Summary
Beskrevet her er en protokol til karakterisering af moduler af biologisk synergistisk miRNAs og deres samling i korte transgener, som muliggør samtidig overekspression til genterapi applikationer.
Abstract
Den biologiske relevans af microRNAs (miRNAs) i sundhed og sygdom betydeligt afhængig af specifikke kombinationer af mange samtidig dereguleret miRNAs snarere end virkningen af en enkelt miRNA. Karakteriseringen af disse specifikke miRNAs moduler er et grundlæggende skridt i at maksimere deres anvendelse i terapi. Dette er yderst relevant, fordi deres kombinatoriske egenskaber kan udnyttes i praksis. Beskrevet her er en metode til at definere en specifik miRNA-signatur, der er relevant for kontrol af onkogene kromatin-repressorer i glioblastoma. Tilgangen definerer først en generel gruppe af miRNAs, der dereguleres i tumorer i forhold til normalt væv. Analysen er yderligere raffineret af differentiale dyrkningsbetingelser, understrege en under gruppe af miRNAs, der er co-udtrykkes samtidigt i specifikke cellulære stater. Endelig er de miRNAs, der opfylder disse filtre, kombineret i en kunstig polycistronic Trans Genes, som er baseret på et stillads af naturligt eksisterende miRNA klynger gener, derefter bruges til overekspression af disse miRNA moduler til at modtage celler.
Introduction
Mirnas tilbyder en uovertruffen mulighed for udvikling af en bred genterapi tilgang til mange sygdomme1,2,3, herunder kræft4,5. Dette er baseret på flere unikke funktioner i disse biologiske molekyler, herunder deres lille størrelse6, simple Biogenese7, og naturlige tendens til at fungere i Association8. Mange sygdomme er karakteriseret ved specifikke miRNA udtryk mønstre, som ofte konvergerer om reguleringen af komplekse biologiske funktioner9. Formålet med denne metode er først at definere en strategi for at identificere grupper af miRNAs, der er synergistisk relevante for specifikke cellulære funktioner. Den indeholder derfor en strategi for genetablering af sådanne miRNA-kombinationer i downstream-undersøgelser og-anvendelser.
Denne metode giver mulighed for funktionel analyse af flere miRNAs på én gang, gearing på deres samtidige målretning af et stort antal mRNAs, og dermed rekapitulere komplekse landskaber af sygdomme. Denne tilgang er for nylig blevet anvendt til at definere en gruppe af tre miRNAs, at 1) er samtidig nedreguleret i hjernen kræft og 2) viser et stærkt Co-Expression mønster under neurale differentiering samt som reaktion på genotoksisk stress ved stråling eller en DNA-alkylerende middel. Det kombinatoriske genekspression af dette modul med tre miRNAs ved hjælp af klynge metoden beskrevet nedenfor resulterer i dybtgående interferens med kræftcellernes biologi og kan let bruges som en genterapi-strategi for prækliniske studier10. Denne protokol kan være af særlig interesse for dem, der er involveret i miRNA-forskningen og dens translationelle anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. karakterisering af funktionelt associerede miRNAs i glioblastoma
- Analyse af bredt differens-miRNA-udtryk i glioblastoma vs. hjernen
- Først bestemme de mest markant dereguleret miRNAs i tumoren. Dette kan opnås ved hjælp af mindst tre forskellige metoder:
- Mine Cancer Genome Atlas, fundet på https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, til sekvensering af data11.
- Udfør mikroarray analyse fra en frisk operativ prøve12.
- Brug tidligere udgivne datasæt13.
Bemærk: Uanset hvilken metode der vælges, giver outputtet et bulk sæt af miRNAs, hvis udtryk er statistisk korreleret (enten direkte eller omvendt) med tumor biologi. Denne første gruppe udgør puljen af miRNAs, der analyseres yderligere med henblik på identifikation af en delmængde af miRNAs, som viser den strengeste funktionelle sammenslutning ved at udføre en mere dynamisk analyse af udtryks ændringer, som beskrevet nedenfor.
- Først bestemme de mest markant dereguleret miRNAs i tumoren. Dette kan opnås ved hjælp af mindst tre forskellige metoder:
- Tilstands specifik analyse af miRNA-udtryk
- Induktion af Celledifferentiering:
- Brug pre-coated poly-D-lysin (PDL) plastik retter til fordel for dannelsen af en enkeltlags kultur. Til skål belægning opløses PDL i vand i en koncentration på 100 μg/mL. Brug 1 mL opløsning pr. 25 cm2 overflade. Skyl 2x med PBS 6 h efter påføring af PDL-opløsningen.
- Plade humane neurale stamceller i lige store mængder (100.000 celler/5 mL) enten i stamcelle medium (neurobasal medium + B27 supplement + 20 ng/mL EGF/FGF), astrocytisk differentiering medium (DMEM + 10% FBS), eller neuronal differentiering medium (neurobasal medium + B27 tillæg, + 2 μM retinsyre)14. Protokollen for oligodendrocyte differentiering kræver tilsætning af IGF-1 (200 ng/ml) efter EGF/FGF fjernelse14,15.
- Efter celle plating, sted i inkubator i 1 uge ved 37 °C, 5% CO2.
- RNA-ekstraktion:
- Efter 7 dage, fjerne cellerne fra inkubator og fjerne mediet.
- Cellerne vaskes med PBS (5 mL). Tilsæt derefter 1 mL lysis-reagens (Se tabel over materialer) for at lyse cellerne og skrabe cellerne i 1,5 ml mikrofuge slange ved hjælp af en celle skraber. Opbevar rørene med de lyserede celler ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
- Fortsæt til total RNA-isolation efter producentens anvisninger.
- undersøgelse af miRNA-udtryk:
- Kvantificere differentialekspression af specifikke miRNAs identificeret i trin 1,1 blandt de tre differentierings mønstre ved real-time PCR, ved hjælp af TaqMan sonder og efter fabrikantens protokoller for reverse transkription og PCR amplifikation ( Figur 1).
- Induktion af Celledifferentiering:
- Validering af miRNA-klynger med stress-specifikke udfordringer
- Kultur G34 glioblastoma Stem-lignende celler i neurobasal medium + B27 supplement + 20 ng/mL EGF/FGF. Start med 1 x 106 celler i 5 ml i en 25 cm2 lav vedhæftnings kolbe.
- Start 48 h efter plating, tilsæt en fordobling af koncentrationen af DNA alkylerende middel temozolomid (TMZ) hver 5 dage som følger:
- Start med 5 μM i 5 dage. Efter 5 dage fjernes mediet og udskiftes med fersk medium uden temozolomid, så de overlevende celler kan komme sig. Efter 48 h tilsættes 10 μM TMZ og inkubates i yderligere 5 dage.
- Gentag trin 1.3.2.1, fordobler TMZ koncentrationen hver gang, indtil en koncentration på mindst 100 μM er nået, og cellerne bliver resistente over for lægemidlet10.
- I et parallelt eksperiment, stråle G34 celler som følger:
- Startende 48 h efter plating 1 x 106 celler i 5 ml i en 25 cm2 lav vedhæftnings kolbe, irradiat celler med 2 Gy energi (enhver bestrålings anlægs giver foton emission er acceptabel). Vend cellerne tilbage til inkubator og Forstyr ikke. Efter 48 h, bestråle cellerne igen med yderligere 2 Gy af energi.
- Gentag trin 1.3.3.1 4X indtil der administreres i alt 10 Gy energi.
- Vend cellerne tilbage til inkubator, og lad dem komme sig i frisk medium i mindst 5 dage før downstream-analysen.
- Efter induktion af resistens, lyse celler ved hjælp af lysis reagens og udtrække total RNA i henhold til producentens protokol.
- Analysér udtrykket for de specifikke miRNAs, der er identificeret i punkt 1.1-1.2 som beskrevet i trin 1.2.1 (figur 2).
- Karakterisering af den funktionelle konvergens af grupperet Mirnas
- Opnå den forventede targetome for hver miRNAs defineret i punkt 1.2-1.3 opnået ved hjælp af miRNA målrettet forudsigelse værktøjer.
Bemærk: Vi generelt ty til Target Scan, som dens algoritme er periodisk opdateret16. Yderligere forudsigelsesværktøjer er miRanda17, mirdb18og Diana-mirpath19. Alle disse programmer er gratis, web-baserede applikationer.- Fra forsiden af Targetscan, skal du vælge den miRNA af interesse fra den præ-befolket drop-down menu. Klik på knappen Send .
- Download den resulterende liste over mål som et regneark ved hjælp af Download tabellen link (supplerende figur 1).
- Hvis du vil mindske chancerne for falske positive forudsigelser, skal du kun medtage mål i kolonnen bevaret websteder i downstream-analyser. Yderligere strenghed kan også opnås ved hjælp af yderligere miRNA forudsigelse programmer (se ovenfor) og kun omfatter mål, der er fælles for alle algoritmer.
- Klassificer de resulterende targetomer i henhold til gene Ontology kategorier ved hjælp af ToppGene Suite20 til at evaluere for berigelse af veje, der er fælles for hver Mirna.
- Indsæt listen over mål, der er hentet fra trin 1.4.1 i vinduet "Training gen set", ved hjælp af HGNC-symbolet som indgangstype. Klik på send > Start. Programmet vil give en outputtabel, der viser de mest betydningsfulde "go" kategorier for den indtastede liste over gener (supplerende figur 2).
- Endelig at fastsætte bidraget fra hver miRNA til reguleringen af en fælles vej eller cellulære proces (i dette tilfælde, kromatin forordning), kontrollere hver targetome opnået i trin 1.4.1 mod den fulde liste over gener, der er involveret i den specifikke cellulære proces ( f. eks. kromatin-forordningen) ved hjælp af Venn-diagramfunktionen, der findes på webstedet for Bioinformatik og evolutionær Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
Bemærk: Dette program giver mulighed for skæringspunktet mellem flere grupper på samme tid (figur 3). De specifikke unikke mål, som hver miRNA får, er derefter kommenteret og udvalgt til efterfølgende funktionelle eksperimenter.- På forsiden af programmet, uploade eller kopiere/indsætte listen, hvis Target mRNAs for hver miRNA eller interesse i de respektive vinduer. Navngiv hver liste med et entydigt id.
- Klik på Send. Programmet vil give en visuel udgang af en Venn diagram med antallet af gener i hver sektor, samt en komplet liste over mRNAs for hver delmængde og skærings kombinationer.
- Opnå den forventede targetome for hver miRNAs defineret i punkt 1.2-1.3 opnået ved hjælp af miRNA målrettet forudsigelse værktøjer.
2. montering af miRNA-moduler i en Polycistronisk transgene klynge
-
Fremstilling af transgene stilladset baseret på miR-17-92 klynge locus
- Hent nucleotidsekvensen af miR-17-92-klyngen fra ensembl genom browser21. Vælg ~ 800 base pair "Core" sekvens omfatter alle seks kodede Mirna Hårnåle af Locus og mindst 200-nucleotid ledsage sekvenser både upstream (5 ') og downstream (3 ') af kernen sekvens.
- Indsæt sekvensen ovenfor i et Word-redigeringsprogram.
- Definer sekvensen af hver enkelt af de seks indfødte Hårnåle ved at hente dem i miRBase22. Marker hver enkelt af disse sekvenser inden for span af den tidligere identificerede "kerne" sekvens. Alle sekvenser mellem hver hårnål repræsenterer afstands sekvenser, som er vigtige for den korrekte behandling af transgenet.
- Fjern de indfødte Hårnåle sekvenser fra "Core" sekvensen, med undtagelse af 3-5 nukleotider ved både 5 ' og 3 ' enderne af hver hårnål, som vil fungere som en acceptor for de nye Hårnåle.
-
Opbygning af en ny transgene kodning flere miRNAs af valg
- Få Hårnåle sekvenser af miRNAs beregnet til at blive overudtrykt i transgenet fra miRBase. Bemærk omhyggeligt de specifikke nukleotider, der er stederne for mikroprocessor spaltning.
- Udskift de fjernede Hårnåle (trin 2.1.4) med Hårnåle sekvenserne for de ønskede miRNAs opnået i trin 2.2.1.
- Tilføj de ønskede begrænsnings sekvenser ved begge ledsage-områder af transgenet for at lette under kloning til valg af leverings vektorer. Kontroller, at de valgte begrænsnings sekvenser ikke findes i selve sekvensen.
- For negative kontroller, brug 20-nucleotid røræg sekvenser til at erstatte den naturlige 20-nucleotid sekvens af hver moden Mirna. Generer disse røræg sekvenser ved hjælp af et online værktøj som https://genscript.com/Tool/Create-scrambled-Sequence.
-
Kontrol af transgenens todimensionelle struktur
- Kopier den fulde transgene sekvens ind i RNA struktur forudsigelse softwareprogram RNAweb fold23.
- Klik på Fortsætved hjælp af standardprogramindstillinger.
- Analysere den grafiske output, især for tilstedeværelsen af veldefinerede Hårnåle og tilstedeværelsen af dobbelt-strandede Stam strukturer mindst 11 nukleotider proksimale til mikroprocessor spaltning site. Se også efter fraværet af forgrenings punkter i Hårnåle sekvenserne (figur 4).
3. opnåelse af transgener ved DNA-syntese
- Efter design og i silico validering af kimerisk Mirna klynge, få den arbejdssekvens ved hjælp af DNA-syntese fra kommercielle leverandører24 og gå videre med downstream kloning til vektorer og transgene levering. Vi har brugt lentiviral vektorer for in vitro levering10 og adeno-associerede vira (aavs) for in vivo intrakraniel levering25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode tillod karakterisering af et modul af tre miRNAs, der er konsekvent nedreguleret i hjernen tumorer, som er co-udtrykkes specifikt under neuronal differentiering (figur 1) og involveret i tumor overlevelse respons efter behandling (figur 2). Dette opnås ved at regulere en kompleks onkogen kromatin repressiv pathway. Dette Co-Expression mønster foreslog en stærk synergistisk aktivitet blandt disse tre miRNAs (figur 3). Derfor, at drage fordel af den lille størrelse og simple Biogenese af Mirnas, den anden del af denne protokol blev anvendt til at designe en transgene (figur 4), der kan samtidig rekapitulere ekspression af de tre Mirnas i glioblastoma celler, både in vitro og in vivo, med signifikant interferens i tumor biologi og lovende translationel anvendelighed (figur 5A, B, C)10. Desuden, det blev påvist, at den transgene klynge er også funktionel i en brystkræft model (figur 5D, E).
Figur 1: karakterisering af et funktionelt Mirna-modul i glioblastoma. A) vulkan plot, der repræsenterer de differentielt udtrykte Mirnas i humane glioblastoma-prøver (n = 516) vs. normal hjerne (n = 10) opnået fra tcga. I grøn er miRNAs med > 4-fold forskel. Den røde cirkel repræsenterer de 10 mest markant nedregulerede miRNAs i glioblastoma. B) relativ ekspression af de 10 Mirnas, der er valgt i a) under induktion af forskellige differentierings veje i neurale stamceller, der viser klar docetaxels opregulering af Mir-124-, Mir-128-og Mir-137-modulerne under induktion af neurale differentiering. Gennemsnit ± SD fra tre biologiske replikater (* p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001; Elevens t-test, to-sidet). Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra reference10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: bekræftelse af co-Expression mønstre af Mirna moduler under genotoksisk stress. Relativ ekspression af de tre miRNAs defineret i figur 1 i flere glioblastoma-celler og cellelinjer (G62-mesenchymal; MGG4-proneural; U251, U87 Pro-neurale-lignende, og T98G mesenchymal-lignende glioblastoma cellelinjer) efter induktion af resistens over for temozolomid (TMZ, pink bars) eller ioniserende stråling (RT, grønne søjler). Rapporteret er midler med SD fra to uafhængige replikater. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra reference10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af funktionel konvergens af targetomer af co-udtrykte miRNAs. Venn Diagramoutput fra bioinformatik og Evolutionary Genomics hjemmeside, samtidig krydser targetome af mærkede Mirnas med mRNAs, der udgør en go kategori af interesse (i dette tilfælde, kromatin repressors). mRNAs, der er unikt målrettet af enkelt miRNAs, blev valgt til yderligere downstream-funktionelle studier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:2D struktur af en manipuleret Mirna sekvens kodning af tre miRNAs klynge. Grafisk output fra RNAweb fold-programmet. Bemærk tilstedeværelsen af tre veldefinerede Stam loop strukturer, der repræsenterer Hårnåle af hver respektive miRNA (miR-124, miR-128, miR-137) kodet af transgenet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: dokumentation for behandling af transgene og dens biologiske virkninger i senere produktionsled. A) relativ kvantificering af Mirna-ekspression efter lentiviral-medieret transduktion af G34 glioblastoma-celler med den transgene Mirna-klynge (Cluster 3) eller negativ kontrol (CTRL). Rapporteret er midler fra tre uafhængige eksperimenter ± SD. (B) Fluorescens mikroskop billeder af G34 glioblastoma kugler, der udtrykker negativ kontrol transgen vs. Cluster 3 transgene. Scale bar = 100 μm. (C) in vivo vækst af intrakranielle humane G34 celle xenografter udtrykker enten kontrol eller klynge 3 transgener. Skala bjælke = 1 mm. Dette tal er blevet gengivet med tilladelse10. D) relativ kvantificering af Mirna-ekspression efter lentiviral-medieret transduktion af MDA-MB-231 brystkræft celler med den transgene Mirna-klynge (Cluster 3) eller negativ kontrol (CTRL). E) Fluorescens mikroskop billeder af MDA-MB-231 brystkræft celler, som udtrykker negativ kontrol transgen vs. Cluster 3 transgene. Scale bar = 100 μm. Alle forsøg blev udført i tre triplicater (* p < 0,05; * * p < 0,01; Studerendes t-test, to-sidet, flere sammenligninger). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: arbejdsgang for TargetScan. (A) skærmbillede af startside, der viser valgmulighederne for Mirna Search. B) repræsentative søgeresultater for miR-137. Liste over målgener er i venstre kolonne. Rød boks betegner gener med bevaret målretnings sites (hvilket tyder på, at der er større tillid til reel målretning). Venligst klik her for at se denne figur. (Højreklik for at downloade.)
Supplerende figur 2: ToppGene Suite workflow. (A) skærmbillede af startside, der viser søgefeltet, hvor listen over gener, der skal analyseres, indsættes. B) repræsentativt søgeresultat for miR-137 targetome, der viser de mest statistisk signifikante gene ontologi (Go)-kategorier. Venligst klik her for at se denne figur. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er baseret på forestillingen om, at miRNAs i stedet for at fungere isoleret set er biologisk relevant ved at arbejde i grupper, og disse grupper er bestemt af specifikke cellulære sammenhænge26. For at retfærdiggøre denne tilgang fra et translationelt perspektiv introduceres en opfølgnings protokol, der tillader rekreation af dette multi-miRNA-mønster i celler/væv. Dette er muligt ved at drage fordel af den relativt simple Biogenese af Mirnas, hvorved anerkendelsen af den karakteristiske Mirna hårnål ved mikroprocessor er nødvendig og tilstrækkelig til korrekt Mirna behandling27. Samtidig giver dette minimale krav mulighed for at bruge det genetiske stilladset af naturligt forekommende miRNA-klynger som rygraden til at udtrykke de ønskede miRNA-moduler, som er indeholdt i korte DNA-sekvenser, der kan monteres i alle leverings vektorer af valg. Det vigtigste krav i denne protokol er at opretholde hårnål struktur og tilstrækkelig længde af stammen komponent til at tillade passende spaltning.
Der er to væsentlige kritiske overvejelser vedrørende gennemførelsen af denne protokol. Det første punkt er den nøjagtige bestemmelse af de optimale miRNA-kombinationer. Dette bestemmes ved omhyggelig analyse af ikke kun miRNA Expression underskrift af celler eller væv i forhold til kontrol, men også af eventuelle samtidige udtryk ændringer observeret som cellerne eksperimentelt manipuleret. Når et sæt af miRNAs er defineret, er det også afgørende at konstatere, at den kunstige graduering af hver ualmindeligt ikke ændrer udtryk for de andre.
Det andet kritiske aspekt vedrører opførelsen af chimeriske sekvenser til kunstigt at rekapitulere denne funktionelle miRNA klyngedannelse. Det er afgørende at overholde de strukturelle krav i Mirna-forarbejdnings maskineriet, som er tilstedeværelsen af en lang nok Stam sekvens (der måler mindst 11 nukleotider) ved oprindelsen af hver Mirna hårnål18, samt vedligeholdelse af originale mellemrum sekvenser af den indfødte miRNA klynge stillads. Efter vores erfaring har opfyldelsen af disse to krav konsekvent givet passende RNA-foldning (figur 4) og resulteret i vellykket multi-Mirna-udtryk.
Den største begrænsning af denne teknik er det begrænsede antal miRNAs, der kan samles i et funktionelt transgen. Vi har med succes konstrueret sekvenser, som overudtrykker op til seks forskellige miRNAs, men observerede en vis nedgang i forarbejdnings effektiviteten, da antallet af Hårnåle øges. Indtil videre er den genetiske struktur af miR-17-92-klyngen blevet brugt, fordi det er den ene kodning det højeste antal hårnål (seks) inden for den korteste DNA-sekvens (~ 800 base Pairs)8. Da der er andre naturlige miRNA-klynger, forventes det, at de også kan bruges til dette formål28. Endelig er det blevet observeret, at ændring af afstanden sekvenser blandt hårnål mindsker deres behandling, så der er nogle begrænsninger med hensyn til, i hvilket omfang den indfødte struktur kan ændres.
Det mest betydningsfulde og fordelagtige aspekt ved denne foreslåede metode er, at det giver mulighed for manipulation af transgener, der samtidig kan over udtrykke flere ønskede miRNAs hovedsageligt ved hjælp af en in silico tilgang, der begrænser behovet for kedelige og tidskrævende molekylære klonings trin, som tidligere beskrevet29,30,31. Den beskrevne protokol er nem at udføre og kræver ikke specialiseret udstyr eller færdigheder.
I betragtning af den anerkendte betydning af miRNAs i molekylær biologi og deres potentiale i terapeutiske anvendelser, denne protokol er af interesse for et stort publikum af forskere. Denne tilgang forventes at tilskynde til fremtidige undersøgelser, der fokuserer på de kombinatoriske egenskaber af miRNAs og vil tjene som et simpelt og robust værktøj til deres udførelse. Endnu vigtigere er, disse grupperet Trans Genes repræsenterer ideelle Cargos til genterapi vektorer. Dokumentation for vellykket in vivo levering af en 3-miRNA klynge er allerede opnået via direkte intratumoral intrakraniel injektion af AAV vektorer (ikke-offentliggjorte data). Det forventes derfor, at denne teknik vil øge de translationelle aspekter af miRNA-forskningen betydeligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke medlemmerne af Harvey Cushing Neuro Oncology Laboratory for støtte og konstruktiv kritik. Dette arbejde blev støttet af NINDS Grants K12NS80223 og K08NS101091 til P. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
