Summary
É descrito aqui um protocolo para caracterizar os módulos de miRNAs biologicamente sinérgica e seu conjunto em transgenes curtos, que permite o superexpressão simultâneo para aplicações da terapia de Gene.
Abstract
A relevância biológica de microRNAs (miRNAs) na saúde e na doença depende significativamente de combinações específicas de muitos miRNAs desregulados simultaneamente ao invés da ação de um único miRNA. A caracterização desses módulos miRNAs específicos é um passo fundamental para maximizar seu uso na terapia. Isso é extremamente relevante porque seus atributos combinatoriais podem ser praticamente explorados. É descrito aqui um método para definir uma assinatura específica de Mirna relevante ao controle de repressores oncogênico do cromatina no glioblastoma. A aproximação define primeiramente um grupo geral de miRNAs que são desegulated nos tumores em comparação ao tecido normal. A análise é ainda mais refinada por condições de cultura diferencial, ressaltando um subgrupo de miRNAs que são coexpressos simultaneamente durante Estados celulares específicos. Finalmente, os miRNAs que satisfazem estes filtros são combinados em um transgenes polycistronic artificiais, que seja baseado em um andaime de genes naturalmente existentes dos conjuntos de Mirna, usado então para o superexpressão destes módulos de Mirna em pilhas de recepção.
Introduction
miRNAs oferecer uma oportunidade ímpar para o desenvolvimento de uma abordagem de terapia gênica ampla para muitas doenças1,2,3, incluindoo cancro4,5. Isto é baseado em diversas características originais destas moléculas biológicas, incluindo seu tamanho pequeno6, biogênese simples7, e tendência natural funcionar na associação8. Muitas doenças são caracterizadas por padrões específicos de expressão de miRNA, que muitas vezes convergem para a regulação de funções biológicas complexas9. O objetivo deste método é primeiro definir uma estratégia para identificar grupos de miRNAs que são sinergicamente relevantes para funções celulares específicas. Consequentemente, fornece uma estratégia para o restabelecimento de tais combinações de miRNA em estudos e aplicações a jusante.
Este método permite a análise funcional de vários miRNAs de uma só vez, aproveitando a sua segmentação simultânea de um grande número de mRNAs, recapitulando assim as paisagens complexas de doenças. Esta abordagem tem sido recentemente empregada para definir um grupo de três miRNAs que 1) são simultaneamente desregulado no cancro do cérebro e 2) mostram um forte padrão de coexpressão durante a diferenciação neural, bem como em resposta ao stress genotóxico por radiação ou um Agente alquilantes do ADN. A reexpressão combinatória deste módulo de três miRNAs pelo método de agrupamento descrito abaixo resulta em profunda interferência com a biologia das células cancerosas e pode ser facilmente utilizada como estratégia de terapia gênica para estudos pré-clínicos10. Este protocolo pode ser de particular interesse para os envolvidos na pesquisa de miRNA e suas aplicações translacionais.
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Protocol
1. caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma
- Análise da expressão diferencial ampla de miRNA em glioblastoma versus cérebro
- Primeiramente, determine os miRNAs o mais significativamente desregulamentado no tumor. Isso pode ser conseguido usando pelo menos três métodos diferentes:
- Mine o Atlas do genoma do cancro, encontrado em https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, para arranjar em seqüência dados11.
- Realize análises de Microarray a partir de um espécime operativo fresco12.
- Use os conjuntos de dados publicados anteriormente13.
Nota: Seja qual for o método escolhido, a saída fornece um conjunto em massa de miRNAs cuja expressão é estatisticamente correlacionada (direta ou inversamente) com a biologia tumoral. Este grupo inicial constitui o conjunto de miRNAs que são analisados para a identificação de um subconjunto de miRNAs exibindo a associação funcional mais rigorosa, realizando uma análise mais dinâmica das alterações de expressão, como discutido abaixo.
- Primeiramente, determine os miRNAs o mais significativamente desregulamentado no tumor. Isso pode ser conseguido usando pelo menos três métodos diferentes:
- Análise de expressão de miRNA específica da condição
- Indução da diferenciação celular:
- Use pratos plásticos pré-revestidos de poli-D-lisina (PDL) para favorecer a formação de uma cultura monocamada. Para o revestimento do prato, dissolva PDL na água em uma concentração de 100 μg/mL. Utilize 1 mL de solução por superfície de 25 cm2 . Enxague 2x com PBS 6 h após a aplicação da solução PDL.
- Placas de células-tronco neurais humanas em quantidades iguais (100.000 células/5 mL) em meio de células-tronco (meio neurobasal + suplemento B27 + 20 ng/mL EGF/FGF), meio de diferenciação astrocítica (DMEM + 10% FBS) ou meio de diferenciação neuronal (meio neurobasal + B27 suplemento, + 2 μM de ácido retinóico)14. O protocolo de diferenciação Oligodendrócito requer adição de IGF-1 (200 ng/ml) após a remoção de EGF/FGF14,15.
- Após o chapeamento de pilha, coloc na incubadora para 1 semana em 37 ° c, 5% CO2.
- Extração de RNA:
- Após 7 dias, retire as células da incubadora e retire o meio.
- Lave as células com PBS (5 mL). Em seguida, adicione 1 ml de reagente de lise (ver tabela de materiais) para lyse as células e raspar as células em 1,5 ml microcentrífuga tubo usando um raspador de células. Mantenha os tubos contendo as células lisadas à temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
- Proceder ao isolamento total do RNA seguindo as instruções do fabricante.
- análise de expressão de miRNA:
- Quantificar a expressão diferencial de miRNAs específicos identificados na etapa 1,1 entre os três padrões de diferenciação por PCR em tempo real, utilizando sondas TaqMan e seguindo os protocolos do fabricante para transcrição reversa e amplificação de PCR ( Figura 1).
- Indução da diferenciação celular:
- Validação de clusters de miRNA por desafios específicos ao stress
- Cultura G34 glioblastoma células tronco-like em meio neurobasal + B27 suplemento + 20 ng/mL EGF/FGF. Comece com 1 x 106 células em 5 ml em um balão de fixação de 25 cm2 baixo.
- Começando 48 h após o chapeamento, adicione a duplicação de concentrações de temozolomida do agente alquilantes do ADN (TMZ) cada 5 dias, como segue:
- Comece com 5 μM durante 5 dias. Após 5 dias, retire o meio e substitua-o por meio fresco sem temozolomida, para permitir que as células sobreviventes se recuperem. Após 48 h, adicionar 10 μM TMZ e incubar por mais 5 dias.
- Repita a etapa 1.3.2.1, dobrando a concentração de TMZ cada vez, até que uma concentração pelo menos de 100 μM esteja alcangada e as pilhas se tornem resistentes à droga10.
- Em um experimento paralelo, irradiar células G34 da seguinte maneira:
- Começando 48 h após o chapeamento 1 x 106 células em 5 ml em um 25 cm2 baixo frasco de fixação, irradiar células com 2 GY de energia (qualquer irradiador fornecendo emissão de fóton é aceitável). Devolva as células à incubadora e não perturbe. Após 48 h, irradiar as pilhas outra vez com 2 GY adicionais da energia.
- Repita o passo 1.3.3.1 4x até que um total de 10 GY de energia é administrado.
- Retorne as pilhas à incubadora e deixe-as recuperar no meio fresco por pelo menos 5 dias antes da análise a jusante.
- Após a indução da resistência, as pilhas do lyse que usam o reagente do lysis e extraem o RNA total de acordo com o protocolo do fabricante.
- Analise a expressão dos miRNAs específicos identificados nas secções 1.1-1.2, conforme descrito no passo 1.2.1 (Figura 2).
- Caracterização da convergência funcional de miRNAs clusterizadas
- Obtenha o targetome previsto de cada miRNAs definido nas seções 1.2-1.3 obtidas usando ferramentas de predição de segmentação de miRNA.
Nota: Nós geralmente recorrem ao TargetScan, pois seu algoritmo é atualizado periodicamente16. As ferramentas de predição adicionais são miRanda17, mirdb18e Diana-mirpath19. Todos esses programas são aplicativos gratuitos e baseados na Web.- Na primeira página do Targetscan, selecione o miRNA de interesse do menu suspenso pré-preenchido. Clique no botão Enviar .
- Baixe a lista de alvos resultante como uma planilha usando o link baixar tabela (complementar Figura 1).
- Para diminuir as chances de previsões falsas positivas, inclua somente alvos dentro da coluna de sites conservados em análises downstream. Também, mais rigor pode ser obtido usando programas adicionais da predição de Mirna (veja acima) e somente including os alvos que são comuns a todos os algoritmos.
- Classifique os targetomes resultantes de acordo com as categorias de ontologia gênica usando o ToppGene Suite20 para avaliar o enriquecimento de caminhos comuns a cada Mirna.
- Cole a lista de alvos obtidos da etapa 1.4.1 na janela "conjunto de genes de treinamento", usando o símbolo HGNC como o tipo de entrada. Clique em enviar > Iniciar. O programa fornecerá uma tabela de saída mostrando as categorias "Go" mais significativas para a lista de genes inseridos (Figura complementar 2).
- Para finalmente estabelecer a contribuição de cada miRNA para a regulação de um caminho comum ou processo celular (neste caso, a regulação da cromatina), verificar cada targetome obtido na etapa 1.4.1 contra a lista completa de genes envolvidos no processo celular específico ( ou seja, regulação da cromatina), utilizando a função de diagrama de Venn fornecida no site de bioinformática e genômica evolutiva http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
Nota: Este programa permite a interseção de vários grupos ao mesmo tempo (Figura 3). Os alvos únicos específicos fornecidos por cada miRNA são anotados então e selecionados para experimentos funcionais a jusante.- Na primeira página do programa, carregue ou copie/cole a lista se o mRNAs de destino para cada miRNA ou interesse nas respectivas janelas. Nomeie cada lista com um identificador exclusivo.
- Clique em Submit. O programa fornecerá uma saída Visual de um diagrama de Venn com números de genes em cada setor, bem como uma lista completa de mRNAs para cada subconjunto e combinações de interseção.
- Obtenha o targetome previsto de cada miRNAs definido nas seções 1.2-1.3 obtidas usando ferramentas de predição de segmentação de miRNA.
2. montagem de módulos de miRNA em um aglomerado transgênico Policístrônico
-
Preparação de andaime transgênico baseado no locus de agrupamento miR-17-92
- Obtenha a sequência de nucleotídeo do cluster miR-17-92 do navegador do genoma do Ensemble21. Selecione o ~ 800 par base "Core" seqüência abrangendo todos os seis codificado Mirna grampos do locus e pelo menos 200-nucleotídeo flanqueando sequências de upstream (5 ') e downstream (3 ') da seqüência de núcleo.
- Cole a seqüência acima em qualquer programa de edição de palavras.
- Defina a sequência de cada um dos seis grampos de cabelo nativos, recuperando-os no miRBase22. Marque cada uma dessas sequências dentro do intervalo da seqüência "núcleo" identificada anteriormente. Todas as seqüências entre cada hairpin representam as seqüências do espaçador, que são importantes para o processamento correto do transgene.
- Remova as sequências de hairpin nativas da sequência "Core", com exceção de 3-5 nucleotídeos em ambos os 5 ' e 3 ' extremidades de cada hairpin, que servirá como um aceitador para os grampos de cabelo novo.
-
Construindo um novo transgene codificando vários miRNAs de escolha
- Obter seqüências de hairpin de miRNAs destinados a ser superexpressos no transgene de miRBase. Anote com cuidado os nucleotídeos específicos que são os locais da clivagem do microprocessador.
- Substitua os grampos de cabelo removidos (passo 2.1.4) com as sequências de hairpin dos miRNAs desejados obtidos na etapa 2.2.1.
- Adicionar seqüências de restrição desejadas em ambas as regiões flanquear do transgene para facilitar a subclonagem em vetores de entrega de escolha. Verifique se as sequências de restrição escolhidas não estão presentes dentro da própria sequência.
- Para controles negativos, use sequências de 20 nucleotídeo mexidos para substituir a seqüência natural de 20 nucleotídeo de cada miRNA maduro. Gere essas sequências embaralhadas usando uma ferramenta online como https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
Verificando a estrutura bidimensional do transgene
- Copie a seqüência transgênica completa para o programa de software de predição de estrutura de RNA RNAweb Fold23.
- Usando as configurações padrão do programa, clique em continuar.
- Analise a saída gráfica, particularmente para a presença de grampos de cabelo bem definidos e a presença de estruturas de haste dobro-encalhadas pelo menos 11 nucleotídeos proximal ao local do clivagem do microprocessador. Além disso, procure a ausência de pontos de ramificação dentro das sequências de hairpin (Figura 4).
3. obtendo transgenes por síntese de DNA
- Após o projeto e na validação do silico do conjunto quimérico de Mirna, obtenha a seqüência de funcionamento usando a síntese do ADN dos vendedores comerciais24 e prossiga com a clonagem a jusante em vetores e na entrega do transgene. Utilizamos vetores lentivirais para entrega in vitro10 e vírus adeno-associados (AAV) para parto intracraniano in vivo25.
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Representative Results
Este método permitiu a caracterização de um módulo de três miRNAs que são consistentemente regulamentados em tumores cerebrais, que são coexpressos especificamente durante a diferenciação neuronal (Figura 1) e envolvidos na resposta de sobrevida tumoral após terapêutica (Figura 2). Isto é conseguido regulando um caminho repressivo oncogênico complexo da cromatina. Esse padrão de coexpressão sugeriu uma forte atividade sinergística entre esses três miRNAs (Figura 3). Consequentemente, aproveitando o pequeno tamanho e a simples biogênese de miRNAs, a segunda parte deste protocolo foi utilizada para projetar um transgene (Figura 4) que poderia, simultaneamente, recapitular a expressão dos três miRNAs em células de glioblastoma, tanto in vitro como in vivo, com interferência significativa na biologia tumoral e aplicabilidade translacional promissora (Figura 5A, B, C)10. Além disso, demonstrou-se que o aglomerado transgênico também é funcional em um modelo de câncer de mama (Figura 5D, E).
Figura 1: caracterização de um módulo funcional de Mirna em glioblastoma. (A) parcela do vulcão representando as miRNAs diferencialmente expressas em amostras de glioblastoma humano (n = 516) versus cérebro normal (n = 10) obtidas de tcga. Em verde são miRNAs com diferença de > 4 vezes. O círculo vermelho representa os 10 miRNAs mais significativamente regulamentados no glioblastoma. (B) expressão relativa dos 10 miRNAs selecionados em (a) durante a indução de diferentes vias de diferenciação em células-tronco neurais, mostrando upregulação clara dos módulos mir-124, mir-128 e mir-137 durante a indução da diferenciação neural. Média ± DP de três repetições biológicas (* p < 0, 5; * * p < 0, 1; * * * p < 0, 1; * * * * p < 0, 1; Teste t de Student, bicaudal). Este valor foi modificado com a permissão da referência10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: confirmação dos padrões de coexpressão dos módulos de Mirna durante o estresse genotóxico. Expressão relativa dos três miRNAs definidos na Figura 1 em múltiplas células de glioblastoma e linhagens celulares (G62-mesenquimal; MGG4-proneural; U251, U87 pro-neural-like, e T98G mesenchymal-como linhas celulares do glioblastoma) após a indução da resistência ao temozolomida (TMZ, barras cor-de-rosa) ou radiação ionizante (RT, barras verdes). Relatados são meios com SD de duas repetições independentes. Este valor foi modificado com a permissão da referência10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise da convergência funcional dos targetomes dos miRNAs coexpressos. Saída de diagrama de Venn do site Bioinformatics e Genomics evolutivo, cruzando simultaneamente o targetome de miRNAs rotulados com os mRNAs constituindo uma categoria GO de interesse (neste caso, repressores de cromatina). os mRNAs visados exclusivamente por miRNAs únicos foram escolhidos para uns estudos funcionais a jusante mais adicionais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: estrutura 2D de uma seqüência de Mirna projetada que codifica o conjunto de três miRNAs. Saída gráfica do programa RNAweb fold. Anote a presença de três estruturas bem definidas do haste-laço que representam os grampos de cabelo de cada miRNA respectivo (miR-124, miR-128, miR-137) codificado pelo transgene. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: evidência de processamento de transgenes e seu efeito biológico a jusante. (A) quantificação relativa da expressão de Mirna após transdução mediada por Lentivirus de células de glioblastoma G34 com o aglomerado de Mirna transgênico (cluster 3) ou controle negativo (Ctrl). Relatados são meios de três experimentos independentes ± DP. (B) imagens de microscópio de fluorescência de esferas de glioblastoma G34 expressando transgene de controle negativo vs. transgene de cluster 3. Barra de escala = 100 μm. (C) crescimento in vivo de xenoenxertos de células G34 humanas intracranianas expressando qualquer controle ou transgenes de cluster 3. Barra de escala = 1 mm. Este número foi reproduzido com permissão10. (D) quantificação relativa da expressão de Mirna após transdução mediada por Lentivirus de células de câncer de mama MDA-MB-231 com o aglomerado de Mirna transgênico (cluster 3) ou controle negativo (Ctrl). (E) imagens de microscópio de fluorescência de células de câncer de mama MDA-MB-231 expressando transgene de controle negativo vs. cluster 3 transgene. Barra de escala = 100 μm. Todos os experimentos foram realizados em triplicados (* p < 0, 5; * * p < 0, 1; Teste t de Student, bicaudal, comparações múltiplas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: fluxo de trabalho do TargetScan. (A) captura de tela da página inicial, mostrando opções de seleção para a pesquisa Mirna. (B) resultados de pesquisa representativos para miR-137. A lista de genes alvo está na coluna da esquerda. A caixa vermelha denota genes com locais de segmentação conservados (sugerindo maior confiança de segmentação real). Por favor clique aqui para ver esta figura. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Complementar Figura 2: fluxo de trabalho do ToppGene Suite. (A) imagem de página inicial mostrando a caixa de pesquisa onde a lista de genes a serem analisados é inserida. (B) resultado de pesquisa representativo para o targetome miR-137, mostrando as categorias de ontologia genética (GO) mais significativas. Por favor clique aqui para ver esta figura. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
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Discussion
Este protocolo baseia-se na noção de que, em vez de funcionar isoladamente, os miRNAs são biologicamente relevantes por trabalharem em grupos, e esses grupos são determinados transcripcionalmente por contextos celulares específicos26. Para justificar essa abordagem a partir de uma perspectiva translacional, um protocolo de acompanhamento que permite a recriação deste padrão de multi-miRNA em células/tecidos é introduzido. Isto é possível aproveitando-se da biosgênese relativamente simples de miRNAs, por meio de que o reconhecimento do hairpin característico de miRNA pelo microprocessador é necessário e suficiente para o processamento correto de miRNA27. Ao mesmo tempo, esta exigência mínima permite o uso do andaime genético de aglomerados naturais de miRNA como uma espinha dorsal para a expressão de módulos desejados de miRNA, que são contidos dentro das seqüências curtas do ADN que podem ser cabidas em todos os vetores da entrega de escolha. A exigência principal deste protocolo é manter a estrutura do hairpin e o comprimento suficiente do componente da haste para permitir a clivagem apropriada.
Há duas considerações críticas importantes sobre a execução deste protocolo. O primeiro ponto é a determinação exata das combinações óptimas de miRNA. Isto é determinado pela análise cuidadosa não somente da assinatura da expressão de miRNA das pilhas ou dos tecidos comparados aos controles, mas igualmente de todas as mudanças simultâneas da expressão observadas porque as pilhas são manipuladas experimentalmente. Uma vez que um conjunto de miRNAs é definido, também é fundamental para verificar que a modulação artificial de cada singularmente não modifica a expressão dos outros.
O segundo aspecto crítico diz respeito à construção de sequências quiméricas para recapitular artificialmente este agrupamento funcional de miRNA. É fundamental respeitar as exigências estruturais da maquinaria de processamento de miRNA, que é a presença de uma seqüência longa bastante da haste (medindo pelo menos 11 nucleotides) na origem de cada hairpin18de Mirna, assim como a manutenção do original seqüências de espaçamento do andaime nativo do aglomerado de miRNA. Em nossa experiência, cumprir estas duas exigências consistentemente rendeu a dobradura apropriada do RNA (Figura 4) e conduziu à expressão bem sucedida de multi-Mirna.
A principal limitação dessa técnica é o número finito de miRNAs que pode ser agrupado em um transgene funcional. Nós projetamos com sucesso sequências superexpressando até seis miRNAs diferentes mas observamos alguma diminuição na eficiência de processamento enquanto o número de grampos de cabelo aumenta. Até agora, a estrutura genética do cluster miR-17-92 tem sido usada, porque é a codificação do maior número de hairpin (seis) dentro da seqüência de DNA mais curta (~ 800 pares de base)8. Como há outros aglomerados naturais de miRNA, prevê-se que eles também poderiam ser usados para este propósito28. Finalmente, observou-se que a modificação de seqüências de espaçamento entre o hairpin diminui o seu processamento, por isso existem algumas restrições em relação a que medida a estrutura nativa pode ser modificada.
O aspecto mais significativo e vantajoso deste método proposto é que ele permite que a engenharia de transgenes que são capazes de sobre-expressão simultaneamente múltiplo desejado miRNAs principalmente usando uma abordagem em silico, limitando a necessidade de tedioso e etapas de clonagem molecular demoradas, como descrito anteriormente29,30,31. O protocolo descrito é fácil de executar e não requer equipamentos especializados ou habilidades.
Considerando a reconhecida importância do miRNAs na biologia molecular e seu potencial em aplicações terapêuticas, este protocolo é de interesse para um grande público de pesquisadores. Espera-se que esta abordagem incentive estudos futuros que se concentrem nas propriedades combinatórias do miRNAs e servirão como uma ferramenta simples e robusta para sua execução. Mais importante, estes transgenes aglomerado representam cargas ideais para vetores da terapia de Gene. A evidência da entrega bem sucedida in vivo de um conjunto 3-miRNA foi obtida já através da injeção intracranial intratumoral direta de vetores de AAV (dados não publicados). Assim, prevê-se que essa técnica aumente significativamente os aspectos translacionais da pesquisa de miRNA.
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Disclosures
Os autores relatam não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer aos membros do laboratório de Oncologia neuro de Harvey Cushing por apoio e críticas construtivas. Este trabalho foi apoiado pelo NINDS concede K12NS80223 e K08NS101091 a P. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
