Summary
我们提出了一个微流体癌片模型，即"进化加速器"技术，它为在单细胞明确定义的环境条件下癌症动力学的长期实时定量研究提供了一个可控的平台水平。这项技术有望成为基础研究或临床前药物开发的体外模型。
Abstract
传统的细胞培养仍然是最常用的临床前模型，尽管它被证明是有限的能力，预测癌症的临床结果。提出了微流体癌片模型，以弥合过于简化的传统二维培养法与更复杂的动物模型之间的差距，后者产生可靠和可重复的定量结果的能力有限。在这里，我们提出了一个微流体癌片模型，该模型以全面的方式再现复杂肿瘤微环境的关键成分，但简单到足以提供可靠的癌症动力学定量描述。这种微流体癌片模型"进化加速器"将大量癌细胞分解成一系列相互关联的肿瘤微环境，同时生成异构化疗应激环境。癌症在药物梯度反应下的进展和进化动态可以实时监测数周，并且可以进行许多下游实验，以补充实验过程中拍摄的延时图像。
Introduction
癌症已日益被公认为是一个复杂的生态系统，它不仅取决于突变细胞群的持续调节，还取决于癌细胞与宿主微环境之间的重要相互作用。从这个意义上说，癌症在一个适应性的景观上进化，表现为多种因素，包括异质肿瘤微环境和与各种宿主细胞的串扰，所有这些都为进一步的遗传或表观遗传变化1，2，3。在实体肿瘤的情况下，化疗和其他资源梯度分布不均匀，有助于其分子异质性，并可能在耐药性的发展中发挥作用，增加特定肿瘤的血管生成亚种群，甚至转移4，5，6。传统的体外二维细胞培养研究，虽然拥有大规模、方便的实验能力，但提供均场、均匀和固定条件，往往缺乏真正所需的精确的空间和时间环境控制模拟体内肿瘤动力学。因此，需要更具代表性的外体模型在药物开发管道中的动物模型之前重现肿瘤微环境，以便更好地预测癌症进展以及动态压力内对药物的反应景观。微流体学已被提出来弥合二维细胞培养研究与更复杂的体内动物研究之间的差距，这些研究可能无法支持可控的定量研究7、8、9。
一个理想的体外系统来描述癌细胞动力学应该具有产生异构微环境的能力，以模拟在肿瘤中可能发生的适应性细胞反应，并允许在单细胞分辨率。在本文中，我们描述了一个微流体细胞培养平台，一种基于PDMS的设备，称为"进化加速器"（EA），它允许在细胞分辨率下对癌细胞动力学进行平行体外研究，并实时采集周，同时稳定地保持整个文化景观的压力梯度。这个平台的设计是基于我们以前的工作，其中生物体的进化动力学在元种群可以加速10，11。具体来说，在一组空间分离的种群中，当暴露于异质应力景观时，与大型统一种群相比，最适合的物种可以更快地在本地种群中占据主导地位。有利的物种然后迁移到邻近的微生境，以寻找资源和空间，并最终主宰整个种群。如图1所示，微流体EA芯片的图案由（i）一对蛇形通道组成，这些通道提供新鲜的介质循环，为化学扩散构造固定边界条件;（ii）六边细胞培养区它由109个相互连接的六角形和24个半六角形室组成，中间类似蜂窝结构。芯片深度为100μm。介质通道和细胞培养区域与小切线（约15μm宽）相连，防止直接介质流动和产生的剪切应力穿过细胞培养区，但仍允许化学物质通过小切线扩散并交换营养成分，代谢废物等。化学梯度的产生如图1B所示，其中一个介质通道含有0.1 mM的荧光，而另一个通道不含荧光。细胞在气体渗透膜上培养，通过膜上对芯片的正背压由微观结构封装。图2说明了器件支架的部件，实验设置如图3所示，在37°C的倒置显微镜上保持培养，相对湿度超过85%，并在诺莫夏气体成分。
该系统通过明场和荧光通道提供局部细胞相互作用的详细观察，并允许在空间上解决下游测定，如免疫荧光、西显孔或质谱。我们之前已经证明，这种微流体癌片上模型在上皮和中位PC3前列腺癌细胞12的长期共培养，以及耐药性多倍体巨的出现，作为原理的证明癌细胞使用上皮PC3细胞系13。尽管我们介绍了该平台的应用，以了解上皮PC3和间质性前列腺癌细胞在多西他塞的应力梯度下的时空动力学，但微流体系统可以很容易地应用于细胞系的任意组合和资源（即药物、营养、氧气）梯度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 微流体装置的制造
- 使用布局设计软件生成所需的微流体模式（参见补充材料）。
- 制作照片蒙版。有关详细信息，请参阅材料表。
- 利用激光书写器，在涂有 100 nm Cr 和 500 nm 光刻胶 AZ1518 的苏打石灰玻璃板上书写图案。
- 与开发人员 AZ300MIF 共同开发光刻胶，使用 60 s。
- 使用 Cr-7 铬蚀刻剂，无需保护光刻胶。
- 在 70°C 下使用光胶剥离残余光胶 45 分钟。
- 图案的光刻胶。有关详细信息，请参阅材料表。
- 在 4000 rpm 的硅晶圆上旋转涂层 HMDS 40 s。
- 在 4000 rpm 的硅晶圆上旋转涂层光刻器 AZ4330，40 s。
- 在 95°C 下软烘烤硅片 60 s。
- 利用面膜对准器将紫外线暴露在硅晶片中。
- 与开发人员 AZ300MIF 共同开发光刻胶 4 分钟。
- 执行 DRIE 蚀刻。有关详细信息，请参阅材料表。
- 使用硅深反应 Ion 蚀刻 （DRIE） 系统对带光刻器图案的晶圆进行干蚀，深度为 100 μm。
- 用丙酮和等离子蚀刻去除带等离子蚀刻的光胶。
- 晶圆氧化和硅化。有关详细信息，请参阅材料表。
- 在 1100 °C 的熔炉中蚀刻硅晶片上执行热氧化 1 小时。
- 等待硅晶片冷却，然后将晶圆放入干燥器中，滴下几滴三氯-1H、1H、2H、2H-全氟基硅烷 （PFOTS）滴在晶圆附近的一个小容器中。
- 在室温下将干燥器的压力泵送至 0.5 atm 60 分钟。硅晶片模具在适当硅化后应具有疏水性，可以通过在晶圆上加入几滴水来进行测试。
- 软光刻。有关详细信息，请参阅材料表。
- 按重量比率将预聚合物和交叉链接器（来自聚甲基硅氧烷 （PDMS） 试剂盒）混合。
- 将混合 PDMS 倒入硅片模上，将高度为 10 mm 的薄膜浇注到硅片模具上。
- 在干燥器中将产生的 PDMS 硅晶圆系统除气 30 分钟至 1 小时。
- 在70°C的培养箱中孵育PDMS硅晶片过夜，以治愈PDMS。
- 一旦PDMS固化，小心地从硅片上剥下PDMS薄膜。
- 使用活检针，根据 PDMS 上图案的位置在入口口打孔，并使用圆形冲孔切割直径为 27 mm 的芯片。
- PDMS 层粘接。
- 热固化两叠27毫米PDMS气缸（无图案），这将成为设备的储层和封盖层。
- 在储层层入口周围切出两个 7 mm 的圆圈，并使用活检针在封顶层的进气口打孔。
- 将三叠 PDMS（图案堆栈、储层、封顶层）与氧等离子体处理结合。
- 使用活检针，在设备插座和中心端口打孔。
2. 培养和细胞系
- 准备培养PC3细胞系的培养介质，包括PC3-EMT和PC3-EPI：将RPMI 1640介质与10%胎儿牛血清（FBS）和1x抗生素抗菌药混合。生成前14所述的细胞线。
注：PC3细胞系在加湿培养箱中保持在37°C，CO2为5%。分裂细胞和亚培养每3天，才达到100%汇合。 - 转染细胞系与细胞质标记荧光标记更好的可视化，如前面12所述，使PC3-EMT表示细胞质GFP和PC3-EPI表示细胞质mCherry。请注意，该技术还与任何荧光标记细胞以及未标记细胞的明场成像兼容。
3. 实验设置
- 金属板支架的制造
- 制作一个板架，该支架足以同时容纳可透气培养皿，通过加工或 3D 打印进行并行实验。3D CAD 文件（"3 孔板"。FCStd"）可以在 GitHub 上找到作为参考（https://github.com/kechihl/3-well-plate）。
- 用螺丝刀拧下支架的部件 （图 2） .通过紫外线照射对部件进行消毒至少 1 小时，并在无菌环境中离开。
注：支架设计为热平衡和理想气体成分提供实质性条件，气体通道入口允许气流。更多细节可以在我们以前的工作12中找到。 - 准备多达三个透气培养皿，其中细胞培养膜相对灵活。
- 细胞系播种
- 在实验开始前24小时，通过胰蛋白化5分钟收获PC3-EPI和PC3-EMT细胞。加入预热培养物，然后在150 x g下离心3分钟，并丢弃上清液。
- 使用血细胞计计算每个 PC3-EPI 和 PC3-EMT 的细胞，并为每个可渗透培养皿分离每个细胞类型的 2.5 x 104。
- 在2 mL培养基中混合和重新悬浮两种细胞类型，并将细胞播种到每个透气培养盘中。
- 将整个板架放在培养箱中过夜，以便细胞附着。
- 通过紫外线照射对 PDMS 设备进行消毒至少 1 小时，并在无菌环境中离开。
- 设置热控制单元和供气系统
- 如图3所示，建立了一个供气系统，该系统由CO2和O 2控制单元、气体泵、气体混合室、加湿器或气泡器以及三套独立的气体阀和压力表组成。更多细节可以在我们以前的工作12中找到。
- 设置 CO2和 O2控制单元，以便它们从 CO2和 N 2 储罐和 O2源调整气体的混合速率。或者，任何在诺莫夏条件下提供气体的供气系统都起作用。
- 确保混合室中结合的气体通过气泡加湿，使相对湿度增加高达 85%（从相对湿度监视器中读取），并且气体通向三个带压力表的独立气体阀，以便 控制和监控板架中的气体流量。
- 将整个板架放在一个带独立加热子单元的舞台上孵化热控制单元中，用于盖子和底板，所有单元均设置为 37°C。有关详细信息，请参阅材料表。
- 微流体装置的安装。有关详细信息，请参阅材料表。
- 确定 3 孔板支架的详细部件顺序，如图2 所示。三口井都是相同且独立的，每口井都有一对气道。每口井都拥有可透气培养皿支架、PDMS 芯片支架、玻璃窗架和一对 35 mm 玻璃窗。这些部件可以使用安装的螺钉进行组装。
注：玻璃窗可确保透气培养膜与井之间有热隔离空间，因此界面上不发生水冷凝。请注意，3口井是独立的，3个实验可以单独完成。 - 在37°C下预温培养基，在真空室中脱气20分钟。
- 使用氧等离子体系统处理 PDMS 芯片 30 s，以保持亲水性。
- 设置注射器系统。用生长培养物缓慢地装入两个注射器，用所需的兴趣试剂（介质、带药物的介质等）缓慢地装上两个注射器。将每个单独的注射器连接到 50 厘米管（ 0 . 020 x 0 . 060OD ）上，通过 23 胶针连接到一个空心钢销中。将空心钢销插入管的另一端。
- 给油管加注，并通过封盖层将钢销插入每个 PDMS 芯片中。填充储层，用介质润湿 PDMS 图案层图案。储层层用作片上气泡陷阱，以防止气泡进入微流体模式。
- 使用培养培养物加载 1 mL 注射器。将注射器连接到 5 厘米管（ 0 . 020 x 0 . 060OD ），通过 23 胶针连接到一个空心钢销中。将空心钢销插入管的另一端，使管部充油。
- 将空心钢销插入芯片的中心孔中，在芯片密封过程中，稍后可以从芯片中抽出过多的介质。
- 由于每个 PDMS 设备需要将四个 10 mL 注射器加载到注射器泵上，因此在前进甲板上每个芯片上加载两个 10 mL 注射器。将另外两个注射器放在注射器系统的退出甲板上。
- 将芯片直接放在透气培养膜的顶部（细胞已附着在膜上）。为了避免微流体模式中的微气泡缠绕，在组装前将预热和脱气介质分配1 mL到35mm透气培养皿中，然后确保芯片以15度倾斜角度接近液体表面。
- 用PDMS芯片架向下推PDMS器件，将可透气培养皿和井夹在每个芯片的透气培养盘支架中。
- 将一块保压器板贴在 PDMS 设备顶部，用 PDMS 芯片支架夹紧，以防止芯片干燥。
- 将阵列周围的介质流速设置为 20 μL/h。
- 在倒置显微镜的电动舞台上将整个板设置在舞台上的培养箱中。将供气系统连接到气体通道，对已安装的 PDMS 芯片加压气体渗透培养膜，以确保设备密封。将仪表压力保持在 0.2 psi（1.4 x 104 Pa）。
- 使用 1 mL 注射器从中心孔中缓慢提取芯片中的过多介质。在提取介质时观察显微镜下的芯片，然后在芯片密封时停止提取。芯片密封应该是显而易见的，因为细胞的一部分将被微结构压碎。
- 将舞台培养箱的温度感应单元连接到 3 孔板，并设置为 37°C。
- 确定 3 孔板支架的详细部件顺序，如图2 所示。三口井都是相同且独立的，每口井都有一对气道。每口井都拥有可透气培养皿支架、PDMS 芯片支架、玻璃窗架和一对 35 mm 玻璃窗。这些部件可以使用安装的螺钉进行组装。
4. 单单元延时成像
- 利用倒置显微镜设置成像软件进行延时图像采集。请注意，EA 实验需要具有完全电动 x-y 级、对焦旋钮、快门和滤镜立方体的倒置荧光显微镜。
- 配置软件，以 10 倍的放大倍率获取两个通道上的图像，在一轮自动对焦后自动拼接图像。请注意，像完美对焦这样的自动校正系统并不能保证令人满意的图像质量。更建议根据芯片上的自动对焦或手动对焦生成自定义对焦表面，以便进行长期图像采集。
- 每小时拍摄一次图像，让实验以数周的时间尺度运行。每天监控图像质量，必要时更新对焦表面。
- 准备PDMS芯片和气体渗透培养皿，以便后续免疫荧光分析，如前13所述。
5. 图像处理和分析
- 实验后处理
- 利用斐济/ImageJ 将图像转换为 TIFF 格式，用于图像处理和测量。
- 压缩 TIFF 文件，以便进一步处理图像。
- 斐济/图像J分析
- 要识别细胞，请执行背景减法和粒子分析，以识别用于细胞位置检测和自动细胞计数的荧光亮点。
- 利用插件（手动跟踪、化学跟踪、迁移工具、跟踪伙伴）来分析细胞运动和迁移。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
芯片上最佳细胞生长的验证
实验平台的主要目标是在复杂的肿瘤微环境中全面再现关键成分和相互作用，但简单到足以提供定量、可靠和可重复的数据。只有完全控制物理和生化环境因素，才能实现这一目标。我们必须排除不需要的因素，或者找出一种方法，将无法控制的因素纳入定量模型，以正确解释人口行为。
第一个测试是确保设备上的最佳细胞生长。设备上的细胞增殖率需要与传统细胞培养中的生长特征相同或相当。作为原理证明，人类前列腺癌细胞系PC3细胞在PDMS芯片中培养，没有外部压力。这些细胞在细胞质中带有荧光标记，因此我们可以使用倒置荧光显微镜观察和量化细胞群。细胞汇合，定义为细胞覆盖的区域，在不同时间帧的每个微生境测量，在荧光图像上给出一个选定的强度阈值，使用Fiji15。图4绘制了每个选定位置的细胞生长曲线。所选位置分散在芯片上，从媒体流入顶点附近的区域到接近媒体媒体的顶点。
图 4 B中的生长曲线完全对齐，表明细胞增殖曲线作为整个芯片位置的函数具有相同的相似性。曲线的初始斜率显示增殖率。设备中细胞的倍增时间约为 24 小时，如图4B所示，时间 0 到 24 小时，这与传统文化软件13中的倍增时间相同。因此，我们得出结论，如果没有外部应力源的存在，物理和生化因子是均匀分布的，导致从时间50到100小时均匀和优化的细胞生长。
我们进一步考虑了在微环境中对亚群之间的细胞动力学进行量化的能力。GFP表达PC3-EMT和mCherry表达PC3-EPI细胞系在EA中共同培养，如图5所示。细胞汇合，定义为细胞覆盖面积的百分比，作为种群大小的指示进行测量。从40%的汇合开始，共同文化在3天内完全融合。有趣的是，我们可以观察微环境中每种表型的进展。虽然总汇合的增长曲线以物流增长模型的形式出现，但PC3-EMT的人口继续增加，PC3-EPI在无症状阶段被抑制。
混合人群中细胞活力测定的示范
细胞运动是一种重要的型板行为。种群的动量分布可以提供有关细胞的物理相互作用、局部微环境的机械特性的信息，有时还可以分析为细胞表观遗传变异的指示。鉴于我们改进的细胞培养平台允许近乎连续的成像，具有精细的时间分辨率的优势最大化了异构种群中单细胞跟踪的潜力。
我们使用插件TrackMate16在斐济（http://fiji.sc）与自定义宏来实现和自动化跟踪过程。TrackMate 允许用户使用斐济脚本编辑器中的脚本语言实现和自定义跟踪算法。跟踪过程分为一系列步骤：分段、筛选和粒子链接过程。
如图6B所示，我们进行了"伤口愈合测定"，作为研究细胞集体迁移和细胞-细胞相互作用的示范。PC3-EPI 和 PC3-EMT 细胞密集地播种在设备中心，并允许自由迁移到空区域。图6C绘制了两种表型速度的规范化直方图。PC3-EMT 的速度明显高于 PC3-EPI 的 1.8 倍，这与中位表型作为皮肤伤口愈合的组成部分这一事实一致，具有卓越的迁移能力，而不是相对的固定上皮表型。
此外，为了观察细胞运动在无压力环境中的进展，我们进行了PC3-EPI和PC3-EMT的长期共培养，初始播种密度均匀，并跟踪细胞速度随时间变化的变化。如图7A，B所示，在培养6天后，当细胞达到更高的汇合时，两种表型的细胞速度分布都向左尾倾斜。
我们可以比较每个类间隔中 PC3-EPI 与 PC3-EMT 的比率。如图7C所示，无论细胞的培养或密度如何，PC3-EMT在高速区域占据主导地位，而PC3-EPI则占据低速区域。虽然两种表型的总体速度显著下降，但PC3-EMT仍然具有移动性，并且受微环境拥挤的影响较小，如图7D所示。PC3-EPI的平均速度下降了40%左右，而PC3-EMT的平均速度仅下降了14%。
有几个因素会影响细胞速度和平均速度的分布，例如人群的拥挤。对所有亚群的连续细胞跟踪和监测对于了解型型行为的进展至关重要。例如，如果我们想要量化未标记子群的等位状态水平，那么不仅获取相关子群的物理数量（例如速度）的分布，作为时间，也是所有共存的细胞亚群的其余。
图1：注射器泵驱动的微流体EA芯片。（A） 微流体装置有两个独立的介质入口、两个出口和一个用于细胞播种或提取过量介质的中心端口。请注意，在介质入口和细胞培养阵列之间，一对蛇形通道，允许介质与透气膜下方通过的大气平衡。（B） 梯度的生成.注射器分别用 ± 0.1 mM 的荧光和无荧光成因将介质泵入芯片，通过右侧的 2 个介质入口，从左侧 2 个介质出口处从芯片中提取。荧光蛋白的浓度与荧光信号的强度成正比，并在介质入口/出口a附近和中心附近进行剖面分析b.图经Lin等人许可再转载201712。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：定制3孔样品板的部件。（a） 3孔板的主体;（b） 一对气体通道，使调节气氛能泵入气体，并通过气道入口的隔膜排出;（c） 设计用来密封井盘和透气培养皿之间的空间的O型环;（d） 直径为 35 mm 的透气培养盘;（e） 碟座;（f） PDMS 装置;（g） PDMS 芯片座;（h） 双层35毫米玻璃窗，旨在保持热隔离和防止水凝结;（i） 玻璃窗架;（j） 加热垫;（k） 温度传感器;（l） 防止芯片干燥的粘合密封器.图转载经林等人许可 201712.请点击此处查看此图的较大版本。
图3：实验设置的原理图。实验设置包括供气系统、气道连接、介质供应连接和成像系统。图转载经林等人许可 201712.请点击此处查看此图的较大版本。
图4：无压力的EA中PC3的生长曲线。PC3 在 EA 中培养，没有外部压力。（A） 带有位置标签的 EA 模式.（B） 在细胞汇合方面，PC3在所选位置的生长曲线。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：EA中PC3-EPI和PC3-EMT的共同培养，无压力。PC3-EPI（红色）和PC3-EMT（绿色）在EA中共同培养，没有外部压力。（A） 在 t = 0 h . （B） 在 t = 95 h （C） 增长曲线处以细胞汇合处拍摄的两个荧光通道的叠加。在整个芯片上测量了每种细胞类型的细胞汇合。每个数据点表示以 15 分钟间隔连续 3 个时间点的平均单元汇合。误差条表示连续 3 个时间点处的细胞汇合的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：混合种群中的细胞运动测定。在混合总体中单细胞跟踪性能的演示。（A） 高斯（LoG）分段的拉普拉西亚如何检测细胞的演示.圆圈指示 LoG 算法检测到的单元格的位置。根据线性分配问题，检测到的细胞从一帧链接到另一帧，以量化细胞运动性。（B） PC3-EPI和PC3-EMT共培养实验的"伤口愈合测定"。细胞在局部播种，高达100%汇合，中心有清晰的边界。安装EA芯片后，观察到细胞通过白色箭头指示的微生境阵列迁移。（C） 细胞运动性直方图的标准化。PC3-EMT 比 PC3-EPI 快 1.8 倍。误差条表示 5 个实验样本的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：PC3-EPI和PC3-EMT长期共同培养的动能测定。PC3-EPI 和 PC3-EMT 的长期共同培养，初始播种密度均匀。细胞速度的分布随时间而变化。（A） 第2天细胞速度的标准化分布。（B） 第6天细胞速度的规范化分布。（C） 每个类间隔中 PC3-EPI 与 PC3-EMT 数量的比率。（D） PC3-EPI 和 PC3-EMT 作为时间函数的平均速度。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
传统细胞培养技术是近一个世纪前发展起来的，尽管事实证明，它预测癌症临床结果的能力有限，但它仍然是生物医学研究中最常用的临床前模型。动物模型具有最高的生理相关性和合理的基因相似性，但长期以来，人们一直承认在预测人类结果方面存在重大局限性。在现有的所有临床前模型中，微流体癌片模型似乎是最有前途的候选者，以满足癌症研究未满足的需求9，19，20。然而，目前的片上癌症模型尚未提供一个平台，能够再现关键组件和相互作用，以全面的方式模拟肿瘤微环境，但足够简单，可以提供可靠和可重复的定量数据。我们的代表性数据表明，我们的微流体细胞培养技术为异质微环境中的长期细胞培养提供了稳定的物理和生化条件。该多功能平台允许对时间相关的化学梯度和环境气体成分进行精密调整。该平台是便携式和兼容的大多数荧光倒置显微镜的高分辨率实时成像，它提供了多维信息的细胞作为时间的函数，包括细胞形态，种群动力学，细胞在单细胞水平上运动和细胞迁移。
与之前的工作11相比，我们注意到，这种用于微流体装置的压力密封封装和组装方法支持许多下游实验能力（例如，FACS、局部代谢物提取、亚克隆种群）扩张、IF、DNA/RNA FISH 等）补充实验过程中拍摄的延时图像。与早期的设备相比，这种从异质培养中特定位置取出细胞的能力是一大进步，因为早期的设备在访问培养基之前必须去除芯片的密封表面。此外，即使在这种情况下，去除盖子的行为也严重干扰了培养物，因此不可能在单一到几个生境水平上对细胞进行局部测试。由于柔性透气膜具有柔软的"可再密封"特性，因此在我们的案例中，这种局部萃取是可能的。
在所呈现的协议中有几个关键步骤。首先，要启动一个长期的流体动力学实验，需要尽可能避免微气泡。因此，在将培养基料加载到注射器中之前，对培养基培养基进行预热和脱气非常重要（步骤 3.4.2）。介质加载和点胶的操作应缓慢而轻柔地进行，以防止气泡形成。PDMS 模式在连接到培养介质供应系统之前，应使用氧等离子体（步骤 3.4.3）进行处理。氧气等离子体处理可确保 PDMS 表面的亲水性，并显著降低微气泡镶扎的可能性。在步骤 3.4.7.中，当将芯片放在细胞培养膜顶部时，PDMS 芯片应以 15 度倾斜角度接近液体表面，以去除培养皿内液体表面上的气泡（如果有）。其次，压力密封法需要一个稳定的气体供应系统，对细胞培养膜进行加压。压力应设置为 0.2 到 0.6 psi。低于 0.2 psi 的压力不足以进行芯片密封。在 1.2 psi 以上，大量的气体会渗透到膜中，并在微流体模式内产生气泡。我们注意到，如果金属 3 孔板的部件未正确组装（包括板体、透气培养皿支架、PDMS 芯片支架、玻璃窗支架、O 型环和一对 35 mm 玻璃窗），则表明气体泄漏为压力读数对气体流量的增加没有反应。只需进行泄漏测试，然后重新装配部件，即可解决泄漏问题。
利用 EA 技术获取的主要数据形式是通过成像。如前所述，EA 技术可以安装在任何倒置显微镜上。但是，为了充分利用系统的优势，强烈建议将系统安装在配备完全电动 x-y 级、电动对焦旋钮、电动快门和电动滤镜立方体的倒置荧光显微镜上。此外，请注意，完美对焦可能无法保证令人满意的图像质量。我们建议使用允许多维图像采集和自定义成像脚本的成像软件。如果没有定期（每 24 小时或 48 小时）自动对焦命令（在图像采集周期中生成自定义对焦表面），保持图像对焦可能具有挑战性。
已实施微流体EA技术，以研究化疗应激环境12下前列腺癌细胞细胞转移种群的适应和进化动态。我们还证明了这种肿瘤状异质微生态学中具有抗药性的多倍体巨癌细胞的出现，表明环境异质性与肿瘤种群中的细胞迁移相结合会导致扩增在耐药表型13的出现。凭借在控制良好的应力梯度下控制和监控混合肿瘤细胞群的行为的能力，我们的微流体EA技术也可以作为研究调节机制和涉及的型型转化的平台。EMT在癌症治疗策略的背景下21。最后但并非最不重要的一点，提出的压力密封封装方法也可以在其他需要环境气体成分和下游实验能力的复杂调整的微流体系统中实现。例如，相同的包装方法被采用结合不同的微流体模式来研究细菌群波如何通过物理屏障传播22。
总之，集体群体动力学在质量上不同于单细胞行为。微流体EA技术允许作为时间的函数单独和集体地对进化动力学和型型行为进行定量研究。这项技术可能为癌症研究提供一个更具有生理相关性的体外模型，并有可能用于临床前药物的开发和筛选。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
未声明任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了NSF PHY-1659940的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al.
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C.
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
