Summary
Décrit ici est un protocole pour caractériser des modules des miRNAs biologiquement synergiques et de leur assemblage en transgènes courts, qui permet la surexpression simultanée pour des applications de thérapie génique.
Abstract
La pertinence biologique des microARN (miARN) dans la santé et la maladie repose de manière significative sur des combinaisons spécifiques de nombreux miARN simultanément déréglementés plutôt que l'action d'un seul miRNA. La caractérisation de ces modules miRNAs spécifiques est une étape fondamentale dans la maximisation de leur utilisation en thérapie. Ceci est extrêmement pertinent parce que leurs attributs combinatoires peuvent être pratiquement exploités. Décrit ici est une méthode pour définir une signature spécifique de miRNA pertinente au contrôle des répresseurs oncogènes de chromatine dans le glioblastoma. L'approche définit d'abord un groupe général de miARN qui sont déréglementés dans les tumeurs par rapport au tissu normal. L'analyse est encore affinée par des conditions de culture différentielles, soulignant un sous-groupe de miARN qui sont co-exprimés simultanément au cours d'états cellulaires spécifiques. Enfin, les miARN qui satisfont ces filtres sont combinés en un transgène polycistronique artificiel, qui est basé sur un échafaudage de gènes de grappes de miARN naturellement existants, puis utilisés pour la surexpression de ces modules miRNA dans les cellules réceptrices.
Introduction
miRNAs offrent une occasion inégalée pour le développement d'une approche de thérapie génique large à de nombreuses maladies1,2,3, y compris le cancer4,5. Ceci est basé sur plusieurs caractéristiques uniques de ces molécules biologiques, y compris leur petite taille6, biogenèse simple7, et la tendance naturelle à fonctionner en association8. Beaucoup de maladies sont caractérisées par des modèles spécifiques d'expression miRNA, qui convergent souvent vers la régulation des fonctions biologiques complexes9. Le but de cette méthode est d'abord de définir une stratégie pour identifier les groupes de miARN qui sont synergiquement pertinents pour des fonctions cellulaires spécifiques. Par conséquent, il fournit une stratégie pour le rétablissement de ces combinaisons miRNA dans les études et les applications en aval.
Cette méthode permet l'analyse fonctionnelle de plusieurs miARN à la fois, en s'appuyant sur leur ciblage simultané d'un grand nombre de MARN, récapitulant ainsi les paysages complexes des maladies. Cette approche a été récemment employée pour définir un groupe de trois miRNAs que 1) sont simultanément downregulated dans le cancer du cerveau et 2) montrent un modèle fort de co-expression pendant la différenciation neurale aussi bien qu'en réponse au stress génotoxique par rayonnement ou un Agent alkylating d'ADN. La réexpression combinatoire de ce module de trois miARN par la méthode de regroupement décrite ci-dessous entraîne une interférence profonde avec la biologie des cellules cancéreuses et peut être facilement utilisée comme stratégie de thérapie génique pour les études précliniques10. Ce protocole peut être particulièrement intéressant pour ceux qui participent à la recherche miRNA et à ses applications translationnelles.
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Protocol
1. Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le glioblastome
- Analyse de l'expression de miRNA différentiel large dans le glioblastoma contre le cerveau
- Tout d'abord, déterminer les miARN les plus significativement déréglementés dans la tumeur. Cela peut être réalisé en utilisant au moins trois méthodes différentes:
- Mine the Cancer Genome Atlas, trouvé à https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, pour le séquençage des données11.
- Effectuer l'analyse de microarray à partir d'un spécimen opératoire frais12.
- Utilisez des ensembles de données publiés précédemment13.
REMARQUE: Quelle que soit la méthode choisie, la sortie fournit un ensemble en vrac de miARN dont l'expression est statistiquement corrélée (directement ou inversement) avec la biologie tumorale. Ce groupe initial constitue le pool de miRNAs qui sont analysés plus en détail pour l'identification d'un sous-ensemble de miRNAs affichant l'association fonctionnelle la plus rigoureuse en effectuant une analyse plus dynamique des changements d'expression, comme discuté ci-dessous.
- Tout d'abord, déterminer les miARN les plus significativement déréglementés dans la tumeur. Cela peut être réalisé en utilisant au moins trois méthodes différentes:
- Analyse de l'expression miRNA spécifique à la condition
- Induction de la différenciation cellulaire :
- Utilisez des plats en plastique pré-enduits de poly-D-lysine (PDL) pour favoriser la formation d'une culture monocouche. Pour le revêtement plat, dissoudre le PDL dans l'eau à une concentration de 100 g/mL. Utiliser 1 ml de solution par surface de 25 cm2. Rincer 2x avec PBS 6 h après l'application de la solution PDL.
- Plaquer les cellules souches neurales humaines en quantités égales (100 000 cellules/5 mL) soit dans le milieu des cellules souches (milieu neurobasal - supplément B27 - 20 ng/mL EGF/FGF), le milieu de différenciation astrocytique (DMEM à 10 % FBS), soit dans le milieu de différenciation neuronale (milieu neurobasal et B27), le milieu de différenciation astrocytique (DMEM à 10 % FBS), ou le milieu de différenciation neuronale (milieu neurobasal et B27) supplément, 2 M acide rétinoïque)14. Le protocole pour la différenciation d'oligodendrocyte exige l'addition de l'IGF-1 (200 ng/mL) après l'enlèvement d'EGF/FGF14,15.
- Après le placage cellulaire, placer dans l'incubateur pendant 1 semaine à 37 oC, 5 % DE CO2.
- Extraction d'ARN:
- Après 7 jours, retirer les cellules de l'incubateur et retirer le milieu.
- Laver les cellules avec du PBS (5 ml). Ensuite, ajouter 1 ml de réactif de lyse (voir Tableau des matériaux)pour lyser les cellules et gratter les cellules en tube microfuge de 1,5 ml à l'aide d'un grattoir cellulaire. Gardez les tubes contenant les cellules lysées à température ambiante (RT) pendant 5 min.
- Procéder à l'isolement total de l'ARN en suivant les instructions du fabricant.
- analyse de l'expression miRNA:
- Quantifier l'expression différentielle des miARN spécifiques identifiés à l'étape 1.1 parmi les trois modèles de différenciation par PCR en temps réel, en utilisant les sondes TaqMan et en suivant les protocoles du fabricant pour la transcription inversée et l'amplification du PCR ( Figure 1).
- Induction de la différenciation cellulaire :
- Validation des clusters miRNA par des défis spécifiques au stress
- Culture G34 glioblastoma cellules souches dans le milieu neurobasal - Supplément B27 20 ng/mL EGF/FGF. Commencez avec 1 x 106 cellules dans 5 ml dans un flacon d'attachement bas de 25 cm2.
- À partir de 48 h après le placage, ajoutez des concentrations de doublement de l'agent alkylating de l'ADN témozolomide (TMZ) tous les 5 jours, comme suit :
- Commencez par 5 M pendant 5 jours. Après 5 jours, retirer le milieu et remplacer par un milieu frais sans témozolomide, pour permettre aux cellules survivantes de récupérer. Après 48 h, ajouter 10 M TMZ et couver pendant encore 5 jours.
- Répétez l'étape 1.3.2.1, doublant la concentration de TMZ à chaque fois, jusqu'à ce qu'une concentration d'au moins 100 M soit atteinte et que les cellules deviennent résistantes au médicament10.
- Dans une expérience parallèle, irradier les cellules G34 comme suit :
- À partir de 48 h après le placage 1 x 106 cellules dans 5 ml dans un flacon d'attachement faible de 25 cm2, irradier les cellules avec 2 Gy d'énergie (tout irradiateur fournissant l'émission de photon est acceptable). Remettre les cellules à l'incubateur et ne pas déranger. Après 48 h, irradier à nouveau les cellules avec 2 Gy supplémentaires d'énergie.
- Répétez l'étape 1.3.3.1 4x jusqu'à ce qu'un total de 10 Gy d'énergie soit administré.
- Remettre les cellules à l'incubateur et les laisser récupérer dans un milieu frais pendant au moins 5 jours avant l'analyse en aval.
- Après l'induction de la résistance, lysez les cellules à l'aide d'un réactif de lyse et extrayez l'ARN total selon le protocole du fabricant.
- Analyser l'expression des miARN spécifiques identifiés dans les sections 1.1-1.2 telles que décrites à l'étape 1.2.1 (figure 2).
- Caractérisation de la convergence fonctionnelle des miARN groupés
- Obtenir le targetome prévu de chaque miARN défini dans les sections 1.2-1.3 obtenues à l'aide d'outils de prévision de ciblage miRNA.
REMARQUE: Nous avons généralement recours à TargetScan, comme son algorithme est périodiquement mis à jour16. D'autres outils de prédiction sont miRanda17, miRDB18, et DIANA-miRPath19. Tous ces programmes sont des applications gratuites sur le Web.- À partir de la première page de Targetscan, sélectionnez le miRNA d'intérêt dans le menu déroulant pré-peuplé. Cliquez sur le bouton Soumettre.
- Téléchargez la liste des cibles qui en résultent sous forme de feuille de calcul à l'aide du lien de table De téléchargement ( Figure supplémentaire1).
- Pour réduire les risques de fausses prédictions positives, n'incluez que des cibles dans la colonne des sites conservés dans les analyses en aval. En outre, une plus grande rigueur peut être obtenue en utilisant des programmes de prédiction miRNA supplémentaires (voir ci-dessus) et en incluant uniquement des cibles communes à tous les algorithmes.
- Classez les targetomes résultants selon les catégories d'Ontologie Gene à l'aide de la suiteToppGene 20 pour évaluer l'enrichissement des voies communes à chaque miRNA.
- Collez la liste des cibles obtenues à partir de l'étape 1.4.1 dans la fenêtre « Ensemble de gènes de formation », en utilisant le symbole HGNC comme type d'entrée. Cliquez sur Soumettre 'gt; Démarrer. Le programme fournira un tableau de sortie montrant les catégories de « Go » les plus importantes pour la liste des gènes saisies(figure supplémentaire 2).
- Pour établir enfin la contribution de chaque miRNA à la régulation d'une voie commune ou d'un processus cellulaire (dans ce cas, régulation de la chromatine), vérifiez chaque targetome obtenu à l'étape 1.4.1 par rapport à la liste complète des gènes impliqués dans le processus cellulaire spécifique ( c.-à-d., régulation de la chromatine), en utilisant la fonction de diagramme de Venn fournie dans le site Web de bioinformatique et de génomique évolutive http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
REMARQUE: Ce programme permet l'intersection de plusieurs groupes en même temps (figure 3). Les cibles uniques spécifiques fournies par chaque miRNA sont ensuite annotées et sélectionnées pour des expériences fonctionnelles en aval.- Dans la première page du programme, téléchargez ou copiez/collez la liste si les ARN cibles pour chaque miRNA ou l'intérêt pour les fenêtres respectives. Nommez chaque liste avec un identifiant unique.
- Cliquez sur Soumettre. Le programme fournira une sortie visuelle d'un diagramme de Venn avec un nombre de gènes dans chaque secteur, ainsi qu'une liste complète des ARNM pour chaque sous-ensemble et combinaisons d'intersections.
- Obtenir le targetome prévu de chaque miARN défini dans les sections 1.2-1.3 obtenues à l'aide d'outils de prévision de ciblage miRNA.
2. Assemblage de modules miRNA dans un cluster transgénique polycistronique
-
Préparation de l'échafaudage transgénique à base de locus de cluster miR-17-92
- Obtenir la séquence de nucléotide du cluster miR-17-92 à partir du navigateur du génome Ensembl21. Sélectionnez la séquence « noyau » de la paire de base de 800 englobant les six épingles à cheveux miRNA codées du locus et au moins 200 nucléotides en amont (5') et en aval (3') de la séquence centrale.
- Collez la séquence ci-dessus dans n'importe quel programme d'édition de mots.
- Définissez la séquence de chacune des six épingles à cheveux indigènes en les récupérant dans miRBase22. Marquez chacune de ces séquences dans la durée de la séquence « de base » précédemment identifiée. Toutes les séquences entre chaque épingle à cheveux représentent des séquences d'espaceur, qui sont importantes pour le traitement correct du transgène.
- Retirez les séquences d'épingles à cheveux indigènes de la séquence « de base », à l'exception des 3-5 nucléotides aux extrémités de 5' et 3' de chaque épingle à cheveux, qui serviront d'accepteur pour les nouvelles épingles à cheveux.
-
Construire un nouveau transgène codant plusieurs miARN de choix
- Obtenir des séquences en épingle à cheveux de miRNAs destinés à être surexprimés dans le transgène de miRBase. Notez soigneusement les nucléotides spécifiques qui sont les sites de clivage microprocesseur.
- Remplacer les épingles à cheveux enlevées (étape 2.1.4) par les séquences en épingle à cheveux des miARN désirés obtenues à l'étape 2.2.1.
- Ajouter les séquences de restriction souhaitées dans les deux régions de flanc du transgène pour faciliter la subclonage dans les vecteurs de livraison de choix. Vérifier que les séquences de restriction choisies ne sont pas présentes dans la séquence elle-même.
- Pour les contrôles négatifs, utilisez des séquences brouillées de 20 nucléotides pour remplacer la séquence naturelle de 20 nucléotides de chaque miRNA mature. Générez ces séquences brouillées à l'aide d'un outil en ligne tel que https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
Vérification de la structure bidimensionnelle du transgène
- Copiez la séquence transgénique complète dans le logiciel de prédiction de la structure de l'ARN RNAweb Fold23.
- En utilisant les paramètres de programme standard, cliquez sur Procéder.
- Analyser la sortie graphique, en particulier pour la présence d'épingles à cheveux bien définies et la présence de structures de tige à double brin au moins 11 nucléotides proximal au site de clivage microprocesseur. Aussi, recherchez l'absence de points de ramification dans les séquences d'épingle à cheveux (Figure 4).
3. Obtenir des Transgènes par synthèse d'ADN
- Après la conception et la validation en silico du cluster miRNA chimérique, obtenir la séquence de travail en utilisant la synthèse de l'ADN des fournisseurs commerciaux24 et procéder au clonage en aval dans les vecteurs et la livraison de transgènes. Nous avons utilisé des vecteurs lentiviraux pour l'accouchement in vitro10 et des virus adéno-associés (AAV) pour la livraison intracrânienne in vivo25.
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Representative Results
Cette méthode a permis la caractérisation d'un module de trois miRNAs qui sont uniformément downregulated dans les tumeurs cérébrales, qui sont co-exprimées spécifiquement pendant la différenciation neuronale (figure 1) et impliquées dans la réponse de survie de tumeur après thérapie (Figure 2). Ceci est accompli en régulant une voie répressive oncogène complexe de chromatine. Ce modèle de coexpression suggérait une forte activité synergique parmi ces trois miRNAs (Figure 3). Par conséquent, profitant de la petite taille et de la biogenèse simple des miARN, la deuxième partie de ce protocole a été utilisée pour concevoir un transgène (Figure 4) qui pourrait récapituler simultanément l'expression des trois miARN dans les cellules du glioblastome, à la fois in vitro et in vivo, avec des interférences significatives dans la biologie tumorale et l'applicabilité translationnelle prometteuse (Figure 5A,B,C)10. En outre, il a été démontré que le groupe transgénique est également fonctionnel dans un modèle de cancer du sein (Figure 5D, E).
Figure 1 : Caractérisation d'un module miARN fonctionnel dans le glioblastome. (A) Parcelle volcanique représentant les miARN exprimés différemment dans des échantillons de glioblastome humain (n 516) par rapport au cerveau normal (n - 10) obtenus à partir de TCGA. En vert sont miRNAs avec la différence de 4 fois. Le cercle rouge représente les 10 miARN les plus significativement downregulated dans le glioblastoma. (B) Expression relative des 10 miARN sélectionnés dans (A) lors de l'induction de différentes voies de différenciation dans les cellules souches neurales, montrant une régulation claire des modules miR-124, miR-128 et miR-137 lors de l'induction de la différenciation neuronale. Moyenne - DD à partir de trois répliques biologiques (p 'lt; 0.05; 'p 'lt; 0.01; 'p 'lt; '0.001; 'p 'lt; 'lt; 0.0001; T-test de l'étudiant, à deux queues). Ce chiffre a été modifié avec la permission de la référence10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Confirmation des modèles de coexpression des modules miRNA pendant le stress génotoxique. Expression relative des trois miARN définis dans la figure 1 dans les cellules et les lignées cellulaires multiples de glioblastoma (G62-mesenchymal ; MGG4-proneural; U251, U87 pro-neural-like, et T98G mesenchymal-comme les lignées cellulaires de glioblastoma) après induction de la résistance au temozolomide (TMZ, barres roses) ou rayonnement ionisant (RT, barres vertes). Rapportés sont des moyens avec SD à partir de deux répliques indépendantes. Ce chiffre a été modifié avec la permission de la référence10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse de la convergence fonctionnelle des targetomes des miARN co-exprimés. Sortie de diagramme de Venn du site Web de bioinformatique et de génomique évolutionnaire, croisant simultanément le targetome des miARN étiquetés avec les ARNm constituant une catégorie d'intérêt GO (dans ce cas, les répresseurs de chromatine). Les ARNm uniquement ciblés par des miARN uniques ont été choisis pour d'autres études fonctionnelles en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Structure 2D d'une séquence de miARN conçue codant les trois amarnades cluster. Sortie graphique du programme RNAweb Fold. Notez la présence de trois structures de boucle de tige bien définies qui représentent les épingles à cheveux de chaque miRNA respectif (miR-124, miR-128, miR-137) codées par le transgène. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Preuve du traitement des transgènes et de son effet biologique en aval. (A) Quantification relative de l'expression miRNA après transduction médiée par lentiviral des cellules de glioblastome de G34 avec le cluster transgénique de miRNA (cluster 3) ou le contrôle négatif (ctrl). Les moyens rapportés sont des moyens de trois expériences indépendantes - SD. (B) Fluorescence microscope images de g34 glioblastoma sphères exprimant transgène de contrôle négatif vs Cluster 3 transgène. Barre d'échelle de 100 m. (C) Croissance in vivo des xénogreffes humaines intracrâniennes de cellules G34 exprimant le contrôle ou le cluster 3 transgènes. Barre d'échelle de 1 mm. Ce chiffre a été reproduit avec la permission10. (D) Quantification relative de l'expression miRNA après transduction médiée par lentiviral des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 avec le cluster transgénique de miRNA (cluster 3) ou le contrôle négatif (ctrl). (E) Images de microscope de fluorescence des cellules de cancer du sein de MDA-MB-231 exprimant le transgène négatif de commande contre le transgène de groupe 3. Barre d'échelle de 100 m. Toutes les expériences ont été réalisées dans des tripliques (p 'lt; 0.05; 'p 'lt; 0.01; Comparaisons multiples à deux queues de l'élève). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Flux de travail TargetScan. (A) Capture d'écran de la page d'accueil, montrant les options de sélection pour la recherche miRNA. (B) Résultats de recherche représentatifs pour miR-137. La liste des gènes cibles se trouve dans la colonne de gauche. La boîte rouge désigne les gènes avec des sites de ciblage conservés (suggérant une plus grande confiance dans le ciblage réel). Veuillez cliquer ici pour voir ce chiffre. (Clic droit pour télécharger.)
Figure supplémentaire 2 : Flux de travail ToppGene Suite. (A) Capture d'écran de la page d'accueil montrant la boîte de recherche où la liste des gènes à analyser est insérée. (B) Résultat de recherche représentatif pour le cible miR-137, montrant les catégories de Génologie (GO) les plus statistiquement significatives. Veuillez cliquer ici pour voir ce chiffre. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Ce protocole est basé sur l'idée que plutôt que de fonctionner isolément, les miARN sont biologiquement pertinents en travaillant en groupes, et ces groupes sont transcriptionnellement déterminés par des contextes cellulaires spécifiques26. Pour justifier cette approche d'un point de vue translationnel, un protocole de suivi qui permet de recréper ce modèle multi-miRNA dans les cellules/tissus est introduit. Ceci est possible en profitant de la biogenèse relativement simple des miRNAs, par qui la reconnaissance de l'épingle à cheveux miRNA caractéristique par microprocesseur est nécessaire et suffisante pour le traitement correct miRNA27. Dans le même temps, cette exigence minimale permet l'utilisation de l'échafaudage génétique des amas naturels de miRNA comme colonne vertébrale pour l'expression des modules miRNA désirés, qui sont contenus dans de courtes séquences d'ADN qui peuvent être installés dans tous les vecteurs de livraison de prédilection. La principale exigence de ce protocole est de maintenir la structure de l'épingle à cheveux et la longueur suffisante de la composante de la tige pour permettre un clivage approprié.
Il y a deux considérations critiques majeures concernant l'exécution de ce protocole. Le premier point est la détermination précise des combinaisons optimales de miRNA. Ceci est déterminé par une analyse minutieuse non seulement de la signature d'expression miRNA des cellules ou des tissus par rapport aux contrôles, mais aussi de tous les changements d'expression simultanés observés que les cellules sont expérimentalement manipulées. Une fois qu'un ensemble de miRNAs est défini, il est également fondamental de s'assurer que la modulation artificielle de chacun ne modifie pas singulièrement l'expression des autres.
Le deuxième aspect critique concerne la construction de séquences chimériques pour récapituler artificiellement ce clustering fonctionnel de miRNA. Il est fondamental de respecter les exigences structurelles de la machinerie de traitement miRNA, qui est la présence d'une séquence de tige assez longue (mesurant au moins 11 nucléotides) à l'origine de chaque épingle à cheveux miRNA18, ainsi que le maintien de l'original séquences d'espacement de l'échafaudage indigène de cluster de miRNA. D'après notre expérience, le fait de satisfaire à ces deux exigences a toujours donné lieu à un pliage approprié de l'ARN (figure 4) et a donné lieu à une expression multi-miRNA réussie.
La principale limitation de cette technique est le nombre fini de miARN qui peuvent être regroupés en un transgène fonctionnel. Nous avons réussi à concevoir des séquences surexprimant jusqu'à six miRNAs différents, mais observé une certaine diminution de l'efficacité de traitement que le nombre d'épingles à cheveux augmente. Jusqu'à présent, la structure génétique de l'amas miR-17-92 a été utilisée, parce que c'est celle qui code le plus grand nombre d'épingles à cheveux (six) dans la séquence d'ADN la plus courte (800 paires de base)8. Comme il existe d'autres amas naturels de miRNA, on s'attend à ce qu'ils puissent également être utilisés à cette fin28. Enfin, il a été observé que la modification des séquences d'espacement entre les enpinets diminue leur traitement, il ya donc quelques contraintes quant à la mesure dans laquelle la structure native peut être modifiée.
L'aspect le plus significatif et le plus avantageux de cette méthode proposée est qu'elle permet l'ingénierie des transgènes capables de surexprimer simultanément plusieurs miARN désirés principalement en utilisant une approche in silico, limitant la nécessité de fastidieux et étapes de clonage moléculaire chronophage, comme décrit précédemment29,30,31. Le protocole décrit est facile à exécuter et ne nécessite pas d'équipement ou de compétences spécialisés.
Compte tenu de l'importance reconnue des miARN en biologie moléculaire et de leur potentiel dans les applications thérapeutiques, ce protocole intéresse un large public de chercheurs. Cette approche devrait encourager les études futures qui se concentrent sur les propriétés combinatoires des miARN et servira d'outil simple et robuste pour leur exécution. Plus important encore, ces transgènes groupés représentent des cargaisons idéales pour les vecteurs de thérapie génique. Des preuves de la livraison in vivo réussie d'un groupe de 3-miRNA ont déjà été obtenues par l'injection intratumorale directe des vecteurs d'AAV (données non publiées). On s'attend donc à ce que cette technique stimule considérablement les aspects translationnels de la recherche sur le miARN.
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Disclosures
Les auteurs ne signalent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les membres du Laboratoire de neuro-oncologie Harvey Cushing pour leur soutien et leurs critiques constructives. Ce travail a été soutenu par les subventions NINDS K12NS80223 et K08NS101091 à P. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
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