Summary
Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die immunstimulierende Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren aus embryonalen Stammzellen tragen.
Abstract
Embryonale Stammzellen (ESCs) sind pluripotente Stammzellen, die sich selbst erneuern und in alle Arten von embryonalen Zellen differenzieren können. Wie viele andere Zelltypen setzen ESCs kleine Membranvesikel wie Exosomen an die extrazelluläre Umgebung frei. Exosomen dienen als essentielle Mediatoren der interzellulären Kommunikation und spielen eine grundlegende Rolle in vielen (patho)physiologischen Prozessen. Der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) fungiert als Zytokin, um die Immunantwort zu modulieren. Das Vorhandensein von GM-CSF in Exosomen hat das Potenzial, ihre immunregulatorische Funktion zu stärken. Hier wurde GM-CSF in der murinen ESC-Zelllinie ES-D3 stabil überexprimiert. Es wurde ein Protokoll entwickelt, um hochwertige exosomenangereicherte extrazelluläre Vesikel (EVs) aus ES-D3-Zellen zu isolieren, die GM-CSF überexprimieren. Isolierte exosomenangereicherte EVs wurden durch eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen charakterisiert. Wichtig ist, dass signifikante Mengen an GM-CSF in exosomenangereicherten Elektrofahrzeugen vorhanden sind. Insgesamt könnten GV-CSF-tragende Exosomen-angereicherte EVs aus ESCs als zellfreie Vesikel fungieren, um ihre immunregulatorischen Aktivitäten auszuüben.
Introduction
ESCs werden aus dem Blastozystenstadium eines Präimplantationsembrionsembrosabgeleitet 1. Als pluripotente Stammzellen haben ESCs die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und sich in jede Art von embryonalen Zellen zu differenzieren. Aufgrund ihres bemerkenswerten Entwicklungspotenzials und ihrer langfristigen Proliferationsfähigkeit sind ESCs für die biomedizinische Forschung äußerst wertvoll1. Aktuelle Forschungsbemühungen haben sich weitgehend auf das therapeutische Potenzial von ESCs für eine Vielzahl von schweren pathologischen Erkrankungen konzentriert, einschließlich Diabetes, Herzerkrankungen und neurodegenerative Erkrankungen2,3,4.
Es ist bekannt, dass Säugetierzellen, einschließlich ESCs, Vesikel mit unterschiedlicher Größe an die extrazelluläre Umgebung abgeben, und diese EVs besitzen aufgrund ihrer Rolle in der interzellulären Kommunikation viele physiologische und pathologische Funktionen5. Unter den verschiedenen Subtypen von EVs sind Exosomen kleine Membranvesikel, die bei der Fusion von intermediären endozytären Kompartimenten, multivesikulären Körpern (MVBs), mit der Plasmamembran von verschiedenen Zelltypen in den extrazellulären Raum freigesetzt werden6. Es wurde berichtet, dass Exosomen interzelluläre Kommunikation vermitteln und an vielen (patho)physiologischen Prozessen beteiligt sind7,8. Exosomen erben einige biologische Funktionen von ihren eigenen Elternzellen, da Exosomen biologische Materialien enthalten, die aus dem Zytosol gewonnen werden, einschließlich Proteine und Nukleinsäuren. So werden die assoziierten Antigene oder Faktoren, die die für eine bestimmte Krankheit spezifische Immunantwort stimulieren, in den Exosomen bestimmter Zelltypen eingekapselt9. Dies ebnete den Weg für klinische Studien, in die tumorabgeleitete Exosomen als Krebsimpfstoff untersucht wurden10.
GM-CSF ist ein Zytokin, das von verschiedenen Arten von Immunzellen abgesondert wird11. Neue Erkenntnisse zeigen, dass GM-CSF das Immunsystem aktiviert und reguliert und eine wesentliche Rolle im Antigen-Präsentationsprozess spielt12. Zum Beispiel legt ein klinischer Bericht nahe, dass GM-CSF die Immunantwort auf Tumore als Impfstoffadjuvans stimuliert13. Mehrere GM-CSF-basierte Krebsimmuntherapiestrategien, um die starke immunstimulierende Aktivität von GM-CSF zu nutzen, wurden in klinischen Studien untersucht14. Unter diesen hat sich ein Krebsimpfstoff, der aus bestrahlten GM-CSF-sezernierenden Tumorzellen besteht, bei fortgeschrittenen Melanompatienten als vielversprechend erwiesen, indem er zelluläre und humorale Antitumorreaktionen und anschließende Nekrose bei metastasierten Tumoren induziert15.
Da die aus ESCs gewonnenen Exosomen ähnliche biologische Aktivitäten besitzen wie die ursprünglichen ESCs, könnten GM-CSF-tragende Exosomen aus ESCs als zellfreie Vesikel fungieren, um die Immunantwort zu regulieren. In diesem Artikel wird eine detaillierte Methode zur Herstellung hochwertiger exosomenangereicherter EVs aus ESCs beschrieben, die GM-CSF exprimieren. Diese exosomenangereicherten EVs haben das Potenzial, als immunregulatorische Vesikel zu dienen, um die Immunantwort zu modulieren.
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Protocol
1. Kultivierung von ES-D3-Zellen
- Um exosomenfreies fetales Rinderserum (FBS) zu erzeugen, laden Sie FBS in eine Ultrazentrifuge und Zentrifuge bei 100.000 x g für 16 h bei 4 °C. Sammeln Sie nach der Zentrifugation Serumüberstand als exosomenfreies FBS, um die murine ESC-Zelllinie ES-D3 zu kultivieren und exosomenangereicherte EVs zu erhalten.
- Bevor Sie die ES-D3-Zellen plattieren, beschichten Sie 15 cm Gewebekulturschalen mit Gelatine (0,1%) bei Raumtemperatur für 30 min.
- Nach einem zuvor beschriebenen Protokoll16werden die ES-D3-Zellen ohne Feederschichtzellen in den gelatinebeschichteten 15 cm Gewebekulturschalen kultiviert. Das ES-D3-Zellkulturmedium besteht aus DMEM, exosomenfreiem FBS (15%), nicht essentiellen Aminosäuren (0,1 mM), L-Glutamin (2 mM), β-Mercaptoethanol (0,1 mM), Penicillin (50 Einheiten/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und Leukämie-inhibitorischem Faktor (LIF; 100 Einheiten/ml). Kulturieren Sie ES-D3-Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator.
- Sobald die ES-D3-Zellen in 15 cm Gewebekulturschalen etwa 90% Konfluenz erreicht haben, entfernen Sie das Medium durch Aspiration. Waschen Sie die Zellen mit Trypsin (5 ml; 0,05%). Trypsin (5 ml) in das Geschirr geben und bei 37 °C 5 min inkubieren. Sammeln Sie die Zellen aus dem Geschirr.
- Fügen Sie den gesammelten Zellen frisches Kulturmedium (5 ml) hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 390 x g für 5 min. Resuspendieren Sie die Zellen in frischem Medium und bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
- Für passagierende Zellen die ES-D3-Zellen (5 x 106)in einer gelatinebeschichteten (0,1%) 15 cm Gewebekulturschale mit frischem Medium (15 ml) zugeben und 3 Tage lang kulturieren, bevor die Zellen subkulturiert werden.
- Um den Zellkulturüberstand zur Isolierung von exosomenangereicherten EVs zu sammeln, tafeln Sie die ES-D3-Zellen (1 x10 7)in einer gelatinebeschichteten (0,1%) 15 cm Gewebekulturschale mit frischem Medium (15 ml) für 3 Tage vor dem Sammeln von Zellkulturüberstand.
2. Erzeugung von GM-CSF-Expressionsplasmid
HINWEIS: Generieren Sie das Transfektionsplasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, um GM-CSF in ES-D3-Zellen zu überexprimieren. In diesem Plasmid wird die Expression von muriner GM-CSF cDNA zusammen mit dem Markerprotein humanisiert Renilla reniformis GFP (hrGFP) durch den humanen Polypeptidkettendehnungsfaktor 1α (EF1α) Promotor17,18angetrieben.
- Generieren Sie das Vektor-Backbone.
- Verdauen Sie das Plasmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg DNA) mit dem Restriktionsenzym EcoRI (100 Einheiten) bei 37 °C für 2 h, um zwei DNA-Fragmente zu erzeugen: das Vektorrückgrat (6,0 kb) und den FD3ER-Insert (2,5 kb).
- 50% der verdauten Plasmid-DNA (10 μg) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit alkalischer Phosphatase (20 Einheiten) bei 37 °C für 1 h behandeln. Lösen Sie sowohl unbehandelte als auch dephosphorylierte DNA mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese (2%) auf.
- Reinigen Sie die Vektor-Backbone-DNA-Fragmente (6,0 kb) mit einem DNA-Gel-Extraktionskit. Während das unbehandelte Vektorrückgrat als leerer Vektor (pEF1α-IRES-hrGFP) dient, wird das dephosphorylierte Vektorrückgrat verwendet, um GM-CSF-exprimierendes Plasmid (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP) zu erzeugen.
- Generieren Sie den GM-CSF cDNA-Einsatz.
- Verdauen Sie das Plasmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) mit dem Restriktionsenzym EcoRI (100 Einheiten) bei 37 °C für 2 h, um zwei DNA-Fragmente zu produzieren: das Vektorrückgrat (6,5 kb) und den murinen GM-CSF cDNA-Insert (474 bp).
- Lösen Sie die verdaute DNA durch Agarosegelelektrophorese auf (2%). Reinigen Sie das murine GM-CSF cDNA-Fragment (474 bp) mit einem DNA-Gel-Extraktionskit.
- Generieren Sie die Ausdrucksplasmide.
- Richten Sie 2 Ligationsreaktionen (10 μL Gesamtvolumen) mit einem DNA-Ligationskit ein.
- Um den leeren Vektor pEF1α-IRES-hrGFP zu erzeugen, ligatieren Sie das unbehandelte Vektorrückgrat aus Schritt 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng).
- Um pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP zu erzeugen, ligatieren Sie die folgenden DNA-Fragmente: (1) das dephosphorylierte Vektor-Backbone aus Schritt 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) und (2) das in Schritt 2.2.2 erzeugte mGM-CSF cDNA-Fragment (474 bp; 200 ng).
- Ligate bei 25 °C für 5 min. Umwandlung von ligierter DNA in DH5α-kompetente E. coli-Zellen. Platten sie die transformierten E. coli-Zellen auf LB-Agarplatten, die Carbenicillin (50 μg/ml) enthalten.
- Reinigen Sie Plasmide aus einzelnen E. coli-Kolonien mit einem DNA-Isolationskit. Validieren Sie die Identitäten der Plasmide durch DNA-Sequenzierung.
- Richten Sie 2 Ligationsreaktionen (10 μL Gesamtvolumen) mit einem DNA-Ligationskit ein.
3. Erzeugung von ES-D3-Zellen, die GM-CSF überexprimieren
HINWEIS: Transfizieren Sie die ES-D3-Zellen mit dem Plasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, um GM-CS zu überexprimieren. Kotransfektieren Sie das Plasmid pBabe-Neo in ES-D3-Zellen, um die Selektion stabil transfizierter Zellen zu erleichtern18,20.
- Transfizieren Sie die Plasmide in die ES-D3-Zellen.
- Die ES-D3-Zellen (1,4 x 106)werden in einer gelatinebeschichteten (0,1%) 10 cm Gewebekulturschale mit Kulturmedium (10 ml) zur Transfektion mit Platte geben. Kulturbeschichtete ES-D3-Zellen bei 37 °C für 24 h.
- Zwei Plasmidmischungen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen werden hergestellt: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, Vektorkontrolle) mit pBabe-Neo (4 μg) und (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, exprimiert GM-CSF) mit pBabe-Neo (4 μg). Führen Sie die Transfektion mit einem Transfektionskit nach dem Protokoll des Herstellers durch.
- Transfektionsmedium (1 ml) und Transfektionsreagenz (64 μL) in jedes Röhrchen, das die Plasmidmischungen enthält, geben und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.
- Fügen Sie die Transfektionsmischungen zu den jeweiligen 10 cm Schalen aus ES-D3-Zellen hinzu. Bei 37 °C für 5 h inkubieren.
- Ersetzen Sie das Medium in 10 cm Geschirr durch frisches Kulturmedium (10 ml). Bei 37 °C 24 h inkubieren.
- Erzeugen Sie Massenpopulationen von stabil transfizierten ES-D3-Zellen.
- Entfernen Sie das Medium aus transfizierten ES-D3-Zellen. Waschen Sie die Zellen mit Trypsin (2 ml; 0,05%). Trypsin (2 ml) hinzufügen und bei 37 °C 5 min inkubieren. Die Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und 2 ml frisches Kulturmedium hinzufügen, um Trypsin zu neutralisieren. Zentrifuge bei 390 x g für 5 min.
- Resuspendieren Sie die transfizierten Zellen in frischem Kulturmedium (10 ml). Bewerten Sie die Fluoreszenzintensität von GFP in transfizierten ES-D3-Zellen mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Die transfizierten Zellen werden in zwei 10 cm große Schalen mit frischem Kulturmedium (10 ml) überführen. Fügen Sie Neomycin (0,5 mg / ml) hinzu, um nicht transfizierte Zellen zu beseitigen.
- Setzen Sie die Kultivierung der transfizierten Zellen in einem Kulturmedium fort, das Neomycin (0,5 mg/ml) enthält. Wenn das transfizierte ES-D3 90% Konfluenz erreicht, übertragen Sie die Zellen wieder auf 15 cm Gewebekulturschalen. Wiederholen Sie den Vorgang für 2 Wochen.
- Generieren Sie Klone von stabil transfizierten ES-D3-Zellen.
- Sobald Massenpopulationen von stabil transfizierten ES-D3-Zellen erzeugt wurden, sammeln Sie die Zellen wie zuvor. Bestimmen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 390 x g für 5 min. Die Zellen (1 x 107 Zellen/ml) werden in frischem Kulturmedium resuspendiert.
- Filtern Sie die Zellen durch ein steriles 40 μm Zellsieb. Reinigen Sie GFP-positive ES-D3-Zellen mit FACS gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Eine einzelne sortierte ES-D3-Zelle wird in eine Vertiefung einer gelatinebeschichteten (0,1%) 96-Well-Gewebekulturplatte mit elterlichen ES-D3-Zellen (1 x 103)in neomycinfreiem Medium (200 μL) einbeschichtet. Die Co-Kultivierung transfizierter ES-D3-Zellen mit ihren nicht transfizierten elterlichen Gegenstücken stellt sicher, dass stabil transfizierte einzelne ES-D3-Zellen überleben und sich als einzelner Klon vermehren.
- Kulturieren Sie die Zellen für 48 h und fügen Sie dann Neomycin (0,5 mg / ml) zu 96-Well-Platten hinzu, um nicht transfizierte elterliche ES-D3-Zellen zu eliminieren.
- Setzen Sie die Kultivierung der GFP-positiven ES-D3-Zellen in 96-Well-Gewebekulturplatten mit Neomycin-haltigem Medium (0,5 mg/ ml) für 1 Woche fort. Klonale ES-D3-Zelllinien für 1 Woche in gelatinebeschichtete (0,1%) 6 cm Gewebekulturschalen mit Kulturmedium (5 ml) übertragen, das Neomycin (0,5 mg/ml) enthält.
- Bestimmen Sie die Intensität der GFP-Fluoreszenz in jedem der transfizierten ES-D3-Zellklone mithilfe von FACS gemäß dem Protokoll des Herstellers. Wählen Sie die ES-D3-Klone aus, die entweder GM-CSF oder den leeren Vektor mit hoher grüner Fluoreszenz exprimieren.
- Bestimmen Sie die Mengen an GM-CSF, die von ES-D3-Zellen mit einem murinen GM-CSF-ELISA-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers ausgeschieden werden.
4. Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln
- Die ES-D3-Zellen (1 x 107)in 15 cm Gewebekulturschalen für 72 h bei 37 °C anzüchten. Sammeln Sie den Zellkulturüberstand. Lagern Sie gesammelte Überstände bei 4 °C bis zu 1 Woche, um die exosomale Integrität zu erhalten.
- Zentrifugieren Sie den Zellkulturüberstand bei 5.000 x g für 60 min bei 4 °C mit einer Zentrifuge, um große Zellfragmente zu sedimentieren.
- Überstand und Zentrifuge bei 100.000 x g für 90 min bei 4 °C mit einer Ultrazentrifuge sammeln.
- Entfernen Sie den Überstand. Spülen Sie jedes Pellet zweimal vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 1 ml) ab, um Restkulturüberstände zu entfernen.
- Resuspend jedes Pellet in PBS. Quantifizierung exosomenangereicherter EVs anhand ihres Proteingehalts5.
- Messen Sie die Proteinkonzentration von exosomenangereicherten EVs mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay. Die erwartete Ausbeute an exosomenangereicherten EVs aus ES-D3-Zellen beträgt etwa 4 μg Protein/ml Zellkulturüberstand. Resuspendieren Sie die exosomenangereicherten EVs in PBS (Proteinkonzentration: ~6 μg/μL). Lagern Sie die exosomenangereicherten EVs bei -80 °C.
5. Charakterisierung exosomenangereicherter extrazellulärer Vesikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie
HINWEIS: Untersuchen Sie die Zusammensetzung und die Struktur der exosomenangereicherten EVs, die aus ESCs isoliert wurden, mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)5.
- Fixieren Sie die mit Exosomen angereicherten EVs (3-5 μg/μL) mit einer Endkonzentration von 2% Paraformaldehyd in EM-Qualität bei Raumtemperatur für 2 h.
- Laden Sie feste Proben (10 μL) auf Kupfergitter mit Kohlenstoffträgerfolie. Inkubieren Sie die Proben mit Kupfergittern für 1 minute und entleeren Sie die Gitter dann mit Filterpapier.
- Färben Sie die Gitter mit einer Färbelösung nach dem Protokoll des Herstellers.
- Die Gitter mit einer Pinzette auf ein Stück Filterpapier übertragen. Lassen Sie die Gitter über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
- Erfassen Sie elektronenmikroskopische Bilder mit einem Transmissionselektronenmikroskop (50.000-fache Vergrößerung) nach dem Protokoll des Herstellers.
6. Bewertung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln durch Western Blot-Analyse
- Bereiten Sie ganzzellige Extrakte vor.
- Entfernen Sie das Medium aus ES-D3-Zellen, die in 15 cm Geschirr kultiviert wurden. Waschen Sie die Zellen mit Trypsin (5 ml; 0,05%). Fügen Sie Trypsin (5 ml) zu den Zellen hinzu. Bei 37 °C 5 min inkubieren. Sammeln Sie die Zellen und fügen Sie frisches Kulturmedium (5 ml) hinzu, um Trypsin zu neutralisieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 390 x g für 5 min. Resuspendieren Sie die Zellen in PBS.
- Bestimmen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 390 x g für 5 min. Resuspendieren Sie die Zellen im SDS-PAGE Ladepuffer mit 0,5% SDS (5.000 Zellen/μL).
- Beschallen Sie die Proben für 10 s mit einem Ultraschallgerät mit 10% Amplitude (Wattzahl: 500 W; Ultraschallfrequenz: 20 kHz). Die Proben 5 min bei 100 °C erhitzen.
- Bereiten Sie die Lysate von exosomenangereicherten EVs vor.
- Die exosomenangereicherten EVs in SDS-PAGE-Ladepuffer mit 0,5% SDS in einer Konzentration von 1,2 μg/μL wieder aufsempfunden.
- Beschallen Sie die Proben für 10 s mit einem Ultraschallgerät mit 10% Amplitude (Wattzahl: 500 W; Ultraschallfrequenz: 20 kHz). Die Proben 5 min bei 100 °C erhitzen.
- Erkennen Sie Proteine durch Western Blot.
- Laden Sie ganze Zellextrakte (10 μL; 5.000 Zellen/μL) und exosomenangereicherte EV-Lysate (10 μL; 1,2 μg/μL) in jede Vertiefung eines Bis-Tris PAGE Gels (4-20%). Übertragen Sie Proteine auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen.
- Inkubieren Sie Membranen mit geeigneten primären und sekundären Antikörpern. Verdünnte Antikörper (in den unten angegebenen Konzentrationen) in Blotting-Puffern, die PBS, Tween-20 (0,2%) und fettfreie Trockenmilch (10% w/v) enthalten.
- Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper: Anti-Annexin V (200 ng/ml), Anti-CD81 (50 ng/ml), Anti-Flotillin-1 (200 ng/ml), Anti-Cytochrom c (100 ng/ml), Antiproteindisulfid-Isomerase (200 ng/ml), Anti-GAPDH (33 ng/ml) und Anti-Oxphos COX IV-Untereinheit IV (600 ng/ml).
- Verwenden Sie die folgenden sekundären Antikörper: Peroxidase-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (20 ng / ml) und Peroxidase-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (20 ng / ml).
- Erkennen Sie Proteine mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Erkennungskit.
7. Bestimmung der GV-CSF-Konzentrationen in exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln mittels ELISA
HINWEIS: Bewerten Sie die Mengen an GM-CSF in exosomenangereicherten Elektrofahrzeugen mittels ELISA unter Verwendung eines Kits für murines GM-CSF nach dem Protokoll des Herstellers mit einigen Änderungen.
- Beschichten Sie die ELISA-Platte mit Capture-Antikörpern. Behandeln Sie exosomenangereicherte EVs (0,6 μg) in PBS allein oder PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) bei Raumtemperatur für 30 min. Behandelte Proben auf die beschichtete ELISA-Platte geben und bei Raumtemperatur 1 h lang inkubieren. Waschen Sie die Platte mit PBS allein oder PBS + 0,05% Tween-20.
- Fügen Sie den Proben Nachweisantikörper hinzu. Bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren. Waschen Sie die Platte mit PBS allein oder PBS + 0,05% Tween-20. Fügen Sie Avidin-HRP zu den Beispielen hinzu. Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren. Waschen Sie die Platte mit PBS allein oder PBS + 0,05% Tween-20.
- Bestimmen Sie die Konzentrationen von GM-CSF in exosomenangereicherten Elektrofahrzeugen, indem Sie die Absorption bei 450 nm auf einem Mikroplattenleser messen.
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Representative Results
GM-CSF wird in murinen ESCs überexprimiert.
Um GM-CSF in ES-D3-Zellen stabil zu überexprimieren, wurde murine GM-CSF cDNA in einen Transfektionsvektor geklont, um den Expressionsvektor pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP zu erzeugen (Abbildung 1A). GM-CSF wurde in ES-D3-Zellen durch Transfektion überexprimiert, und etwa 20% der transient transfizierten ES-D3-Zellen waren GFP-positiv. Zellklone, die GM-CSF oder die leere Vektorkontrolle stabil überexprimieren, wurden von FACS erworben. Wie in Abbildung 1Bgezeigt, war die GFP-Fluoreszenzintensität einer GM-CSF-exprimierenden ES-D3-Zelllinie oder einer ES-D3-Zelllinie, die den leeren Vektor exprimiert, viel höher als die ihrer elterlichen Gegenstücke. Ein ELISA-Assay wurde durchgeführt, um die GM-CSF-Konzentrationen im Zellkulturüberstand verschiedener Zelllinien zu bewerten (Abbildung 2). ES-D3-Zellen, die GM-CSF exprimierten, produzierten deutlich höhere Konzentrationen von GM-CSF im Zellkulturüberstand als ihre leere Vektorkontrolle. Darüber hinaus war die Menge an GM-CSF, die von GM-CSF-exprimierenden ES-D3-Zellen erzeugt wurde, ähnlich der von STO-Fibroblasten, die GM-CSF exprimieren, wie zuvor berichtet19.
Exosomen sind mit extrazellulären Vesikeln angereichert, die von murinen ESCs abgeleitet sind.
Vektorkontroll- und GM-CSF-exprimierende ES-D3-Zellkulturen wurden erweitert und Zellkulturüberstände gesammelt. Elektrofahrzeuge wurden nach mehreren Schritten der Zentrifugation isoliert. Einzelne Elektrofahrzeuge wurden zunächst von TEM bewertet (Abbildung 3). Wie in den TEM-Bildern gezeigt, enthielten isolierte EVs Vesikel unterschiedlicher Größe, was häufig in exosomalen Präparaten beobachtet wird5. Wichtig ist, dass die Durchmesser der einzelnen Vesikel 30-100 nm waren, was mit früheren Berichten übereinstimmt, die Exosomen21beschreiben. Des Weiteren wurde das Vorhandensein von Exosomen in EVs durch Western Blotting untersucht (Abbildung 4). Die Expression exosomaler Marker, einschließlich CD81, Annexin V und Flotillin-1, war in aus ES-D3-Zellen isolierten EVs im Vergleich zu entsprechenden Ganzzellextrakten (WCE) deutlich erhöht. Wichtig ist, dass das Vorhandensein anderer subzellulärer Kompartmentmarker in ES-D3-abgeleiteten EVs nicht nachgewiesen wurde, einschließlich (1) des endoplasmatischen Retikulum (ER) Markerproteins Disulfidisomerase (PDI), (2) der mitochondrialen Marker Cytochrom c und COX IV-Untereinheit IV und (3) des zytosolischen Markers GAPDH. Insgesamt zeigen diese Daten, dass Exosomen in EVs aus ES-D3-Zellen stark angereichert waren.
GM-CSF ist in exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln lokalisiert, die aus ESCs isoliert wurden.
Um festzustellen, ob exosomenangereicherte EVs GM-CSF-Moleküle enthalten, wurde ein ELISA-Assay durchgeführt, um die Konzentrationen von GM-CSF in exosomenangereicherten EVs zu bewerten, die aus ES-D3-Zellen mit oder ohne GM-CSF-Expression erworben wurden (Abbildung 5). Um die Lokalisierung von GM-CSF-Proteinen in exosomenangereicherten EVs weiter zu untersuchen, wurden die GM-CSF-Spiegel in exosomenangereicherten EVs unter verschiedenen Waschbedingungen mittels ELISA quantifiziert. Zu diesem Zweck wurde zunächst das Waschmittel Tween-20 (0,05%) zur Permeabilisierung der exosomalen Membranen eingesetzt und ELISA-Assays in den Puffern mit oder ohne 0,05% Tween-20 durchgeführt. Da bekannt ist, dass Tween-20 Protein-Protein-Interaktionen reduziert, wurden die in den Kontroll-EVs nachgewiesenen GM-CSF-Spiegel im Hintergrund durch Tween-20 im Waschpuffer signifikant reduziert. Im Gegensatz dazu waren die GM-CSF-Spiegel in den EVs von GM-CSF-exprimierenden Zellen signifikant durch Tween-20 erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Tween-20-induzierte exosomale Membranpermeabilisierung GM-CSF-Moleküle in den Vesikeln für die Antikörpererkennung zugänglich macht, was den Nachweis liefert, dass die Mehrheit der exosomalen GM-CSF-Moleküle im Lumen isolierter Vesikel lokalisiert ist.
Abbildung 1: Exogenes GM-CSF wird in ES-D3-Zellen stabil überexprimiert.
(A) Das schematische Diagramm des Plasmids zur Überexpression von murinem GM-CSF in ES-D3-Zellen, in dem ein EF1α-Promotor die GM-CSF-Expression antreibt und hrGFP als Expressionsmarker dient.
(B) Die Fluoreszenzintensität von GFP in GM-CSF-exprimierenden ES-D3-Zellen oder ihren leeren Vektorkontroll-Gegenstücken wurde durch FACS bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: ES-D3-Zellen, die GV-CSF überexprimieren, produzieren hohe Mengen an GM-CSF.
Die GM-CSF-Konzentrationen im Medium der angezeigten Zellen wurden mittels ELISA gemessen. Die Daten werden als mittlere ± Standardabweichungen (Mittelwert ± SD) von drei unabhängigen ELISA-Messungen dargestellt: **p < 0,001, NS = nicht signifikant, ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: ES-D3-abgeleitete extrazelluläre Vesikel werden mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht.
Extrazelluläre Vesikel wurden aus ES-D3-Zellen hergestellt, die mit dem Plasmid transfiziert wurden, das GM-CSF oder sein leeres Vektor-Gegenstück exprimiert. Pfeile zeigen einzelne Vesikel an. Maßstabsbalken = 100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Exosomale Marker sind hochkonzentriert in extrazellulären Vesikeln, die aus ES-D3-Zellen isoliert wurden.
Die Mengen an Markern für Exosomen, endoplasmatisches Retikulum (ER), Mitochondrien und Zytosol in den angegebenen Ganzzellextrakten (WCE) und EVs wurden durch Western Blotting bewertet. PDI = Proteindisulfidisomerase. Molekulargewichtsmarker (kD) befinden sich auf der linken Seite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bewertung der GM-CSF-Spiegel in exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln.
Die Gehalte an GM-CSF in den indizierten exosomenangereicherten EVs wurden unter verschiedenen ELISA-Bedingungen bestimmt. Exosomenangereicherte EVs wurden mit oder ohne 0,05% Tween-20 vorbehandelt. Der ELISA wurde mit einem Waschpuffer durchgeführt, der entweder nur PBS oder PBS + 0,05% Tween-20 enthielt. Die Daten werden als mittlere ± SD von drei unabhängigen ELISA-Assays dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,005, ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Studie zeigt eine hocheffiziente Methode zur Herstellung von exosomenangereicherten EVs, die das immunstimulierende Protein GM-CSF tragen, das zur Untersuchung der immunmodulatorischen Wirkungen von exosomenangereicherten EVs eingesetzt werden kann. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass Exosomen immunregulatorische und Anti-Tumor-Funktionen aufweisen22. So könnten Exosomen aus ESCs, die GV-CSF exprimieren, auch biologische Aktivitäten besitzen, die die Immunantwort regulieren. In diesem Protokoll wurde exogenes gemässmtes GM-CSF in murinen ES-D3-Zellen durch Transfektion stabil überexprimiert (Abbildung 1). Wichtig ist, dass signifikante Mengen an GM-CSF in exosomenangereicherten EVs nachgewiesen wurden, die aus ES-D3-Zellen isoliert wurden, die GM-CSF überexprimieren(Abbildung 5).
Diese Daten deuten darauf hin, dass sich fast alle gentechnisch veränderten Liquor in exosomenangereicherten Elektrofahrzeugen befindet. Als Zytokin wird der Großteil des GM-CSF-Proteins extrazellulär ausgeschieden11. Wie anderes exosomales Frachtmaterial (z. B. mRNAs, miRNAs und Proteine) sind GM-CSF-Moleküle im Zytosol in den intraluminalen Vesikeln (ILVs) von multivesikulären Körpern (MVBs) eingekapselt6,23. Bei der Fusion von MVBs mit der Plasmamembran werden GM-CSF-tragende ILVs in den extrazellulären Raum freigesetzt.
Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die effektive Überexpressung von GM-CSF in murinen ES-D3-Zellen (Abbildung 2). Frühere Bemühungen, dieses Ziel durch retrovirale Infektion zu erreichen, scheiterten weitgehend, wahrscheinlich wegen der Unterdrückung der retroviralen Genexpression auf den transkriptionellen Ebenen in ESCs24. Unter mehreren untersuchten viralen und zellulären Promotoren zeigte der menschliche EF1α-Promotor die robusteste Aktivität in ES-D3-Zellen. Wichtig ist, dass die Transgenexpression unter der Kontrolle des EF1α-Promotors nach einer langfristigen Zellkultur transfizierter ES-D3-Zellen stabil blieb. Um exogenes GM-CSF in einem anderen Zelltyp zu exprimieren, sind weitere Studien erforderlich, um die Wirksamkeit verschiedener Promotoren zu bewerten. Die Anwendung dieser Methode zur Isolierung von GM-CSF-tragenden Exosomen-angereicherten EVs kann auf andere Stammzelltypen sowie Tumorzellen ausgeweitet werden, die zur Exprimierung verschiedener Zytokine entwickelt wurden. Wie GM-CSF werden die meisten Zytokine extrazellulärausgeschieden 25. Daher besteht eine mögliche Einschränkung dieses Ansatzes darin, dass die Menge eines bestimmten Zytokins, die in exosomenangereicherten EVs angesammelt wird, zu niedrig ist, um seine biologische Aktivität zu zeigen. Für ein bestimmtes Zytokin müssen neue Studien durchgeführt werden, um seinen Proteingehalt und seine biologische Aktivität in exosomenangereicherten Elektrofahrzeugen zu optimieren.
Die kritischste Hürde in dieser Studie ist die Erzeugung von ES-D3-Klonen, die GM-CSF überexprimieren. Um den pluripotentialen Zustand aufrechtzuerhalten und die Zellproliferation in vitro zu fördern, werden murine ESCs im Allgemeinen in Gegenwart von Feederzellenkultiviert 26. Um Exosomen ausschließlich aus ESCs zu gewinnen, wurde ein feederzellfreies Protokoll zur Kultur von ESCs27 verwendet. In dieser Studie wurden ES-D3-Zellen in gelatinebeschichteten Schalen mit einem mit LIF ergänzten Medium kultiviert. Die Platteneffizienz und Proliferation einzelner Klone von ES-D3-Zellen unter dieser Kulturbedingung waren extrem gering, was es sehr schwierig machte, ES-D3-Klone aus einzelnen Zellen zu erzeugen. Die Zugabe des bedingten Mediums, das aus elterlichen ES-D3-Zellen gewonnen wurde, konnte den Proliferationsmangel von plattierten einzelnen ES-D3-Zellen nicht retten. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden einzelne ES-D3-Zellen, die GM-CSF überexprimieren, zusammen mit elterlichen ES-D3-Zellen plattiert. Dieser Beschichtungsansatz verbesserte die Lebensfähigkeit von GM-CSF-exprimierenden einzelnen ES-D3-Klonen und erleichterte die klonale Proliferation und Expansion. Einmal transfiziert, wurden offenbar einzelne ES-D3-Klone an Gewebekulturplatten befestigt. Sie vermehrten sich unabhängig von der Anwesenheit anderer ES-D3-Zellen, da die elterlichen ES-D3-Zellen 48 Stunden nach der Plattierung eliminiert wurden, so dass nur transfizierte einzelne ES-D3-Zellen wachsen konnten.
Insgesamt wurde ein Protokoll entwickelt, um erfolgreich exosomenangereicherte EVs zu erzeugen, die GM-CSF aus ESCs tragen und das Potenzial haben, die Immunantwort bei verschiedenen Krankheitszuständen zu stimulieren. Darüber hinaus zeigt unsere kürzlich veröffentlichte Studie, dass GV-CSF-tragende Exosomen-angereicherte EVs aus ESCs als zellfreier prophylaktischer Impfstoff gegen Krebs dienen können28.
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Disclosures
Kavitha Yaddanapudi, Chi Li und John W. Eaton reichten eine US-Patentanmeldung ein" mit "Compositions comprising engineered embryonic stem cell-derived exosomes and methods of use of it".
Acknowledgments
Wir danken Herrn Arkadiusz Slusarczyk und dem Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) für die Erfassung von Transmissionselektronenmikroskopischen Bildern. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse von NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 und CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) und Free to Breathe Research Grant (K.Y.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
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