Summary
Este estudo descreve um método para isolar vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fatores estimulantes da colônia de granulocitos imunes de células-tronco embrionárias.
Abstract
As células-tronco embrionárias (ESCs) são células-tronco pluripotentes capazes de auto-renovação e diferenciação em todos os tipos de células embrionárias. Como muitos outros tipos de células, os ESCs liberam pequenas vesículas de membrana, como exosomos, para o ambiente extracelular. Os exosóis servem como mediadores essenciais da comunicação intercelular e desempenham um papel básico em muitos processos (patho)fisiológicos. O fator estimulante da colônia granulocito-macrófago (GM-CSF) funciona como uma citocina para modular a resposta imune. A presença de GM-CSF em exosóis tem o potencial de aumentar sua função imuno-regulatória. Aqui, GM-CSF foi expressado na linha de células ESC murina ES-D3. Um protocolo foi desenvolvido para isolar vesículas extracelulares supercelulares (EVs) de células ES-D3 superexpressas GM-CSF. EVs isolados enriquecidos com exosome foram caracterizados por uma variedade de abordagens experimentais. É importante ressaltar que quantidades significativas de GM-CSF foram encontradas presentes em EVs exosome enriquecidos. No geral, os EVs exosóicos enriquecidos por GM-CSF dos ESCs podem funcionar como vesículas livres de células para exercer suas atividades imuno-reguladoras.
Introduction
Os ESCs são derivados do estágio blastocisto de um embrião de pré-implantação1. Como células-tronco pluripotentes, os ESCs têm a capacidade de se auto-renovar e diferenciar-se em qualquer tipo de célula embrionária. Devido ao seu notável potencial de desenvolvimento e capacidade proliferativa a longo prazo, os CES são extremamente valiosos para a pesquisa biomédica1. Os esforços atuais de pesquisa têm se concentrado em grande parte no potencial terapêutico das ESCs para uma variedade de doenças patológicas graves, incluindo diabetes, doenças cardíacas e doenças neurodegenerativas2,3,4.
As células mamíferas, incluindo os ESCs, são conhecidas por liberar vesículas com tamanhos variáveis para o ambiente extracelular, e esses EVs possuem muitas funções fisiológicas e patológicas devido ao seu papel na comunicação intercelular5. Entre diferentes subtipos de EVs, exósmos são pequenas vesículas de membrana liberadas de vários tipos de células para o espaço extracelular após a fusão de compartimentos endocíticos intermediários, corpos multivesiculares (MVBs), com a membrana plasmática6. Exosomos têm sido relatados para mediar a comunicação intercelular e estão criticamente envolvidos em muitos processos (patho)fisiológicos7,8. Exosomos herdam algumas funções biológicas de suas próprias células parentais, porque exosomos contêm materiais biológicos adquiridos a partir do citosol, incluindo proteínas e ácidos nucleicos. Assim, os antígenos ou fatores associados que estimulam a resposta imune específica para uma determinada doença são encapsulados nos exossomos de determinados tipos de células9. Isso abriu caminho para testes clínicos explorando exosóis derivados de tumores como uma vacina anticâncativa10.
GM-CSF é uma citocina secretada por diferentes tipos de células imunes11. Evidências emergentes demonstram que o GM-CSF ativa e regula o sistema imunológico e desempenha um papel essencial no processo de apresentação de antígenos12. Por exemplo, um relatório clínico sugere que o GM-CSF estimula a resposta imune aos tumores como adjuvante da vacina13. Várias estratégias de imunoterapia contra o câncer baseadas em GM-CSF para explorar a potente atividade imuno-estimulante do GM-CSF têm sido investigadas em ensaios clínicos14. Entre elas, uma vacina contra o câncer composta por células tumorais irradiadas de GM-CSF tem mostrado alguma promessa em pacientes com melanoma avançado, induzindo respostas de antitumorais celulares e humorais e necrose subsequente em tumores metástases15.
Como os exosóis derivados de ESCs possuem atividades biológicas semelhantes às ESCs originais, talvez exosósmos portadores de GM-CSF de ESCs possam funcionar como vesículas livres de células para regular a resposta imune. Neste artigo, é descrito um método detalhado para produzir EVs exossome enriquecidos de alta qualidade de ESCs expressando GM-CSF. Esses EVs exosome enriquecidos têm o potencial de servir como vesículas imuno-regulatórias para modular a resposta imune.
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Protocol
1. Culturing células ES-D3
- Para gerar soro bovino fetal livre de exosome (FBS), carregue FBS em uma ultracentrifuagem e centrífuga a 100.000 x g por 16 h a 4 °C. Após a centrifugação, colete o supernante soro como FBS sem exosome para a cultura da linha celular ES-D3 e a aquisição de EVs enriquecidos com exosomos.
- Antes de emplacamento das células ES-D3, cubra pratos de cultura tecidual de 15 cm usando gelatina (0,1%) à temperatura ambiente por 30 minutos.
- Seguindo um protocolo descrito anteriormente16,cultura as células ES-D3 sem células de camada alimentador nos pratos de cultura tecidual revestidos de gelatina de 15 cm. O meio de cultura celular ES-D3 é composto por DMEM, FBS livre de exosome (15%), aminoácidos não essenciais (0,1 mM), L-glutamina (2 mM), β-mercaptoetanol (0,1 mM), penicilina (50 unidades/mL), estreptomicina (50 μg/mL) e fator inibidor de leucemia (LIF; 100 unidades/mL). Cultura Células ES-D3 a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2.
- Uma vez que as células ES-D3 atinjam cerca de 90% de confluência em pratos de cultura tecidual de 15 cm, remova o meio por aspiração. Lave as células usando trippsina (5 mL; 0,05%). Adicione trippsina (5 mL) aos pratos e incubar a 37 °C por 5 min. Pegue as células dos pratos.
- Adicione meio de cultura fresco (5 mL) às células coletadas para inativar a trippsina. Centrifugar as células a 390 x g por 5 min. Resuspenda as células em meio fresco e determine o número de células usando um hemócito.
- Para células passantes, emplaque as células ES-D3 (5 x 106) em um prato de cultura de tecido revestido de gelatina (0,1%) de 15 cm com meio fresco (15 mL) e cultura por 3 dias antes de subculturar as células.
- Para coletar a cultura celular supernante para isolamento de EVs enriquecidos com exosome, emplaque as células ES-D3 (1 x 107) em um prato de cultura de tecido revestido de gelatina (0,1%) de 15 cm com meio fresco (15 mL) por 3 dias antes de coletar a cultura celular supernadente.
2. Geração de plasmídeo de expressão GM-CSF
NOTA: Gere a transfecção plasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP para sobreexpressar GM-CSF em células ES-D3. Neste plasmídeo, a expressão de murine GM-CSF cDNA juntamente com a proteína marcador humanizada Renilla reniformis GFP (hrGFP) é impulsionada pelo fator de alongamento da cadeia de polipeptídeo humano 1α (EF1α) promotor17,18.
- Gere a espinha dorsal do vetor.
- Digerir o pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg de DNA) utilizando a enzima de restrição EcoRI (100 unidades) a 37 °C por 2 h para gerar dois fragmentos de DNA: a espinha dorsal vetorial (6,0 kb) e a inserção FD3ER (2,5 kb).
- Transfira 50% do DNA plasmídeo digerido (10 μg) em um tubo de microcentrifuso de 1,5 mL e trate com fosfattase alcalina (20 unidades) a 37 °C por 1 h. Resolva o DNA não tratado e desfosforilado usando eletroforese de gel agarose (2%).
- Purificar os fragmentos de DNA da coluna vertebral vetorial (6,0 kb) usando um kit de extração de gel de DNA . Enquanto a espinha dorsal vetorial não tratada servirá como vetor vazio (pEF1α-IRES-hrGFP), a espinha dorsal vetorial desfosforilada será usada para gerar plasmídeos expressos gm-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-HRGFP).
- Gerar a inserção cDNA GM-CSF.
- Digerir a enzima plasmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) utilizando a enzima de restrição EcoRI (100 unidades) a 37 °C para produzir dois fragmentos de DNA: a espinha dorsal vetorial (6,5 kb) e a inserção cDNA murina GM-CSF (474 bp).
- Resolva o DNA digerido através da eletroforese de gel agarose (2%). Purifique o fragmento de cDNA murine GM-CSF (474 bp) usando um kit de extração de gel de DNA.
- Gerar a expressão plasmídeos.
- Configure 2 reações de ligadura (volume total de 10 μL) usando um kit de ligadura de DNA.
- Para gerar o bitor vazio pEF1α-IRES-hrGFP, ligar a espinha dorsal vetorial não tratada da etapa 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng).
- Para gerar pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ligadurar os seguintes fragmentos de DNA: (1) a espinha dorsal vetorial defosfosfolada da etapa 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) e (2) o fragmento de cDNA mGM-CSF gerado na etapa 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
- Ligate a 25 °C por 5 min. Transforme DNA ligado em células E. coli competentes DH5α. Emplaque as células E. coli transformadas em placas lb-ágar contendo carbenicilina (50 μg/mL).
- Purificar plasmídeos de colônias E. coli usando um kit de isolamento de DNA. Validar as identidades dos plasmídeos por sequenciamento de DNA.
- Configure 2 reações de ligadura (volume total de 10 μL) usando um kit de ligadura de DNA.
3. Geração de células ES-D3 superexpressando GM-CSF
NOTA: Transfeito as células ES-D3 com o pEF1α-mGM-MGM-CSF-IRES-hrGFP para sobreexpressar GM-CS. Cotransfecte o pBabe-Neo plasmídeo em células ES-D3 para facilitar a seleção de células transfectadas18,20.
- Transfeito os plasmídeos para as células ES-D3.
- Emplaque as células ES-D3 (1,4 x 106) em um prato de cultura de tecido revestido de gelatina (0,1%) 10 cm com meio cultura (10 mL) para transfecção. Células ES-D3 banhadas à cultura a 37 °C por 24 h.
- Prepare duas misturas de plasmídeos em tubos de microcentrifuus de 1,5 mL: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, controle vetorial) com pBabe-Neo (4 μg) e (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, expressando GM-CSF) com pBabe-Neo (4 μg). Realizar a transfecção usando um kit de transfecção seguindo o protocolo do fabricante.
- Adicione o meio de transfecção (1 mL) e o reagente de transfecção (64 μL) a cada tubo contendo as misturas plasmidas e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
- Adicione as misturas de transfecção aos respectivos pratos de 10 cm de células ES-D3. Incubar a 37 °C por 5 h.
- Substitua o meio em pratos de 10 cm por meio de cultura fresca (10 mL). Incubar a 37 °C por 24 h.
- Gerar populações em massa de células ES-D3 transfectadas.
- Remova o meio das células ES-D3 transfeinadas. Lave as células com trippsina (2 mL; 0,05%). Adicione trippsina (2 mL) e incubar a 37 °C por 5 min. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione 2 mL de meio de cultura fresco para neutralizar a trippsina. Centrifugar a 390 x g por 5 min.
- Resuspend as células transfectadas em meio de cultura fresca (10 mL). Avalie a intensidade de fluorescência do GFP em células ES-D3 transfecidas usando a classificação celular ativada por fluorescência (FACS), seguindo o protocolo do fabricante.
- Transfira as células transfeinadas em dois pratos de 10 cm contendo meio de cultura fresca (10 mL). Adicione neomicina (0,5 mg/mL) para eliminar células não traduzindo.
- Continue a cultivar as células transfeinadas em meio de cultura contendo neomicina (0,5 mg/mL). Quando o ES-D3 transfeinado atingir 90% de confluência, transfira as células para pratos de cultura tecidual de 15 cm novamente. Repita o procedimento por 2 semanas.
- Gerar clones de células ES-D3 transfectadas.
- Uma vez geradas populações em massa de células ES-D3 transfectadas, colecione as células como antes. Determine os números de células usando um hemócito. Centrifugar as células a 390 x g por 5 min. Resuspend as células (1 x 107 células/mL) em meio de cultura fresca.
- Filtre as células através de um coador celular estéril de 40 μm. Purifique as células ES-D3 soropositivos usando FACS, seguindo o protocolo do fabricante.
- Emplaque uma única célula ES-D3 classificada em um poço de uma placa de cultura de tecido revestida de gelatina (0,1%) de 96 poços contendo células ES-D3 parentais (1 x 103) em meio livre de neomicina (200 μL). Co-culminar células ES-D3 transfectadas com suas contrapartes parentais não traduzindo garante que as células ES-D3 únicas transfectadas transfetam e se proliferam como um único clone.
- Cultue as células por 48 h e, em seguida, adicione neomicina (0,5 mg/mL) a placas de 96 poços para eliminar células ES-D3 não transtravas.
- Continue a cultivar as células ES-D3 GFP positivos em placas de cultura tecidual de 96 poços com neomicina média (0,5 mg/mL) durante 1 semana. Transfira linhas de células clonais ES-D3 para antenas de cultura de tecido de 6 cm com meio de cultura (5 mL) contendo neomicina (0,5 mg/mL) durante 1 semana.
- Determine a intensidade da fluorescência GFP em cada um dos clones de células ES-D3 transfectados usando FACS, seguindo o protocolo do fabricante. Selecione os clones ES-D3 expressando GM-CSF ou o vetor vazio com altos níveis de fluorescência verde.
- Determine as quantidades de GM-CSF secretados por células ES-D3 usando um kit MURine GM-CSF ELISA, seguindo o protocolo do fabricante.
4. Isolamento de vesículas extracelulares enriquecidas por exosome
- Cultura as células ES-D3 (1 x 107) em pratos de cultura tecidual de 15 cm por 72 h a 37 °C. Recolher a cultura celular supernante. Loja coletada supernante a 4 °C até 1 semana para manter a integridade exosmal.
- Centrifugar a cultura celular supernacida a 5.000 x g por 60 min a 4 °C usando uma centrífuga para sedimentar grandes fragmentos celulares.
- Colete o supernatante e a centrífuga a 100.000 x g por 90 min a 4 °C usando uma ultracentrifuagem.
- Remova o supernatante. Enxágue suavemente cada pelota duas vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS; 1 mL) para remover a cultura residual sobrenatante.
- Resuspend cada pelota na PBS. Quantifique os EVs enriquecidos com exosome por seu teor deproteínas 5.
- Meça a concentração proteica de EVs exossome enriquecidos com um ensaio de ácido bicinchonínico (BCA). O rendimento esperado de EVs exossome enriquecidos de células ES-D3 é de aproximadamente 4 μg de proteína/mL de supernanato da cultura celular. Resuspend os EVs enriquecidos com exosomos em PBS (concentração de proteínas: ~6 μg/μL). Armazene os EVs enriquecidos com exososome a -80 °C.
5. Caracterização de vesículas extracelulares enriquecidas exóssomeas por microscopia eletrônica de transmissão
NOTA: Investigue a composição e a estrutura dos EVs enriquecidos com exosome isolados dos ESCs usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM)5.
- Fixar os EVs enriquecidos com exossome (3-5 μg/μL) com uma concentração final de paraformaldeído de grau EM de 2% à temperatura ambiente por 2 h.
- Carregar amostras fixas (10 μL) em redes de cobre com filme de suporte a carbono. Incubar as amostras com grades de cobre por 1 min e, em seguida, drenar as grades com papel filtro.
- Manche as grades com uma solução de coloração seguindo o protocolo do fabricante.
- Transfira as grades para um pedaço de papel filtro usando pinças. Deixe as grades secarem durante a noite à temperatura ambiente.
- Adquira imagens de microscopia eletrônica usando um microscópio eletrônico de transmissão (ampliação de 50.000x), seguindo o protocolo do fabricante.
6. Avaliação de vesículas extracelulares exosome enriquecidas pela análise de manchas ocidentais
- Prepare extratos celulares inteiros.
- Remova o meio das células ES-D3 cultivadas em pratos de 15 cm. Lave as células com trippsina (5 mL; 0,05%). Adicione trippsina (5 mL) às células. Incubar a 37 °C por 5 min. Colete as células e adicione meio de cultura fresco (5 mL) para neutralizar a trippsina. Centrifugar as células a 390 x g por 5 min. Resuspende as células na PBS.
- Determine números de células usando um hemócito. Centrifugar as células novamente a 390 x g por 5 min. Resuspengem as células no buffer de carregamento SDS-PAGE contendo 0,5% de SDS (5.000 células/μL).
- Sonicate as amostras para 10 s usando um sonicator com 10% de amplitude (wattage: 500 W; frequência ultrassônica: 20 kHz). Aqueça as amostras a 100 °C por 5 minutos.
- Prepare os lysates de EVs enriquecidos com exosomos.
- Resuspend os EVs enriquecidos com exosomos no buffer de carregamento SDS-PAGE contendo SDS de 0,5% a uma concentração de 1,2 μg/μL.
- Sonicate as amostras para 10 s usando um sonicator com 10% de amplitude (wattage: 500 W; frequência ultrassônica: 20 kHz). Aqueça as amostras a 100 °C por 5 minutos.
- Detecte proteínas por mancha ocidental.
- Carregar extratos celulares inteiros (10 μL; 5.000 células/μL) e lises EV enriquecidos com exosome (10 μL; 1,2 μg/μL) em cada poço de um gel de PÁGINA Bis-Tris (4-20%). Transfira proteínas para membranas de flúor de polivinilideno (PVDF).
- Incubar membranas com anticorpos primários e secundários apropriados. Anticorpos diluídos (nas concentrações indicadas abaixo) no tampão de manchas contendo PBS, Tween-20 (0,2%) e leite seco sem gordura (10% c/v).
- Use os seguintes anticorpos primários: anti-anexo V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-citocromome c (100 ng/mL), isomerase anti-proteína dissulfeto (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) e anti-Oxphos COX IV-subunit IV (600 ng/mL).
- Use os seguintes anticorpos secundários: anti-coelho de cabra conjugado peroxidase (20 ng/mL) e anti-rato conjugado por peroxidase (20 ng/mL).
- Detecte proteínas usando um kit de detecção de quimiominascência aprimorado.
7. Determinando concentrações GM-CSF em vesículas extracelulares exosome enriquecidas pela ELISA
NOTA: Avalie as quantidades de GM-CSF em EVs exosome enriquecidos pela ELISA usando um kit para murine GM-CSF, seguindo o protocolo do fabricante com algumas modificações.
- Cubra a placa ELISA com anticorpo de captura. Trate EVs enriquecidos com exosome (0,6 μg) apenas em PBS ou PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) em temperatura ambiente por 30 min. Adicione amostras tratadas à placa ELISA revestida e incubar à temperatura ambiente por 1h. Lave a placa apenas com PBS ou PBS + 0,05% Tween-20.
- Adicione anticorpo de detecção às amostras. Incubar em temperatura ambiente por 1h. Lave a placa apenas com PBS ou PBS + 0,05% Tween-20. Adicione Avidin-HRP às amostras. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Lave a placa apenas com PBS ou PBS + 0,05% Tween-20.
- Determine as concentrações de GM-CSF em EVs enriquecidos com exosomos medindo a absorvância a 450 nm em um leitor de microplacas.
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Representative Results
O GM-CSF é superexpresso em ESCs murine.
Para expressar de forma estável GM-CSF em células ES-D3, o cDNA murine GM-CSF foi clonado em um vetor de transfecção para gerar a expressão vetor pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(Figura 1A). O GM-CSF foi superexpresso em células ES-D3 por transfecção, e cerca de 20% das células ES-D3 transitóriamente transfectadas foram GFP-positivos. Clones de células que expressam demais o GM-CSF ou o controle de vetor vazio foram adquiridos pela FACS. Como mostrado na Figura 1B,a intensidade de fluorescência GFP de uma linha celular ES-D3 expressa em GM-CSF ou uma linha celular ES-D3 expressando o vetor vazio era muito maior do que a de seus colegas parentais. Foi realizado um ensaio ELISA para avaliar as concentrações GM-CSF na cultura celular sobrenante de diferentes linhas celulares(Figura 2). As células ES-D3 expressando GM-CSF produziram níveis notavelmente mais altos de GM-CSF na cultura celular supernascida do que seu controle de vetores vazios. Além disso, a quantidade de GM-CSF gerada pelas células ES-D3 expressas pela GM-CSF foi semelhante à dos fibroblastos STO que expressam GM-CSF, como relatado anteriormente19.
Exosóis são enriquecidos em vesículas extracelulares derivadas de ESCs murinas.
O controle de vetores e as culturas celulares ES-D3 expressas por GM-CSF foram expandidas, e a supernação da cultura celular foi coletada. Os EVs foram isolados após várias etapas de centrifugação. Os EVs únicos foram primeiramente avaliados pela TEM (Figura 3). Como mostrado nas imagens TEM, os EVs isolados continham vesículas de diferentes tamanhos, o que é comumente observado nas preparações exosômicas5. É importante ressaltar que os diâmetros das vesículas individuais foram de 30-100 nm, consistentes com relatórios anteriores que descrevem exosósmos21. Além disso, a presença de exosóis em EVs foi examinada pela mancha ocidental(Figura 4). A expressão de marcadores exosômicos, incluindo CD81, anexo V e Flotillin-1, foi marcadamente aprimorada em EVs isolados de células ES-D3 em comparação com extratos celulares inteiros correspondentes (WCE). É importante ressaltar que não foi detectada a presença de outros marcadores de compartimento subcelular em EVs derivados do ES-D3, incluindo (1) o reticulum endoplasmático (ER) marcador de proteína dissulfato isomerase (PDI), (2) os marcadores mitocondrial citocromo c e COX IV-subunit IV, e (3) o marcador citosolmático GAPDH. No geral, esses dados demonstram que os exossomos foram altamente enriquecidos em EVs derivados de células ES-D3.
O GM-CSF está localizado dentro de vesículas extracelulares exosome enriquecidas isoladas dos ESCs.
Para determinar se os EVs enriquecidos com exosome contêm moléculas GM-CSF, foi realizado ensaio ELISA para avaliar os níveis de GM-CSF em EVs exosomos enriquecidos adquiridos a partir de células ES-D3 com ou sem expressão GM-CSF(Figura 5). Para investigar ainda mais a localização da proteína GM-CSF dentro de EVs exosome enriquecidos, os níveis gm-CSF foram quantificados em EVs exosomos enriquecidos em diferentes condições de lavagem pela ELISA. Para isso, o detergente Tween-20 (0,05%) foi empregado pela primeira vez para permeabiliizar as membranas exosômicas, e os ensaios ELISA foram realizados nos buffers com ou sem 0,05% Tween-20. Como o Tween-20 é conhecido por reduzir as interações proteína-proteína, os níveis de GM-CSF de fundo detectados nos EVs de controle foram significativamente reduzidos por Tween-20 no tampão de lavagem. Em contraste, os níveis de GM-CSF nos EVs das células expressas gm-CSF foram significativamente aumentados pelo Tween-20. Esses resultados demonstram que a permeabilização da membrana exosômica induzida por Tween-20 torna as moléculas GM-CSF dentro das vesículas acessíveis para reconhecimento de anticorpos, fornecendo evidências de que a maioria das moléculas exossômicas gm-CSF estão localizadas dentro do lúmen de vesículas isoladas.
Figura 1: O GM-CSF exógeno é expresso em células ES-D3.
(A) O diagrama esquemático do plasmídeo para superexpressão do GM-CSF murino em células ES-D3, no qual um promotor EF1α conduz a expressão GM-CSF e o hrGFP serve como um marcador de expressão.
(B) A intensidade de fluorescência do GFP nas células ES-D3 expressas por GM-CSF ou suas contrapartes vazias de controle vetorial foi determinada pelo FACS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: As células ES-D3 que expressam sobreexpressivas GM-CSF produzem altos níveis de GM-CSF.
As concentrações GM-CSF no meio das células indicadas foram medidas por ELISA. Os dados são apresentados como desvios padrão ± médios (média ± SD) de três medidas ELISA independentes: **p < 0,001, NS = não significativo, ANOVA com o teste de comparação múltipla de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Vesículas extracelulares derivadas do ES-D3 são examinadas por microscopia eletrônica de transmissão.
Vesículos extracelulares foram preparados a partir de células ES-D3 transfeccionadas com o plasmídeo expressando GM-CSF ou sua contraparte vetorial vazia. Setas indicam vesículas individuais. Barra de escala = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Os marcadores exossômicos estão altamente concentrados em vesículas extracelulares isoladas das células ES-D3.
As quantidades de marcadores para exosóis, ânticulo endoplasmático (ER), mitocôndrias e citosol nos extratos celulares inteiros indicados (OMC) e EVs foram avaliadas por manchas ocidentais. PDI = isomerase de dissulfeto proteico. Os marcadores de peso molecular (kD) estão à esquerda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Avaliação dos níveis de GM-CSF em vesículas extracelulares exosome enriquecidas.
Os níveis de GM-CSF nos EVs exosome enriquecidos indicados foram determinados em diferentes condições ELISA. Os EVs enriquecidos com exosome foram pré-tratados com ou sem 0,05% de Tween-20. A ELISA foi realizada utilizando-se tampão de lavagem contendo apenas PBS ou PBS + 0,05% Tween-20. Os dados são apresentados como a média ± SD de três ensaios ELISA independentes. *p < 0,05, **p < 0,005, ANOVA com o teste de comparação múltipla de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este estudo mostra um método altamente eficiente de produção de EVs enriquecidos com exosomos carregando a proteína imuno-estimulante GM-CSF, que pode ser empregada para estudar os efeitos imuno-modulatórios de EVs enriquecidos com exosomos. Vários estudos sugerem que os exosóis exibem funções imuno-regulatórias e anti-tumores22. Assim, exosóis de ESCs expressando GM-CSF também podem possuir atividades biológicas que regulam a resposta imune. Neste protocolo, o exógeno murine GM-CSF foi expressado em células Murine ES-D3 por transfecção(Figura 1). É importante ressaltar que quantidades significativas de GM-CSF foram detectadas em EVs exosome enriquecidos isolados de células ES-D3 superexpressando GM-CSF(Figura 5).
Esses dados sugerem que quase todos os GM-CSF residem dentro de EVs enriquecidos com exosome. Como citocina, a maioria da proteína GM-CSF é secretada extracelularmente11. Como outros materiais de carga exosmal (por exemplo, mRNAs, miRNAs e proteínas), as moléculas GM-CSF no citosol são encapsuladas nas vesículas intraluminais (ILVs) de corpos multivesiculares (MVBs)6,23. Após a fusão de MVBs com a membrana plasmática, os ILVs portadores de GM-CSF são liberados no espaço extracelular.
Um passo importante neste protocolo é efetivamente sobreexpressar o GM-CSF em células Murine ES-D3(Figura 2). Os esforços anteriores para alcançar esse objetivo por infecção retroviral falharam em grande parte, provavelmente devido à supressão da expressão genética retroviral nos níveis transcricionais nos ESCs24. Entre vários promotores virais e celulares examinados, o promotor humano EF1α mostrou a atividade mais robusta nas células ES-D3. É importante ressaltar que a expressão transgênica sob o controle do promotor EF1α permaneceu estável após a cultura celular de longo prazo das células ES-D3 transfeinadas. Para expressar o exógeno GM-CSF em outro tipo de célula, são necessários estudos adicionais para avaliar a eficiência de vários promotores. A aplicação deste método para isolar EVs exossomos com rolamento de GM-CSF pode ser expandida para outros tipos de células-tronco, bem como células tumorais projetadas para expressar várias citocinas. Como o GM-CSF, a maioria das citocinas são secretadas extracelularmente25. Portanto, uma possível limitação dessa abordagem é que a quantidade de uma determinada citocina acumulada em EVs exósiais é muito baixa para exibir sua atividade biológica. Para uma citocina particular, novos estudos precisam ser realizados para otimizar seu nível de proteína e atividade biológica em EVs enriquecidos com exosomos.
O obstáculo mais crítico neste estudo é a geração de clones ES-D3 superexpressando o GM-CSF. Para manter o estado pluripotencial e promover a proliferação celular in vitro, os ESCs murinas são geralmente cultivados na presença de células alimentadoras26. Para adquirir exósmos exclusivamente de ESCs, foi empregado um protocolo sem células alimentadora para cultura ESCs27. Neste estudo, as células ES-D3 foram cultivadas em pratos revestidos de gelatina utilizando meio suplementado com LIF. A eficiência da placa e a proliferação de clones únicos de células ES-D3 sob esta condição de cultura foram extremamente baixas, tornando muito desafiador gerar clones ES-D3 a partir de células únicas. A adição do meio condicional obtido das células ES-D3 parental não conseguiu resgatar a deficiência de proliferação de células ES-D3 únicas banhadas. Para superar essa limitação, células ES-D3 únicas que superexpressam GM-CSF foram banhadas juntamente com as células ES-D3 dos pais. Essa abordagem de revestimento melhorou a viabilidade de clones ES-D3 únicos que expressam GM-CSF, facilitando a proliferação e expansão clonais. Uma vez transfeinados, clones únicos ES-D3 aparentemente ligados a placas de cultura tecidual. Eles proliferaram independentemente da presença de outras células ES-D3, uma vez que as células ES-D3 parentais foram eliminadas 48 h após serem emplacados, permitindo que apenas as células ES-D3 únicas transfeinadas crescessem.
No geral, foi desenvolvido um protocolo para gerar com sucesso EVs enriquecidos com exosomos que transportam GM-CSF de ESCs com potencial para estimular a resposta imune em diferentes condições da doença. Além disso, nosso estudo recentemente publicado demonstra que os EVs exosomicos exósiais de ESCs podem servir como uma vacina profilática livre de células contra o câncer28.
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Disclosures
Kavitha Yaddanapudi, Chi Li e John W. Eaton apresentaram um pedido de patente dos EUA "Composições que compreendem exosóis embrionários projetados derivados de células-tronco e métodos de uso dela".
Acknowledgments
Somos gratos ao Sr. Arkadiusz Slusarczyk e à Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) por adquirir imagens de microscópio eletrônico de transmissão. Este trabalho foi apoiado em parte por subvenções do NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 e CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) e Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
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