Summary
Beskrevet her er en protokoll for karakteriserer moduler av biologisk synergi miRNAs og deres forsamling i korte transgenes, som tillater samtidig overuttrykte for genterapi applikasjoner.
Abstract
Den biologiske relevansen av microRNAs (miRNAs) i helse og sykdom er avhengig av bestemte kombinasjoner av mange samtidig deregulerte miRNAs snarere enn handlingen av en enkelt miRNA. Karakterisering av disse spesifikke miRNAs modulene er et grunnleggende skritt for å maksimere deres bruk i terapi. Dette er svært relevant fordi deres Kombinatorisk attributter kan være praktisk utnyttet. Beskrevet her er en metode for å definere en bestemt miRNA signatur relevant for kontroll av kreftfremkallende kromatin repressors i glioblastom. Tilnærmingen definerer først en generell gruppe av miRNAs som er deregulerte i svulster i forhold til normalt vev. Analysen er videreutviklet av differensial kultur forhold, understreker en undergruppe av miRNAs som er co-uttrykt samtidig under bestemte mobilnettet stater. Til slutt, den miRNAs som tilfredsstiller disse filtrene er kombinert i en kunstig polycistronic transgenes, som er basert på et stillas av naturlig eksisterende miRNA klynger gener, deretter brukes til overuttrykte av disse miRNA modulene til å motta celler.
Introduction
miRNAs tilbyr en enestående mulighet for utvikling av et bredt genterapi tilnærming til mange sykdommer1,2,3, inkludert kreft4,5. Dette er basert på flere unike funksjoner av disse biologiske molekyler, inkludert deres lille størrelse6, Simple kognitiv7, og naturlig tendens til å fungere i foreningen8. Mange sykdommer er preget av spesifikke miRNA uttrykk mønstre, som ofte sammenfaller med regulering av komplekse biologiske funksjoner9. Formålet med denne metoden er først å definere en strategi for å identifisere grupper av miRNAs som er synergi relevante for bestemte cellulære funksjoner. Følgelig gir det en strategi for re-etablering av slike miRNA kombinasjoner i nedstrøms studier og applikasjoner.
Denne metoden gjør det mulig for funksjonell analyse av flere miRNAs samtidig, utnytte på deres samtidige målretting av et stort antall mRNAs, og dermed recapitulating komplekse landskap av sykdommer. Denne tilnærmingen har nylig vært ansatt for å definere en gruppe på tre miRNAs at 1) er samtidig downregulated i hjernen kreft og 2) viser en sterk co-uttrykk mønster under neural differensiering så vel som i respons til gentoksisk stress ved stråling eller en DNA alkylating agent. Den Kombinatorisk re-uttrykk for denne modulen av tre miRNAs av Clustering metoden beskrevet nedenfor resulterer i dyp interferens med biologi av kreftceller og kan lett brukes som en genterapi strategi for prekliniske studier10. Denne protokollen kan være av spesiell interesse for de som er involvert i miRNA forskning og dens translational applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. karakterisering av funksjonelt Associated miRNAs i glioblastom
- Analyse av bred differensial miRNA uttrykk i glioblastom g. hjernen
- Først bestemme de mest betydelig deregulerte miRNAs i svulsten. Dette kan oppnås ved hjelp av minst tre forskjellige metoder:
- Mine kreft Genova Atlas, funnet på https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, for sekvensering data11.
- Utfør Microarray analyse fra en fersk operativ prøve12.
- Bruk tidligere publiserte datasett13.
Merk: Uansett hvilken metode som er valgt, gir utdataene en bulk sett med miRNAs hvis uttrykk er statistisk korrelert (enten direkte eller omvendt) med tumor biologi. Denne første gruppen utgjør bassenget av miRNAs som er videre analysert for identifisering av en undergruppe av miRNAs viser de strengeste funksjonelle foreningen ved å utføre en mer dynamisk analyse av uttrykket endringer, som omtalt nedenfor.
- Først bestemme de mest betydelig deregulerte miRNAs i svulsten. Dette kan oppnås ved hjelp av minst tre forskjellige metoder:
- Tilstands spesifikt uttrykk analyse av miRNA
- Induksjon av celle differensiering:
- Bruk pre-belagt Poly-D-lysin (PDL) plast retter å favorisere dannelsen av en monolag kultur. For oppvask belegg, oppløse PDL i vann ved en konsentrasjon av 100 μg/mL. Bruk 1 mL oppløsning per 25 cm2 overflate. Skyll 2x med PBS 6 h etter påføring av PDL.
- Plate menneskelige nevrale stamceller i like mengder (100 000 celler/5 mL) enten i Stamcelle medium (neurobasal medium + B27 supplement + 20 ng/mL EGF/FGF), astrocytic differensiering medium (DMEM + 10% FBS), eller neuronal differensiering medium (neurobasal medium + B27 supplement, + 2 μM retinoic syre)14. Protokollen for oligodendrocyte differensiering krever tillegg av IGF-1 (200 ng/ml) etter EGF/FGF fjerning14,15.
- Etter celle plating, plasser i inkubator i 1 uke ved 37 ° c, 5% CO2.
- RNA-ekstraksjon:
- Etter 7 dager, fjerne cellene fra inkubator og fjerne mediet.
- Vask cellene med PBS (5 mL). Tilsett deretter 1 mL lyse Rings reagens (se tabell over materialer) for å lyse cellene og skrape cellene i 1,5 ml microfuge tube ved hjelp av en celle skraper. Oppbevar rørene som inneholder de lysert cellene ved romtemperatur (RT) i 5 min.
- Fortsett til total RNA-isolering etter produsentens anvisninger.
- miRNA uttrykk analyse:
- Kvantifisere differensial uttrykk for bestemte miRNAs identifisert i trinn 1,1 blant de tre differensiering mønstre av sanntids PCR, ved hjelp av TaqMan sonder og følge produsentens protokoller for omvendt transkripsjon og PCR forsterkning ( Figur 1).
- Induksjon av celle differensiering:
- Validering av miRNA klynger av stress-spesifikke utfordringer
- Kultur G34 glioblastom stilk-lignende celler i neurobasal medium + B27 supplement + 20 ng/mL EGF/FGF. Start med 1 x 106 celler i 5 ml i en 25 cm2 lav Vedleggs kolbe.
- Starter 48 h etter plating, legge dobling konsentrasjoner av DNA alkylating agent temozolomid (TMZ) hver 5 dager, som følger:
- Start med 5 μM i 5 dager. Etter 5 dager, Fjern mediet og Erstatt med friskt medium uten temozolomid, slik at de overlevende cellene kan gjenopprettes. Etter 48 h, tilsett 10 μM TMZ og ruge for ytterligere 5 dager.
- Gjenta trinn 1.3.2.1, dobling TMZ konsentrasjon hver gang, inntil en konsentrasjon på minst 100 μM er nådd og celler blir resistente mot stoffet10.
- I et parallelt eksperiment, irradiate G34 celler som følger:
- Starter 48 h etter plating 1 x 106 celler i 5 ml i en 25 cm2 lav vedlegg kolbe, irradiate celler med 2 gy energi (noen irradiator gi Foton utslipp er akseptabelt). Returner cellene til inkubator og ikke forstyrr. Etter 48 h, irradiate cellene igjen med ytterligere 2 gy energi.
- Gjenta trinn 1.3.3.1 4X til totalt 10 gy av energi administreres.
- Returner cellene til inkubator og la dem gjenopprette i friskt medium i minst 5 dager før nedstrøms analyse.
- Etter induksjon av motstanden, lyse celler ved hjelp av lyse reagens og trekke ut total RNA i henhold til produsentens protokoll.
- Analyser uttrykket for de spesifikke miRNAs som er identifisert i avsnitt 1.1-1.2 som beskrevet i trinn 1.2.1 (figur 2).
- Karakterisering av funksjonell konvergens av gruppert miRNAs
- Skaff spådde targetome av hver miRNAs definert i seksjoner 1.2-1.3 innhentet ved hjelp av miRNA målretting prediksjon verktøy.
Merk: Vi vanligvis ty til TargetScan, som sin algoritme er periodisk oppdatert16. Ytterligere prediksjon verktøy er miRanda17, miRDB18, og DIANA-miRPath19. Alle disse programmene er gratis, web-baserte applikasjoner.- Fra forsiden av Targetscan, Velg den miRNA av interesse fra den forhåndsutfylte rullegardinmenyen. Klikk Send -knappen.
- Last ned den resulterende listen over mål som et regneark ved hjelp av koblingen Last ned tabell (supplerende figur 1).
- For å redusere sjansene for falske positive spådommer, ta bare med mål i den bevarte områder kolonnen i nedstrøms analyser. Også ytterligere stringens kan fås ved hjelp av ekstra miRNA prediksjon programmer (se ovenfor) og bare inkludert mål som er felles for alle algoritmer.
- Klassifisere den resulterende targetomes i henhold til Gene ontologi kategorier ved hjelp ToppGene Suite20 å evaluere for berikelse av stier som er felles for hver miRNA.
- Lim inn listen over mål som er Hentet fra trinn 1.4.1 i vinduet "trenings gen sett", med HGNC-symbol som oppføringstype. Klikk på Submit > Start. Programmet vil gi en utleverings tabell som viser de mest betydningsfulle "Go" kategorier for den oppgitte listen av gener (supplerende figur 2).
- Til slutt etablere bidraget av hver miRNA til regulering av en felles vei eller cellulær prosess (i dette tilfellet, kromatin regulering), sjekk hver targetome innhentet i trinn 1.4.1 mot den fullstendige listen over gener som er involvert i den spesifikke cellulære prosessen ( dvs., kromatin regulering), ved hjelp av venn diagram funksjon i bioinformatikk og evolusjonære Genomics nettsted http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
Merk: Dette programmet gjør at skjæringspunktet mellom flere grupper samtidig (Figur 3). Den spesifikke unike mål gitt av hver miRNA er deretter kommentert og valgt for nedstrøms funksjonelle eksperimenter.- På forsiden av programmet, laste opp eller kopiere/lime inn listen hvis målet mRNAs for hver miRNA eller interesse i de respektive vinduene. Navngi hver liste med en unik identifikator.
- Klikk på submit. Programmet vil gi et visuelt resultat av et venn diagram med antall gener i hver sektor, samt en fullstendig liste over mRNAs for hvert delsett og skjæringspunkt kombinasjoner.
- Skaff spådde targetome av hver miRNAs definert i seksjoner 1.2-1.3 innhentet ved hjelp av miRNA målretting prediksjon verktøy.
2. montering av miRNA moduler i en Polycistronic transgene Cluster
-
Fremstilling av transgene stillas basert på miR-17-92 klynge knutepunkt
- Skaff nukleotid sekvensen av miR-17-92 klyngen fra Ensembl Genova nettleseren21. Velg ~ 800 base pair "core" sekvens som omfatter alle seks kodede miRNA pinner av geometriske og minst 200-nukleotid flankerer sekvenser både oppstrøms (5 ') og nedstrøms (3 ') av kjernen sekvensen.
- Lim inn sekvensen ovenfor i et hvilket som helst redigeringsprogram for ord.
- Definer sekvensen av hver enkelt av de seks innfødte hårnålene ved å hente dem i miRBase22. Merk hver enkelt av disse sekvensene i løpet av den tidligere identifiserte "kjerne" sekvensen. Alle sekvenser mellom hver av de store hæler representerer avstands sekvenser, som er viktige for riktig behandling av transgene.
- Fjern de innfødte hår sekvensene fra "kjerne" sekvensen, med unntak av 3-5 nukleotider på både 5 ' og 3 ' endene av hver hår, som vil tjene som en Acceptor for de nye nålene.
-
Bygge en ny transgene koding flere miRNAs av valget
- Skaff deg miRNAs sekvenser som skal overexpressed i transgene fra miRBase. Nøye oppmerksom på de spesifikke nukleotider som er områder av mikroprosessor kløft.
- Erstatt de fjernede hårnålene (trinn 2.1.4) med den hæler sekvenser av ønsket miRNAs innhentet i trinn 2.2.1.
- Legg ønsket begrensning sekvenser på begge flankerer områder av transgene for å lette subcloning i levering vektorer av valget. Kontroller at de valgte Begrensnings sekvensene ikke finnes i selve sekvensen.
- For negative kontroller, bruk 20-nukleotid krypterte sekvenser til å erstatte den naturlige 20-nukleotid sekvens av hver modne miRNA. Generer disse krypterte sekvensene ved hjelp av et nettbasert verktøy, for eksempel https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
Verifisere den todimensjonale strukturen til transgene
- Kopier hele transgene sekvensen inn i RNA strukturen prediksjon programmet RNAweb fold23.
- Velg Fortsetthvis du bruker standardprogram innstillinger.
- Analysere den grafiske produksjonen, spesielt for tilstedeværelsen av veldefinerte pinner og tilstedeværelse av dobbel-strandet stilk strukturer minst 11 nukleotider proksimale til mikroprosessor kløften området. Også se etter fravær av forgrening poeng innenfor hæler sekvenser (Figur 4).
3. innhenting Transgenes av DNA-syntese
- Etter design og i silisiummangan validering av chimeric miRNA klyngen, få arbeider sekvensen ved hjelp av DNA-syntese fra kommersielle leverandører24 og fortsette med nedstrøms kloning i vektorer og transgene levering. Vi har brukt lentiviral vektorer for in vitro levering10 og adeno-assosiert virus (AAVs) for in vivo intrakraniell levering25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden tillot karakterisering av en modul av tre miRNAs som er gjennomgående downregulated i hjernesvulster, som er co-uttrykt spesielt under neuronal differensiering (figur 1) og involvert i tumor overlevelse respons etter behandling (figur 2). Dette oppnås ved å regulere en kompleks kreftfremkallende kromatin undertrykkende sti. Dette co-Expression mønster foreslo en sterk synergi aktivitet blant disse tre miRNAs (Figur 3). Følgelig utnytter den lille størrelsen og enkel kognitiv av miRNAs, den andre delen av denne protokollen ble brukt til å designe en transgene (Figur 4) som kan samtidig recapitulate uttrykk for de tre miRNAs i glioblastom celler, både in vitro og in vivo, med betydelig innblanding i tumor biologi og lovende translational anvendelighet (figur 5A, B, C)10. I tillegg ble det demonstrert at transgene-klyngen også er funksjonell i en brystkreft modell (figur 5D, E).
Figur 1: karakterisering av en funksjonell miRNA modul i glioblastom. (A) vulkan tomten som representerer Differensielt uttrykt miRNAs i Human glioblastom prøver (n = 516) vs. normal hjernen (n = 10) HENTET fra TCGA. I grønt er miRNAs med > 4-fold forskjell. Den røde sirkelen representerer de 10 mest signifikant downregulated miRNAs i glioblastom. (B) relative uttrykk for de 10 miRNAs valgt i (A) under induksjon av ulike differensiering trasé i nevrale stamceller, viser klare oppregulering av mir-124, mir-128, og miR-137 moduler under induksjon av nevrale differensiering. Gjennomsnittlig ± SD fra tre biologiske replikerer (* p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001; Student t-test, tosidig). Dette tallet er endret med tillatelse fra referanse10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bekreftelse på co-Expression mønstre av miRNA moduler under gentoksisk stress. Relativ uttrykk for de tre miRNAs som er definert i figur 1 i flere glioblastom celler og cellelinjer (G62-mesenchymal; MGG4-proneural; U251, U87 Pro-neural-like, og T98G mesenchymal-lignende glioblastom cellelinjer) etter induksjon av resistens mot temozolomid (TMZ, rosa barer) eller ioniserende stråling (RT, grønne barer). Rapportert er midler med SD fra to uavhengige replikerer. Dette tallet er endret med tillatelse fra referanse10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyse av funksjonell konvergens av targetomes av co-uttrykt miRNAs. Venn diagram output fra bioinformatikk og evolusjonære Genomics nettsted, samtidig krysse targetome av merket miRNAs med mRNAs utgjør en GO kategori av interesse (i dette tilfellet, kromatin repressors). mRNAs unikt målrettet av enkelt miRNAs ble valgt for ytterligere nedstrøms funksjonelle studier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:2D struktur av en konstruert miRNA sekvens koding de tre miRNAs klyngen. Grafisk output fra RNAweb fold programmet. Merk tilstedeværelsen av tre godt definerte Stem-loop strukturer som representerer hårnålene til hver respektive miRNA (miR-124, miR-128, miR-137) kodet av transgene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bevis på transgene behandling og dens nedstrøms biologiske effekt. (A) relativ kvantifisering av miRNA uttrykk etter lentiviral-mediert Transduction av G34 glioblastom celler med transgene miRNA klyngen (Cluster 3) eller negativ kontroll (Ctrl). Rapportert er midler fra tre uavhengige eksperimenter ± SD. (B) fluorescens mikroskop bilder av G34 glioblastom kuler uttrykker negativ kontroll transgene g. Cluster 3 transgene. Scale bar = 100 μm. (C) in vivo vekst av intrakraniell menneskelige G34 celle xenotransplantater uttrykker enten kontroll eller Cluster 3 transgenes. Skala bar = 1 mm. Dette tallet er gjengitt med tillatelse10. (D) relative kvantifisering av miRNA uttrykk etter lentiviral-mediert TRANSDUCTION av MDA-MB-231 brystkreftceller med transgene miRNA klyngen (Cluster 3) eller negativ kontroll (Ctrl). (E) fluorescens mikroskop bilder av MDA-MB-231 brystkreftceller uttrykker negativ kontroll transgene g. Cluster 3 transgene. Scale bar = 100 μm. Alle eksperimenter ble utført i triplicates (* p < 0,05; * * p < 0,01; Student t-test, tosidig, flere sammenligninger). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: TargetScan arbeidsflyt. (A) startside skjermbilde, som viser valgmuligheter for miRNA søk. (B) representative søkeresultater for miR-137. Liste over mål gener er i venstre kolonne. Rød boks betegner gener med bevarte målrettings sider (noe som tyder på høyere tillit til reell målretting). Vennligst klikk her for å se dette tallet. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende figur 2: ToppGene Suite arbeidsflyt. (A) startside skjermbilde som viser søkeboksen der listen over gener som skal analyseres settes inn. (B) representativt søkeresultat for miR-137-targetome, som viser de mest statistisk signifikante Gene ONTOLOGI (Go)-kategoriene. Vennligst klikk her for å se dette tallet. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er basert på forestillingen om at i stedet for å fungere isolert, miRNAs er biologisk relevant ved å arbeide i grupper, og disse gruppene er transcriptionally bestemmes av bestemte cellulære sammenhenger26. For å rettferdiggjøre denne tilnærmingen fra en translational perspektiv, en oppfølging protokoll som gjør at rekreasjon av denne multi-miRNA mønster i celler/vev er innført. Dette er mulig ved å dra nytte av den relativt enkle kognitiv av miRNAs, der anerkjennelse av de karakteristiske miRNA-hæler av mikroprosessor er nødvendig og tilstrekkelig for riktig miRNA prosessering27. Samtidig, dette minimale kravet tillater bruk av genetisk stillas av naturlig forekommende miRNA klynger som en ryggrad for uttrykk for ønsket miRNA moduler, som finnes i korte DNA-sekvenser som kan monteres i noen levering vektorer valgfrihet. De viktigste kravene i denne protokollen er å opprettholde den hæler struktur og tilstrekkelig lengde av stammen komponent for å tillate passende kløft.
Det er to viktige viktige betraktninger om gjennomføringen av denne protokollen. Det første punktet er nøyaktig bestemmelse av de optimale miRNA kombinasjoner. Dette bestemmes av nøye analyse av ikke bare miRNA uttrykk signatur av celler eller vev i forhold til kontroller, men også av eventuelle samtidige uttrykk endringer observert som cellene er eksperimentelt manipulert. Når et sett med miRNAs er definert, er det også grunnleggende å konstatere at kunstig modulering av hver særdeles ikke endrer uttrykk for de andre.
Den andre kritiske aspektet gjelder byggingen av chimeric sekvenser til kunstig recapitulate denne funksjonelle miRNA Clustering. Det er grunnleggende å overholde de strukturelle kravene i miRNA prosessering maskiner, som er tilstedeværelsen av en lang nok stilk sekvens (måle minst 11 nukleotider) på opprinnelsen til hver miRNA hår hår18, samt vedlikehold av originale mellomrom sekvenser av Native miRNA klyngen stillaset. I vår erfaring, oppfyller disse to kravene har konsekvent gitt riktig RNA folding (Figur 4) og resulterte i vellykket multi-miRNA uttrykk.
Den store begrensningen av denne teknikken er det endelige antallet miRNAs som kan grupperes sammen til en funksjonell transgene. Vi har med hell konstruert sekvenser overexpressing opp til seks forskjellige miRNAs men observert noen nedgang i behandlingen effektivitet som antall pinner øker. Så langt har den genetiske strukturen til miR-17-92-klyngen blitt brukt, fordi det er den som har flest hæler (6) innenfor korteste DNA-sekvens (~ 800 base par)8. Ettersom det er andre naturlige miRNA klynger, er det forventet at de også kunne brukes til dette formålet28. Til slutt, det har blitt observert at modifisering av avstand sekvenser blant de hæler minsker deres behandling, så det er noen begrensninger i forhold til hvilken grad den opprinnelige strukturen kan endres.
De fleste betydelig og fordelaktig aspektet av denne foreslo metoden er det alt den innrømmer det ingeniørvitenskap av transgenes det er kjøpedyktig samtidig overekspresjon mangfoldig ønsket miRNAs hovedsakelig benytter en inne silisiummangan adgang, begrenser behovet for kjedelig og tidkrevende molekylær kloning trinn, som tidligere beskrevet29,30,31. Protokollen beskrevet er enkel å utføre og krever ikke spesialisert utstyr eller ferdigheter.
I betraktning av den anerkjente betydningen av miRNAs i molekylærbiologi og deres potensial i terapeutiske anvendelser, denne protokollen er av interesse for et stort publikum av forskere. Denne tilnærmingen er forventet å oppmuntre til fremtidige studier som fokuserer på Kombinatorisk egenskapene til miRNAs og vil tjene som et enkelt og robust verktøy for utførelsen. Enda viktigere er disse klynger transgenes representerer ideelle cargos for genterapi vektorer. Bevis for vellykket in vivo levering av en 3-miRNA klyngen har allerede blitt innhentet via direkte intratumoral intrakraniell injeksjon av AAV vektorer (upubliserte data). Det er derfor forventet at denne teknikken vil betydelig øke translational aspekter av miRNA forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke medlemmene av Harvey Cushings Nevro onkologi Laboratory for støtte og konstruktiv kritikk. Dette arbeidet ble støttet av NINDS tilskudd K12NS80223 og K08NS101091 til P. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
