksimale værdi, der skal være den sidste roterende tid.
- Prøvning af løfte reb14
- Placer løfte wire instrumentet (70 cm højt; rebet er 0,2 cm i diameter og 40 cm langt) på skrivebordet.
- Har rat greb reb med sine forbimbs og hænge rotten.
- Registrer tidspunktet for ophængning og Beregn pointene.
Bemærk: en score på 3:0 − 2 s på rebet; En score på 2:3 − 4 s på rebet; En score på 1:5 − 6 s på rebet; En score på 0: mere end 7 s på rebet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved anvendelse af ovennævnte procedure for en MCAO/R-model med en Longa-score og TTC-farvning, forskellige behandlinger af gennemsnitsvægten (275/300/320 g), bolt typer (2636/2838/3040/3043; Tabel 1) og iskæmisk gange (2-3 h) og 1 dag reperfusion blev brugt til at screene for den optimale hjernen iskæmi model i rotter. Model parametre af 300 g vægt, 3040 gevind Bolt, og 3 h hjernen infarkt tid var den mest egnede til den største cerebral infarkt, højeste Longa score og største model succes ratio. Dette blev væsentligt forbedret på konventionel behandling af en 275 g vægt, 2636 gevind Bolt, og 2 h hjernen infarkt tid (figur 1).
Endvidere, rotter med 300 g vægt, 3040 gevind Bolt, 3 h hjernen infarkt tid og en 2 − 3 Longa score undergik sensoriske funktionstests (en bilateral asymmetri test, en gitter-Walking test, en rotarod test, og en løft reb test) og TTC farvning at studere opsving status af hjernen iskæmi fra 1-90 dage. Infarkt og krympe volumen var 23,4%, 19,6%, 16,1% (p < 0,01, sammenlignet med den første dag) og 15,7% (p < 0,01, sammenlignet med den første dag) efter henholdsvis 1, 35, 60 og 90 dage post Mcao/R (figur 2). På den første dag efter MCAO/R, infarkt volumen var størst. Med tiden blev den infarkt volumen mindre og formindskelsen volumen blev større. Infarkt og Shrink volumen ikke længere ændret efter 60 dage af MCAO/R.
Den sensorimotoriske bias i den bilaterale asymmetri test, gitter-Walking fejl tider i Grid-Walking test og løft reb score i løft reb test alle signifikant øget, mens rotarod tid i rotarod test faldt betydeligt efter 1 dag i MCAO/R (figur 3), som indikerede, at alle fire tests var meningsfulde i fasen af akut hjerne iskæmi. Men, kun sensorimotor bias vedligeholdt store funktionelle lidelser med en tidsafhængig måde efter 35, 60 og 90 dage af MCAO/R. Der var betydelige forskelle i gitter-Walking fejl tider i Grid-Walking test efter 35 og 60 dage af MCAO/R. Disse resultater viste, at den bilaterale asymmetri test og Grid-Walking test kunne være egnede sensorisk funktion tests for den fase af nyttiggørelse og overdreven i rotter.
Figur 1:300 g vægt, 3040 gevind Bolt, 3 h hjerneinfarkt tid kan være den optimale tilstand af hjernen iskæmisk skade induceret af MCAO/R. (A, B) Billeder og kartografi af infarkt volumen af hjernevæv (n = 9 − 12). C) Longa-score (n = 9 − 12). (D) statistikkerne for model succes ratio for rotter (n = 10 − 15). Model succes ratio = (samlet antal rotter-død rotter efter MCAO/R-svigt rotter efter MCAO/R)/samlet antal rotter. Svigt rotter er den model rotter, der ikke har en egnet Longa score. Fejllinjer repræsenterer S.D., *p < 0,05, * *p < 0,01. Dette tal er blevet ændret fra Liu et al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: infarkt og krympe volumen faldt gradvist fra 1 til 90 dage efter MCAO/R. (A) TTC farvning af rotte hjernevæv. B) kartografi og krympe volumen (n = 16 − 19). Fejllinjer repræsenterer S.D., * *P < 0,01 vs. den første dag efter mcao/R. Dette tal er blevet ændret fra Liu et al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: bilateral asymmetri test og Grid-Walking test var de egnede sensorimotoriske funktionstests i Recovery og overdreven fase af hjernen iskæmi. (A) den rette lemmer, der rives ind i et udsvævnings eksperiment. (B) gitter-Walking fejl tider i Grid-Walking test. C) længden af tiden i rotarod-testen. D) scoren for prøvning af løft af reb. Fejllinjer repræsenterer S.D., n = 15 − 19, *p < 0,05, * * *P < 0,001. Dette tal er blevet ændret fra Liu et al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Type | Diameteren af gevind bolt | Diameteren af gevind bolthoved | Anbefalet vægt af rotte | Niveau |
| 2636 | 0,26 mm | 0,36 mm | 250-280 g | A4 |
| 2838 | 0,28 mm | 0,38 mm | 280-350 g | A4 |
| 3040 | 0,30 mm | 0,40 mm | 360-400 g | A4 |
| 3043 | 0,30 mm | 0,43 mm | > 400 g | A4 |
| Bemærk: A4-niveau gevind bolt er den standard, at hovedet enden er halvkugleformet, den forreste ende er dækket med poly-lysin, markeret, steriliseret, og buy-on-brug uden nogen behandling (dette bord er blevet modificeret fra Liu et al., 2018). | ||||
Tabel 1: oplysninger om trådblottet. Denne tabel er blevet ændret fra Liu et al.15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange modeller etablere metoder og adfærdsmæssige indikatorer, der er godt brugt i akut cerebral iskæmi kan ikke have væsentlige ændringer i inddrivelse og overdreven stadier af hjernen iskæmi16,17. Men, antallet af patienter med hjernen iskæmisk i Recovery og overdreven stadier er den største. Det er vigtigt at vælge en egnet dyremodel for genopretning og overdreven stadier af iskæmi slagtilfælde.
Vi bruger MCAO/R-modellen i rotter til at screene den passende vægt af rotter (260 − 330 g), typen af gevind bolt (2636/2838/3040/3043), og tidspunktet for hjernens infarkt (2-3 h) for den mest alvorlige infarkt skade, en høj model succes ratio, og synlige adfærdsmæssige indikatorer , som vil være egnet til genopretning og sequelae stadier af hjernen iskæmi.
Rotter, der vejer 300 g med en 3040 gevind bolt og 3 h hjerneinfarkt tid har større infarkt volumener, mere alvorlige adfærdsmæssige defekter, og en større model succes ratio (figur 1). Desuden, vi leverede valideringsmetoder af denne rotte model af TTC farvning og sensorimotorik funktionstests (bilateral asymmetri test, gitter-Walking test, rotarod test og løft reb test) 1-90 dage efter reperfusion. Vi fandt, at den bilaterale asymmetri test og Grid-Walking test kunne anvendes til forskning opsving og overdreven stadier af iskæmi, fordi de betydelige forskelle i disse indikatorer sidste 90 dage og 60 dage, hhv. Jo større infarkt og krympe volumen er, jo mere alvorlige sensorimotoriske underskud, som kan ses i figur 2 og figur 3.
Denne metode er primært egnet til hjernen iskæmi forårsaget af MCAO. Men modellen har forskelle i hjernens anatomier mellem mennesker og rotter, såsom karakteren af sikkerhedsstillelse cirkulation. En anden begrænsning er, at hvid stof opsving ikke kan ses af TTC farvning. Yderligere undersøgelser af sikkerhedsstillelse cirkulation og hvid stof opsving med MR Imaging eller andre metoder kan bekræfte den forudsigende værdi af denne model.
Det mest kritiske spørgsmål er, at evnen til at skabe en MCAO/R model i rotter er ikke let og kræver praksis. Før eksperimentet, bekræft en acceptabel og parallel model succes ratio. Flere instrumenter og metoder er nødvendige for at teste sensorimotor funktion i genopretning og overdreven stadier af slagtilfælde. Hvis en mere vanskelig opgave, såsom at øge hastigheden fra 10 til 30 rpm blev brugt, en længere periode med underskud kan forekomme i rotarod test. Andre adfærdsmæssige tests kan også være egnet til denne model, såsom gangart afsløring. Mere præcise detekteringsmetoder bør anvendes til patienter i Recovery og overdreven stadier af hjernen iskæmi, som kan identificere effekten af narkotika eller andre terapeutiske værktøjer.
Som en ny dyremodel for at studere hjernen iskæmi i Recovery og overdreven stadier, den metode, der præsenteres her er meningsfuld og fortjener popularisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Kinas National Natural Science Foundation (81603315, 81603316), Key R & D plan for Jiangxi provinsen i Kina (20171ACH80001), industrielle og akademiske samarbejdsprojekter i gymnasier og universiteter i Fujian-provinsen i Kina (2018Y41010011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical Microscope | Leica (Germany) | S8 | Microscopic operating instrument |
| Blade | Gellette | / | Cutting brain sections |
| Constant Temperature Shaking Bed | Taicang Experimental Equipment Factory | THZ-C | To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature |
| Digital Camera | Canon | 700D | For taking pictures of TTC staining |
| Electric Shaver | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 3000# | Removal of hair from the neck of rats |
| Forceps Hamostatic | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 14 cm | Using for brain removing |
| Image Pro Plus Software | Media Cybernetics Inc. | 6.0 | Analyze the infarct volume |
| Isoflurane | RWD Life Science | 217170702 | Anesthetic gas |
| Microforceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Microshear | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Ophthalmic Forceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Auxiliary skin and muscle anatomy |
| Pphthalmic Scissors | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Using for cutting the skin of neck |
| Rat Brain Slice Mold | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 400 g | For standard, uniform cutting of brain tissue |
| Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus | Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. | ZH-300B | To test the sensorimotor function |
| Small Animal Anaesthesia Machine | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | ABM3000 | A gas anesthetic machine |
| Small Animal Thermostat | Beijing Damida Technology Co., Ltd. | DM.7-YLS-20A | To maintain animal body temperature constant during operation |
| Surgical Scissors | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 16 cm | Using for decapitate and brain removing |
| Suture | Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. | 4-0 / 5-0 | Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations |
| Thread Bolt | Beijing Cinontech Co. Ltd. | 2636/2838/3040/3043-A4 | Blockage of the middle cerebral artery in rats |
| 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) | Sigma | LOT#BCBP3272V | Brain section staining reagent |
References
- Kong, L. L., et al. Neutralization of chemokine-like factor 1, a novel C-C chemokine, protects against focal cerebral ischemia by inhibiting neutrophil infiltration via MAPK pathways in rats. Journal of Neuroinflammation. 11, 112 (2014).
- Jiang, M., et al. Neuroprotective effects of bilobalide on cerebral ischemia and reperfusion injury are associated with inhibition of pro-inflammatory mediator production and down-regulation of JNK1/2 and p38 MAPK activation. Journal of Neuroinflammation. 11, 167 (2014).
- Thomas, A., Detilleux, J., Flecknell, P., Sandersen, C. Impact of Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) Guidelines on Peri-Anesthesia Care for Rat Models of Stroke: A Meta-Analysis Comparing the Years 2005 and 2015. PLoS One. 12, e0170243 (2017).
- Kumar, A., Aakriti,, Gupta, V. A review on animal models of stroke: An update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
- Tong, F. C., et al. An enhanced model of middle cerebral artery occlusion in nonhuman primates using an endovascular trapping technique. AJNR Am. Journal of Neuroradiology. 36, 2354-2359 (2015).
- Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
- Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9, 541-551 (2014).
- Abrahám, H., Somogyvári-Vigh, A., Maderdrut, J. L., Vigh, S., Arimura, A. Filament size influences temperature changes and brain damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Exp. Brain Res. 142, 131-138 (2002).
- Sun, M. N., et al. Coumarin derivatives protect against ischemic brain injury in rats. European Journal of Medicinal Chemistry. 67, 39-53 (2013).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cell. 30, 785-796 (2012).
- Zhang, S., et al. Protective effects of Forsythia suspense extract with antioxidant and anti-inflammatory properties in a model of rotenone induced neurotoxicity. Neurotoxicology. 52, 72-83 (2016).
- Milani, D., et al. Poly-arginine peptides reduce infarct volume in a permanent middle cerebral artery rat stroke model. BMC Neuroscience. 17, 19 (2016).
- DeGraba, T. J., Ostrow, P., Hanson, S., Grotta, J. C. Motor performance, histologic damage, and calcium influx in rats treated with NBQX after focal ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14, 262-268 (1994).
- Liu, P., et al. Validation of a preclinical animal model to assess brain recovery after acute stroke. European Journal of Pharmacology. 835, 75-81 (2018).
- Zuo, W., et al. IMM-H004 prevents toxicity induced by delayed treatment of tPA in a rat model of focal cerebral ischemia involving PKA-and PI3K-dependent Akt activation. European Journal of Neuroscience. 39, 2107-2118 (2014).
- Yang, L., et al. L-3-n-butylphthalide Promotes Neurogenesis and Neuroplasticity in Cerebral Ischemic Rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 21, 733-741 (2015).
