Summary
Questo studio descrive un metodo per isolare vescicole extracellulari arricchite di esosomi che trasportano fattori di stimolazione delle colonie di macrofagi dei granulociti immunostimoltori da cellule staminali embrionali.
Abstract
Le cellule staminali embrionali (ESC) sono cellule staminali pluripotenti in grado di auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule embrionali. Come molti altri tipi di cellule, le ESC rilasciano piccole vescicole di membrana, come gli esosomi, nell'ambiente extracellulare. Gli esosomi fungono da mediatori essenziali della comunicazione intercellulare e svolgono un ruolo fondamentale in molti processi (pato)fisiologici. Il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) funziona come una citochina per modulare la risposta immunitaria. La presenza di GM-CSF negli esosomi ha il potenziale per aumentare la loro funzione immuno-regolatoria. Qui, GM-CSF è stato stabilmente sovraespresso nella linea cellulare murina ESC ES-D3. È stato sviluppato un protocollo per isolare vescicole extracellulari (EV) arricchite di esosomi di alta qualità da cellule ES-D3 che sovraesprimono GM-CSF. I veicoli elettrici isolati arricchiti di esosomi erano caratterizzati da una varietà di approcci sperimentali. È importante sottolineare che quantità significative di GM-CSF sono risultate presenti nei veicoli elettrici arricchiti di esosomi. Nel complesso, i veicoli elettrici arricchiti di esosomi contenenti GM-CSF provenienti da ESC potrebbero funzionare come vescicole prive di cellule per esercitare le loro attività di immunoregolamentazione.
Introduction
Le ESC sono derivate dallo stadio di blastocisti di un embrione preimpianto1. Come cellule staminali pluripotenti, le SC hanno la capacità di auto-rinnovarsi e differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula embrionale. Grazie al loro notevole potenziale di sviluppo e alla capacità proliferativa a lungo termine, le SC sono estremamente preziose per la ricerca biomedica1. Gli attuali sforzi di ricerca si sono in gran parte concentrati sul potenziale terapeutico delle ESC per una varietà di importanti disturbi patologici, tra cui diabete, malattie cardiache e malattie neurodegenerative2,3,4.
Le cellule di mammifero, comprese le ESC, sono note per rilasciare vescicole di dimensioni variabili nell'ambiente extracellulare e queste EV possiedono molte funzioni fisiologiche e patologiche a causa del loro ruolo nella comunicazione intercellulare5. Tra i diversi sottotipi di EV, gli esosomi sono piccole vescicole di membrana rilasciate da vari tipi di cellule nello spazio extracellulare dopo la fusione di compartimenti endocitici intermedi, corpi multivesicolari (MVB), con la membranaplasmatica 6. Gli esosomi sono stati segnalati per mediare la comunicazione intercellulare e sono criticamente coinvolti in molti processi (pato)fisiologici7,8. Gli esosomi ereditano alcune funzioni biologiche dalle proprie cellule parentali, perché gli esosomi contengono materiali biologici acquisiti dal citosol, tra cui proteine e acidi nucleici. Pertanto, gli antigeni associati o i fattori che stimolano la risposta immunitaria specifica per una data malattia sono incapsulati negli esosomi di particolari tipi di cellule9. Ciò ha spianato la strada a studi clinici che esplorano gli esosomi derivati dal tumore come vaccino anti-cancro10.
GM-CSF è una citochina secreta da diversi tipi di cellule immunitarie11. Prove emergenti dimostrano che GM-CSF attiva e regola il sistema immunitario e svolge un ruolo essenziale nel processo di presentazione dell'antigene12. Ad esempio, un rapporto clinico suggerisce che GM-CSF stimola la risposta immunitaria ai tumori come adiuvantevaccinale 13. Diverse strategie di immunoterapia del cancro basate su GM-CSF per sfruttare la potente attività immunostimolante di GM-CSF sono state studiate in studi clinici14. Tra questi, un vaccino antitumorale composto da cellule tumorali secrete di GM-CSF irradiate ha mostrato qualche promessa nei pazienti con melanoma avanzato inducendo risposte antitumorali cellulari e umorali e successiva necrosi nei tumori metastatizzati15.
Poiché gli esosomi derivati dalle ESC possiedono attività biologiche simili a quelli delle ESC originali, forse gli esosomi portatori di GM-CSF da ESC potrebbero funzionare come vescicole prive di cellule per regolare la risposta immunitaria. In questo documento, viene descritto un metodo dettagliato per produrre veicoli elettrici arricchiti di esosomi di alta qualità da ESC che esprimono GM-CSF. Questi veicoli elettrici arricchiti di esosomi hanno il potenziale per fungere da vescicole immunoregolatrici per modulare la risposta immunitaria.
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Protocol
1. Coltivazione di cellule ES-D3
- Per generare siero bovino fetale privo di esosomi (FBS), caricare FBS in un ultracentrifuga e centrifuga a 100.000 x g per 16 ore a 4 °C. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante sierico come FBS privo di esosomi per la coltura della linea cellulare ESC murina ES-D3 e l'acquisizione di veicoli elettrici arricchiti di esosomi.
- Prima di placcare le cellule ES-D3, rivestire piatti di coltura tissutale di 15 cm usando gelatina (0,1%) a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Seguendo un protocollo16precedentemente descritto, le cellule ES-D3 senza cellule dello strato di alimentazione nelle stoviglie di coltura tissutale di 15 cm rivestite di gelatina. Il terreno di coltura cellulare ES-D3 è composto da DMEM, FBS privo di esosomi (15%), amminoacidi non essenziali (0,1 mM), L-glutammina (2 mM), β-mercaptoetanolo (0,1 mM), penicillina (50 unità / mL), streptomicina (50 μg / mL) e fattore inibitorio della leucemia (LIF; 100 unità / mL). Coltura di cellule ES-D3 a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2.
- Una volta che le cellule ES-D3 raggiungono circa il 90% di confluenza in piatti di coltura tissutale di 15 cm, rimuovere il mezzo mediante aspirazione. Lavare le cellule con tripsina (5 ml; 0,05%). Aggiungere la tripsina (5 ml) ai piatti e incubare a 37 °C per 5 min. Raccogli le cellule dai piatti.
- Aggiungere il terreno di coltura fresco (5 ml) alle cellule raccolte per inattivare la tripsina. Centrifugare le celle a 390 x g per 5 min. Risusciscere le cellule in mezzo fresco e determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
- Per le cellule che passano, placcare le cellule ES-D3 (5 x 106) in un piatto di coltura tissutale rivestito di gelatina (0,1%) di 15 cm con terreno fresco (15 ml) e colturare per 3 giorni prima di soggioturare le cellule.
- Per raccogliere il surnatante di coltura cellulare per l'isolamento di EV arricchiti con esosomi, placcare le cellule ES-D3 (1 x 107) in un piatto di coltura tissutale rivestito di gelatina (0,1%) di 15 cm con mezzo fresco (15 ml) per 3 giorni prima della raccolta del surnatante di coltura cellulare.
2. Generazione di plasmidi di espressione GM-CSF
NOTA: Generare il plasmide di trasfezione pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP per sovraesprimere GM-CSF nelle cellule ES-D3. In questo plasmide, l'espressione del cDNA murino GM-CSF insieme alla proteina marcatore umanizzata Renilla reniformis GFP (hrGFP) è guidata dal promotore del fattore di allungamento della catena polipeptidica umana 1α (EF1α)17,18.
- Generare la dorsale vettoriale.
- Digerire il plasmide pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg di DNA) utilizzando l'enzima di restrizione EcoRI (100 unità) a 37 °C per 2 ore per generare due frammenti di DNA: la spina dorsale vettoriale (6,0 kb) e l'inserto FD3ER (2,5 kb).
- Trasferire il 50% del DNA plasmidico digerito (10 μg) in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e trattare con fosfatasi alcalina (20 unità) a 37 °C per 1 ora. Risolvere sia il DNA non trattato che il DNA defosforilato utilizzando l'elettroforesi su gel di agarose (2%).
- Purificare i frammenti di DNA della spina dorsale vettoriale (6,0 kb) utilizzando un kit di estrazione del gel di DNA. Mentre la dorsale vettoriale non trattata fungerà da vettore vuoto (pEF1α-IRES-hrGFP), la dorsale vettoriale defosforilata verrà utilizzata per generare plasmide che esprime GM-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
- Generare l'inserto cDNA GM-CSF.
- Digerire il plasmide pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) utilizzando l'enzima di restrizione EcoRI (100 unità) a 37 °C per 2 ore per produrre due frammenti di DNA: la spina dorsale vettoriale (6,5 kb) e l'inserto murino GM-CSF cDNA (474 bp).
- Risolvere il DNA digerito attraverso l'elettroforesi su gel di agarose (2%). Purificare il frammento murino di cDNA GM-CSF (474 bp) utilizzando un kit di estrazione del gel di DNA.
- Generare i plasmidi di espressione.
- Impostare 2 reazioni di legatura (10 μL di volume totale) utilizzando un kit di legatura del DNA.
- Per generare il vettore vuoto pEF1α-IRES-hrGFP, ligate la dorsale vettoriale non trattata dal passaggio 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng).
- Per generare pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ligate i seguenti frammenti di DNA: (1) la spina dorsale vettoriale defosforilata dal passo 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) e (2) il frammento di cDNA mGM-CSF generato nel passaggio 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
- Ligate a 25 °C per 5 min. Trasformare il DNA legato in cellule di E. coli competenti DH5α. Placcare le cellule di E. coli trasformate su piastre LB-agar contenenti carbenicillina (50 μg/mL).
- Purificare i plasmidi da singole colonie di E. coli utilizzando un kit di isolamento del DNA. Convalidare le identità dei plasmidi mediante sequenziamento del DNA.
- Impostare 2 reazioni di legatura (10 μL di volume totale) utilizzando un kit di legatura del DNA.
3. Generazione di cellule ES-D3 che sovraesprimono GM-CSF
NOTA: Trasfettate le cellule ES-D3 con il plasmide pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP per sovraesprimere GM-CS. Cotrasfettere il plasmide pBabe-Neo in cellule ES-D3 per facilitare la selezione delle cellule stabilmente trasfettate18,20.
- Trasfettate i plasmidi nelle cellule ES-D3.
- Placcare le cellule ES-D3 (1,4 x 106) in un piatto di coltura tissutale rivestito di gelatina (0,1%) di 10 cm con terreno di coltura (10 ml) per la trasfezione. Cellule ES-D3 placcate in coltura a 37 °C per 24 ore.
- Preparare due miscele di plasmidi in tubi microcentrifuga da 1,5 mL: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, controllo vettoriale) con pBabe-Neo (4 μg) e (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, che esprimono GM-CSF) con pBabe-Neo (4 μg). Effettuare la trasfezione utilizzando un kit di trasfezione seguendo il protocollo del produttore.
- Aggiungere il mezzo di trasfezione (1 mL) e il reagente di trasfezione (64 μL) a ciascun tubo contenente le miscele di plasmidi e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Aggiungere le miscele di trasfezione alle rispettive stoviglie da 10 cm di cellule ES-D3. Incubare a 37 °C per 5 ore.
- Sostituire il mezzo in piatti da 10 cm con terreno di coltura fresco (10 ml). Incubare a 37 °C per 24 ore.
- Generare popolazioni di massa di cellule ES-D3 stabilmente trasfettate.
- Rimuovere il mezzo dalle cellule ES-D3 trasfettate. Lavare le cellule con tripsina (2 ml; 0,05%). Aggiungere tripsina (2 mL) e incubare a 37 °C per 5 min. Trasferire le cellule in un tubo di centrifuga da 15 mL e aggiungere 2 mL di terreno di coltura fresco per neutralizzare la tripsina. Centrifuga a 390 x g per 5 min.
- Riconsosciare le cellule trasfettate in terreno di coltura fresco (10 ml). Valutare l'intensità di fluorescenza della GFP nelle cellule ES-D3 trasfettate utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS), seguendo il protocollo del produttore.
- Trasferire le cellule trasfettate in due piatti da 10 cm contenenti terreno di coltura fresco (10 ml). Aggiungere neomicina (0,5 mg / mL) per eliminare le cellule non trasfettate.
- Continuare a coltivare le cellule trasfettate in terreno di coltura contenente neomicina (0,5 mg/ml). Quando l'ES-D3 trasfettato raggiunge il 90% di confluenza, trasferire nuovamente le cellule a piatti di coltura tissutale di 15 cm. Ripetere la procedura per 2 settimane.
- Generare cloni di cellule ES-D3 trasfettate stabilmente.
- Una volta generate popolazioni di massa di cellule ES-D3 stabilmente trasfettate, raccogliere le cellule come prima. Determinare i numeri di cella utilizzando un emocitometro. Centrifugare le celle a 390 x g per 5 min. Risuspenare le cellule (1 x 107 cellule/ml) in terreno di coltura fresco.
- Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare sterile da 40 μm. Purificare le celle ES-D3 GFP-positive utilizzando FACS, seguendo il protocollo del produttore.
- Placcare una singola cellula ES-D3 ordinata in un pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti rivestita di gelatina (0,1%) contenente cellule ES-D3 parentali (1 x10 3) in mezzo privo di neomicina (200 μL). La co-coltura di cellule ES-D3 trasfettate con le loro controparti parentali non trasfettate assicura che le singole cellule ES-D3 trasfettate stabilmente sopravvivano e proliferano come un singolo clone.
- Colturare le cellule per 48 ore, quindi aggiungere neomicina (0,5 mg / mL) a piastre a 96 pozzi per eliminare le cellule ES-D3 parentali non trasfettate.
- Continuare a coltivare le cellule ES-D3 GFP-positive in piastre di coltura tissutale a 96 pozzi con terreno contenente neomicina (0,5 mg / mL) per 1 settimana. Trasferire le linee cellulari clonali ES-D3 a piatti di coltura tissutale rivestiti di gelatina (0,1%) 6 cm con terreno di coltura (5 ml) contenente neomicina (0,5 mg / mL) per 1 settimana.
- Determinare l'intensità della fluorescenza GFP in ciascuno dei cloni cellulari ES-D3 trasfettate utilizzando FACS, seguendo il protocollo del produttore. Selezionare i cloni ES-D3 che esprimono GM-CSF o il vettore vuoto con alti livelli di fluorescenza verde.
- Determinare le quantità di GM-CSF secrete dalle cellule ES-D3 utilizzando un kit ELISA GM-CSF murino, seguendo il protocollo del produttore.
4. Isolamento delle vescicole extracellulari arricchite con esosomi
- Coltura delle cellule ES-D3 (1 x 107) in piatti di coltura tissutale da 15 cm per 72 ore a 37 °C. Raccogliere il surnatante di coltura cellulare. Conservare il surnatante raccolto a 4 °C fino a 1 settimana per mantenere l'integrità esosomiale.
- Centrifugare il surnatante di coltura cellulare a 5.000 x g per 60 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga per sedimentare grandi frammenti cellulari.
- Raccogliere il surnatante e la centrifuga a 100.000 x g per 90 minuti a 4 °C utilizzando un ultracentrifuga.
- Rimuovere il surnatante. Risciacquare delicatamente ogni pellet due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 1 mL) per rimuovere il surnatante residuo di coltura.
- Ripresa di ogni pellet in PBS. Quantificare gli EV arricchiti con esosomi in modo che il loro contenuto proteico5.
- Misurare la concentrazione proteica di EV arricchiti di esosomi con un test di acido bicinchoninico (BCA). La resa attesa di EV arricchiti con esosomi da cellule ES-D3 è di circa 4 μg di proteina/mL di surnatante di coltura cellulare. Risospendare gli EV arricchiti di esosomi in PBS (concentrazione proteica: ~ 6 μg / μL). Conservare i veicoli elettrici arricchiti di esosomi a -80 °C.
5. Caratterizzazione di vescicole extracellulari arricchite di esosomi mediante microscopia elettronica a trasmissione
NOTA: Studiare la composizione e la struttura degli EV arricchiti di esosomi isolati dalle ESC utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM)5.
- Fissare i veicoli elettrici arricchiti di esosomi (3-5 μg/μL) con una concentrazione finale di paraformaldeide di grado EM al 2% a temperatura ambiente per 2 ore.
- Caricare campioni fissi (10 μL) su griglie di rame con film di supporto al carbonio. Incubare i campioni con griglie di rame per 1 minuto, quindi scaricare le griglie con carta da filtro.
- Macchiare le griglie con una soluzione colorante seguendo il protocollo del produttore.
- Trasferire le griglie in un pezzo di carta da filtro utilizzando una pinzetta. Lasciare asciugare le griglie durante la notte a temperatura ambiente.
- Acquisire immagini al microscopio elettronico utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (ingrandimento 50.000x), seguendo il protocollo del produttore.
6. Valutazione delle vescicole extracellulari arricchite di esosomi mediante analisi western blot
- Preparare estratti di cellule intere.
- Rimuovere il mezzo dalle cellule ES-D3 coltivate in piatti da 15 cm. Lavare le cellule con tripsina (5 ml; 0,05%). Aggiungere tripsina (5 ml) alle cellule. Incubare a 37 °C per 5 min. Raccogliere le cellule e aggiungere terreno di coltura fresco (5 ml) per neutralizzare la tripsina. Centrifugare le celle a 390 x g per 5 min. Risuspendare le celle in PBS.
- Determinare i numeri di cella utilizzando un emocitometro. Centrifugare nuovamente le celle a 390 x g per 5 min. Sospendare le celle nel buffer di caricamento SDS-PAGE contenente lo 0,5% di SDS (5.000 celle/μL).
- Sonicare i campioni per 10 s utilizzando un sonicatore con ampiezza del 10% (wattaggio: 500 W; frequenza ultrasonica: 20 kHz). Riscaldare i campioni a 100 °C per 5 min.
- Prepara i lisi dei veicoli elettrici arricchiti di esosomi.
- Riesemere i veicoli elettrici arricchiti di esosomi nel buffer di caricamento SDS-PAGE contenente lo 0,5% di SDS ad una concentrazione di 1,2 μg/μL.
- Sonicare i campioni per 10 s utilizzando un sonicatore con ampiezza del 10% (wattaggio: 500 W; frequenza ultrasonica: 20 kHz). Riscaldare i campioni a 100 °C per 5 min.
- Rileva le proteine da Western blot.
- Caricare estratti di cellule intere (10 μL; 5.000 cellule/μL) e losati EV arricchiti con esosomi (10 μL; 1,2 μg/μL) in ciascun pozzet di un gel Bis-Tris PAGE (4-20%). Trasferire le proteine sulle membrane di polivinilidene fluoruro (PVDF).
- Incubare le membrane con anticorpi primari e secondari appropriati. Anticorpi diluiti (alle concentrazioni indicate di seguito) in tampone tampone contenente PBS, Tween-20 (0,2%) e latte secco non grasso (10% p/v).
- Utilizzare i seguenti anticorpi primari: anti-Annexin V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-citocromo c (100 ng/mL), anti-proteina disolfuro isomerasi (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) e anti-Oxphos COX IV-subunità IV (600 ng/mL).
- Utilizzare i seguenti anticorpi secondari: IgG di capra coniugata con perossidasi anti-coniglio (20 ng/mL) e IgG di capra coniugata con perossidasi (20 ng/mL).
- Rileva le proteine utilizzando un kit di rilevamento della chemiluminescenza avanzato.
7. Determinazione delle concentrazioni di GM-CSF nelle vescicole extracellulari arricchite di esosomi mediante ELISA
NOTA: Valutare le quantità di GM-CSF in veicoli elettrici arricchiti di esosomi mediante ELISA utilizzando un kit per GM-CSF murino, seguendo il protocollo del produttore con alcune modifiche.
- Rivestire la piastra ELISA con anticorpi di cattura. Trattare i veicoli elettrici arricchiti di esosomi (0,6 μg) in PBS da solo o PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) a temperatura ambiente per 30 min. Aggiungere i campioni trattati alla piastra ELISA rivestita e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la piastra con PBS da solo o PBS + 0,05% Tween-20.
- Aggiungere anticorpi di rilevamento ai campioni. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la piastra con PBS da solo o PBS + 0,05% Tween-20. Aggiungere Avidin-HRP agli esempi. Incubare a temperatura ambiente per 30 min. Lavare la piastra con PBS da solo o PBS + 0,05% Tween-20.
- Determinare le concentrazioni di GM-CSF in veicoli elettrici arricchiti di esosomi misurando l'assorbanza a 450 nm su un lettore di micropiasche.
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Representative Results
GM-CSF è sovraespresso nelle QCS murine.
Per sovraesprimere stabilmente GM-CSF nelle cellule ES-D3, il cDNA murino GM-CSF è stato clonato in un vettore di trasfezione per generare il vettore di espressione pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figura 1A). Il GM-CSF è stato sovraespresso nelle cellule ES-D3 per trasfezione e circa il 20% delle cellule ES-D3 trasfettate transitoriamente erano GFP-positive. I cloni cellulari che sovraesprimono stabilmente GM-CSF o il controllo del vettore vuoto sono stati acquisiti da FACS. Come mostrato nella Figura 1B,l'intensità di fluorescenza GFP di una linea cellulare ES-D3 che esprime GM-CSF o di una linea cellulare ES-D3 che esprime il vettore vuoto era molto più alta di quella delle loro controparti parentali. È stato effettuato un test ELISA per valutare le concentrazioni di GM-CSF nel surnatante di coltura cellulare di diverse linee cellulari (Figura 2). Le cellule ES-D3 che esprimono GM-CSF hanno prodotto livelli marcatamente più elevati di GM-CSF nella coltura cellulare surnatante rispetto al loro controllo vettoriale vuoto. Inoltre, la quantità di GM-CSF generata dalle cellule ES-D3 che esprimono GM-CSF era simile a quella dei fibroblasti STO che esprimono GM-CSF, come riportato in precedenza19.
Gli esosomi sono arricchiti in vescicole extracellulari derivate da ESC murine.
Il controllo vettoriale e le colture cellulari ES-D3 che esprimono GM-CSF sono stati ampliati ed è stato raccolto il surnatante di coltura cellulare. I veicoli elettrici sono stati isolati dopo diverse fasi di centrifugazione. I veicoli elettrici singoli sono stati valutati per la prima volta da TEM (Figura 3). Come mostrato nelle immagini TEM, i veicoli elettrici isolati contenevano vescicole di diverse dimensioni, che è comunemente osservato nei preparati esosomiali5. È importante sottolineare che i diametri delle singole vescicole erano 30-100 nm, in linea con i rapporti precedenti che descrivevano gli esosomi21. Inoltre, la presenza di esosomi nei veicoli elettrici è stata esaminata mediante Western blotting (Figura 4). L'espressione di marcatori esosomiali, tra cui CD81, annessina V e flotillina-1, è stata notevolmente migliorata negli EV isolati dalle cellule ES-D3 rispetto ai corrispondenti estratti di cellule intere (WCE). È importante sottolineare che non è stata rilevata la presenza di altri marcatori compartimentali subcellulari negli EV derivati da ES-D3, tra cui (1) la proteina disolfuro isomerasi (PDI) del reticolo endoplasmatico (ER), (2) i marcatori mitocondriali citocromo c e COX IV-subunità IV e (3) il marcatore citosolico GAPDH. Nel complesso, questi dati dimostrano che gli esosomi erano altamente arricchiti nei veicoli elettrici derivati da cellule ES-D3.
GM-CSF è localizzato all'interno di vescicole extracellulari arricchite di esosomi isolate da ESC.
Per determinare se gli EV arricchiti di esosomi contengono molecole GM-CSF, è stato condotto un test ELISA per valutare i livelli di GM-CSF in EV arricchiti di esosomi acquisiti da cellule ES-D3 con o senza espressione di GM-CSF (Figura 5). Per studiare ulteriormente la localizzazione delle proteine GM-CSF all'interno di EV arricchiti di esosomi, i livelli di GM-CSF sono stati quantificati in EV arricchiti di esosomi in diverse condizioni di lavaggio da ELISA. A tale scopo, il detergente Tween-20 (0,05%) è stato inizialmente impiegato per permeabilizzare le membrane esosomiali e i saggi ELISA sono stati eseguiti nei tamponi con o senza 0,05% Tween-20. Poiché Tween-20 è noto per ridurre le interazioni proteina-proteina, i livelli di fondo GM-CSF rilevati nei veicoli elettrici di controllo sono stati significativamente ridotti da Tween-20 nel tampone di lavaggio. Al contrario, i livelli di GM-CSF nei veicoli elettrici delle cellule che esprimono GM-CSF sono stati significativamente aumentati da Tween-20. Questi risultati dimostrano che la permeabilizzazione della membrana esosomiale indotta da Tween-20 rende le molecole GM-CSF all'interno delle vescicole accessibili per il riconoscimento anticorpale, fornendo la prova che la maggior parte delle molecole esosomiali GM-CSF sono localizzate all'interno del lume di vescicole isolate.
Figura 1: Il GM-CSF esogeno è stabilmente sovraespresso nelle cellule ES-D3.
(A) Il diagramma schematico del plasmide per la sovraespressione murina GM-CSF nelle cellule ES-D3, in cui un promotore EF1α guida l'espressione GM-CSF e hrGFP funge da marcatore di espressione.
(B) L'intensità di fluorescenza della GFP nelle cellule ES-D3 che esprimono GM-CSF o nelle loro controparti vuote di controllo vettoriale è stata determinata dal FACS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le cellule ES-D3 che sovraesprimono GM-CSF producono alti livelli di GM-CSF.
Le concentrazioni di GM-CSF nel mezzo delle cellule indicate sono state misurate mediante ELISA. I dati sono presentati come deviazioni standard ± media (media ± SD) di tre misurazioni ELISA indipendenti: **p < 0,001, NS = non significativo, ANOVA con il test di confronto multiplo di Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le vescicole extracellulari derivate da ES-D3 vengono esaminate mediante microscopia elettronica a trasmissione.
Le vescicole extracellulari sono state preparate da cellule ES-D3 trasfettate con il plasmide che esprime GM-CSF o la sua controparte vettoriale vuota. Le frecce indicano le singole vescicole. Barra della scala = 100 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: I marcatori esosomiali sono altamente concentrati nelle vescicole extracellulari isolate dalle cellule ES-D3.
Le quantità di marcatori per esosomi, reticolo endoplasmatico (ER), mitocondri e citosol negli estratti di cellule intere (WCE) e EV indicati sono state valutate mediante Western blotting. PDI = proteina disolfuro isomerasi. I marcatori di peso molecolare (kD) sono sulla sinistra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Valutazione dei livelli di GM-CSF in vescicole extracellulari arricchite con esosomi.
I livelli di GM-CSF nei veicoli elettrici arricchiti di esosomi indicati sono stati determinati in diverse condizioni ELISA. I veicoli elettrici arricchiti con esosomi sono stati pretrattati con o senza 0,05% di Tween-20. ELISA è stato effettuato utilizzando tampone di lavaggio contenente solo PBS o PBS + 0,05% Tween-20. I dati sono presentati come la media ± SD di tre saggi ELISA indipendenti. *p < 0,05, **p < 0,005, ANOVA con il test di confronto multiplo di Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo studio mostra un metodo altamente efficiente per produrre EV arricchiti di esosomi che trasportano la proteina immunostimolante GM-CSF, che può essere impiegata per studiare gli effetti immunomodulanti dei veicoli elettrici arricchiti di esosomi. Diversi studi suggeriscono che gli esosomi esibiscono funzioni immuno-regolatorie eantitumorali 22. Pertanto, gli esosomi delle ESC che esprimono GM-CSF potrebbero anche possedere attività biologiche che regolano la risposta immunitaria. In questo protocollo, il GM-CSF murino esogeno è stato stabilmente sovraespresso nelle cellule murine ES-D3 per trasfezione (Figura 1). È importante sottolineare che quantità significative di GM-CSF sono state rilevate in VEICOLI elettrici arricchiti di esosomi isolati da cellule ES-D3 che sovraesprimono GM-CSF (Figura 5).
Questi dati suggeriscono che quasi tutti i GM-CSF risiedono all'interno di veicoli elettrici arricchiti di esosomi. Come citochina, la maggior parte della proteina GM-CSF viene secreta extracellulare11. Come altri materiali di carico esosomiali (ad esempio, mRNA, miRNA e proteine), le molecole GM-CSF nel citosol sono incapsulate nelle vescicole intraluminali (ILV) di corpi multivescicolari (MVB)6,23. Dopo la fusione di MVB con la membrana plasmatica, gli ILV portatori di GM-CSF vengono rilasciati nello spazio extracellulare.
Un passo importante in questo protocollo è quello di sovraesprimere efficacemente GM-CSF nelle cellule murine ES-D3 (Figura 2). I precedenti sforzi per raggiungere questo obiettivo con l'infezione retrovirale sono in gran parte falliti, probabilmente a causa della soppressione dell'espressione genica retrovirale a livello trascrizionale nelle MSC24. Tra i diversi promotori virali e cellulari esaminati, il promotore ef1α umano ha mostrato l'attività più robusta nelle cellule ES-D3. È importante sottolineare che l'espressione transgenica sotto il controllo del promotore EF1α è rimasta stabile dopo la coltura cellulare a lungo termine di cellule ES-D3 trasfettate. Per esprimere il GM-CSF esogeno in un altro tipo di cellula, sono necessari ulteriori studi per valutare l'efficienza di vari promotori. L'applicazione di questo metodo per isolare gli EV arricchiti di esosomi contenenti GM-CSF può essere estesa ad altri tipi di cellule staminali e alle cellule tumorali progettate per esprimere varie citochine. Come GM-CSF, la maggior parte delle citochine sono secrete extracellulare25. Pertanto, una possibile limitazione di questo approccio è che la quantità di una data citochina accumulata in EV arricchiti di esosomi è troppo bassa per mostrare la sua attività biologica. Per una particolare citochina, è necessario effettuare nuovi studi per ottimizzarne il livello proteico e l'attività biologica negli EV arricchiti di esosomi.
L'ostacolo più critico in questo studio è la generazione di cloni di ES-D3 che sovraesprimono GM-CSF. Per mantenere lo stato pluripotenziale e promuovere la proliferazione cellulare in vitro, le SC murine vengono generalmente coltivate in presenza di cellule feeder26. Per acquisire esosomi esclusivamente da ESC, è stato utilizzato un protocollo feeder-cell-free per la coltura di ESC27. In questo studio, le cellule ES-D3 sono state coltivate in piatti rivestiti di gelatina utilizzando un mezzo integrato con LIF. L'efficienza della piastra e la proliferazione di singoli cloni di cellule ES-D3 in questa condizione di coltura erano estremamente basse, rendendo molto difficile generare cloni ES-D3 da singole cellule. L'aggiunta del mezzo condizionale ottenuto da cellule ES-D3 parentali non è riuscita a salvare il deficit di proliferazione delle singole cellule ES-D3 placcate. Per superare questa limitazione, le singole cellule ES-D3 che sovraesprimono GM-CSF sono state placcate insieme alle cellule ES-D3 parentali. Questo approccio di placcatura ha migliorato la vitalità dei singoli cloni di ES-D3 che esprimono GM-CSF, facilitando la proliferazione e l'espansione clonale. Una volta trasfettato, singoli cloni di ES-D3 apparentemente attaccati a piastre di coltura tissutale. Hanno proliferato indipendentemente dalla presenza di altre cellule ES-D3, poiché le cellule ES-D3 parentali sono state eliminate 48 ore dopo essere state placcate, consentendo solo alle singole cellule ES-D3 trasfettate di crescere.
Nel complesso, è stato sviluppato un protocollo per generare con successo veicoli elettrici arricchiti di esosomi che trasportano GM-CSF da ESC con il potenziale per stimolare la risposta immunitaria in diverse condizioni di malattia. Inoltre, il nostro studio pubblicato di recente dimostra che gli EV arricchiti di esosomi contenenti GM-CSF provenienti da ESC possono servire come vaccino profilattico privo di cellule contro il cancro28.
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Disclosures
Kavitha Yaddanapudi, Chi Li e John W. Eaton hanno presentato una domanda di brevetto statunitense "Composizioni comprendenti esosomi derivati da cellule staminali embrionali ingegnerizzate e metodi di utilizzo degli stessi".
Acknowledgments
Siamo grati al signor Arkadiusz Slusarczyk e al Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) per l'acquisizione di immagini al microscopio elettronico a trasmissione. Questo lavoro è stato supportato in parte da sovvenzioni di NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 e CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) e Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
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