Summary
Deze studie beschrijft een methode om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes te isoleren die immuunstimulerende granulocyten macrofaagkolonie-stimulerende factoren dragen uit embryonale stamcellen.
Abstract
Embryonale stamcellen (SER's) zijn pluripotente stamcellen die in staat zijn tot zelfvernieuwing en differentiatie in alle soorten embryonale cellen. Net als veel andere celtypen geven SER's kleine membraanblaasjes, zoals exosomen, af aan de extracellulaire omgeving. Exosomen dienen als essentiële bemiddelaars van intercellulaire communicatie en spelen een basisrol in veel (patho)fysiologische processen. Granulocyte-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) functioneert als een cytokine om de immuunrespons te moduleren. De aanwezigheid van GM-CSF in exosomen heeft het potentieel om hun immuunregulerende functie te stimuleren. Hier werd GM-CSF stabiel overexpressie in de muriene ESC-cellijn ES-D3. Er werd een protocol ontwikkeld om hoogwaardige exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes (EV's) te isoleren uit ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie geven. Geïsoleerde exosoom-verrijkte EV's werden gekenmerkt door een verscheidenheid aan experimentele benaderingen. Belangrijk is dat aanzienlijke hoeveelheden GM-CSF aanwezig bleken te zijn in exosoom-verrijkte EV's. Over het algemeen kunnen GM-CSF-dragende exosoom-verrijkte EV's van SER's functioneren als celvrije blaasjes om hun immuunregulerende activiteiten uit te oefenen.
Introduction
SER's zijn afgeleid van het blastocyststadium van een pre-implantatie-embryo1. Als pluripotente stamcellen hebben SER's het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in elk type embryonale cel. Vanwege hun opmerkelijke ontwikkelingspotentieel en proliferatieve capaciteit op lange termijn zijn SER's uiterst waardevol voor biomedisch onderzoek1. De huidige onderzoeksinspanningen hebben zich grotendeels gericht op het therapeutisch potentieel van SER's voor een verscheidenheid aan belangrijke pathologische aandoeningen, waaronder diabetes, hartaandoeningen en neurodegeneratieve ziekten2,3,4.
Van zoogdiercellen, waaronder SER's, is bekend dat ze blaasjes met variabele grootte afgeven aan de extracellulaire omgeving, en deze EV's bezitten veel fysiologische en pathologische functies vanwege hun rol in intercellulaire communicatie5. Onder verschillende subtypen van EV's zijn exosomen kleine membraanblaasjes die vrijkomen uit verschillende celtypen in de extracellulaire ruimte bij fusie van intermediaire endocytische compartimenten, multivesiculaire lichamen (MWB's), met het plasmamembraan6. Van exosomen is gemeld dat ze intercellulaire communicatie bemiddelen en zijn kritisch betrokken bij veel (patho)fysiologische processen7,8. Exosomen erven sommige biologische functies van hun eigen ouderlijke cellen, omdat exosomen biologische materialen bevatten die uit het cytosol zijn verkregen, waaronder eiwitten en nucleïnezuren. De geassocieerde antigenen of factoren die de immuunrespons specifiek voor een bepaalde ziekte stimuleren, zijn dus ingekapseld in de exosomen van bepaalde soorten cellen9. Dit maakte de weg vrij voor klinische onderzoeken naar tumor-afgeleide exosomen als een anti-kankervaccin10.
GM-CSF is een cytokine uitgescheiden door verschillende soorten immuuncellen11. Opkomend bewijs toont aan dat GM-CSF het immuunsysteem activeert en reguleert en een essentiële rol speelt in het antigeen-presenterende proces12. Een klinisch rapport suggereert bijvoorbeeld dat GM-CSF de immuunrespons op tumoren stimuleert als een vaccinadjuvans13. Verschillende gm-csf-gebaseerde kanker immunotherapie strategieën om de krachtige immuunstimulerende activiteit van GM-CSF te benutten zijn onderzocht in klinische onderzoeken14. Onder deze, een kankervaccin samengesteld uit bestraalde GM-CSF-afscheidende tumorcellen heeft enige belofte getoond bij gevorderde melanoompatiënten door cellulaire en humorale antitumorreacties en daaropvolgende necrose in uitgezaaide tumoren te induceren15.
Omdat de exosomen afgeleid van SER's vergelijkbare biologische activiteiten hebben als de oorspronkelijke SER's, kunnen GM-CSF-dragende exosomen van SER's misschien functioneren als celvrije blaasjes om de immuunrespons te reguleren. In dit artikel wordt een gedetailleerde methode beschreven om hoogwaardige exosoom-verrijkte EV's te produceren van SER's die GM-CSF tot expressie geven. Deze exosoom-verrijkte EV's hebben het potentieel om te dienen als immuunregulerende blaasjes om de immuunrespons te moduleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ES-D3 cellen kweken
- Om exosoomvrij foetaal runderserum (FBS) te genereren, laadt u FBS in een ultracentrifuge en centrifugeer u gedurende 16 uur bij 4 °C bij 100.000 x g. Verzamel na centrifugeren serumsupernatant als exosoomvrije FBS voor het kweken van de muriene ESC-cellijn ES-D3 en het verwerven van exosoomverrijkte EV's.
- Voordat u de ES-D3-cellen plateert, bedekt u de 15 cm weefselkweekschalen met gelatine (0,1%) op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Volgens een eerder beschreven protocol16, kweek de ES-D3 cellen zonder feederlaagcellen in de met gelatine beklede 15 cm weefselkweekschalen. Het ES-D3 celkweekmedium bestaat uit DMEM, exosoomvrije FBS (15%), niet-essentiële aminozuren (0,1 mM), L-glutamine (2 mM), β-mercaptoethanol (0,1 mM), penicilline (50 eenheden / ml), streptomycine (50 μg / ml) en leukemie remmende factor (LIF; 100 eenheden / ml). Kweek ES-D3 cellen bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
- Zodra de ES-D3-cellen ongeveer 90% samenvloeiing bereiken in 15 cm weefselkweekschalen, verwijdert u het medium door aspiratie. Was de cellen met trypsine (5 ml; 0,05%). Voeg trypsine (5 ml) toe aan de gerechten en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Verzamel de cellen uit de gerechten.
- Voeg vers kweekmedium (5 ml) toe aan de verzamelde cellen om de trypsine te inactiveren. Centrifugeer de cellen bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen in vers medium en bepaal het celnummer met behulp van een hemocytometer.
- Voor passaging cellen, plaat de ES-D3 cellen (5 x 106) in een gelatine-gecoate (0,1%) 15 cm weefselkweek schaal met vers medium (15 ml) en kweek gedurende 3 dagen voordat subculturatie van de cellen.
- Om het celkweeksupernatant te verzamelen voor isolatie van exosoomverrijkte EV's, verguld de ES-D3-cellen (1 x10 7) in een met gelatine bedekte (0,1%) 15 cm weefselkweekschaal met vers medium (15 ml) gedurende 3 dagen voorafgaand aan het verzamelen van celkweeksupernatant.
2. Generatie van GM-CSF expressie plasmide
OPMERKING: Genereer het transfectieplasmide pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP om GM-CSF in ES-D3-cellen te overexpresseren. In dit plasmide wordt de expressie van murine GM-CSF cDNA samen met het markereiwit gemensualiseerd Renilla reniformis GFP (hrGFP) aangedreven door de humane polypeptideketen rekfactor 1α (EF1α) promotor17,18.
- Genereer de vectorbackbone.
- Verteer het plasmide pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg DNA) met behulp van het restrictieszym EcoRI (100 eenheden) bij 37 °C gedurende 2 uur om twee DNA-fragmenten te genereren: de vectorbackbone (6,0 kb) en FD3ER-insert (2,5 kb).
- Breng 50% van het verteerde plasmide-DNA (10 μg) over in één microcentrifugebuis van 1,5 ml en behandel met alkalische fosfatase (20 eenheden) bij 37 °C gedurende 1 uur. Los zowel onbehandeld als gedefosforyleerd DNA op met behulp van agarosegel-elektroforese (2%).
- Zuiver de vector backbone DNA-fragmenten (6,0 kb) met behulp van een DNA-gelextractiekit. Terwijl de onbehandelde vectorbackbone zal dienen als de lege vector (pEF1α-IRES-hrGFP), zal de gedefosforyleerde vectorbackbone worden gebruikt om GM-CSF-expresserend plasmide (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP) te genereren.
- Genereer de GM-CSF cDNA-insert.
- Verteer het plasmide pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) met behulp van het restrictie-enzym EcoRI (100 eenheden) bij 37 °C gedurende 2 uur om twee DNA-fragmenten te produceren: de vectorbackbone (6,5 kb) en de murine GM-CSF cDNA-insert (474 bp).
- Los het verteerde DNA op via agarosegel-elektroforese (2%). Zuiver het murine GM-CSF cDNA-fragment (474 bp) met behulp van een DNA-gelextractiekit.
- Genereer de expressie plasmiden.
- Stel 2 ligatiereacties in (10 μL totaal volume) met behulp van een DNA-ligatiekit.
- Om de lege vector pEF1α-IRES-hrGFP te genereren, ligaat u de onbehandelde vectorbackbone uit stap 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng).
- Om pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP te genereren, ligaat u de volgende DNA-fragmenten: (1) de gedefosforyleerde vectorbackbone uit stap 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) en (2) het mGM-CSF cDNA-fragment gegenereerd in stap 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
- Ligate bij 25 °C gedurende 5 min. Transformeer geligeerd DNA in DH5α competente E. coli cellen. Plaat de getransformeerde E. coli-cellen op LB-agarplaten die carbenicilline (50 μg/ ml) bevatten.
- Zuiver plasmiden uit enkele E. coli-kolonies met behulp van een DNA-isolatiekit. Valideer de identiteit van de plasmiden door DNA-sequencing.
- Stel 2 ligatiereacties in (10 μL totaal volume) met behulp van een DNA-ligatiekit.
3. Generatie van ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie
OPMERKING: Transfecteer de ES-D3-cellen met het plasmide pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP om GM-CS te overexpressie. Cotransfecteer het plasmide pBabe-Neo in ES-D3-cellen om de selectie van stabiel getransfecteerde cellente vergemakkelijken 18,20.
- Transfecteer de plasmiden in de ES-D3-cellen.
- Verdeel de ES-D3-cellen (1,4 x 106) in een met gelatine beklede (0,1%) 10 cm weefselkweekschaal met kweekmedium (10 ml) voor transfectie. Gekweekte ES-D3-cellen bij 37 °C gedurende 24 uur.
- Bereid twee plasmidemengsels in microcentrifugebuizen van 1,5 ml: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, vectorcontrole) met pBabe-Neo (4 μg) en (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, gm-csf) met pBabe-Neo (4 μg). Voer transfectie uit met behulp van een transfectiekit volgens het protocol van de fabrikant.
- Voeg transfectiemedium (1 ml) en transfectiereagens (64 μL) toe aan elke buis die de plasmidemengsels bevat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg de transfectiemengsels toe aan de respectievelijke 10 cm schalen van ES-D3-cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 uur.
- Vervang het medium in schalen van 10 cm door vers kweekmedium (10 ml). Incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur.
- Genereer bulkpopulaties van stabiel getransfecteerde ES-D3-cellen.
- Verwijder het medium uit getransfecteerde ES-D3-cellen. Was de cellen met trypsine (2 ml; 0,05%). Voeg trypsine (2 ml) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Breng de cellen over in een centrifugebuis van 15 ml en voeg 2 ml vers kweekmedium toe om trypsine te neutraliseren. Centrifugeer bij 390 x g gedurende 5 min.
- Resuspend de getransfecteerde cellen in vers kweekmedium (10 ml). Evalueer de fluorescentie-intensiteit van GFP in getransfecteerde ES-D3-cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), volgens het protocol van de fabrikant.
- Breng de getransfecteerde cellen over in twee schalen van 10 cm met vers kweekmedium (10 ml). Voeg neomycine (0,5 mg / ml) toe om niet-getransfecteerde cellen te elimineren.
- Ga door met het kweken van de getransfecteerde cellen in kweekmedium dat neomycine bevat (0,5 mg / ml). Wanneer de getransfecteerde ES-D3 90% confluentie bereikt, breng de cellen opnieuw over naar 15 cm weefselkweekschalen. Herhaal de procedure gedurende 2 weken.
- Genereer klonen van stabiel getransfecteerde ES-D3-cellen.
- Zodra bulkpopulaties van stabiel getransfecteerde ES-D3-cellen zijn gegenereerd, verzamelt u de cellen zoals voorheen. Bepaal de celaantallen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen (1 x 107 cellen/ml) in vers kweekmedium.
- Filter de cellen door een steriele celzeef van 40 μm. Zuiver GFP-positieve ES-D3-cellen met behulp van FACS, volgens het protocol van de fabrikant.
- Plaats een enkele gesorteerde ES-D3-cel in één put van een met gelatine bedekt (0,1%) 96-put weefselkweekplaat met ouderlijke ES-D3-cellen (1 x 103) in neomycinevrij medium (200 μL). Co-culturing van getransfecteerde ES-D3-cellen met hun niet-getransfecteerde ouderlijke tegenhangers zorgt ervoor dat stabiel getransfecteerde enkele ES-D3-cellen overleven en prolifereren als een enkele kloon.
- Kweek de cellen gedurende 48 uur en voeg vervolgens neomycine (0,5 mg / ml) toe aan 96-well platen om niet-getransfecteerde ouderlijke ES-D3-cellen te elimineren.
- Ga door met het kweken van de GFP-positieve ES-D3-cellen in 96-well weefselkweekplaten met medium dat neomycine (0,5 mg / ml) bevat gedurende 1 week. Breng klonale ES-D3-cellijnen over naar gelatine-gecoate (0,1%) 6 cm weefselkweekschalen met kweekmedium (5 ml) die neomycine (0,5 mg / ml) bevatten gedurende 1 week.
- Bepaal de intensiteit van GFP-fluorescentie in elk van de getransfecteerde ES-D3-celklonen met behulp van FACS, volgens het protocol van de fabrikant. Selecteer de ES-D3-klonen die GM-CSF of de lege vector met hoge niveaus van groene fluorescentie tot expressie brengen.
- Bepaal de hoeveelheden GM-CSF die door ES-D3-cellen worden uitgescheiden met behulp van een murine GM-CSF ELISA-kit, volgens het protocol van de fabrikant.
4. Isolatie van exosoomverrijkte extracellulaire blaasjes
- Kweek de ES-D3 cellen (1 x 107) in 15 cm weefselkweekschalen gedurende 72 h bij 37 °C. Verzamel het celkweeksupernatant. Bewaar verzameld supernatant bij 4 °C tot 1 week om de exosomale integriteit te behouden.
- Centrifugeer het celcultuursupernatant bij 5.000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C met behulp van een centrifuge om grote celfragmenten te bezinken.
- Verzamel het supernatant en centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 90 minuten bij 4 °C met behulp van een ultracentrifuge.
- Verwijder het supernatant. Spoel elke pellet voorzichtig twee keer af met fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS; 1 ml) om restkweeksupernatant te verwijderen.
- Resuspend elke pellet in PBS. Kwantificeer exosoomverrijkte EV's aan de maat van hun eiwitgehalte5.
- Meet de eiwitconcentratie van exosoomverrijkte EV's met een bicinchoninezuur (BCA) -test. De verwachte opbrengst van exosoom-verrijkte EV's uit ES-D3-cellen is ongeveer 4 μg eiwit / ml celkweeksupernatant. Resuspend de exosoom-verrijkte EV's in PBS (eiwitconcentratie: ~6 μg/μL). Bewaar de exosoomverrijkte EV's bij -80 °C.
5. Karakterisering van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes door transmissie-elektronenmicroscopie
OPMERKING: Onderzoek de samenstelling en de structuur van de exosoom-verrijkte EV's geïsoleerd uit SER's met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)5.
- Fixeer de exosoomverrijkte EV's (3-5 μg/μL) met een eindconcentratie van 2% EM-kwaliteit paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Laad vaste monsters (10 μL) op koperen roosters met koolstofondersteuningsfolie. Incubeer de monsters met koperen roosters gedurende 1 minuut en giet de roosters vervolgens af met filterpapier.
- Bevlek de roosters met een kleuringsoplossing volgens het protocol van de fabrikant.
- Breng de roosters met een pincet over op een stuk filterpapier. Laat de roosters een nacht drogen bij kamertemperatuur.
- Verkrijg elektronenmicroscopiebeelden met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (50.000x vergroting), volgens het protocol van de fabrikant.
6. Evaluatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes door western blot analyse
- Bereid hele celextracten voor.
- Verwijder het medium uit ES-D3-cellen die in schalen van 15 cm zijn gekweekt. Was de cellen met trypsine (5 ml; 0,05%). Voeg trypsine (5 ml) toe aan de cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Verzamel de cellen en voeg vers kweekmedium (5 ml) toe om trypsine te neutraliseren. Centrifugeer de cellen bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen in PBS.
- Bepaal celaantallen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen in SDS-PAGE laadbuffer met 0,5% SDS (5.000 cellen/μL).
- Soniceer de samples gedurende 10 s met behulp van een sonicator met 10% amplitude (wattage: 500 W; ultrasone frequentie: 20 kHz). Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 100 °C.
- Bereid de lysaten van exosoom-verrijkte EV's voor.
- Resuspend de exosoom-verrijkte EV's in SDS-PAGE laadbuffer met 0,5% SDS in een concentratie van 1,2 μg/μL.
- Soniceer de samples gedurende 10 s met behulp van een sonicator met 10% amplitude (wattage: 500 W; ultrasone frequentie: 20 kHz). Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 100 °C.
- Detecteer eiwitten door Western blot.
- Laad hele celextracten (10 μL; 5.000 cellen/μL) en exosoomverrijkte EV-lysaten (10 μL; 1,2 μg/μL) in elke put van een Bis-Tris PAGE-gel (4-20%). Breng eiwitten over op polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen.
- Incubeer membranen met geschikte primaire en secundaire antilichamen. Verdun antilichamen (in de hieronder aangegeven concentraties) in blottingbuffer met PBS, Tween-20 (0,2%) en magere droge melk (10% w/v).
- Gebruik de volgende primaire antilichamen: anti-Annexine V (200 ng/ml), anti-CD81 (50 ng/ml), anti-flotilline-1 (200 ng/ml), anti-cytochroom c (100 ng/ml), anti-eiwit disulfide isomerase (200 ng/ml), anti-GAPDH (33 ng/ml) en anti-oxfos COX IV-subunit IV (600 ng/ml).
- Gebruik de volgende secundaire antilichamen: peroxidase-geconjugeerde geiten anti-konijn IgG (20 ng / ml) en peroxidase-geconjugeerde geiten anti-muis IgG (20 ng / ml).
- Detecteer eiwitten met behulp van een verbeterde chemiluminescentiedetectiekit.
7. Bepaling van GM-CSF-concentraties in exosoomverrijkte extracellulaire blaasjes door ELISA
OPMERKING: Evalueer de hoeveelheden GM-CSF in exosoom-verrijkte EV's met ELISA met behulp van een kit voor murine GM-CSF, volgens het protocol van de fabrikant met enkele wijzigingen.
- Bekleed de ELISA-plaat met vangantilichaam. Behandel exosoomverrijkte EV's (0,6 μg) alleen in PBS of PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg behandelde monsters toe aan de gecoate ELISA-plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de plaat alleen met PBS of PBS + 0,05% Tween-20.
- Voeg detectieantilichaam toe aan de monsters. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de plaat alleen met PBS of PBS + 0,05% Tween-20. Voeg Avidin-HRP toe aan de monsters. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Was de plaat alleen met PBS of PBS + 0,05% Tween-20.
- Bepaal de concentraties GM-CSF in exosoomverrijkte EV's door de absorptie bij 450 nm te meten op een microplaatlezer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GM-CSF is overexpressie in murine SER's.
Om GM-CSF stabiel te overexpressie in ES-D3-cellen, werd murine GM-CSF cDNA gekloond in een transfectievector om de expressievector pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP te genereren (Figuur 1A). GM-CSF was overexpressie in ES-D3-cellen door transfectie en ongeveer 20% van de tijdelijk getransfecteerde ES-D3-cellen was GFP-positief. Celklonen die GM-CSF stabiel overexpressie of de lege vectorcontrole uitdrukten, werden verworven door FACS. Zoals te zien is in figuur 1B,was de GFP-fluorescentie-intensiteit van een GM-CSF-expresserende ES-D3-cellijn of een ES-D3-cellijn die de lege vector tot expressie brengt veel hoger dan die van hun ouderlijke tegenhangers. Een ELISA-test werd uitgevoerd om de GM-CSF-concentraties in het celkweeksupernatant van verschillende cellijnen te evalueren(figuur 2). ES-D3-cellen die GM-CSF tot expressie brengen, produceerden aanzienlijk hogere niveaus van GM-CSF in het celkweeksupernatant dan hun lege vectorcontrole. Bovendien was de hoeveelheid GM-CSF gegenereerd door GM-CSF-tot expressie brengende ES-D3-cellen vergelijkbaar met die van STO-fibroblasten die GM-CSF tot expressie brengen, zoals eerder gemeld19.
Exosomen zijn verrijkt met extracellulaire blaasjes afgeleid van muriene SER's.
Vectorcontrole en GM-CSF-tot expressie gebrachte ES-D3 celculturen werden uitgebreid en celkweek supernatant werd verzameld. EV's werden geïsoleerd na verschillende stappen van centrifugeren. Afzonderlijke EV's werden voor het eerst geëvalueerd door TEM(figuur 3). Zoals te zien is in de TEM-afbeeldingen, bevatten geïsoleerde EV's blaasjes van verschillende grootte, wat vaak wordt waargenomen in exosomale preparaten5. Belangrijk is dat de diameters van de individuele blaasjes 30-100 nm waren, in overeenstemming met eerdere rapporten die exosomen21beschreven . Verder werd de aanwezigheid van exosomen in EV's onderzocht door Western blotting(figuur 4). De expressie van exosomale markers, waaronder CD81, annexine V en Flotillin-1, was aanzienlijk verbeterd in EV's geïsoleerd uit ES-D3-cellen in vergelijking met overeenkomstige hele celextracten (WCE). Belangrijk is dat de aanwezigheid van andere subcellulaire compartimentmarkers in van ES-D3 afgeleide EV's niet werd gedetecteerd, waaronder (1) het endoplasmatisch reticulum (ER) markereiwit disulfide-isomerase (PDI), (2) de mitochondriale markers cytochroom c en COX IV-subeenheid IV, en (3) de cytosolische marker GAPDH. Over het algemeen tonen deze gegevens aan dat exosomen sterk verrijkt waren in EV's afgeleid van ES-D3-cellen.
GM-CSF is gelokaliseerd in exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit SER's.
Om te bepalen of exosoomverrijkte EV's GM-CSF-moleculen bevatten, werd elisa-test uitgevoerd om de niveaus van GM-CSF te evalueren in exosoom-verrijkte EV's verkregen uit ES-D3-cellen met of zonder GM-CSF-expressie(figuur 5). Om de lokalisatie van GM-CSF-eiwitten in exosoomverrijkte EV's verder te onderzoeken, werden de GM-CSF-niveaus gekwantificeerd in exosoom-verrijkte EV's onder verschillende wasomstandigheden door ELISA. Voor dit doel werd het wasmiddel Tween-20 (0,05%) eerst gebruikt om de exosomale membranen te permeabiliseren en ELISA-assays werden uitgevoerd in de buffers met of zonder 0,05% Tween-20. Omdat bekend is dat Tween-20 eiwit-eiwitinteracties vermindert, werden de gm-csf-achtergrondspiegels die in de controle-EV's werden gedetecteerd, aanzienlijk verlaagd met Tween-20 in de wasbuffer. Daarentegen werden GM-CSF-niveaus in de EV's van GM-CSF-expressing cellen significant verhoogd met Tween-20. Deze resultaten tonen aan dat Tween-20-geïnduceerde exosomale membraanpermeabilisatie GM-CSF-moleculen in de blaasjes toegankelijk maakt voor antilichaamherkenning, wat bewijs levert dat de meerderheid van exosomale GM-CSF-moleculen gelokaliseerd zijn in het lumen van geïsoleerde blaasjes.
Figuur 1: Exogene GM-CSF is stabiel overexpressie in ES-D3 cellen.
(A) Het schematische diagram van het plasmide voor overexpressie van murine GM-CSF in ES-D3 cellen, waarin een EF1α promotor GM-CSF expressie aandrijft en hrGFP dient als expressiemarker.
B)Fluorescentie-intensiteit van GFP in GM-CSF-tot expressie brengende ES-D3-cellen of hun lege vectorcontrole-tegenhangers werd bepaald door FACS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie hebben, produceren hoge niveaus van GM-CSF.
GM-CSF-concentraties in het medium van de aangegeven cellen werden gemeten met ELISA. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviaties (gemiddelde ± SD) van drie onafhankelijke ELISA-metingen: **p < 0,001, NS = niet significant, ANOVA met tukey's meervoudige vergelijkingstest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ES-D3-afgeleide extracellulaire blaasjes worden onderzocht door transmissie-elektronenmicroscopie.
Extracellulaire blaasjes werden bereid uit ES-D3-cellen die getransfecteerd waren met het plasmide dat GM-CSF of zijn lege vectortegenhanger tot expressie brengt. Pijlen geven individuele blaasjes aan. Schaalbalk = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Exosomale markers zijn sterk geconcentreerd in extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit ES-D3 cellen.
De hoeveelheden markers voor exosomen, endoplasmatisch reticulum (ER), mitochondriën en cytosol in de aangegeven hele celextracten (WCE) en EV's werden geëvalueerd door Western blotting. PDI = eiwit disulfide isomerase. Moleculaire gewichtsmarkers (kD) bevinden zich aan de linkerkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Evaluatie van GM-CSF-niveaus in exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes.
De niveaus van GM-CSF in de geïndiceerde exosoom-verrijkte EV's werden bepaald onder verschillende ELISA-omstandigheden. Exosoom-verrijkte EV's werden voorbehandeld met of zonder 0,05% Tween-20. ELISA werd uitgevoerd met behulp van wasbuffer met alleen PBS of PBS + 0,05% Tween-20. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke ELISA-assays. *p < 0,05, **p < 0,005, ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie toont een zeer efficiënte methode voor het produceren van exosoom-verrijkte EV's met het immuunstimulerende eiwit GM-CSF, dat kan worden gebruikt om de immuunmodulerende effecten van exosoom-verrijkte EV's te bestuderen. Verschillende studies suggereren dat exosomen immuunregulerende en antitumorale functies vertonen22. Exosomen van SER's die GM-CSF tot expressie komen, kunnen dus ook biologische activiteiten bezitten die de immuunrespons reguleren. In dit protocol werd exogene murine GM-CSF stabiel overexpressie in muriene ES-D3-cellen door transfectie(figuur 1). Belangrijk is dat aanzienlijke hoeveelheden GM-CSF werden gedetecteerd in exosoom-verrijkte EV's geïsoleerd uit ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie geven(figuur 5).
Deze gegevens suggereren dat bijna alle GM-CSF zich in exosoomverrijkte EV's bevindt. Als cytokine wordt de meerderheid van het GM-CSF-eiwit extracellulair uitgescheiden11. Net als ander exosomaal ladingmateriaal (bijv. MRNA's, miRNA's en eiwitten), worden GM-CSF-moleculen in het cytosol ingekapseld in de intraluminale blaasjes (ILV's) van multivesiculaire lichamen (MVP's)6,23. Bij fusie van MVP's met het plasmamembraan komen GM-CSF-dragende ILV's vrij in de extracellulaire ruimte.
Een belangrijke stap in dit protocol is het effectief overexpressie van GM-CSF in murine ES-D3 cellen(Figuur 2). Eerdere pogingen om dit doel te bereiken door retrovirale infectie faalden grotendeels, waarschijnlijk vanwege de onderdrukking van retrovirale genexpressie op de transcriptionele niveaus in SER's24. Van verschillende onderzochte virale en cellulaire promotors vertoonde de menselijke EF1α-promotor de meest robuuste activiteit in ES-D3-cellen. Belangrijk is dat de transgenexpressie onder controle van de EF1α-promotor stabiel bleef na langdurige celkweek van getransfecteerde ES-D3-cellen. Om exogene GM-CSF in een ander celtype tot expressie te brengen, zijn verdere studies nodig om de efficiëntie van verschillende promotors te evalueren. De toepassing van deze methode om GM-CSF-dragende exosoom-verrijkte EV's te isoleren, kan worden uitgebreid naar andere stamceltypen en tumorcellen die zijn ontworpen om verschillende cytokines tot expressie te brengen. Net als GM-CSF worden de meeste cytokines extracellulairuitgescheiden 25. Daarom is een mogelijke beperking van deze benadering dat de hoeveelheid van een bepaald cytokine die zich ophoopt in exosoom-verrijkte EV's te laag is om zijn biologische activiteit te vertonen. Voor een bepaald cytokine moeten nieuwe studies worden uitgevoerd om het eiwitniveau en de biologische activiteit in exosoomverrijkte EV's te optimaliseren.
De meest kritieke hindernis in deze studie is het genereren van ES-D3-klonen die GM-CSF overexpressie. Om de pluripotentiële toestand te behouden en celproliferatie in vitro te bevorderen, worden muriene SER's over het algemeen gekweekt in aanwezigheid van feedercellen26. Om exosomen uitsluitend van SER's te verkrijgen, werd een feeder-celvrij protocol gebruikt om SER's27 te cultureren. In deze studie werden ES-D3-cellen gekweekt in gelatine-gecoate schalen met behulp van medium aangevuld met LIF. De plaatefficiëntie en proliferatie van enkele klonen van ES-D3-cellen onder deze kweekconditie waren extreem laag, waardoor het zeer uitdagend was om ES-D3-klonen uit afzonderlijke cellen te genereren. De toevoeging van het voorwaardelijke medium verkregen uit ouderlijke ES-D3-cellen slaagde er niet in om de proliferatiedeficiëntie van vergulde enkele ES-D3-cellen te redden. Om deze beperking te overwinnen, werden enkele ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie geven, samen met ouderlijke ES-D3-cellen geplateerd. Deze platingbenadering verbeterde de levensvatbaarheid van GM-CSF-uitdrukkende enkele ES-D3-klonen, waardoor klonale proliferatie en expansie werd vergemakkelijkt. Eenmaal getransfecteerd, enkele ES-D3-klonen blijkbaar bevestigd aan weefselkweekplaten. Ze prolifereerden ongeacht de aanwezigheid van andere ES-D3-cellen, omdat ouderlijke ES-D3-cellen 48 uur na het vergulden werden geëlimineerd, waardoor alleen getransfecteerde enkele ES-D3-cellen konden groeien.
Over het algemeen werd een protocol ontwikkeld om met succes exosoom-verrijkte EV's met GM-CSF van SER's te genereren met het potentieel om de immuunrespons in verschillende ziekteomstandigheden te stimuleren. Bovendien toont onze onlangs gepubliceerde studie aan dat GM-CSF-dragende exosoom-verrijkte EV's van SER's kunnen dienen als een celvrij profylactisch vaccin tegen kanker28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kavitha Yaddanapudi, Chi Li en John W. Eaton dienden een Amerikaanse patentaanvraag in "Samenstellingen bestaande uit gemanipuleerde embryonale stamcel-afgeleide exosomen en methoden voor het gebruik daarvan."
Acknowledgments
We zijn de heer Arkadiusz Slusarczyk en Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) dankbaar voor het verkrijgen van transmissie-elektronenmicroscoopbeelden. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 en CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) en Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G.
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
