Summary
这项研究描述了一种将携带免疫刺激性粒细胞巨噬细胞刺激因子的外细胞富集细胞外囊泡从胚胎干细胞中分离的方法。
Abstract
胚胎干细胞（ESCs）是多能干细胞，能够自我更新和分化到所有类型的胚胎细胞。像许多其他细胞类型一样，ESC 将小膜囊泡（如外显子）释放到细胞外环境中。外显子是细胞间交流的重要中介，在许多（病理）生理过程中发挥着基本作用。粒细胞-巨噬细胞群刺激因子（GM-CSF）作为细胞因子调节免疫反应。GM-CSF在外显子中的存在有可能增强其免疫调节功能。在这里，GM-CSF在穆林ESC细胞系ES-D3中被稳定地过度表达。开发了一个协议，将高质量的外体富集细胞外囊泡（EV）与ES-D3细胞分离出来，从而过度表达GM-CSF。孤立的外体丰富的电动汽车的特点是各种实验方法。重要的是，在富含外显子的电动汽车中发现了大量GM-CSF。总的来说，来自ESC的具有转基因-CSF的外生丰富型电动汽车可以作为无细胞囊泡来发挥其免疫调节作用。
Introduction
ESC来自植入前胚胎1的胚泡阶段。作为多能干细胞，ESC有能力自我更新并分化成任何类型的胚胎细胞。由于其显著的发展潜力和长期增殖能力，ESC对生物医学研究具有极其宝贵的价值。目前的研究工作主要集中在ESC治疗各种重大病理疾病的潜力，包括糖尿病，心脏病和神经退行性疾病2，3，4。
众所周知，哺乳动物细胞，包括ESC，会向细胞外环境释放大小不一的囊泡，这些EV由于在细胞间通信中的作用而具有许多生理和病理功能。在不同的子类型EV中，外显子是小膜囊从不同细胞类型释放到细胞外空间后融合的中间内分泌室，多血管体（MVB），与等离子膜6。据报道，外显体可以调解细胞间的交流，并严重参与许多（病理）生理过程7，8。外显子从它们自己的母细胞中继承了一些生物功能，因为外体含有从细胞溶胶中获取的生物材料，包括蛋白质和核酸。因此，相关的抗原或刺激特定疾病免疫反应的因素被封装在特定类型的细胞9的外源中。这为探索肿瘤衍生外显体作为抗癌疫苗10的临床试验铺平了道路。
GM-CSF是由不同类型的免疫细胞11分泌的细胞因子。新出现的证据表明，GM-CSF激活和调节免疫系统，并在抗原呈现过程中发挥着至关重要的作用。例如，一份临床报告表明，GM-CSF刺激免疫反应肿瘤作为疫苗辅助剂13。在14日的临床试验中，研究了几种基于GM-CSF的癌症免疫治疗策略，以利用GM-CSF强大的免疫刺激活性。其中，由辐照GM-CSF分泌肿瘤细胞组成的癌症疫苗通过诱导细胞和幽默抗肿瘤反应以及随后转移肿瘤15中的坏死，在晚期黑色素瘤患者中显示出一定的希望。
由于来自ESC的外显子具有与原始ESC相似的生物活动，因此可能来自ESC的转基因-CSF携带的外体可以起到无细胞囊泡的作用，以调节免疫反应。本文介绍了从ESC中生产出高质量外体浓缩电动汽车的详细方法，该方法表达了GM-CSF。这些富含外体的电动汽车有可能作为免疫调节囊泡来调节免疫反应。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 培养ES-D3细胞
- 要生成无外显子的母牛血清 （FBS），在 4 °C 下以 100，000 x g 的速度将 FBS 装载到超中心和离心机中，持续 16 小时。 离心后，收集血清超高纳特作为无外奥体的FBS，用于培育粘膜ESC细胞系ES-D3和获得富含外体的EV。
- 在电镀ES-D3细胞之前，在室温下使用明胶（0.1%）涂抹15厘米的组织培养皿30分钟。
- 按照先前描述的协议16，培养ES-D3细胞没有喂食层细胞在明胶涂层的15厘米组织培养皿。ES-D3细胞培养基由DMEM、无外显子FBS（15%）组成， 非必要的氨基酸（0.1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）、β-甲醇（0.1mM）、青霉素（50单位/mL）、链霉素（50微克/mL）和白血病抑制因子（LIF;100单位/mL）。在 5% CO2 加湿孵化器中，在 37 °C 下培养 ES-D3 细胞。
- 一旦ES-D3细胞在15厘米的组织培养皿中达到90%左右的汇流，通过吸气去除介质。使用试丁石（5ml;0.05%）清洗细胞。将试丁鱼 （5 mL） 添加到菜肴中，在 37 °C 下孵育 5 分钟。从盘子中收集细胞。
- 在收集的细胞中加入新鲜培养介质 （5 mL） 以灭活试丁二醇。将细胞以 390 x g 离心 5 分钟。将细胞重新用新鲜介质中恢复，并使用血细胞计确定细胞数。
- 对于传递细胞，将ES-D3细胞（5 x 106）镀在明胶涂层（0.1%）15厘米组织培养皿中，用新鲜介质（15 mL）培养3天，然后再对细胞进行亚培养。
- 为了收集细胞培养超高分子以隔离外层丰富的电动汽车，在收集细胞培养超高剂之前，将ES-D3细胞（1 x10 7）在明胶涂层（0.1%）15厘米组织培养皿中，用新鲜介质（15mL）镀3天。
2. 转基因-CSF表达质粒的生成
注：生成转染质粒 pEF1+ -mGM-CSF-IRES-hrGFP，在 ES-D3 细胞中过度表达 GM-CSF。在这个质粒中，穆林GM-CSF cDNA的表达以及标记蛋白人性化的Renilla再造GFP（hrGFP）是由人类多肽链拉长因子1+（EF1+）促进剂17，18驱动的。
- 生成矢量骨干。
- 在 37 °C 的 2 小时中，使用限制酶 EcoRI （100 单位） 以 37 °C 为 2 小时消化质粒 pEF1+-FD3ER-IRES-hrGFP （20 μg DNA），生成两个 DNA 片段：矢量骨干（6.0 kb）和 FD3ER 插入（2.5 kb）。
- 将消化的质粒DNA（10 μg）的50%转移到一个1.5mL微中心管中，在37°C为1小时时用碱性磷酸酶（20单位）治疗。使用阿加罗斯凝胶电泳（2%）解决未经治疗和脱磷脱磷的DNA。
- 使用DNA凝胶提取包净化病媒骨干DNA片段（6.0 kb）。虽然未经处理的病媒骨干将用作空载体（pEF1+-IRES-hrGFP），但脱磷载体骨干将用于生成GM-CSF表达质粒（pEF1+-mGM-CSF-IRES-hrGFP）。
- 生成 GM-CSF cDNA 插入。
- 在 37 °C 2h 下使用限制酶 EcoRI （100 单位） 消化质粒 pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 （20 μg），以产生两个 DNA 片段：矢量骨干（6.5 kb） 和穆林 GM-CSF cDNA 插入（474 bp）。
- 通过阿加罗斯凝胶电泳（2%）解决消化的DNA。使用DNA凝胶提取试剂盒净化穆林GM-CSF cDNA片段（474 bp）。
- 生成表达质粒。
- 使用DNA连体件设置2个连合反应（10 μL 总体积）。
- 要生成空矢量 pEF1+ -IRES-hrGFP，从步骤 2.1.3（6.0 kb;500 ng）中将未经处理的矢量骨干液化。
- 生成 pEF1+ -mGM-CSF-IRES-hrgFP， 将以下DNA片段连结：（1） 从第 2.1.3 步（6.0 kb;500 ng）和 （2） 第 2.2.2 步（474 bp;200 ng）中生成的 mGM-CSF cDNA 片段。
- 利盖特在 25 °C 为 5 分钟。将液化DNA转化为DH5+称职 大肠杆菌 细胞。将转化后 的大肠杆菌 细胞镀在含有卡苯西林（50微克/mL）的LB-agar板上。
- 使用DNA分离试剂盒从单一 大肠杆菌 群中净化质粒。通过DNA测序验证质粒的身份。
- 使用DNA连体件设置2个连合反应（10 μL 总体积）。
3. ES-D3细胞的生成过度表达GM-CSF
注：用质粒 pEF1+ -mGM-CSF-IRES-hrGFP 将 ES-D3 细胞转换为过度表达的 GM-CS。将质粒pBabe-Neo共生到ES-D3细胞中，以方便选择稳定转染的细胞18，20。
- 将质粒转移到ES-D3细胞中。
- 将ES-D3细胞（1.4 x 106）镀在明胶涂层（0.1%）10厘米组织培养皿中，培养介质（10ml）进行转染。培养镀ES-D3细胞在37°C为24小时。
- 在 1.5 毫升微中心管中准备两种质粒混合物： （1） pEF1+ -IRES-hrGFP （28 μg， 向量控制） 与 pBabe-Neo （4 μg） 和 （2） pEF1 + - mGM - CSF - iRES - hrgfp （28 μg， 表示 GM-CSF） 与 pBabe-Neo （4 μg）.。按照制造商的协议使用转染套件进行转染。
- 将转染介质（1 mL）和转染试剂（64微升）加入含有质粒混合物的管中，并在室温下孵育5分钟。
- 将转染混合物加入ES-D3细胞的10厘米盘子中。在 37 °C 下孵育 5 小时。
- 用新鲜培养介质（10 mL）替换 10 厘米菜肴中的介质。在 37 °C 下孵育 24 小时。
- 生成稳定转染的ES-D3细胞的大量种群。
- 从转染的 ES-D3 细胞中取出介质。用试丁石（2 mL;0.05%）清洗细胞。加入试丁鱼（2 mL），在37°C孵育5分钟。将细胞转移到 15 mL 离心机管中，并添加 2 mL 的新鲜培养介质来中和试管素。离心机在 390 x g 5 分钟。
- 在新鲜培养物介质（10 mL）中重新使用受感染的细胞。根据制造商的协议，使用荧光激活的细胞排序 （FACS） 评估转基因 ES-D3 细胞中 GFP 的荧光强度。
- 将转染的细胞转移到两个10厘米的盘子中，其中含有新鲜培养介质（10ml）。加入新霉素（0.5毫克/毫升），以消除未受感染的细胞。
- 继续培养含有新霉素（0.5毫克/毫升）培养基的转染细胞。当转染的ES-D3达到90%的汇流时，再次将细胞转移到15厘米的组织培养皿中。重复此过程 2 周。
- 生成稳定转染的ES-D3细胞的克隆。
- 一旦生成了稳定转染的ES-D3细胞的大量种群，就会像以前一样收集细胞。使用血细胞计确定细胞数。将细胞以 390 x g 离心 5 分钟。在新鲜培养介质中重新使用细胞（1 x10 7 细胞/mL）。
- 通过无菌的 40 μm 细胞过滤器过滤细胞。按照制造商的协议，使用 FACS 净化 GFP 阳性 ES-D3 细胞。
- 将单个排序的ES-D3细胞板板放入明胶涂层（0.1%）96井组织培养板的一口井中，该培养板含有无新霉素介质（200微升）中的母体ES-D3细胞（1 x 103）。与未受感染的亲子细胞共同培育受感染的ES-D3细胞，确保稳定地转染单个ES-D3细胞作为单个克隆存活并增殖。
- 培养细胞48小时，然后加入新霉素（0.5毫克/mL）到96井板，以消除未翻译的父母ES-D3细胞。
- 继续在96井组织培养板中培育GFP阳性ES-D3细胞，其中含有新霉素（0.5毫克/毫升）1周。将克隆ES-D3细胞系转移到明胶涂层（0.1%）6厘米组织培养皿与培养基（5 mL）含有新霉素（0.5毫克/mL）1周。
- 根据制造商的协议，使用 FACS 确定每个转染的 ES-D3 细胞克隆中 GFP 荧光的强度。选择表达GM-CSF或具有高绿色荧光水平的空载体的ES-D3克隆。
- 根据制造商的协议，使用粘膜 GM-CSF ELISA 套件确定 ES-D3 细胞分泌的 GM-CSF 数量。
4. 分离出体丰富的细胞外囊泡
- 在 37 °C 下将 ES-D3 细胞（1 x10 7）培养在 15 厘米组织培养皿中，培养 72 小时。 收集细胞培养超高。商店在 4 °C 下收集超高纳坦，最长达 1 周，以保持外显体完整性。
- 用离心机将细胞培养超高分子在 5，000 x g 下离心，在 4 °C 下进行 60 分钟，以沉积大细胞片段。
- 使用超中心喷气在 4 °C 下以 100，000 x g 收集超高离心机 90 分钟。
- 取出超高超。用磷酸盐缓冲盐水（PBS;1 mL）轻轻冲洗每个颗粒两次，以去除残留培养物超高超。
- 在 PBS 中重新使用每个颗粒。通过蛋白质含量5来量化富含外体的 EV。
- 用双辛酸 （BCA） 检测外层富集 EV 的蛋白质浓度。ES-D3细胞中富含外体的EV的预期产量约为4微克蛋白质/mL的细胞培养超高。在 PBS 中重新使用富含体的 EV（蛋白质浓度：+6 μg/μL）。将富含外体的 EV 存储在 -80 °C 下。
5. 通过传输电子显微镜对外体富集的细胞外囊泡进行定性
注：使用传输电子显微镜（TEM）5，研究从ESC分离出来的富含外体的电动汽车的组成和结构。
- 将富含外体的 EV（3-5 μg/μL）在室温下将 2% 的 EM 级副甲醛固定在 2 小时。
- 用碳支持膜将固定样品 （10 μL） 加载到铜格栅上。用铜网格孵育样品1分钟，然后用滤纸排干网格。
- 按照制造商的协议用染色解决方案弄脏网格。
- 使用钳子将网格传输到一张滤纸上。允许网格在室温下通宵干燥。
- 根据制造商的协议，使用传输电子显微镜（50，000 倍放大倍）获取电子显微镜图像。
6. 通过西方斑点分析对富含外体的细胞外囊泡的评价
- 准备整个细胞提取物。
- 从 15 厘米盘中培养的 ES-D3 细胞中取出介质。用试丁石（5ml;0.05%）清洗细胞。在细胞中加入试丁石（5ml）。在 37 °C 下孵育 5 分钟。收集细胞并添加新鲜培养介质 （5 mL） 来中和试丁石。将细胞以 390 x g 离心 5 分钟。重新暂停 PBS 中的细胞。
- 使用血细胞计确定细胞数。以 390 x g 再次离心细胞 5 分钟。在 SDS-PAGE 加载缓冲器中重新暂停包含 0.5% SDS（5，000 个单元格/μL）的电池。
- 使用振幅为 10% 的声波器（功率：500 W;超声波频率：20 kHz）对样品进行 10s 的声波处理。在 100 °C 下加热样品 5 分钟。
- 准备富含外体的电动汽车的解质。
- 在 SDS-PAGE 装载缓冲器中重新使用富含外体的 EV，该缓冲器的浓度为 1.2 μg/μL，其中包含 0.5% SDS。
- 使用振幅为 10% 的声波器（功率：500 W;超声波频率：20 kHz）对样品进行 10s 的声波处理。在 100 °C 下加热样品 5 分钟。
- 通过西方污点检测蛋白质。
- 将全细胞提取物（10 μL;5，000个细胞/μL）和富含外体的EV裂解剂（10 μL;1.2 μg/μL）装载到 Bis-Tris PAGE 凝胶（4-20%）的每个井中。将蛋白质转移到氟化物聚乙烯（PVDF）膜上。
- 用适当的初级和二级抗体孵育膜。在含有PBS、Tween-20（0.2%）和脱脂干牛奶（10%w/v）的印迹缓冲中稀释抗体（在下面所示的浓度）中。
- 使用以下主要抗体：抗附素V（200 ng/mL）、抗CD81（50 ng/mL）、抗浮法林-1（200 ng/mL）、抗细胞色素c（10） 0 ng/mL）、抗蛋白脱硫异构酶（200 ng/mL）、抗GAPDH（33 ng/mL）和抗牛磷COXX IV-亚细胞IV（600 ng/mL）。
- 使用以下二级抗体：过氧化酶结合山羊抗兔IgG（20 ng/mL）和过氧化酶结合山羊抗鼠IgG（20 ng/mL）。
- 使用增强的化疗检测包检测蛋白质。
7. 由 ELISA 确定外层富集的细胞外囊中的 GM-CSF 浓度
注：根据制造商的协议，对 ELISA 在富含外体的 EV 中的 GM-CSF 数量进行评估，并根据制造商的协议进行一些修改。
- 用捕获抗体涂抹 ELISA 板。单独在 PBS 或 PBS 中单独处理富含外体的 EV（0.6 μg），或在室温下将 0.05% Tween-20 （100 μL） 治疗 30 分钟。将经过处理的样品添加到涂层的 ELISA 板中，并在室温下孵育 1 小时。单独用 PBS 或 PBS 清洗盘子 = 0.05% Tween-20。
- 在样品中添加检测抗体。在室温下孵育1小时。单独用 PBS 或 PBS 清洗盘子 = 0.05% Tween-20。在样品中添加阿维丁-HRP。在室温下孵育30分钟。单独用 PBS 或 PBS 清洗盘子 = 0.05% Tween-20。
- 通过测量微板读卡器上 450 nm 的吸水量，确定外体富集 EV 中 GM-CSF 的浓度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GM-CSF 在穆林 ESC 中表达过度。
为了在ES-D3细胞中稳定地过度表达GM-CSF，将MM-CSF cDNA克隆成一个转染载体，以生成表达载体pEF1+-mGM-CSF-IRES-hrGFP（图1A）。通过转染，GM-CSF在ES-D3细胞中表达过度，约20%的瞬态瞬态瞬态ES-D3细胞为GFP阳性。细胞克隆稳定过度表达GM-CSF或空矢量控制被FACS收购。如图1 B所示，GM-CSF表达ES-D3细胞系或ES-D3细胞线表达空载体的GFP荧光强度远远高于其父母的荧光强度。ELISA进行了一项检测，以评估不同细胞系的细胞培养超高分子中的GM-CSF浓度（图2）。表达GM-CSF的ES-D3细胞在细胞培养超高中产生的GM-CSF水平明显高于其空载体控制水平。此外，正如前19日报道的，GM-CSF表达ES-D3细胞产生的转基因-CSF量与表达GM-CSF的STO成纤维细胞的量相似。
外显子富含从木质ESC衍生的细胞外囊。
矢量控制和GM-CSF表达ES-D3细胞培养物得到扩展，细胞培养超高分子被收集。经过几步离心后，电动汽车被隔离。单台EV首先由TEM（图3）进行评估。如 TEM 图像所示，隔离的 EV 包含不同尺寸的囊泡，这在外体制剂5中通常可见。重要的是，单个囊泡的直径为30-100纳米，与先前描述外显子21的报告一致。此外，西方印迹（图4）还检查了电动汽车中外显体的存在。与相应的全细胞提取物（WCE）相比，从ES-D3细胞分离出来的电动汽车中，外体标记（包括CD81、附体V和Flotillin-1）的表达显著增强。重要的是，在ES-D3衍生的电动汽车中未检测到其他亚细胞隔间标记物的存在，包括（1）内质网膜（ER）标记蛋白脱硫异构酶（PDI），（2）线粒体标记细胞色素c和COX IV-子联盟IV，以及（3）细胞溶性标记GAPDH。总体而言，这些数据表明，从ES-D3细胞衍生的电动汽车中，外显体具有高度丰富的丰富性。
GM-CSF 在从 ESC 分离的外层富集的细胞外囊中定位。
为了确定富含外体的EV是否含有GM-CSF分子，ELISA进行了检测，以评估从ES-D3细胞获得的具有或没有GM-CSF表达的外体富集EV中GM-CSF的水平（图5）。为了进一步调查外体富集电动汽车内的GM-CSF蛋白本地化，ELISA在不同洗涤条件下对外体富集的EV进行了排量。为此，首先使用洗涤剂Tween-20（0.05%）来渗透外显膜，ELISA检测是在缓冲器中进行，无论有无0.05%的Tween-20。由于Tween-20已知可以减少蛋白质-蛋白质相互作用，因此在控制电动汽车中检测到的背景GM-CSF水平在洗涤缓冲器中显著降低了Tween-20。相比之下，转基因-CSF表达细胞EV中的GM-CSF水平显著提高Tween-20。这些结果表明，Tween-20诱导的外膜渗透使囊泡内的GM-CSF分子能够进行抗体识别，从而证明大多数外溶性转基因-CSF分子在孤立的囊泡的流明内定位。
图1：外源性GM-CSF在ES-D3细胞中明显过度表达。
（A） ES-D3细胞中过度表达的粘膜GM-CSF的质粒示意图，其中EF1+促进器驱动GM-CSF表达，hrGFP作为表达标记。
（B） GM-CSF表达ES-D3细胞或其空矢量控制对应物中GFP的荧光强度由FACS确定。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：ES-D3细胞过度表达GM-CSF产生高水平的转基因-CSF。
ELISA测量了所指示细胞介质中的GM-CSF浓度。数据被呈现为三个独立的 ELISA 测量的平均±标准偏差（平均± SD）：**p < 0.001，NS = 不显著，ANOVA 与 Tukey 的多重比较测试。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：ES-D3衍生的细胞外囊泡通过传输电子显微镜检查。
细胞外囊泡由ES-D3细胞制成，这些细胞被质粒转染，表达GM-CSF或其空载体对应物。箭头表示单个囊泡。秤杆 = 100 纳米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：外显微标记高度集中在从ES-D3细胞分离的细胞外囊泡中。
经西方印迹评估，对所示全细胞提取物（WCE）和EV中外显体、内质视网膜（ER）、线粒体和细胞醇的标记量进行了评估。PDI = 蛋白质脱硫异构酶。分子重量标记 （kD） 在左边。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：对外层富集细胞外囊泡中GM-CSF水平的评价。
在所示富含外体的电动汽车中，GM-CSF 的水平是在不同的 ELISA 条件下确定的。外高浓缩 EV 被预处理与或没有 0.05% Tween-20.ELISA 使用仅包含 PBS 或 PBS + 0.05% Tween-20 的洗涤缓冲器进行。这些数据被呈现为三个独立的 ELISA 检测的平均± SD。*p < 0.05， **p < 0.005， ANOVA 与图基的多个比较测试。 请单击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究展示了一种高效的方法，可以产生携带免疫刺激蛋白GM-CSF的富含外体的EV，可用于研究富含外体的电动汽车的免疫调节作用。一些研究表明，外显体表现出免疫调节和抗肿瘤功能22。因此，来自表达转基因-CSF的ESC的外显子可能也具有调节免疫反应的生物活动。在本协议中，外源性粘液GM-CSF通过转染在木质ES-D3细胞中稳定过度表达（图1）。重要的是，从ES-D3细胞中分离出大量转基因-CSF（图5）。
这些数据表明，几乎所有的GM-CSF都位于富含外体的电动汽车内。作为细胞因子，大多数转基因-CSF蛋白是细胞外分泌的。与其他外体货物材料（如 mRNA、miRNA 和蛋白质）一样，细胞溶胶中的 GM-CSF 分子被封装在多血管体 （MVB）6、23的发光囊泡 （ILV） 中。将MVB与等离子膜融合后，GM-CSF携带的ILV被释放到细胞外空间。
本协议中的一个重要步骤是在穆林ES-D3细胞中有效过度表达GM-CSF（图2）。先前通过逆转录病毒感染实现这一目标的努力基本上失败了，可能是因为ESC24的转录水平抑制了逆转录基因表达。在检查的几个病毒和细胞促进剂中，人类EF1+促进剂在ES-D3细胞中表现出最强健的活动。重要的是，在EF1+促进器的控制下，在受感染的ES-D3细胞的长期细胞培养之后，转基因表达保持稳定。为了在另一种细胞类型中表达外源性GM-CSF，需要进一步研究来评估各种促进剂的效率。这种方法的应用，以隔离GM-CSF携带外体丰富的电动汽车可以扩展到其他干细胞类型，以及肿瘤细胞工程表达各种细胞因子。像GM-CSF一样，大多数细胞因子都是细胞外分泌的25。因此，这种方法的一个可能局限性是，在富含外体的电动汽车中积累的给定细胞因子数量太低，无法显示其生物活性。对于特定的细胞因子，需要进行新的研究，以优化其蛋白质水平和外体丰富的电动汽车中的生物活性。
这项研究中最重要的障碍是产生ES-D3克隆，过度表达GM-CSF。为了保持多能状态和促进细胞在体外增殖，在馈线细胞26的存在下，通常培养出粘膜ESC。为了专门从ESC获得外显子，采用了培养ESC27 的无馈线细胞协议。在这项研究中，ES-D3细胞在明胶涂层的盘子中使用LIF补充的介质培养。在这种培养条件下，ES-D3细胞单克隆的板效率和增殖极低，因此从单个细胞生成ES-D3克隆极具挑战性。从父母ES-D3细胞中获取的条件介质的加入未能挽救镀单ES-D3细胞的增殖缺陷。为了克服这一限制，单个ES-D3细胞过度表达GM-CSF与父母ES-D3细胞一起镀。这种电镀方法提高了转基因-CSF表达单个ES-D3克隆的可行性，促进了克隆增殖和扩张。一旦被转染，单个ES-D3克隆显然附着在组织培养板上。它们扩散，而不管其他ES-D3细胞的存在，因为父母的ES-D3细胞在镀血后48小时被消除，只允许转染单个ES-D3细胞生长。
总的来说，制定了一个方案，成功地从ESC中产生携带GM-CSF的富含外体的电动汽车，有可能在不同的疾病条件下刺激免疫反应。此外，我们最近发表的研究表明，来自ESC的转基因-CSF携带富含体的电动汽车可以作为抗癌的无细胞预防疫苗。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
卡维塔·亚达纳普迪、奇·李和约翰·伊顿提交了美国专利申请，"包括工程胚胎干细胞衍生的外体及其使用方法的组成"。
Acknowledgments
我们感谢阿尔卡迪乌斯·斯卢萨尔奇克先生和肯塔基生物医学研究基础设施网络（KBRIN，P20GM103436）获得传输电子显微镜图像。这项工作得到了NIH AA018016-01（J.W.E.）、肯塔基联邦研究挑战信托基金（J.W.E.）、NIH CA106599和CA175003（C.L.）、NIH CA198249（K.Y.）和自由呼吸研究补助金（K.Y.）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G.
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
