Summary
Tek hücreli de iyi tanımlanmış çevre koşulları içinde kanser dinamikleri uzun vadeli gerçek zamanlı kantitatif çalışmalar için kontrol edilebilir bir platform sağlayan bir mikroakışkan kanser-on-çip modeli, "Evrim Hızlandırıcı" teknolojisi saiyoruz Düzey. Bu teknolojinin temel araştırma veya klinik öncesi ilaç geliştirme için bir in vitro model olarak çalışması beklenmektedir.
Abstract
Konvansiyonel hücre kültürü en sık kullanılan preklinik model olmaya devam etmektedir, kanserklinik sonuçları tahmin etmek için kanıtlanmış sınırlı yeteneğine rağmen. Mikroakışkan kanser-on-chip modelleri, güvenilir ve tekrarlanabilir kantitatif sonuçlar üretmek için sınırlı yeteneği olan aşırı basitleştirilmiş konvansiyonel 2D kültürler ve daha karmaşık hayvan modelleri arasındaki boşluğu köprü önerilmiştir. Burada, karmaşık bir tümör mikroortamının temel bileşenlerini kapsamlı bir şekilde üreten, ancak kanser dinamiklerinin sağlam kantitatif açıklamalarını sağlayacak kadar basit olan mikroakışkan kanser-on-chip modelini salıyoruz. Bu mikroakışkan kanser-on-çip modeli, "Evrim Hızlandırıcı," heterojen kemoterapötik stres manzara oluştururken tümör mikroortamların birbirine bağlı bir dizi içine kanser hücrelerinin büyük bir nüfus ayırır. İlerleme ve ilaç gradyan yanıt olarak kanser evrimsel dinamikleri gerçek zamanlı olarak haftalarca izlenebilir, ve çok sayıda downstream deneyler deneyleri boyunca alınan zaman atlamalı görüntüleri tamamlayıcı yapılabilir.
Introduction
Kanser giderek mutasyona uğramış hücre popülasyonlarının sürekli disregülasyon değil, aynı zamanda kanser hücreleri ve konak mikroçevre arasındaki hayati etkileşimlere bağlıdır karmaşık bir ekosistem olarak kabul edilmiştir. Bu anlamda, kanser, heterojen bir tümör mikroçevre ve konak hücrelerin çeşitli ile crosstalk da dahil olmak üzere faktörlerin bir kombinasyonu ile tezahür adaptif bir manzara üzerinde gelişir, tüm bunlar daha fazla genetik veya daha fazla seçici baskılar katkıda epigenetik değişiklikler1,2,3. Solid tümörler bağlamında, kefireutics ve diğer kaynak gradyanlarının düzensiz dağılımı moleküler heterojenitelerine katkıda bulunur ve ilaç direncigelişiminde rol oynayabilir, belirli tümöre anjiyogenez artmış alt popülasyonlar ve hatta metastaz4,5,6. Konvansiyonel in vitro 2D hücre kültürü çalışmaları, büyük ölçekli, uygun deneysel kapasiteye sahip iken, ortalama alan sağlar, üniforma, ve sabit koşullar, genellikle gerçekten gerekli hassas mekansal ve zamansal çevresel kontrol yoksun in vivo tümör dinamikleri taklit. Bu nedenle, kanser insidansının daha iyi tahmin edilebilmesi ve dinamik stres içindeki ilaçlara verilen tepkilerin daha iyi tahmin edilebilmesi için, ilaç geliştirme boru hattındaki hayvan modellerinden önce tümör mikroçevresini yeniden üretmek için daha fazla temsili ex vivo modeline ihtiyaç vardır. Manzara. Mikroakışkanlar 2D hücre kültürü çalışmaları ve kontrol edilebilir kantitatif çalışmaları desteklemek mümkün olmayabilir vivo hayvan çalışmaları daha karmaşık arasındaki boşluğu köprü önerilmiştir7,8,9.
Kanser hücre dinamiklerini karakterize etmek için ideal bir in vitro sistem, bir tümörde meydana gelen adaptif hücresel yanıtları taklit etmek için heterojen bir mikroortam oluşturma yeteneğine sahip olmalıdır, hem de bu dinamiklerin gözlem için izin tek hücreli çözünürlük. Bu makalede, bir mikroakışkan hücre kültür platformu, bir PDMS tabanlı cihaz "Evrim Hızlandırıcı" (EA), hücresel çözünürlükte kanser hücre dinamikleri paralel in vitro çalışmalar için izin veren bir gerçek zamanlı veri toplama üzerinde hafta ders, stably kültür manzara genelinde stres degradeleri korurken. Bu platformun tasarımı, metapopülasyondaki organizmaların evrimsel dinamiklerinin10,11hızlandırılabildiği önceki çalışmamıza dayanmaktadır. Özellikle, bir düzeyde etkileşim mekansal olarak ayrılmış popülasyonlar bir grup, heterojen bir stres manzara maruz kaldığında, en uygun türler daha hızlı büyük bir tektip nüfus ile karşılaştırıldığında yerel bir popülasyonhakim olabilir. Avantajlı türler daha sonra kaynak ve uzay arayışı içinde komşu mikrohabitatlara göç eder ve sonunda tüm popülasyona hükmeder. Şekil 1'degösterildiği gibi, mikroakışkan EA yongasının deseni (i) taze ortam sirkülasyonu sağlayan ve kimyasal difüzyon için sabit sınır koşulları oluşturan bir çift serpantin kanaldan ve (ii) altıgen hücre kültür bölgesinden oluşur. merkezde 109 birbirine bağlı altıgen ve 24 yarı altıgen odaktan oluşan petek yapısına benzer. Çip 100 μm derinliğindedir. Medya kanalları ve hücre kültürü bölgesi, doğrudan medya akışını ve hücre kültürü alanında ortaya çıkan kesme stresini önleyen küçük kilerek (yaklaşık 15 μm genişliğinde) bağlanır, ancak yine de kimyasalların küçük kerektonlar aracılığıyla dağılmasına ve besin alışverişine izin verir, metabolik atık, vb. Kimyasal degradelerin üretimi Şekil 1B'degösterilmiştir, bir medya kanalı 0.1 mM floresan içerirken diğer kanalfloresan içermez. Hücreler, mikroyapılar tarafından çipe karşı membran üzerindeki pozitif geri basınç yoluyla kapsüllenen, geçirilebilir bir gaz membranı üzerinde kültürlenir. Cihaz tutucunun bileşenleri Şekil 2'degösterilmiştir ve deneysel kurulum Şekil 3'tegösterilmiştir , burada kültür 37 °C'de ters bir mikroskop üzerinde korunur, %85'in üzerinde bağıl nem ile ve normoksia gaz bileşimi.
Bu sistem, brightfield ve floresan kanallar aracılığıyla lokalize hücresel etkileşimlerin ayrıntılı gözlemini sağlar ve immünoffloresan, Batı lekeleri veya kütle spektrometresi gibi mekansal olarak çözülmüş downstream tahlillerine olanak sağlar. Daha önce epitel ve mezenkimal PC3 prostat kanseri hücrelerinin uzun vadeli ortak kültür bu mikroakışkan kanser-on-chip modelinin bir kanıtı olarak göstermiştir12 yanı sıra ilaca dirençli poliploid dev ortaya çıkması epitel PC3 hücre hattı13kullanarak kanser hücreleri . Biz docetaxel bir stres gradyanı altında epitelyal PC3 ve mezenkimal prostat kanseri hücrelerinin spatiotemporal dinamikleri anlamak için bu platformun uygulama sunarken, mikroakışkan sistem kolayca hücre hatlarının herhangi bir kombinasyonu uygulanabilir ve kaynak (yani, ilaç, besin, oksijen) degradeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroakışkan cihazın imalatı
- Bir düzen tasarım yazılımı kullanarak istenilen mikroakışkan deseni oluşturun (Bkz. Ek Malzemeler).
- Fotomaskeyi üret. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.
- Bir lazer yazar kullanarak, cr 100 nm ve photoresist AZ1518 500 nm ile kaplı bir soda-kireç cam plaka üzerinde desen yazın.
- 60 s için geliştirici AZ300MIF ile photoresist geliştirin.
- Cr-7 Krom Etchant kullanarak fotodirençten korunmadan kromu uzaklaştırın.
- 70 °C'de 45 dakika boyunca fotodirenç lisi kullanarak artık fotodirençten sıyırın.
- Foto-dayandak desen. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.
- 40 s için 4000 rpm silikon gofret üzerinde Spin ceket HMDS.
- 40 s için 4000 rpm silikon gofret üzerinde Spin ceket photoresist AZ4330.
- Yumuşak fırında silikon gofret 95 °C 60 s.
- UV'yi silikon gofrete maruz bırakmak için maske hizalayıcısını kullan.
- 4 dakika boyunca geliştirici AZ300MIF ile photoresist geliştirin.
- DRIE gravür gerçekleştirin. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.
- 100 μm derinlikte Silikon Derin Reaktif Iyon Gravür (DRIE) sistemi kullanarak fotodirenç ile desenli gofret kuru-etch.
- Bir plazma etcher ile aseton ve plazma etch ile photoresist kapalı şerit.
- Gofret oksidasyonu ve silanizasyon. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.
- 1100 °C'de fırında kazınan silikon gofret üzerinde 1 saat termal oksidasyon gerçekleştirin.
- Silikon gofret soğumasını bekleyin ve sonra trichloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) birkaç damla gofret yakın küçük bir kapta damlamış bir desiccator içine gofret yerleştirin.
- 60 dakika oda sıcaklığında 0,5 atm için kurutucu basıncı pompalayın. Silikon gofret kalıp uygun silanizasyon dan sonra hidrofobik haline gelmelidir, hangi gofret üzerine su birkaç damlacıkları ekleyerek test edilebilir.
- Yumuşak litografi. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.
- Ağırlık oranına göre 10:1'de ön polimer ve çapraz bağlayıcıyı (polimetilsiloksane (PDMS) kitinden) karıştırın.
- Silanized silikon gofret kalıp üzerine yüksekliği 10 mm film oluşturmak için karışık PDMS dökün.
- Degas 30 dakika için bir kurutucu ortaya çıkan PDMS-silikon gofret sistemi 1 saat.
- PDMS'yi tedavi etmek için bir gecede 70 °C'lik bir kuluçka makinesinde PDMS-silikon gofret inkübün.
- PDMS iyileştikten sonra, SILIKON gofretinip pdfms filmini dikkatlice soyun.
- Biyopsi iğneleri kullanarak, PDMS'deki desenin konumuna göre giriş portlarında delik açmak ve 27 mm çapındaki talaşları kesmek için dairesel bir zımba kullanır.
- PDMS katman yapıştırma.
- Isı 27 mm PDMS silindir (desenolmadan) iki yığın kür, hangi rezervuar tabakası ve cihazın kapama tabakası olacak.
- Rezervuar tabakasındaki girişlerin etrafında 7 mm'lik iki daire kesin ve kapama katmanındaki giriş bağlantı noktalarında delikler açmak için biyopsi iğnesi kullan.
- Üç pdms destesini (desenli yığın, rezervuar tabakası, kapama tabakası) oksijen plazma sıyrıkile bağlayın.
- Biyopsi iğnesi ile, çıkışları ve cihazın merkezi bağlantı noktasında delik leri delin.
2. Medya ve hücre hattı hazırlama
- PC3-EMT ve PC3-EPI dahil olmak üzere PC3 hücre hatları, kültür ortamı için ortam hazırlayın: mix RPMI 1640 orta ile 10% fetal sığır serum (FBS) ve 1x antibiyotik-antimikotik. Daha önce açıklandığı gibi hücre hatları oluşturun14.
NOT: PC3 hücre hatları 37 °C'de nemlendirilmiş kuvözlerde %5 CO2ile yukarıdaki ortamda muhafaza edilmektedir. Hücreleri ve alt kültürü her 3 günde bir % 100 biraraya gelmeden önce ayırın. - Daha iyi görüntüleme için sitoplazmik etiketli floresan belirteçleri ile Transfect hücre hatları, daha önce açıklandığı gibi12, PC3-EMT sitoplazmik GFP ifade eder ve PC3-EPI sitoplazmik mCherry ifade eder. Teknolojinin floresan etiketli hücrelerin yanı sıra etiketlenmemiş hücrelerin parlak alan görüntülemesiyle de uyumlu olduğunu unutmayın.
3. Deneysel kurulum
- Metal plaka tutucu imalatı
- İşleme veya 3D baskı ile paralel deneyler için eşzamanlı gaz geçirilebilir kültür yemeklerini tutmak için yeterli olan bir plaka tutucu üretin. 3D CAD dosyası ("3-iyi plaka. FCStd") GitHub'da referans olarak bulunabilir (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
- Tutucunun(Şekil 2)bileşenlerini bir tornavida ile sökün. Bileşenleri UV ışınlarına maruz kalım yoluyla en az 1 saat dezenfekte edin ve steril bir ortamda bırakın.
NOT: Tutucu, hava akımına izin veren gaz kanalı girişleri ile termal denge ve ideal gaz bileşimleri için önemli koşullar sağlamak üzere tasarlanmıştır. Daha fazla bilgi bizim önceki çalışma12bulunabilir. - Hücre kültürü zarının nispeten esnek olduğu en fazla üç gaz geçirilebilir kültür yemeği hazırlayın.
- Hücre hattı tohumlama
- Denemenin başlamasından 24 saat önce, 5 dakika için trypsinization tarafından PC3-EPI ve PC3-EMT hücreleri hasat. Önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin, sonra santrifüj 150 x g 3 dakika için ve supernatant atın.
- Her PC3-EPI ve PC3-EMT'nin hücrelerini hemositometre kullanarak sayın ve her gaz geçirgen kültür yemeği için her hücre tipinden toplam 2,5 x 104'ü izole edin.
- Kültür medyasının 2 mL'lik iki hücre türünü karıştırın ve yeniden askıya alın ve hücreleri gaz geçirgen kültür çanağının her birine yerleştirin.
- Hücrelerin bağlanması için tüm plaka tutucuyu bir gecede kuvözde bırakın.
- PDMS cihazlarını UV ışınları ile en az 1 saat dezenfekte edin ve steril bir ortamda bırakın.
- Termal kontrol ünitesi ve gaz besleme sisteminin kurulması
- Şekil 3'tegösterildiği gibi, hem CO2 hem de O2 kontrol üniteleri, gaz pompası, gaz karıştırma odası, nemlendirici veya kabarcık ve üç ayrı gaz vanası ve basınç ölçer setinden oluşan bir gaz besleme sistemi kurmak. Daha fazla bilgi bizim önceki çalışma12bulunabilir.
- CO2 ve O2 kontrol ünitelerini, CO 2 ve N2 tanklarından ve O2 kaynağından gelen gazın karıştırma hızını ayarlayabilen şekilde ayarlayın. Alternatif olarak, normoksia koşulu altında gaz sağlayan herhangi bir gaz besleme sistemi çalışacaktır.
- Karıştırma odasında birleştirilen ve bir kabarcık tarafından nemlendirilen gazın bağıl nem oranının %85'e kadar arttırIldiğinden (bağıl nem monitöründen okunduğu gibi) ve gazın basınç göstergelerine sahip üç bağımsız gaz vanasına yol açtığından emin olun plaka tutucuda gaz akış hızını kontrol edin ve izleyin.
- Tüm plaka tutucuyu, kapak ve alt plaka için ayrı ısıtma alt üniteleri ile 37 °C olarak ayarlanmış bir kademeli kuluçka termal kontrol ünitesine yerleştirin. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.
- Mikroakışkan cihazın kurulumu. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.
- Şekil 2'deolduğu gibi, 3 kuyulu plaka tutucunun ayrıntılı bileşenlerinin sırayla olduğunu belirleyin. Her üç kuyu nun her biri aynı ve bağımsızdır ve her kuyu için bir çift gaz kanalı vardır. Her kuyuda gaz geçirilebilir kültür çanak tutucusu, BIR PDMS yonga tutucu, cam pencere tutucu ve 35 mm cam pencere bulunmaktadır. Bu bileşenler, monte edilmiş vidalar kullanılarak monte edilebilir.
NOT: Cam pencereler, gaz geçirgen kültür membranı ile kuyu arasında ısıyalıtımlı bir boşluk olmasını sağlar, bu sayede arayüzdeki sıcaklık farklılıkları nedeniyle su yoğuşması oluşmaz. 3 kuyunun bağımsız olduğunu ve 3 denemenin ayrı olarak yapılabileceğini unutmayın. - 37 °C'de sıcak öncesi kültür ortamı ve 20 dk.lık bir vakum odasında gaz gaz.
- Hidrofililiği korumak için PDMS yongalarını 30 s'lik oksijen plazma sistemi kullanarak tedavi edin.
- Şırınga sistemini kur. Büyüme ortamı ve diğer iki şırınga ile birlikte iki şırıngayı istenilen reaktifle (medya, ilaçlı medya, vb.) yavaşça yükleyin. Her bir şırıngayı 50 cm'lik bir boruya (0,020" x 0,060"OD) 23 G dağıtım iğnesi ile tek bir içi boş çelik iğneye bağlayın. Tüpün diğer ucuna içi boş bir çelik pim takın.
- Boruyu asallayın ve çelik pimi kapama katmanı üzerinden her PDMS yongasına takın. Rezervuar katmanını doldurun ve PDMS desen katmanı deseni ortamla ıslayın. Rezervuar tabakası mikroakışkan desen içine girmesini hava kabarcıkları önlemek için bir çip kabarcık tuzak olarak çalışır.
- Kültür ortamı ile 1 mL şırınga yükleyin. Şırıngayı 5 cm'lik bir boruya (0,020" x 0,060"OD) 23 G dağıtım iğnesi ile içi boş bir çelik iğneye bağlayın. Tüpün diğer ucuna içi boş bir çelik pim takın ve boruyu asal.
- Çipin orta deliğine içi boş çelik pimi yerleştirin, talaş sızdırmazlık işlemi sırasında talaştan daha sonra aşırı ortam çıkarılabilir.
- Her PDMS cihazı bir şırınga pompasına yüklenen dört adet 10 mL şırınga gerektirdiğinden, ön güvertedeki talaş başına iki adet 10 mL şırınga yükleyin. Diğer iki şırıngayı şırınga sisteminin geri çekilme güvertesine yerleştirin.
- Çipi doğrudan gaz geçirilebilir kültür zarlarının üzerine yerleştirin (zaten zarlara yapışmış hücrelerle). Mikrokabarcıkları mikroakışkan desene sokmamak için, 1 mL önceden ısıtılmış ve gazsız ortamı montajdan önce 35 mm gaz geçirgen kültür kabına dağıtın ve ardından çipin sıvı yüzeye 15 derecelik eğim açısıyla yaklaştırdığından emin olun.
- PdMS yonga tutucusu PDMS cihazını aşağı doğru iterek, her bir çip için gaz geçirilebilir kültür çanağı ve kuyuyu sıkın.
- PDMS cihazının üstüne bir fırıncı kağıdı bantlayın ve çipin kurumasını önlemek için PDMS yonga tutucusuyla kenetleyin.
- Dizi nin etrafındaki ortam akış hızını 20 μL/h olarak ayarlayın.
- Tüm plakayı sahnedeki inkübatörde ters bir mikroskobun motorlu aşamasında ayarlayın. Gaz besleme sistemini gaz kanallarına bağlayın ve cihazın sızdırmazkalmasını sağlamak için gaz geçirilebilir kültür membranını kurulu PDMS çipe karşı basınçlandırın. Gösterge basıncını 0,2 psi (1,4 x 104 Pa) koruyun.
- Orta deki delikten 1-mL şırıngayı kullanarak çipteki aşırı ortamı yavaşça ayıklayın. Ortamı ayıklarken mikroskop altında çipi gözlemleyin ve talaş mühürlendiğinde çıkarmayı bırakın. Hücrelerin bir kısmı mikro yapılar tarafından ezileceği için talaş sızdırmazlığı belirgin olmalıdır.
- Sahnedeki inkübatörün sıcaklık algılama ünitesini 3 kuyulu plakaya bağlayın ve 37 °C'ye ayarlayın.
- Şekil 2'deolduğu gibi, 3 kuyulu plaka tutucunun ayrıntılı bileşenlerinin sırayla olduğunu belirleyin. Her üç kuyu nun her biri aynı ve bağımsızdır ve her kuyu için bir çift gaz kanalı vardır. Her kuyuda gaz geçirilebilir kültür çanak tutucusu, BIR PDMS yonga tutucu, cam pencere tutucu ve 35 mm cam pencere bulunmaktadır. Bu bileşenler, monte edilmiş vidalar kullanılarak monte edilebilir.
4. Tek hücreli zaman atlamalı görüntüleme
- Ters görüntü elde etmek için ters bir mikroskop kullanarak görüntüleme yazılımı ayarlayın. Bir EA deneyi için tam motorlu x-y aşaması, odak düğmesini, deklanşörünü ve filtre küplerini içeren ters floresan mikroskobun gerekli olduğunu unutmayın.
- Bir tur otomatik netlemeden sonra otomatik görüntü dikişi ile her bir yonga için 10kat büyütme de iki kanal boyunca görüntü elde etmek için yazılım yapılandırın. Perfect Focus gibi otomatik düzeltme sistemlerinin tatmin edici görüntü kalitesini garanti etmediğini unutmayın. Daha fazla yonga genelinde otofokus veya manuel odaklama dayalı uzun vadeli görüntü edinimi için özelleştirilmiş bir odak yüzeyi oluşturmak için tavsiye edilir.
- Her saat fotoğraf çekmek ve deneme hafta zaman ölçeğinde çalışan bırakın. Görüntü kalitesini günlük olarak izleyin ve gerekirse odak yüzeyini güncelleyin.
- Daha önce açıklandığı gibi, sonraki immünofloresan analizi için PDMS çip ve gaz geçirilebilir kültür çanak hazırlayın13.
5. Görüntü işleme ve analizi
- Deneysel işlem sonrası
- Fiji/ImageJ kullanan görüntü işleme ve ölçümler için görüntüleri TIFF biçimine dönüştürün.
- Daha fazla görüntü işleme kolaylığı için TIFF dosyalarını sıkıştırın.
- Fiji/ImageJ analizi
- Hücreleri tanımlamak için, hücre konumu algılama ve otomatik hücre sayma için floresan parlak noktaları tanımlamak için Arka Plan Çıkarma ve Parçacık Analizi gerçekleştirin.
- Hücre hareketliliğini ve geçişini analiz etmek için eklentileri (Manuel İzleme, Kemotaksis, Geçiş Aracı, Trackmate) kullan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çipte optimum hücre büyümesinin doğrulanması
Deney platformunun temel amacı, karmaşık bir tümör mikroortamında ki temel bileşenleri ve etkileşimleri kapsamlı bir şekilde yeniden üretmektir, ancak nicel, güvenilir ve tekrarlanabilir veriler sağlayacak kadar basittir. Bu amaca ancak fiziksel ve biyokimyasal çevresel faktörlerin tam kontrolü ne olursa olsun ulaşılabiliyor. İstenmeyen faktörleri dışlamalı veya popülasyon davranışlarını doğru yorumlamak için kontrol edilemeyen faktörleri nicel modele dahil etmenin bir yolunu bulmalıyız.
İlk test cihazda optimum hücre büyümesini sağlamaktır. Cihazdaki hücre çoğalma hızının geleneksel hücre kültüründeki büyüme profilleriyle aynı veya karşılaştırılabilir olması gerekir. İlke bir kanıtı olarak, insan prostat kanseri hücre hattı PC3 hücreleri harici stres varlığı olmadan PDMS çip kültürlü edildi. Bu hücreler sitoplazmada floresan olarak etiketlendi, böylece ters floresan mikroskopi kullanarak hücre popülasyonlarını gözlemleyip ölçebildik. Hücreler tarafından kapsanan alan olarak tanımlanan hücreler biraraya gelir, fiji15kullanılarak floresan görüntülerde seçili yoğunluk eşiği verilen farklı zaman dilimlerinde her mikrohabitatta ölçüldü. Seçilen her pozisyondaki hücrelerin büyüme eğrileri Şekil 4'teçizilmiştir. Seçilen pozisyonlar, medya girişinin doruk noktasının yakınındaki bölgeden medya kuruluşlarına yakın tepeye kadar çipin her tarafına dağılmış durumda.
Şekil 4B'deki büyüme eğrileri iyi hizalanmış olup, hücre çoğalma profilinin çip teki pozisyonun bir fonksiyonu olarak aynılığını göstermektedir. Eğrilerin ilk eğimi çoğalma oranını ortaya çıkarır. Cihazdaki hücreler için iki katına çıkarma süresi, Şekil 4B'de 0 ile 24 saat arasında gösterildiği gibi yaklaşık 24 saattir ve bu da geleneksel kültür yazılımlarında iki katına çıkarma süresiyle aynıdır13. Bu nedenle, dış stres kaynağı olmadan, fiziksel ve biyokimyasal faktörlerin eşit olarak dağıtıldığı sonucuna varArak 50 ila 100 saat arasında homojen ve optimize edilmiş hücre büyümesine yol açmaktadır.
Ayrıca, bir mikro ortamda alt popülasyonlar arasındaki hücre dinamiklerini ölçme yeteneğini de göz önünde bulundurduk. GFP ifade eden PC3-EMT ve mCherry-expressing PC3-EPI hücre hatları Şekil 5'tegösterildiği gibi EA'da birlikte kültürlendi. Hücrelerin kapsadığı alanın yüzdesi olarak tanımlanan hücre birleşimi, popülasyonbüyüklüğünün göstergesi olarak ölçülür. %40'tan başlayarak, ortak kültür 3 gün içinde tamamen uyumlu bir hal aldı. İlginçtir ki, her bir fenotipin mikro ortamdaki ilerlemesini gözlemleyebiliriz. Toplam birleşmebüyüme eğrisi lojistik büyüme modeli şeklinde iken, PC3-EMT nüfusu genişlemeye devam etti ve PC3-EPI asimptotik fazda bastırıldı.
Karma popülasyonda hücre hareketliliği titreşmelerinin gösterimi
Hücre hareketliliği önemli bir henotibik davranıştır. Bir popülasyonun hareketlilik dağılımı hücrelerin fiziksel etkileşimi, yerel mikroortamın mekanik özellikleri hakkında bilgi sağlayabilir ve bazen hücrelerin epigenetik varyasyonunun bir göstergesi olarak analiz edilebilir. Geliştirilmiş hücre kültürü platformumuzun neredeyse sürekli görüntülemeye olanak sağladığı göz önüne alındığında, ince zamansal çözünürlüğe sahip olmanın avantajı heterojen bir popülasyonda tek hücre izleme potansiyelini en üst düzeye çıkarır.
İzleme işlemini uygulamak ve otomatikleştirmek için özelleştirilmiş makro ile Fiji'deki TrackMate16 eklentisini (http://fiji.sc) kullanıyoruz. TrackMate, kullanıcının Fiji Script Düzenleyicisi'nden bir komut dosyası dilini kullanarak bir izleme algoritması uygulamasına ve özelleştirmesine olanak tanır. İzleme işlemi bir dizi adıma bölünür: segmentasyon, filtreleme ve parçacık bağlama işlemleri.
Şekil 6B'degösterildiği gibi hücre kolektif göçü ve hücre-hücre etkileşimini incelemek için bir gösteri olarak "yara iyileşmesi titreci" gerçekleştirdik. PC3-EPI ve PC3-EMT hücreleri yoğun cihazın merkezinde tohumlanmış ve boş bölgeye serbestçe göç etmesine izin ver. Her iki fenotipin hızının normalleştirilmiş histogramı Şekil 6C'deçizilir. PC3-EMT hızı 1.8x bir faktör tarafından PC3-EPI önemli ölçüde daha yüksekti, mezenkimal fenotip görece aksine göç etmek için olağanüstü yeteneği ile kutanöz yara iyileşmesi bir bileşeni olarak hizmet gerçeği ile tutarlıdır sabit epitel fenotip.
Ayrıca, stressiz bir ortamda hücre hareketliliğinin ilerlemesini gözlemlemek için, pc3-EPI ve PC3-EMT'nin uzun vadeli ortak kültürünü tek tip başlangıç tohumlama yoğunluğuile gerçekleştirdik ve zamana göre değişen hücre hızıdağılımını takip ettik. Şekil 7A,B'degösterildiği gibi, 6 günlük kültürden sonra, hücreler daha yüksek bir araya geldikçe, her iki fenotip için hücre hızı dağılımları sol kuyruklara doğru eğildi.
Her sınıf aralığında PC3-EPI ile PC3-EMT arasındaki oranı karşılaştırabiliriz. Şekil 7C'degösterildiği gibi, hücrelerin kültür veya yoğunluk günlerinden bağımsız olarak, PC3-EMT yüksek hızlı bölgeye hakim ken PC3-EPI düşük hız bölgesini işgal etti. Genel hız her iki fenotip için de önemli ölçüde azalmış olsa da, PC3-EMT hareketli kaldı ve Şekil 7D'degösterildiği gibi mikroortamın kalabalıklığından daha az etkilendi. PC3-EPI'nin ortalama hızı %40, PC3-EMT'nin hızı ise sadece %14 düştü.
Hücre hızının dağılımını ve ortalama hızı etkileyebilecek çeşitli faktörler vardır, örneğin nüfusun kalabalıklığı. Tüm alt popülasyonlar üzerinde sürekli hücre takibi ve izlenmesi, henotibik davranışın ilerlemesini anlamak için gereklidir. Örneğin, etiketlenmemiş bir alt popülasyonun mezenkimal durumunun düzeyini ölçmek istersek, yalnızca ilgili alt popülasyonun fiziksel miktarının (örneğin, hız) dağılımını zaman, ama aynı zamanda hücrelerin bir arada bulunan alt popülasyonun tüm geri kalanı.
Şekil 1: Şırınga pompası güdümlü mikroakışkan EA çipi. (A) Mikroakışkan cihazın iki ayrı orta giriş, iki çıkış ve aşırı ortamın hücre tohumlanması veya çıkarılması için bir merkezi bağlantı noktası vardır. Orta girişler ve hücre kültürü dizileri arasında, ortam gaz geçirilebilir membran altından geçirilen atmosfer ile dengelemek için izin serpantin kanalları bir çift unutmayın. (B) Degrade nin nesli. Şırıngalar, soldaki 2 orta prizdeki çipten çıkarılan sağdaki 2 orta giriş aracılığıyla sırasıyla ~ 0,1 mM floresan ve flüserin olmadan orta yıpranmaya neden oluyor. Floresan konsantrasyonu floresan sinyalinin yoğunluğu ile orantılıdır ve orta giriş/çıkışlar a ve merkeze yakın profillenir b. Lin ve ark. 201712'ninizniyle çoğaltılan şekil . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Özelleştirilmiş 3 kuyu numune plakasının bileşenleri. (a) 3 kuyu plakasının ana gövdesi; (b) şartlı atmosferin pompalanıp gaz kanallarının girişindeki septadan dışarı boşaltılmasına izin veren bir çift gaz kanalı; (c) kuyu plakası ile gaz geçirilme kültürü çanağı arasındaki boşluğu kapatmak için tasarlanmış bir O-halka; (d) 35 mm çapında gaz geçirilme kültürü çanak; (e) çanak tutucu; (f) PDMS aygıtı; (g) PDMS yonga tutucuları; (h) ısı yalıtımını korumak ve su yoğuşmasını önlemek için tasarlanmış çift katmanlı 35 mm cam pencereler; (i) cam pencere tutucu; (j) Isıtma pedleri; (k) sıcaklık sensörü; (l) çipin kurumalarını engelleyen Yapışkan lı işleyici. Şekil Lin ve ark. 201712izni ile çoğaltılır . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Deneysel kurulumun şematik şekli. Gaz besleme sistemi, gaz kanalları bağlantısı, orta besleme bağlantısı ve görüntüleme sistemi de dahil olmak üzere deneyin kurulumu. Şekil Lin ve ark. 201712izni ile çoğaltılır . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: EA'da PC3'ün stres olmadan büyüme eğrileri. PC3 dış stres varlığı olmadan EA kültürlü edildi. (A) Konum etiketli EA deseni. (B) PC3'ün hücre birleşimi açısından seçilen konumlardaki büyüme eğrileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: EA'da PC3-EPI ve PC3-EMT'nin stres olmadan ortak kültürü. PC3-EPI (kırmızı) ve PC3-EMT (yeşil) dış stres varlığı olmadan EA'da ortak kültüre alındı. (A) T = 0 h. (B) Floresan görüntüde iki floresan kanalın yerleşmesi t = 95 h. (C) Hücre birleşimi açısından büyüme eğrileri. Her hücre türünün hücre birleşimi tüm çipte ölçüldü. Her veri noktası, 15 dakikalık aralıklarla alınan ardışık 3 zaman noktasında ortalama hücre birleşimini temsil eder. Hata çubukları, ardışık 3 zaman noktasında hücre birleşiminin standart sapması temsil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Karma popülasyonda hücre hareketliliği titreci. Karma popülasyonda tek hücre izleme performansının gösterimi. (A) Gaussian (LoG) segmentasyonuna bağlı Laplacian tarafından hücrelerin nasıl algılandırılabildiğini niçin gösterebilen bir gösteri. Daireler LoG algoritması tarafından algılanan hücrelerin yerini gösterir. Algılanan hücreler, hücre hareketliliğini ölçmek için doğrusal atama problemine bağlı olarak çerçeveden kareye bağlanır. (B) PC3-EPI ve PC3-EMT ortak kültür deneyinin "yara iyileşmesi analizi". Hücreler yerel olarak %100'e kadar biraraya geldi ve merkezde net bir sınır vardı. EA çipinin kurulmasından sonra hücrelerin beyaz oklarla belirtildiği gibi mikrohabitat dizisinden geçtikleri gözlenmiştir. (C) Hücre hareketliliğinin histogramını normalleştirdi. PC3-EMT, 1.8x faktörüyle PC3-EPI'den daha hızlıdır. Hata çubukları 5 deneme örneğinin standart sapını temsil ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: PC3-EPI ve PC3-EMT'nin uzun vadeli ortak kültürünün hareketliliği titreci. Pc3-EPI ve PC3-EMT'nin tek tip başlangıç tohumlama yoğunluğuna sahip uzun vadeli bir ortak kültürü. Hücre hızının dağılımı zamana göre değişir. (A) 2. (B) 6. (C) Her sınıf aralığında PC3-EPI sayısının PC3-EMT'ye oranı. (D) Zamanın bir fonksiyonu olarak PC3-EPI ve PC3-EMT'nin ortalama hızı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konvansiyonel hücre kültürü neredeyse bir yüzyıl önce geliştirilen ve biyomedikal araştırmalarda en sık kullanılan preklinik modeli kalır, kanser klinik sonuçları tahmin etmek için kanıtlanmış sınırlı yeteneğine rağmen17. Hayvan modelleri en yüksek fizyolojik alaka ve insanlar için makul genetik benzerlik sunuyoruz, ama uzun insan sonuçları tahmin önemli sınırlamalar olduğu kabul edilmiştir18. Tüm mevcut preklinik modeller arasında, mikroakışkan kanser-on-çip modelleri kanser araştırma9karşılanmamış ihtiyacı karşılamak için en umut verici aday gibi görünüyor9 ,19,20. Ancak, mevcut kanser-on-chip modelleri kapsamlı bir şekilde bir tümör mikroçevre taklit etmek için önemli bileşenleri ve etkileşimleri çoğaltmak mümkün bir platform sunmak için henüz, henüz yeterince güvenilir ve tekrarlanabilir kantitatif veri sağlamak için basit. Temsili verilerimiz, mikroakışkan hücre kültürü teknolojimizin heterojen mikroortamlarda uzun vadeli hücre kültürü için istikrarlı fiziksel ve biyokimyasal koşullar sağladığını göstermektedir. Bu çok fonksiyonlu platform, zamana bağlı kimyasal degradenin ve ortam gazı bileşiminin sofistike bir şekilde ayarlanmasını sağlar. Platform taşınabilir ve hücre morfolojisi, nüfus dinamikleri, hücre de dahil olmak üzere zaman fonksiyonu olarak hücrelerin çok boyutlu bilgi sunan yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı görüntüleme için floresan ters mikroskoplar çoğu için uyumludur tek hücre düzeyinde hareketlilik ve hücre geçişi.
Önceki çalışmamız11ile karşılaştırıldığında, mikroakışkan cihazımız için bu basınçsız paketleme ve montaj yönteminin çok sayıda alt akım deney imkânı sağladığını (örneğin, FACS, yerel metabolit ekstraksiyonu, alt klonal popülasyonlar) genleşme, IF, DNA/RNA FISH, vb.) deneyler süresince çekilen hızlandırılmış görüntüleri tamamlayıcı. Heterojen bir kültürde belirli yerlerden hücreleri kaldırma bu yeteneği bir kültür 11 erişemeden önce bir çip için sızdırmazlık yüzeyinin kaldırılması gerekiyordu önceki cihazlara göre büyük bir ilerlemedir11. Ayrıca, bu durumda bile, kapağı kaldırma eylemi kültürü önemli ölçüde rahatsız etti, böylece hücrelerin tek ila birkaç habitat düzeyinde yerel test edilmesi mümkün değildi. Bu tür lokalize ekstraksiyon esnek gaz geçirilebilir membran yumuşak "resealable" doğası nedeniyle bizim durumumuzda mümkün oldu.
Sunulan protokolde birkaç kritik adım vardır. Her şeyden önce, istikrarlı akışkan dinamikleri ile uzun vadeli bir deney başlatmak için, mikrokabarcıklar mümkün olduğunca kaçınılmalıdır. Bu nedenle, medyayı şırıngalara yüklemeden önce kültür ortamını (adım 3.4.2) önceden ısıtmak ve gazdan arındırmak önemlidir. Kabarcık oluşumunu önlemek için ortam yükleme ve dağıtım manipülasyonu yavaş ve yavaşça yapılmalıdır. PDMS deseni, kültür medya tedarik sistemine bağlanmadan önce oksijen plazması (adım 3.4.3) ile tedavi edilmelidir. Oksijen plazma tedavisi PDMS yüzeyinin hidrofililiğini sağlar ve mikrokabarcık entrapping olasılığını önemli ölçüde azaltır. Adım 3.4.7., hücre kültürü membran üstüne çip yerleştirerek, PDMS çip kültür çanak içinde sıvı yüzeyinde kabarcıklar (varsa) kurtulmak için 15 derecelik bir eğim açısı ile sıvı yüzeye yaklaşım gerekir. İkinci olarak, basınç sızdırmazlık yöntemi hücre kültürü zarına baskı yapan istikrarlı bir gaz besleme sistemi gerektirir. Basınç 0.2 ile 0.6 psi arasında ayarlanmalıdır. 0,2 psi'nin üzerindeki basınç talaş sızdırmazlığı için yetersizdir. 1.2 psi üzerinde, gaz önemli miktarda membran nüfuz ve mikroakışkan desen içinde kabarcıklar oluşturmak. Metal 3 kuyulu plakanın bileşenleri düzgün bir şekilde monte edilmezse (plaka gövdesi, gaz geçirgen kültür çanak tutucusu, PDMS yonga tutucu, cam pencere tutucusu, O-halkaları ve bir çift 35 mm cam pencere dahil), gaz sızıntısı basınç okuma gaz akışının artışına yanıt vermekte olmaz. Sızıntı sorunu sadece bir sızıntı testi yaparak ve daha sonra bileşenleri yeniden birleştirerek çözülebilir.
EA teknolojisinin kullanımı ile elde edilen en önemli veri biçimi görüntüleme yoluyla dır. Daha önce de belirtildiği gibi, EA teknolojisi herhangi bir ters mikroskop üzerine kurulabilir. Ancak, sistemin avantajlarından tam olarak yararlanmak için, sistemin tam motorlu x-y aşaması, motorlu odak düğmesini, motorlu kepenk ve motorlu filtre küpü ile donatılmış ters floresan mikroskoba monte etmesi şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, Perfect Focus tatmin edici görüntü kalitesini garanti olmayabilir unutmayın. Biz çok boyutlu görüntü edinimi ve özelleştirilmiş görüntüleme komut sağlayan bir görüntüleme yazılımı kullanmanızı öneririz. Görüntüleri iyi odaklanmış tutmak, görüntü edinme döngüsü sırasında özelleştirilmiş bir netleme yüzeyi oluşturan periyodik (her 24 saat veya 48 saatte bir) otofokus komutu olmadan zor olabilir.
Sunulan mikroakışkan EA teknolojisi bir kemoterapötik stres manzara 12 altında prostat kanseri hücre metapopülasyonlarında adaptasyon ve evrim dinamikleri çalışma için uygulanmıştır12. Ayrıca bu tümör benzeri heterojen mikro-ekolojide ilaç direnci poliploid dev kanser hücrelerinin ortaya çıkışını gösterdik, çevresel heterojenitenin tümör popülasyonu içindeki hücre göçüyle birleşerek amplifikasyona neden olacağını gösterdik. dirençli fenotiplerin ortaya çıkmasıüzerine 13. İyi kontrollü stres gradyanları altında karışık tümör hücre popülasyonlarının davranışlarını kontrol etme ve izleme becerisi ile mikroakışkan EA teknolojimiz aynı zamanda düzenleyici mekanizmaları ve ilgili bilim lerde metnotik dönüşümü incelemek için bir platform olarak hizmet verebilir. Kanser terapötik stratejileri bağlamında EMT21. Son olarak, sunulan basınçsız sızdırmazlık paketleme yöntemi, ortam gazı bileşiminin ve aşağı akım deney kapasitelerinin sofistike ayarını gerektiren diğer mikroakışkan sistemlerde de uygulanabilir. Örneğin, aynı paketleme yöntemi bakteri popülasyon dalgaları fiziksel bariyerler22ile yayılır nasıl çalışma için farklı mikroakışkan desen dahil etmek için kullanılmıştır.
Özetle, kolektif nüfus dinamikleri niteliksel olarak tek hücreli davranışlardan farklıdır. Mikroakışkan EA teknolojisi, zamanın bir fonksiyonu olarak evrimsel dinamiklerin ve metnotik davranışların tek tek ve toplu olarak nicel olarak incelenmesine olanak sağlar. Bu teknoloji kanser araştırmaları için fizyolojik olarak daha uygun bir in vitro modeli sunabilir, ve potansiyel olarak klinik öncesi ilaç geliştirme ve tarama için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması bildirilmemiş.
Acknowledgments
Bu çalışma NSF PHY-1659940 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al.
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C.
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
