Summary
Vi presenterer en mikrovæskebasert kreft-on-chip-modellen, "Evolution Accelerator"-teknologi, som gir en kontrollerbar plattform for langsiktig sanntids kvantitative studier av kreft dynamikk innenfor veldefinerte miljøforhold på én celle Nivå. Denne teknologien forventes å fungere som en in vitro-modell for fundamental forskning eller før-klinisk narkotika utvikling.
Abstract
Konvensjonell cellekultur er fortsatt den mest brukte prekliniske modellen, til tross for sin påvist begrenset evne til å forutsi kliniske resultater i kreft. Mikrovæskebasert Cancer-on-chip modeller har blitt foreslått å bygge bro mellom unyansert konvensjonelle 2D kulturer og mer kompliserte dyremodeller, som har begrenset evne til å produsere pålitelige og reproduserbar kvantitative resultater. Her presenterer vi en mikrovæskebasert kreft-on-chip modell som gjengir viktige komponenter i en kompleks svulst mikromiljøet på en helhetlig måte, men er enkel nok til å gi robuste kvantitative beskrivelser av kreft dynamikk. Dette mikrovæskebasert kreft-on-chip-modellen, den "Evolution Accelerator," bryter ned en stor befolkning av kreftceller i en sammenhengende rekke tumor microenvironments mens generere en heterogen kjemoterapeutiske stress landskap. Progresjon og evolusjonære dynamikken i kreft som svar på narkotika gradering kan overvåkes i uker i sanntid, og mange nedstrøms eksperimenter kan utføres komplementære til tidsforløpbilder tatt gjennom løpet av eksperimentene.
Introduction
Kreft har blitt stadig mer anerkjent som et komplekst økosystem som avhenger ikke bare av den fortsatte feilregulering av mutert celle populasjoner, men også på vitale interaksjoner mellom kreftceller og verten mikromiljøet. I denne forstand utvikler kreft på en adaptiv landskapet manifestert ved en kombinasjon av faktorer, inkludert en heterogen tumor mikromiljøet og crosstalk med en rekke verts celler, som alle bidrar selektiv press for videre genetisk eller epigenetic endringer1,2,3. I sammenheng med solide svulster, bidrar ujevn fordeling av chemotherapeutics og andre ressurs graderinger til deres molekylære heterogenitet og kan spille en rolle i utviklingen av resistens, økt angiogenese til bestemte tumor subpopulasjoner, og selv metastasering4,5,6. Konvensjonelle in vitro 2D cellekultur studier, samtidig som besitter stor skala, praktisk eksperimentell kapasitet, gir middel felt, uniform, og faste forhold, ofte mangler den nøyaktige romlige og timelige miljøkontroll nødvendig for å virkelig etterligne in vivo tumor dynamikk. Således, det er en nød for flere Distinguished ex vivo modeller å avbilde det svulst mikromiljøet tidligere å dyr modeller inne stoffet utviklingen rørledning i orden for en bedre prediksjon av kreften progresjon likeledes idet Svar å medikamenter innen dynamiske trykk Landskap. Materialer har blitt foreslått å bygge bro over gapet mellom 2D cellekultur studier og mer komplekse in vivo dyrestudier som kanskje ikke kunne støtte kontrollerbar kvantitative studier7,8,9.
En ideell in vitro-system for å karakterisere kreftcelle dynamikk bør ha muligheten til å generere en heterogen mikromiljøet å etterligne den adaptive cellulære svar som kan skje i en svulst, samt tillate observasjon av disse dynamikken på en oppløsning med én celle. I denne artikkelen beskriver vi en mikrovæskebasert cellekultur plattform, en PDMS-basert enhet kalt "Evolution Accelerator" (EA), som tillater parallell in vitro studier av kreftcelle dynamikk ved mobilnettet oppløsning med sanntids datainnhenting over løpet av uker, mens stabilt opprettholde graderinger av stress over kulturlandskapet. Utformingen av denne plattformen er basert på vår tidligere arbeid, der evolusjonære dynamikken i organismer i en metapopulation kan bli akselerert10,11. Nærmere bestemt i en gruppe av romlig adskilte populasjoner som samhandler på et eller annet nivå, når de utsettes for en heterogen stress landskap, den mest passende arter kan dominere i en lokalbefolkning raskere sammenlignet med at en stor ensartet befolkning. Den fordelaktige arten deretter migrere til nabo microhabitats på leting etter ressurser og plass, og til slutt dominerer hele befolkningen. Som vist i figur 1, er mønsteret av mikrovæskebasert EA chip sammensatt av (i) et par Serpentine kanaler som gir fersk Media sirkulasjon og konstruere faste grensen forhold for kjemisk diffusjon, og (II) den sekskantede celle kulturen regionen som består 109 sammenhengende sekskantede og 24 halv-sekskantede kamre i sentrum, likner en honeycomb struktur. Brikken er 100 μm i dybden. Mediekanaler og cellekultur regionen er forbundet med små åpninger (ca 15 μm bred), som hindrer direkte Media flyt og den resulterende skjær stress over cellen kulturområdet, men likevel tillate kjemikalier til diffuse gjennom små åpninger og utveksle næringsstoffer, metabolsk avfall, etc. Generering av kjemiske graderinger er demonstrert i figur 1B, der én mediekanal inneholder 0,1 mm fluorescein mens den andre kanalen er fri for fluorescein. Cellene er kultivert på en gass gjennomtrengelig membran, innkapslet av mikrostrukturen gjennom det positive bakre trykket på membranen mot brikken. Komponentene i enhets holde ren er illustrert i figur 2, og det eksperimentelle oppsettet er illustrert i Figur 3, der kulturen opprettholdes på en invertert mikroskop ved 37 ° c, med over 85% relativ fuktighet, og betinget under normoxia gass sammensetning.
Dette systemet gir detaljert observasjon av lokaliserte cellulære interaksjoner via brightfield og fluorescerende kanaler og gir mulighet for romlig nedstrøms analyser som immunofluorescence, Western Blot, eller masse massespektrometri. Vi har tidligere demonstrert som en proof-of-prinsippet av denne mikrovæskebasert kreft-på-chip-modellen på lang sikt co-kulturen av epitel og mesenchymal PC3 prostata kreftceller12 samt fremveksten av narkotika-motstand polyploid giganten kreftceller ved hjelp av epitel PC3 cellelinje13. Mens vi presenterer anvendelsen av denne plattformen for å forstå den spatiotemporal dynamikken i epitel PC3 og mesenchymal prostata kreftceller under en stress gradering av docetaksel, kan mikrovæskebasert systemet enkelt brukes til en kombinasjon av cellelinjer og ressurs (dvs. narkotika, næringsstoffer, oksygen) graderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikasjon av mikrovæskebasert apparat
- Generer ønsket mikrovæskebasert mønster ved hjelp av en programvare for oppsetts utforming (se supplerende materialer).
- Dikte opp photomask. Se tabell over materialer for flere detaljer.
- Ved hjelp av en laser forfatter, skriver mønsteret på en brus-kalk glassplate belagt med 100 NM på CR og 500 NM i photoresist AZ1518.
- Utvikle photoresist med utvikleren AZ300MIF for 60 s.
- Etse bort krom uten beskyttelse fra photoresist ved hjelp av CR-7 Chromium Etsemiddelet.
- Strip av resterende photoresist bruker en photoresist stripper ved 70 ° c for 45 min.
- Mønster photoresist. Se tabell over materialer for flere detaljer.
- Spin coat HMDS på silisium wafer på 4000 RPM for 40 s.
- Spin coat photoresist AZ4330 på silisium wafer på 4000 RPM for 40 s.
- Soft bake silisium wafer på 95 ° c for 60 s.
- Bruk masken aligner å eksponere UV til silisium wafer.
- Utvikle photoresist med utbygger AZ300MIF for 4 min.
- Utfør DRIE-etsing. Se tabell over materialer for flere detaljer.
- Tørk-etse wafer mønstret med photoresist ved hjelp av et Silicon Deep reaktiv ion etsing (DRIE) system for 100 μm dybde.
- Strip av photoresist med aceton og plasma etch med en plasma Etcher.
- Wafer oksidasjon og silanisering. Se tabell over materialer for flere detaljer.
- Utfør termisk oksidasjon på den etset silisium wafer i en ovn ved 1100 ° c i 1 time.
- Vent til silisium platen kjøles ned, og legg deretter wafer i en desikator med noen få dråper triklorpropan-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-silan (PFOTS) dryppet i en liten beholder i nærheten av wafer.
- Pump trykket på desikator til 0,5 ATM ved romtemperatur i 60 min. Den silisium wafer mold bør bli hydrofobe etter riktig silanisering, som kan testes ved å legge flere dråper vann på wafer.
- Myk litografi. Se tabell over materialer for flere detaljer.
- Bland pre-polymer og kryss-linker (fra polymethylsiloxane (PDMS) Kit) på en 10:1 av vekt forhold.
- Hell den blandede PDMS å lage en 10 mm film i høyden på silanized silisium wafer mold.
- Degas den resulterende PDMS-Silicon wafer system i en desikator for 30 min til 1 t.
- Ruge PDMS-Silicon wafer i en 70 ° c inkubator over natten for å kurere PDMS.
- Når PDMS er kurert, skrelle PDMS film av silisium wafer nøye.
- Ved hjelp av biopsi nåler, punch gjennom-hull ved innløpet portene basert på plasseringen av mønsteret på PDMS og ansette en sirkulær punch til å kutte chips 27 mm i diameter.
- PDMS lag binding.
- Heat kurere to stabler av 27 mm PDMS sylindere (uten mønster), som vil bli reservoaret laget og capping lag av enheten.
- Skjær ut to 7 mm sirkler rundt viker på reservoaret laget, og bruke en biopsi nål for å slå gjennom-hull ved innløpet portene på capping laget.
- Bond tre stabler av PDMS (mønstret stabel, reservoar lag, capping lag) med oksygen plasma behandling.
- Med biopsi nålen, punch gjennom-hull på utsalgssteder og sentrum porten på enheten.
2. klargjøring av medier og cellelinjer
- Forbered Media for dyrking PC3 cellelinjer, inkludert PC3-EMT og PC3-EPI: Bland RPMI 1640 medium med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 1x antibiotika-antimykotisk. Generer cellelinjer som beskrevet tidligere14.
Merk: PC3 cellelinjer opprettholdes i de ovennevnte mediene i fuktet inkubatorer ved 37 ° c med 5% CO2. Split celler og under kultur hver 3 dager, før de når 100% confluency. - Transfect cellelinjer med cytoplasmatiske-merket fluorescerende markører for bedre visualisering, som beskrevet tidligere12, slik at PC3-EMT uttrykker cytoplasmatiske GFP og PC3-Epi uttrykker cytoplasmatiske mCherry. Merk at teknologien er også kompatibel med alle fluorescerende-merket celler samt brightfield Imaging av umerkede celler.
3. eksperimentell oppsett
- Fabrikasjon av metallplate holder
- Dikte opp en plate holder som er tilstrekkelig til å holde samtidige gass gjennomtrengelig kultur retter for parallelle eksperimenter ved maskinering eller 3D-utskrift. 3D CAD-filen ("3-brønn plate. FCStd ") kan bli funnet på GitHub som en referanse (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
- Skru ut komponentene i holderen (figur 2) med en skrutrekker. Desinfisere komponentene via UV-eksponering i minst 1 time og la i et sterilt miljø.
Merk: holderen er utformet for å gi betydelige forhold for termisk likevekt og ideelle gass komposisjoner, med gass kanal innganger som gir mulighet for luftstrøm. Flere detaljer finnes i vårt forrige arbeid12. - Forbered opptil tre gass gjennomtrengelig kultur retter, hvorav cellekultur membranen er relativt fleksibel.
- Cellelinje seeding
- 24 timer før starten av eksperimentet, høste PC3-EPI og PC3-EMT celler ved trypsinization i 5 min. Legg prewarmed kultur Media, så sentrifuger på 150 x g for 3 min og kast supernatanten.
- Telle celler av hver PC3-EPI og PC3-EMT ved hjelp av en hemocytometer og isolere totalt 2,5 x 104 av hver celle type for hver gass-gjennomtrengelig kultur parabolen.
- Bland og resuspend de to celletyper i 2 mL kultur Media og frø cellene i hver av gass gjennomtrengelig kultur parabolen.
- La hele plate holderen i inkubator natten for celler å feste.
- Desinfisere PDMS-enhetene via UV-eksponering i minst 1 time og la være i et sterilt miljø.
- Sette opp termisk kontrollenhet og gass forsyningssystem
- Som vist i Figur 3, sette opp et gass forsyningssystem som består av både co2 og O2 kontroll enheter, en gass pumpe, en gass blande kammer, en luftfukter eller bubbler, og tre separate sett med gassventiler og Trykkmålere. Flere detaljer finnes i vårt forrige arbeid12.
- Sett opp CO2 og o2 kontroll enheter slik at de justerer blande hastigheten på gassen fra co2 og N2 tanker og O2 kilde. Alternativt, noe gass forsyningssystem som gir gass under normoxia tilstand ville fungere.
- Kontroller at gassen som er kombinert i blandekammeret og fuktet av en bubbler slik at den relative fuktigheten økes til 85% (som lest ut fra en relativ luftfuktighet Monitor) og at gassen fører til tre uavhengige gassventiler med Trykkmålere for å kontrollere og overvåke gass strømningshastigheten i plate holderen.
- Plasser hele plateholderen i en On-Stage inkubasjons termisk kontrollenhet med separate varme under enheter for lokket og bunnplaten, med alle enheter satt til 37 ° c. Se tabell over materialer for flere detaljer.
- Installasjon av mikrovæskebasert enhet. Se tabell over materialer for flere detaljer.
- Identifiser at de detaljerte komponentene i 3-brønn plate holderen er i orden, som i figur 2. Hver av de tre brønnene er identiske og uavhengige, med et par gass kanaler for hver brønn. Hver brønn besitter en gass gjennomtrengelig kultur parabol holder, en PDMS chip holder, en glass vindu holderen, og et par 35 mm glassvinduer. Disse komponentene kan monteres ved hjelp av de monterte skruene.
Merk: glassvinduene sørger for at det er et termisk isolert rom mellom den gass gjennomtrengelig kultur membranen og brønnen slik at det ikke oppstår kondens på grunn av temperaturforskjeller i grensesnittet. Vær oppmerksom på at de tre brønnene er uavhengige, og 3 eksperimenter kan gjøres separat. - Pre-Warm kultur medium ved 37 ° c og Degas i et vakuum kammer i 20 min.
- Behandle PDMS chips ved hjelp av en oksygen plasma system for 30 s for å opprettholde hydrofiliteten.
- Sett opp sprøyte systemet. Sett inn to sprøyter langsomt med vekst Media og andre to sprøyter med ønsket reagens av interesse (Media, Media med narkotika, etc.). Koble hver enkelt sprøyte til en 50 cm slange (0,020 "x 0.060" OD) med en 23 G doserings nål i en hul stål pinne. Sett en hul stål pinne inn i den andre enden av slangen.
- Prime slangen og sett stål pinnen inn i hver PDMS chip gjennom capping laget. Fyll opp reservoaret laget og fukt PDMS mønster lag mønster med Media. Reservoaret laget fungerer som en on-chip boble felle for å hindre luftbobler fra å komme inn i mikrovæskebasert mønster.
- Legg i en 1 mL sprøyte med kultur medier. Koble sprøyten til en 5 cm slange (0,020 "x 0.060" OD) med en 23 G doserings nål i en hul stål pinne. Sett en hul stål PIN inn i den andre enden av slangen og Prime slangen.
- Sett inn hul stål PIN inn i midten hullet av brikken, der overdreven Media kan trekkes ut fra chip senere under chip forsegling prosessen.
- Etter hvert som hver PDMS-enhet krever 4 10 mL sprøyter som er lastet på en sprøyte pumpe, må du laste 2 10 mL sprøyter per brikke i det fremre dekket. Legg de to andre sprøyter i uttaks dekket på sprøyte systemet.
- Plasser chip direkte på toppen av gass gjennomtrengelig kultur membraner (med celler allerede levd opp til membraner). For å unngå entrapping mikrobobler i mikrovæskebasert mønster, dispensere 1 mL prewarmed og degassed Media inn i 35 mm gass gjennomtrengelig kultur rett før montering, og deretter sørge for at brikken nærmer seg væskeoverflaten med en 15-graders vinkel.
- Klem den gass-gjennomtrengelig kultur parabolen og brønnen i gass gjennomtrengelig kultur parabol holderen for hver chip, med PDMS chip holder presser PDMS enheten nedover.
- Tape et ark med en sealer på toppen av PDMS enheten og klemme med PDMS chip holderen for å hindre at brikken tørker ut.
- Angi medie flyt hastighet rundt matrisen til 20 μL/h.
- Sett hele platen i den på scenen inkubator på den motoriserte fasen av et invertert mikroskop. Koble gass forsynings systemet til gass kanalene og pressurizing den gass gjennomtrengelig kultur membranen mot den installerte PDMS-brikken for å sikre tetting av enheten. Oppretthold måle trykk ved 0,2 PSI (1,4 x 104 pa).
- Trekk ut overflødige medier langsomt i brikken ved hjelp av sprøyten på 1 mL fra senterhullet. Observer brikken under mikroskopet mens utpakking av media og deretter stoppe utpakking når brikken er forseglet. Chip tetting bør være opplagt siden en del av cellene ville bli knust av mikro-strukturer.
- Koble temperatur føle enheten på den On-Stage inkubator til 3-brønn plate og satt til 37 ° c.
- Identifiser at de detaljerte komponentene i 3-brønn plate holderen er i orden, som i figur 2. Hver av de tre brønnene er identiske og uavhengige, med et par gass kanaler for hver brønn. Hver brønn besitter en gass gjennomtrengelig kultur parabol holder, en PDMS chip holder, en glass vindu holderen, og et par 35 mm glassvinduer. Disse komponentene kan monteres ved hjelp av de monterte skruene.
4. time-lapse-avbildning med én celle
- Konfigurer bildebehandlingsprogramvare ved å bruke et omvendt mikroskop til tidsforløp bilde anskaffelse. Legg merke til at et invertert fluorescerende mikroskop med fullt motoriserte x-y-trinn, fokus knott, lukker og filter kuber er nødvendig for et EA-eksperiment.
- Konfigurer programvare for å hente bilder på tvers av to kanaler med 10x forstørrelse for hver chip med automatisk bilde-søm etter en runde med autofokus. Vær oppmerksom på at automatiske korrigerings systemer som Perfect Focus ikke garanterer tilfredsstillende bildekvalitet. Det er mer anbefalt å generere en tilpasset fokus overflate for langsiktig bilde oppkjøpet basert på enten autofokus eller manuell fokus på tvers av brikken.
- Ta bilder hver time og la eksperimentet kjøre på tidsskalaen i uker. Overvåk bildekvaliteten på daglig basis, og Oppdater fokus flaten om nødvendig.
- Forbered PDMS-chip og gass gjennomtrengelig kultur rett for påfølgende immunofluorescent analyse, som beskrevet tidligere13.
5. bildebehandling og analyse
- Etter eksperimentell prosessering
- Konverter bilder til TIFF-format for bildebehandling og målinger ved hjelp av Fiji/ImageJ.
- Komprimer TIFF-filer for enklere bildebehandling.
- Fiji/ImageJ analyse
- For å identifisere celler, kan du utføre bakgrunns subtraksjon og partikkel analyse for å identifisere fluorescerende lyspunkter for påvisning av celleplassering og automatisk celle telling.
- Bruk plugins (manuell sporing, chemotaxis, Migration Tool, Trackmate) for å analysere celle motilitet og migrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering av optimal cellevekst på chip
Et hovedmål med eksperimentet plattformen er å reprodusere viktige komponenter og interaksjoner i en kompleks svulst mikromiljøet på en helhetlig måte, men likevel enkel nok til å gi kvantitative, pålitelige og reproduserbar data. Dette målet kan bare oppnås hvis vi har full kontroll over de fysiske og biokjemiske miljømessige faktorene. Vi må enten utelukke uønskede faktorer eller finne en måte å innlemme den ukontrollerte faktorer i den kvantitative modellen til riktig tolke befolkningen atferd.
Den første testen er å sikre optimal cellevekst på enheten. Cellen spredning rate på enheten må være identiske eller sammenlignes med deres vekst profil i konvensjonell cellekultur. Som et bevis på prinsippet, menneskelig prostata kreftcelle linje PC3 celler ble kultivert i PDMS chip uten tilstedeværelse av ytre stress. Disse cellene var fluorescensmerkete-merket i cytoplasma slik at vi kunne observere og kvantifisere bestanden av celler ved hjelp av invertert fluorescerende mikroskopi. Celler samløpet, definert som området som dekkes av celler, ble målt ved hver microhabitat på ulike tidsrammer gitt en valgt intensitet terskel på fluorescerende bilder ved hjelp av Fiji15. Veksten kurver av celler ved hver valgt posisjon er plottet i Figur 4. Den valgte stillingene er spredt over chip, fra regionen nær toppen av Media tilsig til Apex nær Media utsalgssteder.
Veksten kurver i Figur 4B er godt justert, noe som tyder på identicality av cellen spredning profil som en funksjon av posisjon over brikken. Den innledende skråningen av kurvene avslører spredning rate. Dobling tid for cellene i enheten er rundt 24 timer som vist i Figur 4B fra Time 0 til 24 timer, som er den samme som dobling tid i konvensjonelle cultureware13. Derfor konkluderer vi at uten tilstedeværelse av en ekstern kilde til stress, de fysiske og biokjemiske faktorer er jevnt fordelt, fører til homogen og optimalisert cellevekst fra tid 50 til 100 timer.
Vi vurderte videre muligheten til å kvantifisere celle dynamikk mellom subpopulasjoner i en mikromiljøet. GFP-uttrykker PC3-EMT og mCherry-uttrykker PC3-EPI cellelinjer var co-kultivert i EA som vist i figur 5. Celle samløpet, definert som prosentandelen av arealet som dekkes av cellene, måles som indikasjon på størrelsen på befolkningen. Starter fra 40% samløpet, vokste co-kulturen fullt confluent innen 3 dager. Interessant, kan vi observere progresjon av hver fenotype i mikromiljøet. Mens veksten kurve av total samløpet er i form av logistikk vekst modell, befolkningen i PC3-EMT fortsatte å ekspandere og PC3-EPI ble undertrykt i asymptotiske fasen.
Demonstrasjon av celle motilitet analysen i en blandet befolkning
Celle motilitet er en viktig fenotypiske oppførsel. Motilitet fordelingen av en befolkning kan gi informasjon om fysisk interaksjon av celler, de mekaniske egenskapene til lokale mikromiljøet, og kan noen ganger bli analysert som en indikasjon på epigenetic variasjon av celler. Gitt at vår forbedret cellekultur plattform gir nesten kontinuerlig bildebehandling, fordelen av å ha fine Temporal oppløsning maksimerer potensialet i enkelt celle sporing i en heterogen befolkning.
Vi bruker plugin TrackMate16 i Fiji (http://Fiji.SC) med tilpasset makro for å implementere og automatisere sporings prosessen. TrackMate tillater brukeren å implementere og tilpasse en sporing algoritme ved hjelp av et skriptspråk fra Fiji Script Editor. Sporings prosessen er inndelt i en rekke trinn: segmentering, filtrering og partikkel koblings prosesser.
Som vist i figur 6B, utførte vi en "sår helbredende analyse" som en demonstrasjon for å studere celle kollektiv migrasjon og celle-celle interaksjon. PC3-EPI og PC3-EMT celler var tett seeded i midten av enheten og fikk lov til å fritt migrere mot tomme regionen. Den normalisert histogrammet av hastigheten på begge fenotyper er plottet i figur 6C. Hastigheten på PC3-EMT var signifikant høyere enn PC3-EPI med en faktor på 1,8 x, noe som er forenlig med det faktum at mesenchymal fenotype fungerer som en del av hud såret healing med eksepsjonell evne til å migrere i motsetning til sammenlignbare stasjonære epitel fenotype.
Videre, for å observere progresjon av celle motilitet i et stress-fritt miljø, utførte vi en langsiktig co-kultur av PC3-EPI og PC3-EMT med uniform innledende seeding tetthet og spores fordelingen av cellehastighet varierende med tiden. Som vist i figur 7A, B, etter 6 dager med kultur, som celler nådde høyere samløpet, distribusjoner av cellehastighet for begge fenotyper lente seg mot venstre haler.
Vi kan sammenligne forholdet mellom antall PC3-EPI til PC3-EMT i hvert klasse intervall. Som vist i figur 7C, uavhengig av dager med kultur eller tetthet av celler, PC3-EMT dominerte høyhastighets regionen mens PC3-Epi okkuperte lav hastighet sone. Selv om den samlede hastigheten sank betraktelig for både fenotyper, forble PC3-EMT aktive og ble påvirket mindre av crowdedness av mikromiljøet som vist i figur 7D. Den gjennomsnittlige hastigheten på PC3-EPI falt rundt 40%, mens det av PC3-EMT bare falt 14%.
Det er flere faktorer som kan påvirke fordelingen av cellehastighet og gjennomsnittlig hastighet, for eksempel crowdedness av befolkningen. Kontinuerlig celle sporing og overvåking over alle pasientpopulasjonen er avgjørende for å forstå progresjonen av fenotypiske adferd. For eksempel, hvis vi ønsker å kvantifisere nivået av mesenchymal status av en umerkede pasientpopulasjonen, ville det være mer informativ å erverve ikke bare fordelingen av den fysiske mengden (f. eks, hastighet) av de interesserte pasientpopulasjonen som en funksjon av tid, men også at av alle resten av coexisting pasientpopulasjonen av celler.
Figur 1: sprøyte-pumpe-drevet MIKROVÆSKEBASERT EA chip. (A) mikrovæskebasert enheten har to separate medium innganger, to utsalgssteder, og en sentral port for celle seeding eller ekstraksjon av overdreven medium. Legg merke til at mellom de medium inntak og cellekultur arrays, et par Serpentine kanaler som tillater medium å likevekt med atmosfæren passert under gass gjennomtrengelig membran. (B) generering av gradient. De sprøyter pumpen mediet med ~ 0,1 mM fluorescein og ingen fluorescein henholdsvis inn i chip gjennom 2 medium viker på høyre, hentet ut fra chip på 2 middels utsalgssteder på venstre. Konsentrasjonen av fluorescein er proporsjonal med intensiteten av fluorescens signal, og er profilert nær middels viker/utsalgssteder og i nærheten av sentrum b. figur gjengitt med tillatelse fra Lin et al. 201712. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: komponentene i den tilpassede 3 godt Prøveplate. (a) hoveddelen av 3 brønn plate; (b) et par gass kanaler som tillater betinget atmosfære som skal pumpes inn og ventilert ut gjennom septa ved inngangen av gass kanaler; (c) en O-ring designet for å forsegle mellomrommet mellom brønn platen og den gass gjennomtrengelig kultur parabolen; (d) 35 mm diameter gass gjennomtrengelig kultur parabol; (e) parabolen holderen; (f) PDMS enheten; (g) PDMS chip holdere; (h) den doble lag 35 mm glassvinduer designet for å opprettholde termisk isolasjon og forhindre vann kondens; (i) glass vindu holderen; (j) Varmeputer; (k) temperatur sensor; (l) limet sealer som holder brikken fra å tørke ut. Figur gjengitt med tillatelse fra Lin et al. 201712. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: den skjematisk figur av eksperimentell oppsett. Oppsettet av eksperimentet, inkludert gass forsynings systemet, gass kanaler tilkobling, mediet forsyning tilkobling og Imaging system. Figur gjengitt med tillatelse fra Lin et al. 201712. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: vekst kurver av PC3 i EA uten stress. PC3 ble kultivert i EA uten tilstedeværelse av ytre stress. (A) mønster av EA med stillings etiketter. (B) vekst KURVER av PC3 ved de valgte posisjonene i form av celle samløpet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: co-kulturen i PC3-Epi og PC3-EMT i EA uten stress. PC3-EPI (rød) og PC3-EMT (grønn) var co-kultivert i EA uten tilstedeværelse av ytre stress. (A) overlapping av to fluorescerende kanaler ved t = 0 h. (B) fluorescerende bilde tatt på t = 95 h. (C) vekst kurver i form av celle samløpet. Celle samløpet av hver celle type ble målt på hele brikken. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet celle samløpet på 3 påfølgende tid poeng tatt med 15-min intervaller. Feilfeltene representerer standardavviket for celle samløpet ved de 3 påfølgende tids punktene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: celle motilitet analysen i en blandet befolkning. Demonstrasjonen av enkelt celle sporing ytelse i en blandet befolkning. (A) en demonstrasjon av hvordan celler oppdages ved Laplacian av Gaussian (LoG) segmentering. Sirklene angir plasseringen av celler som registreres av Logg-algoritmen. De oppdagede cellene er koblet fra ramme til ramme basert på det lineære oppgave problemet å kvantifisere celle motilitet. (B) "såret healing analysen" av PC3-Epi og PC3-EMT co-kultur eksperiment. Celler ble sådd lokalt opp til 100% samløpet med en klar grense i sentrum. Etter installasjon av EA chip, celler ble observert å migrere gjennom microhabitat array som indikert av de hvite pilene. (C) normalisert histogram av celle motilitet. PC3-EMT er raskere enn PC3-EPI med en faktor på 1,8 x. Feilfeltene representerer standardavviket for 5 eksperiment prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Den motilitet analysen av en langsiktig co-kultur PC3-Epi og PC3-EMT. En langsiktig co-kulturen i PC3-EPI og PC3-EMT med uniform første seeding tetthet. Fordelingen av cellehastighet varierer med tiden. (A) normalisert fordeling av cellehastighet på dag 2. (B) normalisert fordeling av cellehastighet på dag 6. (C) forholdet mellom antall PC3-Epi til PC3-EMT i hvert klasse intervall. (D) gjennomsnittlig hastighet på PC3-Epi og PC3-EMT som en funksjon av tid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konvensjonelle celle kulturen ble utviklet for nesten hundre år siden og er fortsatt den mest brukte prekliniske modellen i biomedisinsk forskning, til tross for sin påvist begrenset evne til å forutsi kliniske resultater i kreft17. Animal modeller tilbyr den høyeste fysiologiske relevans og rimelig genetisk likhet til mennesker, men har lenge vært anerkjent for å ha betydelige begrensninger i å forutsi menneskelige utfall18. Blant alle de eksisterende prekliniske modeller, mikrovæskebasert Cancer-on-chip modeller synes å være den mest lovende kandidat til å tilfredsstille unmet trenger i kreftforskning9,19,20. Imidlertid, aktuelle kreften-opp på-flis modeller ha ennå å tilbud en plattform det er kjøpedyktig avbilde nøkkelkomponentene og vekselsvirkningene å etterligne en svulst mikromiljøet inne en allsidig måte, ennå enkel nok å skaffe pålitelig og reproduserbar kvantitativ data. Våre representative data viser at vår mikrovæskebasert cellekultur teknologi gir stabile fysiske og biokjemiske forhold for lang tids cellekultur i heterogene microenvironments. Denne multifunksjonelle plattformen tillater sofistikert justering av en tidsavhengig kjemisk gradient samt ambient gass sammensetning. Plattformen er bærbar og kompatibel med de fleste av fluorescerende invertert mikroskop for høyoppløselig sanntids Imaging, som tilbyr flerdimensjonale informasjon av celler som en funksjon av tid, inkludert celle morfologi, befolkning dynamikk, celle motilitet og celle migrasjon på et enkelt cellenivå.
Sammenlignet med vår tidligere arbeid11, vi oppmerksom på at denne trykk-tetting emballasje og montering metode for vår mikrovæskebasert enhet muliggjør mange nedstrøms eksperiment kapasiteter (f. eks FACS, lokale metabolitten utvinning, sub-klonal bestander DNA/RNA-fisk osv.) komplementære til time-lapse bilder tatt i løpet av eksperimentene. Denne evnen til å fjerne celler fra bestemte steder i en heterogene kultur er et stort fremskritt sammenlignet med tidligere enheter, der tetningsflaten til en chip måtte fjernes før man kunne få tilgang til kulturen11. Videre, selv i så fall, lov å fjerne dekselet betydelig forstyrret kulturen slik at lokal testing av celler på en enkelt til få habitat nivåer var ikke mulig. Slike lokaliserte ekstraksjon var mulig i vårt tilfelle på grunn av den myke "resealable" natur av den fleksible gass gjennomtrengelig membran.
Det er flere kritiske trinn i den presenterte protokollen. Først av alt, for å initiere et langsiktig eksperiment med stabil fluidic dynamikk, mikrobobler må unngås så mye som mulig. Derfor er det viktig å prewarm og Degas kultur mediet (Step 3.4.2) før du legger mediet inn i sprøyter. Manipulering av Media lasting og dosering bør gjøres langsomt og forsiktig for å hindre boble dannelse. Den PDMS mønsteret bør behandles med oksygen plasma (trinn 3.4.3) før du kobler til kulturen Media Supply system. Oksygen plasma behandling sikrer hydrofiliteten av PDMS overflate og reduserer muligheten for microbubble entrapping. I trinn 3.4.7., når du plasserer brikken på toppen av cellen kultur membranen, bør PDMS chip nærme væsken overflaten med en 15-graders vippe vinkel for å kvitte seg med bobler (hvis noen) på den flytende overflaten inne i kultur parabolen. For det andre krever trykk-forsegling metoden et stabilt gass forsyningssystem som pressurizes cellekultur membranen. Trykket bør settes mellom 0,2 til 0,6 PSI. Trykk lavere enn 0,2 PSI er utilstrekkelig for chip tetting. Over 1,2 PSI vil en betydelig mengde gass trenge gjennom membranen og generere bobler innenfor mikrovæskebasert mønsteret. Vi registrerer at hvis komponentene i metall 3-brønn platen ikke er riktig montert (inkludert plate kroppen, den gass gjennomtrengelig kultur parabolen holder, en PDMS chip holder, en glass vindu holder, O-ringer, og et par 35 mm glassvinduer), ville man identifisere gasslekkasje som Trykk avlesningen vil bli irresponsive til økningen av gass strømmen. Lekkasjen problemet kan løses ganske enkelt ved å gjøre en lekkasjetest og deretter montering komponentene.
Den viktigste formen for data ervervet med bruk av EA-teknologien er gjennom Imaging. Som tidligere nevnt kan EA-teknologien installeres på et invertert mikroskop. Men for å utnytte fordelene av systemet, er det sterkt anbefalt å installere systemet på en invertert fluorescerende mikroskop utstyrt med fullt motorisert x-y scenen, motorisert fokus knott, motorisert lukker, og motorisert filter kube. Vær også oppmerksom på at Perfect Focus kanskje ikke garanterer tilfredsstillende bildekvalitet. Vi foreslår at du bruker et bildebehandlingsprogram som tillater multi-dimensjonal image oppkjøp og tilpasset Imaging script. Holde bildene godt fokusert kan være utfordrende uten periodisk (hver 24 timer eller 48 timer) autofokus kommando, som genererte en tilpasset fokus overflaten under bildet oppkjøpet syklus.
Den presenterte mikrovæskebasert EA-teknologi har blitt iverksatt for å studere tilpasningen og evolusjon dynamikk i prostata kreftcelle metapopulations under et kjemoterapeutiske stress landskap12. Vi har også vist fremveksten av narkotika-resistens polyploid gigantiske kreftceller i denne tumor-lignende heterogene mikro-økologi, viser at miljømessige heterogenitet kombinert med celle migrasjon innen tumor befolkning ville føre til forsterkning på fremveksten av resistente fenotyper13. Med muligheten til å kontrollere og overvåke atferden til blandede tumor celle populasjoner under godt kontrollerte stress graderinger, kan vår mikrovæskebasert EA-teknologi også fungere som en plattform for å studere regulatoriske mekanismer og fenotypiske transformasjon involvert i EMT i sammenheng med kreft terapeutiske strategier21. Sist men ikke minst, den presenterte trykk-tetting emballasje metoden kan også implementeres i andre mikrovæskebasert systemer som krever sofistikert justering av ambient gass sammensetning samt nedstrøms eksperimentet kapasiteter. For eksempel, den samme emballasjen metoden ble brukt til å innlemme ulike mikrovæskebasert mønster for å studere hvordan bakterielle befolknings bølger spres gjennom fysiske barrierer22.
Oppsummert er kollektive befolknings dynamikk kvalitativt forskjellig fra enkelt celle atferd. Det mikrovæskebasert EA teknologien innrømmer det kvantitativ studere av det evolusjonær dynamikk og fenotypiske opptreden hver for seg og kollektivt som funksjonen av tid. Denne teknologien kan presentere en mer fysiologisk relevant in vitro modell for kreftforskning, og potensielt for prekliniske narkotika utvikling og screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konflikter av interesse erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NSF PHY-1659940.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al.
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C.
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
