Summary
המתואר כאן הוא פרוטוקול לאפיון מודולים של miRNAs ביולוגית מירסטים וההרכבה שלהם לתוך טרנסגנים קצרים, אשר מאפשר ביטוי יתר בו של טיפול גנטי יישומים.
Abstract
הרלוונטיות הביולוגית של microRNAs (miRNAs) בבריאות ובמחלות מסתמך באופן משמעותי על שילובים ספציפיים של מירנאס רבים בו בו במקום הפעולה של Mirnas יחיד. האפיון של אלה מודולים miRNAs ספציפיים הוא צעד בסיסי למקסם את השימוש בהם בטיפול. זה רלוונטי מאוד כי התכונות הקומבינטורית שלהם יכול להיות מנוצל כמעט. המתואר כאן היא שיטה להגדיר חתימה ספציפית miRNA רלוונטי השליטה של כרומטין repressors הכרומטוגניים ב glioblastoma. הגישה הראשונה מגדירה קבוצה כללית של miRNAs כי הם הפונים בגידולים בהשוואה לרקמות נורמלי. הניתוח מעודן עוד יותר על-ידי תנאי תרבות דיפרנציאלים, והבקיע קבוצת משנה של miRNAs אשר מבוטאים בו במהלך מדינות סלולר ספציפיות. בסופו של דבר, miRNAs כי לספק מסננים אלה משולבים לתוך הטרנסגנים מלאכותיים polycistronic, אשר מבוסס על פיגום של הגנים הקיימים מירונה אשכולות, לאחר מכן משמש ביטוי יתר של אלה מודולים Mirnas לתוך מקבל תאים.
Introduction
mirnas מציעים הזדמנות ללא תחרות לפיתוח של גישה טיפולית רחבה למחלות רבות1,2,3, כולל סרטן4,5. זה מבוסס על מספר תכונות ייחודיות של מולקולות ביולוגיות אלה, כולל גודל קטן שלהם6, biogenesis פשוט7, ונטייה טבעית לתפקד באסוציאציה8. מחלות רבות מתאפיינות בביטויים ספציפיים של ביטוי miRNA, אשר לעתים קרובות להתכנס על התקנה של פונקציות ביולוגיות מורכבות9. מטרת שיטה זו היא הראשונה להגדיר אסטרטגיה כדי לזהות קבוצות של miRNAs הקשורים בסינרגיה לפונקציות סלולריות ספציפיות. כתוצאה מכך, הוא מספק אסטרטגיה להקמת מחדש של שילובים כאלה של miRNA במחקרים ויישומים במורד הזרם.
שיטה זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של miRNAs מרובים בבת אחת, מינוף על המיקוד הסימולטני שלהם של מספר רב של mRNAs, ובכך ללכוד את הנופים המורכבים של מחלות. גישה זו הועסק לאחרונה כדי להגדיר קבוצה של שלושה miRNAs כי 1) הם בו מוסתות בו בסרטן המוח 2) להראות דפוס חזק ביטוי שיתוף במהלך בידול עצבי, כמו גם בתגובה ללחץ גנוטוקסיידי קרינה או . סוכן די. אנ. איי קומבינטורית re-ביטוי של מודול זה של שלושה miRNAs על ידי שיטת האשכול המתואר להלן תוצאות הפרעה עמוקה עם הביולוגיה של תאים סרטניים ניתן להשתמש בקלות כאסטרטגיה ריפוי גנטי למחקרים פרה-קליניים10. פרוטוקול זה עשוי להיות מעניין במיוחד לאלה המעורבים במחקר miRNA ויישומים הטרנסלבותית שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אפיון מירכי הקשורים פונקציונלית בגלינובלסטומה
- ניתוח של ביטוי נרחב miRNA הדיפרנציאלי במוח גלנובלסטומה
- ראשית, בדוק את מירנאס החוצה. באופן משמעותי ביותר בגידול ניתן להשיג זאת באמצעות לפחות שלוש שיטות שונות:
- שלי הגנום אטלס הסרטן, נמצא ב https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, עבור רצף נתונים11.
- לבצע ניתוח microarray מתוך מדגם פעיל חדש12.
- השתמש בערכות נתונים שפורסמו בעבר13.
הערה: באיזו שיטה נבחר, הפלט מספק קבוצה גורפת של miRNAs אשר הביטוי הוא מתאם סטטיסטית (או ישירות או הפוך) עם ביולוגיה של הגידול. קבוצה ראשונית זו מהווה את מאגר miRNAs שנותחו עוד לזיהוי קבוצת משנה של miRNAs המציגה את השיוך התפקודי הקפדני ביותר על-ידי ביצוע ניתוח דינמי יותר של שינויי ביטויים, כפי שמתואר להלן.
- ראשית, בדוק את מירנאס החוצה. באופן משמעותי ביותר בגידול ניתן להשיג זאת באמצעות לפחות שלוש שיטות שונות:
- ניתוח ביטוי מיוחד לתנאי miRNA
- אינדוקציה של בידול התא:
- השתמש במנות פלסטיק מצופות מראש ללייזין (PDL) כדי להעדיף את היווצרות התרבות המונאולייר. עבור ציפוי צלחת, לפזר PDL במים בריכוז של 100 μg/mL. השתמש 1 mL של פתרון לכל 25 ס"מ על פני שטח2 . לשטוף 2x עם PBS 6 h לאחר היישום של פתרון PDL.
- צלחת בתאי גזע עצביים האדם בכמויות שוות (100,000 תאים/5 mL) או בינונית תא גזע (נוירובלית בינונית + B27 + 20 ng/mL EGF/FGF), בידול astrocytic (DMEM דיום + 10% FGF), או מדיום בידול עצבי (נוירובסיס בינונית + B27 תוספת, + 2 חומצות μM retinoic)14. הפרוטוקול עבור אוליגודנדרוציטים בידול דורש תוספת IGF-1 (200 ng/mL) לאחר הסרת egf/fgf14,15.
- לאחר ציפוי תא, מקום בחממה לשבוע 1 ב 37 ° c, 5% CO2.
- הוצאת רנ א:
- לאחר 7 ימים, להסיר את התאים מהאינקובטור ולהסיר את המדיום.
- שטוף את התאים עם PBS (5 מ"ל). לאחר מכן, להוסיף 1 מ ל של מגיב לפירוק (ראה טבלת חומרים) כדי lyse את התאים ומגרד את התאים לתוך 1.5 mL microfuge הצינור באמצעות מגרד התא. שמור את הצינורות המכילים את התאים למטה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות.
- המשך לבידוד RNA מוחלט בעקבות הוראות היצרן.
- ניתוח ביטוי miRNA:
- לכמת את הביטוי הדיפרנציאלי של miRNAs ספציפיים שזוהו בשלב 1.1 בקרב שלושת דפוסי הבידול על ידי ה-PCR בזמן אמת, באמצעות בדיקה TaqMan ובעקבות פרוטוקולי היצרן עבור תמלול והגברה PCR ( איור 1).
- אינדוקציה של בידול התא:
- אימות מושבות miRNA על ידי אתגרים ספציפיים למתח
- תרבות G34 גלנובלסטומה בתאי גזע בינונית נוירובסיס + B27 תוספת + 20 ng/mL EGF/FGF. התחל עם 1 x 106 תאים 5 מ ל ב 25 ס מ2 בקבוקון מצורף נמוך.
- החל 48 h לאחר ציפוי, להוסיף ריכוזי ההכפלה של הסוכן temozolomide al, הסוכנת של DNA (TMZ) כל 5 ימים, כדלקמן:
- התחל עם 5 μM במשך 5 ימים. לאחר 5 ימים, להסיר את המדיום ולהחליף עם מדיום טרי ללא temozolomide, כדי לאפשר לתאים ששרדו להתאושש. לאחר 48 h, להוסיף 10 μM TMZ ו הדגירה עבור עוד 5 ימים.
- חזור על שלב 1.3.2.1, הכפלת TMZ הריכוז בכל פעם, עד ריכוז של לפחות 100 μM הגיע ותאים להיות עמידים בפני הסם10.
- בניסוי מקבילי, מקרין G34 תאים כדלקמן:
- החל 48 h לאחר ציפוי 1 x 106 תאים ב 5 מ ל ב 25 ס מ2 בקבוקון מצורף נמוך, הפעלת תאים עם 2 Gy של אנרגיה (כל הקרנת מתן לפליטת פוטון הוא מקובל). החזר את התאים אל החממה ואל תפריע. לאחר 48 h, להקרין את התאים שוב עם 2 Gy של אנרגיה נוספת.
- חזור על השלב 1.3.3.1 4x עד סך של 10 Gy של אנרגיה מנוהל.
- להחזיר את התאים לחממה ולתת להם להתאושש בינוני טרי לפחות 5 ימים לפני ניתוח במורד הזרם.
- לאחר אינדוקציה של התנגדות, התאים lyse באמצעות מגיב לפירוק לחלץ כולל RNA על פי פרוטוקול של היצרן.
- לנתח את הביטוי של miRNAs מסוימים שזוהו בסעיפים 1.1-1.2 כפי שמתואר בשלב 1.2.1 (איור 2).
- אפיון ההתכנסות הפונקציונלית של מירנאס באשכולות
- השג את המיקוד החזוי של כל miRNAs מוגדר בסעיפים 1.2-1.3 המתקבלים באמצעות Mirnas כלים חיזוי היעד.
הערה: אנחנו בדרך כלל האתר TargetScan, כפי שאלגוריתם שלה מתעדכן מדי פעם16. כלים נוספים לחיזוי הם מירנדה17, mirdb18, ו דיאנה-mirdb19. כל התוכניות הללו הן יישומים מבוססי אינטרנט ללא תשלום.- מהעמוד הקדמי של Targetscan, בחר באפשרות miRNA של עניין מהתפריט הנפתח שאוכלס מראש. לחץ על לחצן Submit .
- הורד את רשימת היעדים המתקבלת כגיליון אלקטרוני באמצעות הקישור לטבלת ההורדות (איור משלים 1).
- כדי להקטין את הסיכויים של תחזיות חיוביות שקריות, כלול רק מטרות בתוך עמודת האתרים ששומרו בניתוחי במורד הזרם. כמו כן, ניתן להשיג היתר נוסף באמצעות תוכניות חיזוי miRNA נוספות (ראה לעיל) ורק כולל מטרות המשותפות לכל האלגוריתמים.
- לסווג את היעד המתקבל על פי קטגוריות האונטולוגיה של גנים באמצעות ToppGene סוויטה20 כדי להעריך עבור העשרה של מסלולים המשותפים לכל mirna.
- הדבק את רשימת היעדים שהושגו משלב 1.4.1 בחלון "ערכת הגן הדרכה", באמצעות סמל HGNC כסוג הערך. לחץ על שלח ≫ התחל. התוכנית תספק טבלת פלט המציגה את הקטגוריות "Go" המשמעותית ביותר עבור רשימת הגנים המוזנים (איור משלים 2).
- כדי לקבוע לבסוף את התרומה של כל miRNA לוויסות של מסלול משותף או תהליך הסלולר (במקרה זה, תקנה כרומטין), לבדוק כל היעד המתקבל בשלב 1.4.1 נגד הרשימה המלאה של גנים המעורבים בתהליך הסלולר הספציפי ( i.e., רגולציה כרומטין), באמצעות הפונקציה של דיאגרמת הקבוצות המסופקת באתר האינטרנט http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
הערה: תוכנית זו מאפשרת הצטלבות של קבוצות מרובות בעת ובעונה אחת (איור 3). המטרות הייחודיות הספציפיות שסופקו על ידי כל miRNA מסומנים ונבחרו לניסויים פונקציונליים במורד הזרם.- בעמוד הראשון של התוכנית, להעלות או להעתיק/להדביק את הרשימה אם היעד mRNAs עבור כל miRNA או עניין בחלונות המתאימים. שם כל רשימה עם מזהה ייחודי.
- לחץ על שלח. התוכנית תספק פלט חזותי של דיאגרמת חיתוך קבוצות עם מספר גנים בכל סקטור, כמו גם רשימה מלאה של mRNAs עבור כל שילובי משנה והצטלבות.
- השג את המיקוד החזוי של כל miRNAs מוגדר בסעיפים 1.2-1.3 המתקבלים באמצעות Mirnas כלים חיזוי היעד.
2. הרכבת מודולים miRNA לתוך אשכול הטרנסגניים הפוליפוניים
-
הכנת הגרדום הטרנסגניים על בסיס מקום האשכול מיר-17-92
- להשיג את הרצף נוקלאוטיד של האשכול מיר-17-92 מדפדפן הגנום Ensembl21. בחר את ~ 800 בסיס זוג בסיסי "רצף" המקיף את כל ששת הפינים מקודד miRNA של מקום ולפחות 200-נוקלאוטיד מאגפים רצפים הן במעלה (5 ') ו במורד הזרם (3 ') של רצף הליבה.
- הדבק את הרצף למעלה לכל תוכנית עריכת מילה.
- הגדירו את הרצף של כל אחד מששת סיכות השיער הילידים על ידי מחזורם ב-miRBase22. סמן כל אחד מרצפים אלה בטווח של רצף "הליבה" שזוהה בעבר. כל רצף בין כל צורה של סיכת מייצג רצפי מרווח, אשר חשובים לעיבוד הנכון של המשגר.
- הסירו את רצפי העצם המקוריים מרצף ה"ליבה", למעט 3-5 נוקלאוטידים בשני הקצוות של 5 ' ו-3 ', שישמשו כקבלה לסיכות השיער החדשות.
-
בניית הקידוד החדש של מירגנים מרובים של בחירה
- לקבל רצפים סיכת ראש של miRNAs נועד להיות מבוטא יתר על השימוש ב-הטרנסגנים מ Mirnas. שים לב לנוקלאוטידים הספציפיים שבהם נמצאים האתרים של פצילות מיקרו-מעבד.
- החלף את סיכות השיער שהוסרו (שלב 2.1.4) עם רצפי סיכת ראש של miRNAs הרצוי שהתקבלו בשלב 2.2.1.
- הוסף רצפי הגבלה רצוי בשני האזורים האגפים של הטרנסגנים כדי להקל על שכפול משנה לתוך וקטורים מסירה של בחירה. ודא שרצפי ההגבלה שנבחרו אינם נוכחים ברצף עצמו.
- עבור פקדים שליליים, להשתמש 20-נוקלאוטיד רצפים מקושקשות להחליף את הטבעי 20-נוקלאוטיד רצף של כל miRNA בוגרת. צור רצפי מקושקשות אלה באמצעות כלי מקוון כגון https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
אימות המבנה הדו-מימדי של הטרנסגנים
- העתק את רצף הטרנסגניים המלא לתוך תוכנת החיזוי של מבנה RNA RNAweb קפל23.
- באמצעות הגדרות תוכנית רגילה, לחץ על המשך.
- לנתח את הפלט הגרפי, במיוחד לנוכחות סיכות השיער מוגדרים היטב ונוכחות של מבני גזע כפול תקועים לפחות 11 נוקלאוטידים האבוטיים לאתר המחשוף מיקרו. כמו כן, חפשו את היעדר נקודות הסתעפות בתוך רצפי הראש (איור 4).
3. קבלת טרנסגנים על ידי סינתזה DNA
- לאחר העיצוב באימות סיליקו של האשכול הצ miRNA, לקבל את רצף העבודה באמצעות סינתזה DNA מספקים מסחריים24 ולהמשיך עם שיבוט במורד הזרם לתוך וקטורים ומסירה טרנסגנטית. השתמשנו וקטורים ויראליות עבור במסירה מחוץ למבחנה10 ו-adeno הקשורים וירוסים (aavs) עבור במסירה vivo גולגולתית25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו אפשרה אפיון של מודול של שלושה miRNAs כי הם בעקביות מוסדר בגידולים במוח, אשר מבוטא במיוחד במהלך בידול עצבי (איור 1) ומעורב בתגובת הישרדות הגידול לאחר (איור 2). הדבר מתבצע על-ידי ויסות מסלול דכאואני כרומטין מורכב. תבנית הביטוי המשותף הציעה פעילות סינגיסטית חזקה בקרב שלושת מירנאס (איור 3). כתוצאה מכך, ניצול הגודל הקטן והביוגנזה הפשוטה של miRNAs, החלק השני של פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לעצב transgene (איור 4) שיכול במקביל ללכוד את הביטוי של שלושת mirnas בתאים גלינובלסטומה, הן במבחנה והן בvivo, עם הפרעות משמעותיות בביולוגיה של הגידול ובאופן מבטיח ישימות טרנסלבית (איור 5א, ב, ג)10. בנוסף, הוכח כי אשכול הטרנסגניים הוא גם פונקציונלי במודל סרטן השד (איור 5ד, ה).
איור 1: אפיון של מודול מירנה פונקציונלי בגלינובלסטומה. (א) מגרש הר הגעש המייצג את מירנאס באופן מהותי בדגימות גלינובלסטומה של האדם (n = 516) לעומת המוח הרגיל (n = 10) המתקבל מ TCGA. בירוק הם miRNAs עם ההבדל > 4 קיפול. המעגל האדום מייצג את 10 מאוד באופן משמעותי miRNAs מוסדרות ב glioblastoma. (ב) ביטוי יחסי של 10 mirnas נבחר ב (א) במהלך אינדוקציה של מסלולים בידול שונים בתאי גזע עצביים, מראה ברור Upregulation של מיר-124, מיר-128, ו מיר-137 מודולים במהלך אינדוקציה של בידול עצבי. ממוצע ± SD מתוך שלושה משכפל ביולוגי (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001; * * * * p < 0.0001; מבחן t, דו-זנבי של הסטודנט. דמות זו שונתה עם אישור מהפניה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אישור על דפוסי ביטוי משותף של מודולים miRNA במהלך הלחץ הגנוטוקסיני. ביטוי יחסי של שלושת miRNAs מוגדר באיור 1 בתאים גלינובלסטומה מרובים וקווי תאים (G62-mesenchymal; MGG4; U251, U87 pro-עצביות, ו T98G mesenchymal כמו קווי התאים gliנובלסטומה) לאחר אינדוקציה של התנגדות temozolomide (TMZ, בארים ורודים) או קרינה מייננת (RT, ירוק ברים). הדיווח משמעו עם SD משני משכפל בלתי תלוי. דמות זו שונתה עם הרשאה מהפניה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח ההתכנסות הפונקציונלית של היעד של מירנאס משותף. הפלט מאתר האינטרנט של ביואינפורמטיקה והגנומיקה ההתפתחותית, ובמקביל חוצה את היעד של מירנאס עם ה-mRNAs המהווים קטגוריית התעניינות מסוג GO (במקרה זה, כרומטין repressors). mRNAs ממוקד באופן ייחודי על ידי מירנאס יחיד נבחרו עבור מחקרים פונקציונליים נוספים במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: המבנה 2D של רצף miRNA הנדסה קידוד שלוש אשכול Mirna. פלט גרפי מתוכנית הקיפול של RNAweb. הערה הנוכחות של שלושה מוגדרים היטב לולאה מבנים המייצגים את סיכות השיער של כל miRNA בהתאמה (מיר-124, מיר-128, מיר-137) מקודד על ידי הטרנסוגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הוכחה לעיבוד טרנסגנטי ולהשפעה הביולוגית שלה בזרם. (A) כימות יחסית של ביטוי mirna לאחר התמרה ויראלית בתיווך של תאים G34 גלנובלסטומה עם אשכול mirna הטרנסגניים (אשכול 3) או שלילי (ctrl). הדיווחים הם אמצעי מפני שלושה ניסויים עצמאיים ± SD. (ב) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של כדורי G34 gliנובלסטומה המבטא שלילי העברה שליטה לעומת אשכול 3 הטרנסגנים. סרגל סרגל = 100 μm. (ג) ב vivo צמיחה של הגוף האנושי G34 cell xenografts תלי ביטוי או שליטה או אשכול 3 הטרנסגנים. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. הדמות הזאת שוחזר עם הרשאה10. (ד) כימות יחסית של ביטוי mirna לאחר התמרה ויראלית-בתיווך של מד א-ב-231 תאים סרטניים עם האשכול mirna הטרנסגניים (אשכול 3) או שלילי (ctrl). (ה) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של מד א-מגה-בתים-231 התאים סרטן השד ביטוי שלילי transgene לעומת אשכול 3 הטרנסגנים. סרגל קנה מידה = 100 μm. כל הניסויים נערכו בטרילקטים (* p < 0.05; * * p < 0.01; מבחן t של סטודנט, דו-זנבי, השוואות מרובות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: זרימת עבודה TargetScan. (A) מסך דף הבית, הצגת אפשרויות בחירה עבור חיפוש mirna. (ב) תוצאות החיפוש של הנציג עבור מיר-137. רשימת גנים מכוונים נמצאת בעמודה השמאלית. התיבה האדומה מציינת גנים עם מיקוד שימור אתרים (מציע ביטחון גבוה יותר של פילוח אמיתי). אנא לחץ כאן כדי לצפות באיור זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
איור משלים 2: תהליך העבודה של חבילת ToppGene. (A) דף הבית מסך המציג את תיבת החיפוש שבו הרשימה של הגנים לניתוח מוכנס. (ב) תוצאת החיפוש של הנציג של מיר-137 היעד, המציגה את הקטגוריות המשמעותיות ביותר מבחינה סטטיסטית של גן האונטולוגיה (GO). אנא לחץ כאן כדי לצפות באיור זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מבוסס על הרעיון כי במקום לתפקד בבידוד, miRNAs הם רלוונטיים ביולוגית על ידי עבודה בקבוצות, וקבוצות אלה נקבעים באמצעות ההקשרים הסלולריים הספציפיים26. כדי להצדיק גישה זו מנקודת מבט טרנסלתית, פרוטוקול המשך טיפול המאפשר בילוי של דפוס זה multi-miRNA בתאים/רקמות הוא הציג. זה אפשרי על ידי ניצול של ביוגנזה פשוטה יחסית של miRNAs, לפיו ההכרה של סיכת הראש האופיינית Mirnas על ידי מעבד הוא הכרחי ומספיק עבור עיבוד הנכון Mirnas27. במקביל, זו דרישה מינימלית מאפשר להשתמש הגרדום הגנטי של אשכולות המתרחשים באופן טבעי כמו עמוד השדרה עבור הביטוי של מודולים miRNA הרצוי, אשר נמצאים בתוך רצפי DNA קצר שניתן להתאים לכל וקטורים מסירה בחירה. הדרישה העיקרית של פרוטוקול זה היא שמירה על מבנה הראש ואורך מספיק של רכיב הגזע כדי לאפשר מחשוף מתאים.
קיימים שני שיקולים קריטיים עיקריים הנוגעים לביצוע פרוטוקול זה. הנקודה הראשונה היא ההגדרה המדויקת של השילובים האופטימליים של miRNA. זה נקבע על ידי ניתוח קפדני של לא רק את חתימת ביטוי miRNA של תאים או רקמות לעומת פקדים, אלא גם של כל הביטוי בו שינויים שנצפו כמו התאים מניפולציות ניסויים. לאחר מוגדר מערכת של miRNAs, זה גם בסיסי לוודא שהאפנון המלאכותי של כל אחד משני האנשים אינו משנה את הביטוי של האחרים.
ההיבט הקריטי השני מטפל בבניית רצפי הצ כדי ללכוד מלאכותית את המבנה הפונקציונלי הזה מירנא. זה בסיסי לציית הדרישות המבבניות של מכונות עיבוד miRNA, שהיא נוכחות של רצף גזע ארוך מספיק (מדידת לפחות 11 נוקלאוטידים) במקור של כל סיכת ראש מירונה18, כמו גם תחזוקה של המקורי רצפי מרווחים של פיגום האשכול היליד miRNA. בניסיון שלנו, מילוי שתי דרישות אלה הניב בעקביות מתאים RNA המתאים (איור 4) והביא ביטוי מוצלח Multi-mirna.
המגבלה העיקרית של טכניקה זו היא המספר הסופי של miRNAs שניתן להרכיב יחד לתוך הגנטי התפקודי. יש לנו מהונדסים בהצלחה רצפים יתר על הבעה עד שישה miRNAs שונים אבל נצפתה כמה ירידה ביעילות עיבוד כמו מספר סיכות השיער גדל. עד כה המבנה הגנטי של האשכול מיר-17-92 כבר נעשה שימוש, כי זה אחד קידוד המספר הגבוה ביותר של סיכת ראש (שש) בתוך רצף ה-DNA הקצר ביותר (~ 800 זוגות בסיס)8. כפי שיש אשכולות אחרים miRNA טבעי, הוא צפוי כי הם יכולים גם לשמש למטרה זו28. לבסוף, זה כבר נצפתה כי שינוי של רצפי מרווח בין הראש מקטין את העיבוד שלהם, ולכן יש כמה אילוצים לגבי מה היקף מבנה יליד ניתן לשנות.
ההיבט המשמעותי ביותר והיתרון של השיטה המוצעת היא שהיא מאפשרת הנדסה של טרנסגנים, כי הם מסוגלים בו לבטא מרובים מספר הרצויה mirnas בעיקר באמצעות גישה סיליקו, הגבלת הצורך מייגע ו צעדי שיבוט מולקולריים לזמן רב, כפי שתוארו בעבר29,30,31. הפרוטוקול המתואר קל לביצוע ואינו דורש ציוד מיוחד או מיומנויות.
בהתחשב בחשיבות המזוהה של miRNAs בביולוגיה מולקולרית והפוטנציאל שלהם ביישומים טיפוליים, פרוטוקול זה הוא עניין של קהל גדול של חוקרים. גישה זו צפויה לעודד מחקרים עתידיים המתמקדים בתכונות הקומבינטורית של miRNAs וישמש כלי פשוט וחזק עבור הוצאתו להורג. יותר חשוב, אלה טרנסגנים באשכולות מייצגים מטענים אידיאלי עבור וקטורים ריפוי גנטי. ראיות של מוצלח במסירה vivo של אשכול 3-miRNA כבר הושג באמצעות הזרקה ישירה intrאטומיאלית בתוך גולגולתי של וקטורים AAV (נתונים שלא פורסמו). כך צפוי טכניקה זו להגביר באופן משמעותי את ההיבטים הטרנסלבותית של מחקר miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מדווחים על ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לחברי המעבדה הארווי קושינג נוירו אונקולוגיה לתמיכה וביקורת בונה. עבודה זו נתמכת על ידי NINDS מענקים K12NS80223 ו K08NS101091 ל P. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
