Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки динамики формирования шпинделя и митотического прогрессирования. Наше применение замедленной визуализации позволяет пользователю идентифицировать клетки на различных стадиях митоза, отслеживать и выявлять митотические дефекты, а также анализировать динамику шпинделя и судьбу митотических клеток при воздействии антимитотических препаратов.
Abstract
Визуализация замедленного времени в живых клетках является важным инструментом в клеточной биологии, который дает представление о клеточных процессах, которые в противном случае могли бы быть упущены из виду, неправильно поняты или неправильно истолкованы анализом фиксированных клеток. В то время как визуализация и анализ фиксированных клеток надежны и достаточны для наблюдения за клеточным устойчивым состоянием, он может быть ограничен в определении временного порядка событий на клеточном уровне и плохо оснащен для оценки преходящего характера динамических процессов, включая митотической прогрессии. В отличие от этого, живая клеточная визуализация является красноречивым инструментом, который может быть использован для наблюдения за клеточными процессами на одноклеточном уровне с течением времени и имеет способность фиксировать динамику процессов, которые в противном случае были бы плохо представлены в визуализации с фиксированными клетками. Здесь мы описываем подход к генерации клеток, несущих флуоресцентно помеченные маркеры хроматина и микротрубочек и их использование в живых клеточных подходах к визуализации для мониторинга выравнивания метафазной хромосомы и митотической выхода. Мы описываем методы, основанные на визуализации, для оценки динамики формирования шпинделя и митотического прогрессирования, включая идентификацию клеток на различных стадиях митоза, выявление и отслеживание митотических дефектов, а также анализ динамики шпинделя и митотические клетки судьба после лечения митотические ингибиторы.
Introduction
Анализ фиксированных клеток на основе изображений обычно используется для оценки изменений уровня популяции клеток в ответ на различные возмущения. В сочетании с синхронизацией клеток, а затем сбор и изображение серийных точек времени, такие подходы могут быть использованы, чтобы предложить клеточной последовательности событий. Тем не менее, фиксированная визуализация клеток ограничена тем, что временные отношения подразумеваются для населения и не демонстрируются на уровне отдельных клеток. Таким образом, в то время как фиксированная клеточная визуализация и анализ достаточны для наблюдения за надежными фенотипами и изменениями устойчивого состояния, способность обнаруживать переходные изменения с течением времени и изменения, влияющие только на субпопуляцию клеток, несовершенна. В отличие от этого, живая клеточная визуализация является красноречивым инструментом, который может быть использован для наблюдения за клеточными и субклеточными процессами в одной клетке, или клеточной популяции, с течением времени и без помощи подходов синхронизации, которые сами по себе могут повлиять на клеточное поведение 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
Формирование биполярного митоtic шпинделя имеет важное значение для надлежащей сегрегации хромосомы во время деления клеток, в результате чего две генетически идентичные клетки дочери. Дефекты в структуре митотического шпинделя, которые развращает митотическую прогрессию и ставят под угрозу точность сегрегации хромосом, могут привести к катастрофическим делениям клеток и снижению жизнеспособности клеток. По этой причине, митотические яды, которые изменяют образование шпинделя являются перспективными терапии, чтобы ограничить быстрое распространение раковых клеток7,8,9. Тем не менее, фиксированный клеточный анализ структуры шпинделя после добавления митотических ядов ограничен в своей способности оценить динамический процесс формирования шпинделя и не может указывать, являются ли наблюдаемые изменения в структуре шпинделя постоянными или вместо этого преходящий и может быть преодолен, чтобы позволить успешное разделение клеток.
В этом протоколе мы описываем подход к оценке динамики митоза после возмущений шпинделя с помощью визуализации живых клеток. Использование hTERT увековеченных RPE-1 клеточной линии инженерии, чтобы выразить RFP помечены Histone 2B визуализировать хроматин, вместе с EGFP помечены й-тубулин для визуализации микротрубочек, сроки метафазной хромосомы выравнивания, анафазы начала, и в конечном счете судьба митотической клетки оценивается с помощью визуальных сигналов движения хромосомы, уплотнения и ядерной морфологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Поколение клеток hTERT-RPE-1 устойчиво выражает RFP-Histone 2B (RFP-H2B) и З-тубулин-ЭГП (tub-EGFP)
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги следуют асептическим методам и происходят в шкафу безопасности уровня биобезопасности II (BSL2).
- Создание ретровируса, несущего гены, представляющие интерес (з-тубулин-EGFP и RFP-H2B) путем трансфекции 293T-клеток с соответствующими лентивирными плазмидами в соответствии с инструкциями производителя системы доставки трансфекции на основе липидов.
- День 1: Используйте одноразовое стекло Пастер пипетка, чтобы аспирировать среды культуры клеток из пластины суб-конфилент29T клеток и смыть остаточной среде с фосфатами буферного соливого (PBS), добавив 5 мл PBS. Swirl распространять PBS по нижней пластины, а затем аспирировать PBS с стерильной одноразовой стеклянной pipette Pasteur.
- Добавьте 2 мл 0,05% трипсина, который был предварительно разогрет до 37 градусов по Цельсию и верните тарелку в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в течение 2 до 5 минут, чтобы позволить клеткам адептов быть освобожденными от поверхности тарелки клеточной культуры.
- Добавьте 8 мл свежего модифицированного орел-медиума Dulbecco (DMEM) в дополнение к 10% сыворотке крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина в тарелку, содержащую трипсин.
- Приостановите работу клеток, аккуратно протянив трубку и переветривайте подвеску на стерильную коническую трубку 15 мл. Поместите коническую трубку в сбалансированную центрифугу и вращайтесь при 161 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы аккуратно гранулировать клетки.
- Аспирировать раствор среднего/трипсина из пеллетных клеток и повторно приостанавливать клетки в 10 мл DMEM дополнены 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Используйте гемоситометр для подсчета 293T клеточной подвески и пластины 2 х 106 293T клеток на скважину 6 хорошо пластины.
- Культурные клетки в общем объеме 2 мл модифицированного орла Dulbecco Medium (DMEM) дополнены 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина и поддерживаются в увлажненном инкубаторе при 37 Градусах по Цельсию с 5% CO2.
- День 2: Pipette 7 л липидных основе трансфекционного реагента доставки и 100 л пониженной среды сыворотки в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки и позволяют ему инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин (трубка #1).
- В отдельной микроцентрифуговой трубке объемом 1,5 мл, пипетке 1 мкг вектора экспрессии RFP-H2B (или 1 мкг вектора экспрессии з-тубулин-ЭГПП), вместе с реагентом экспресс-усилителя мощностью 5 л (в соответствии с требованиями руководства производителя), 0,5 мкг pMD2.G и 1 мкг psPAX2 и 100 мкг уменьшенного сыворотки среднего (трубка #2).
- Объедините содержимое ступени 1.1.7 и шага 1.1.8 тщательно трубоуклады трубки #2 в трубку #1 и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может быть масштабирована по мере необходимости для трансфекции клеток в дополнительных скважинах. - Пипетка трансфекционной реакции dropwise к желаемой хорошо, содержащих 293T клеток в 2 мл среднего и вернуть блюдо в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для генерации клеток, выражающих как RFP-H2B, так и a-tubulin-EGFP, генерируют отдельный вирус для каждой конструкции выражения (шаги 1.1.7- 1.1.9). - День 3: Аспирируйте и замените среду 2 мл свежего DMEM, дополненного 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Вернуть блюдо в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
- День 4: Соберите среду, содержащую выраженные частицы вируса, будучи осторожным, чтобы не нарушить или удалить 293T клеток. Фильтр среды, содержащей частицы вируса, проходя через фильтр 0,45 мкм, прикрепленный к 5 мл шприца. Аликвот вирус для кратковременного хранения при 4 градусах Цельсия, или долгосрочное хранение при -80 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные частицы, полученные таким образом, будут присутствовать в диапазоне 1 х 107 х 1 х 108 Преображенские единицы/мл. Поскольку вирусопроизводящие клетки и клетки, которые должны быть инфицированы, культивируются в одной и той же среде, вирусная концентрация для замены среды не требуется, и фильтрованные вирусные частицы могут быть использованы непосредственно для заражения клеток. - Семена 2 х 105 hTERT-RPE-1 клетки на хорошо 6-наилучшим блюдо в рамках подготовки к вирусной инфекции. Культурные клетки в 2 мл DMEM дополнены 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина и поддерживать в увлажненном инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
- День 5: Добавьте бромис того гексадиметрина (например, полибрен) к клеткам hTERT-RPE-1 до конечной концентрации 8 мкг/мл. Заразить клетки смесью из 500 л вируса, разбавленного в 500 л среды клеточной культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гексадимитрин бромидбульонный бульон раствор готовится в стерильной дистиллированной воде, а затем фильтруется через фильтр 0,45 мкм. - День 6: Использование одноразового стекла Пастер пипетка, аспирировать среды из скважин, содержащих вирус инфицированных клеток. Замените среду культуры клетки с 2 мл DMEM, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина, а также соответствующие концентрации антибиотика, чтобы выбрать для плазмидной интеграции и выражения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида экспрессии З-тубулин-ЭГП, используемая в описанных экспериментах, несет в себе ген пуромицин-резистентности, а плазмида экспрессии RFP-H2B несет ген сопротивления бласцидина. Таким образом, 10 мкг/мл пуромицицина и 2 мкг/мл бласцидина используются для выбора клеток З-тубулин-ЭГП, RFP-H2B, выражающих hTERT RPE-1. Концентрации антибиотиков, используемых для выбора может отличаться для различных клеточных линий, используемых. - Поддерживайте клетки под отбором антибиотиков в течение 5-7 дней, заменяя среду каждые 3 дня свежей средой, содержащей соответствующие отборные реагенты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны поддерживаться при субслиянии во время отбора и должны быть расширены по мере необходимости, как описано в шагах 1.1.1 до 1.1.4. - Используйте иммунофлуоресценцию для подтверждения выражения помеченных конструкций.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании, одноклеточные клоны могут быть получены для получения единообразных уровней экспрессии в популяции клеток. Как только будут подтверждены стабильные клоны, клетки могут поддерживаться в стандартных условиях культуры в отсутствие отбора антибиотиков.
2. Подготовка клеток для визуализации живых клеток после возмущений митотической шпинделя
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте асептические методы и выполнять шаги в шкафбезопасности BSL2.
- Используя стерильное одноразовое стекло Пастер пипетка, аспирируйте среду из культурной пластины, содержащей клеточную линию, которая несет конструкцию выражения (ы) (от шага 1.7). Кратко промыть клетки с 10 мл стерильных PBS. Вихрь распространять PBS по нижней пластины, а затем аспирировать PBS с стерильной одноразовой стеклянной pipette Pasteur.
- Добавьте 2 мл 0,05% трипсина в тарелку 10 см. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия в течение 2-5 мин или до тех пор, пока клетки не отсоединятся от поверхности пластины.
- Добавьте 8 мл свежей среды в тарелку, содержащую трипсин. Приостановите работу клеток, аккуратно протянив трубку и переветривайте подвеску на стерильную коническую трубку 15 мл. Поместите коническую трубку в сбалансированную центрифугу и вращайтесь при 161 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы аккуратно гранулировать клетки.
- Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend в 10 мл PBS, пайпетируя мягко с 10 мл серологического пипетки. Поместите коническую трубку в сбалансированную центрифугу и вращайтесь при 161 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы аккуратно гранулировать клетки.
- Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend в 10 мл свежей среде, аккуратно прокладывая с 10 мл серологического пипетки.
- Подсчитайте клетки, затем вычислите число клеток с помощью гемаситометра и разбавьте до концентрации 1-2 х 105 клеток/мл в среде клеточной культуры. Семя 500 л клеточной подвески к каждой скважине стерильной 12-ну хорошо визуализации нижней пластины. Поместите пластину в инкубатор клеточной культуры и позвольте клеткам прилипнуть к поверхности пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация живых клеток требует, чтобы клетки были хорошо приклеены, чтобы они оставались связанными с плоскости изображения во время приобретения изображения. Продолжительность времени, необходимого для клеток придерживаться следующие покрытия может отличаться от одной линии клеток к другой и должны быть оптимизированы для клеточной линии в исследовании. - До 30 мин до начала тайм-лап изображения, добавить соответствующую концентрацию митотического препарата в один или несколько из скважин, посеянных с клетками. Чтобы учесть потенциальное влияние органического растворителя на клеточное поведение, добавьте равный объем разбавителя ингибитора в клетки в качестве контроля. Например, убедитесь, что добавление 100 нМ специфического ингибитора митотической киназы Аврора А (например, ализертиб) параллельно с равным объемом ДМСО, разбавителя для этого препарата, в контрольной скважине клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнительный анализ динамических изменений в митотической прогрессии требуют подготовки колодцев клеток при отсутствии возмущений, позволяющих проводить визуализацию нормальных митозов параллельно экспериментальным условиям.
3. Микроскоп, созданный для замедленной визуализации RFP-H2B, q-tubulin-GFP, выражающих клетки(рисунок 1, рисунок 2)
- Поместите пластину культуры клеток, содержащую RFP-H2B, q-tubulin-GFP, выражающие клетки hTERT RPE-1, которые будут изображены в соответствующую стадию вставки на перевернутом эпифлюоресценционном микроскопе, который оснащен камерой высокого разрешения (пиксельный размер 0,67 мкм в 20x), экологическая камера предварительно разогрета до 37 градусов по Цельсию, а система доставки для увлажненного 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Либо закрытые экологические камеры или температуры контролируемых этапе вставки могут быть целесообразными при условии увлажненной 5% CO2 могут быть доставлены и стабильный контроль температуры получены. - Используйте 20-x воздушную цель с численной диафрагмой 0,5 и оборудованную для высококонтрастной флуоресценции и фазового контраста или яркого поля изображения. Просмотр клеток с фазовой контрастной или яркой поля, отрегулируйте курс и сосредоточьте внимание на микроскопе, чтобы привлечь клетки в фокус.
- Определите и установите оптимальное время экспозиции для получения изображений Brightfield, GFP и RFP, выбрав соответствующий куб фильтра с соответствующим возбуждением и выбросом флюорофоров, которые будут изображены. Кроме того, нажмите кнопку автоматической экспозиции, чтобы ввести заранее определенное время экспозиции. Если сигнал не является достаточно интенсивным, выберите пиксельный биннинг, чтобы обеспечить более короткое время экспозиции, нажав на биннингную вкладку и выбрав 2 х 2 пикселя из меню drop down.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фототоксичность может ухудшить прогрессирование митотической и жизнеспособности клеток. Неспособность митотических клеток в контролируемых популяциях завершить нормальные митозы может свидетельствовать о том, что время воздействия и/или продолжительность изображения необходимо оптимизировать. - Используйте программное обеспечение для приобретения и анализа, которое позволяет одновременно приобретать многокогосную, многоскважинную визуализацию и определять параметры для приобретения изображения.
- Выберите и откалибруйте сцену микроскопа до многоскважины, в соответствии с инструкциями производителя. Используйте программное обеспечение для приобретения изображений, чтобы выделить или иным образом выбрать скважины, которые будут изображены, нажав на соответствующие скважины в диаграмме формата пластины, которая используется.
- Под панелью управления GeneratedPoints (рисунок 2),определить координаты в каждой скважине, которые будут изображены, нажав на вкладку размещения точек и выбрав предопределенное или случайное размещение координат из падение вниз меню. Выберите вкладку «Рабочая зона» и выберите ограниченное из меню понижения, чтобы ограничить область выбора координат, чтобы исключить границы скважины. Нажмите на вкладки Count и Distribution, чтобы выбрать количество и распределение точек, которые должны быть захвачены в скважине, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество координат, которые могут быть изображены на скважину в пределах 5 мин приращения времени будет ограничено числом скважин, которые будут изображены, а также время экспозиции для каждого канала. Как правило, 5-8 координат на скважину достаточно, чтобы наблюдать по крайней мере 50 клеток в каждом состоянии прогресс через митоз в течение 4 ч. - Выберите и вввеждите временной интервал и продолжительность сбора изображений, нажав на и ввводя значения в панель управления TimeSequence.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретение изображений каждые 1 до 5 минут подходит для мониторинга динамики митотической прогрессии. Общая продолжительность изображения должна отражать нужную конечную точку и скорость пролиферации клеточной линии. Например, 4 часа достаточно, чтобы увидеть, как многие клетки прогрессируют через митоз, 16 часов достаточно, чтобы увидеть большинство клеток RPE-1 в асинхронном прогрессе популяции через митоз.
4. Анализ изображения замедленного периода для определения метафазных сроков и судьбы митотических клеток после возмущений митотического шпинделя
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ изображений с помощью программного обеспечения для приобретения изображений(Таблица материалов), ImageJ, или сопоставимое программное обеспечение для анализа изображений.
- Визуализируйте RFP-H2B помеченный хроматин, выбрав изображения, полученные с помощью кубика фильтра RFP на месте. Определите ячейку, вводя митоз, как показано в первоначальном уплотнении хроматина(рисунок 2C,синяя стрелка) и ядерный конверт сломать (когда з-тубулин-EGFP больше не исключается ядерной границы).
- Определить митотическое время выравнивания метафазы и начала анафазы в отдельных клетках: Отслеживайте ячейку через последовательные временные точки в приобретенном фильме, чтобы определить количество таймтов/минут от митотического входа до rfP-H2B-маркированного хроматина завершает выравнивание на экваторе клетки во время метафазы(рисунок 2C,желтая наконечник стрелы).
- Для мониторинга митотического времени, митотической верности и судьбы клеток, продолжайте отслеживать клетку через последовательные временные точки, чтобы определить временной координат, при которых анафазная хромосома сегрегации очевидна(Рисунок 2C, белая стрелка) и /или где хроматин декомборации и ядерного конверта реформирования (как указано на тубулин исключение из ядра) произошло.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возмущения в сборке шпинделя или митотической прогрессии могут быть оценены как функция времени, необходимого для получения биполярного митоtic шпинделя и достижения полного выравнивания хромосомы, или для завершения анафазной сегрегации хромосомы. - Визуализируйте RFP-H2B для выявления клеток в каждой популяции, которые проявляют митотические дефекты, включая отстающие хромосомы и хроматины мосты во время анафазной сегрегации хромосомы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Компромиссный митотической верности может также привести к многоядерных или микронуклеядных клеток дочери и могут быть визуализированы в клетках после митотической выхода, как на рисунке 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка митотического прогрессирования в присутствии возмущений шпинделя
Регулирование фокусировки шпинделя полюса является важным шагом в надлежащем биполярное образование шпинделя. Нарушение в этом процессе через истощение белка, ингибирование наркотиков, или изменения в центросомном количестве коррумпированных структур шпинделя и задержки или остановки митотической прогрессии10,11,12,13. Тем не менее, некоторые возмущения только преходяще задержки формирования шпинделей с клетками в конечном итоге проходит через митоз для завершения анафазной хромосомы сегрегации14. При отсутствии подходов синхронизации клеток, которые сами по себе могут косвенно воздействовать на митотические процессы1,2,клетки продвигаются через митоз асинхронно(рисунок 2С). Используя RFP-H2B для идентификации хроматина, митотические клетки с компактным хроматином могут быть поставлены как напавшие в прометафазу (те, которые до полного выравнивания метафазы: Рисунок 2C,синие наконечники стрел), метафаза (полное выравнивание хромосомы: Рисунок 2 C, желтые наконечники стрел) и анафасы (хромосомы, сегрегированные по отношению к шпиндельным полюсам: Рисунок 2C,белые наконечники стрел). Захват 5-8 координат более 4 ч достаточно, чтобы следить за прогрессированием по крайней мере 50 клеток через митоз в данном состоянии. Для изучения динамики сборки шпинделя после изменений в центросомном количестве и/или ингибировании Авроры Киназы, важного регулятора спинное шеста фокусировки14,15,16, 17, мы использовали живой клетки замедленной визуализации человеческих клеток с 2 центросомы, или те, содержащие сверхнумерарные центросомы. Клетки культивировались в присутствии или отсутствии ингибитора киназы Аврора до начала визуализации. Клетки с 2 центросомы испытывают нарушение митотической прогрессии при лечении с помощью ингибитора киназы, но в конечном итоге способны достичь выравнивания метафазной хромосомы(Рисунок 2C,желтая наконечник стрелки). В отличие от этого, клетки с йgt;2 центросомы изысканно чувствительны к аврора ингибирование и проявлять увеличение прометафазы клеток и отсутствие метафазных клеток, что свидетельствует о задержке в сборке шпинделя и митотической прогрессии.
Рисунок 3 показывает, что таких подходов к визуализации по времени достаточно для контроля как сборки шпинделей, так и митотической верности. Путем визуализировать s-tubulin-EGFP, было замечено что клетки которые испытывают нарушение шпинделера (показано здесь из-за центросомы overduplication) претерпевают динамические изменения по мере того как фокусировка полюса шпинделя достигается и биполярный митотический шпиндель сформирован в подготовке к деления клеток. Параллельно с сборкой шпинделя, хромосомное движение может быть визуализировано с помощью RFP-H2B для оценки выравнивания хромосом и точности сегрегации. Митотические клетки, которые испытывают преходящую многополярность шпинделя, восприимчивы к ошибкам вложений, которые приводят к отставанию хромосом во время анафазы и образуют микроядерные клетки в последующей фазе G1 клеточного цикла. Такие дефекты очевидны с этими подходами изображения живых клеток.
Изменения в динамической прогрессии митоза изменить митотические сроки и влияние митотических клеток судьба
После распада ядерного конверта, образование шпинделя и движение хромосомы можно отследить через этапы митоза для оценки митотического прогрессирования, продолжительности и судьбы клеток, которые продвигаются в анафазу. Центросомное усиление, особенность, распространенная во многих видах рака, характеризуется наличием дополнительных центросом и многополярным образованием шпинделя18,19,20. Как многополярных делений привести к высоко анеуплоидных и, вероятно, нежизнеспособных клеток дочери, раковые клетки активно кластера дополнительных центросомов, чтобы сформировать биполярный шпиндель и пройти биполярное деление5,20,21, 22,23,24. Используя подходы к визуализации живых клеток, наши репрезентативные результаты показывают, что клетки с нормальным содержанием центросомного могут исходить из разбивки ядерного конверта через метафазное выравнивание и начало анафазы для достижения биполярного деления менее чем за 30 минут ( Рисунок 4 A,D, E). При наличии дополнительных центросом, почти 50% клеток способны преодолеть переходный многополярный митотический шпиндель и сформировать биполярное рассеивание клеток(Рисунок 4C,D). Остальные клетки не в состоянии достичь биполярного шпинделя и, как результат выхода митоза через многополярное деление(Рисунок 4B,D). Независимо от того, достигается биполярность шпинделя, клетки с дополнительными центросомы демонстрируют значительно увеличенную продолжительность митоза по сравнению с клетками с 2 центросомыми, что указывает на то, что динамика митотической прогрессии может быть изменена даже при изменениях в митотический исход не является очевидным(Рисунок 4E).
Рисунок 1: Выбор параметров микроскопа и камеры. (A) Представление окна для выбора желаемого объективного и соответствующего куба фильтра с помощью программного обеспечения для приобретения изображений. Показан выбор цели 20-x увеличения и кубика фильтра яркого поля. (B) Клетки в образце пластины находятся и приведены в фокус с помощью яркого поля или фазы контрастной микроскопии. (C) Представление окна для установки параметров экспозиции для каждого захвата изображения. Пиксельный биннинг может быть использован, если это необходимо, для достижения сокращения времени экспозиции за захват и минимизации фото-повреждения клеток. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Захват изображения и анализ замедленной микроскопии. (A и B) Представление окна, указывающее, как параметры приобретения изображений устанавливаются с помощью программного обеспечения для приобретения изображений рабочих мест NIS Elements HCA. Это программное обеспечение позволяет много-координаторов, мульти-хорошо изображения с течением времени. Каждое задание может быть изменено, чтобы указать скважины и координаты, которые должны быть захвачены. (C)Одновременные рамки из четырех условий одного эксперимента. RFP-H2B используется для отслеживания хроматина. Хроматин уплотнение и позиционирование используются для выявления различных стадий митоза: Прометафа (уплотнение при отсутствии выравнивания хромосомы, синяя наконечник стрелки), Метафаза (полное выравнивание хромосомы на экваторе клетки, желтая наконечник стрелы) и Анафаза (после начала синхронной хромосомной сегрегации, белой наконечником стрелы). Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Визуализация замедленного устранения визуализирует дефекты в митотической верности. Клетки, содержащие дополнительные центросомы образуют многополярные шпиндели и часто группируют их в биполярный шпиндель до завершения деления клеток. Здесь клетка входит в митоз с семью различными шпиндельными полюсами (белыми звездочками), которые со временем сгруппированы в два основных шпинделя. В этот момент хромосомы способны выравниваться вдоль экватора шпинделя, и клетка переходит к анафазе. Преходящая многополярность позволила к малюсовому креплению одной хромосомы. Эта неразрешенная ошибка приводит к отстающей хромосоме во время анафазы, которая становится включена в микроядерный участок в одной дочерней клетке (помеченной стрелой). Хроматин визуализирован с помощью RFP-Histone 2B и микротрубочки визуализированы с помощью з-тубулин-ЭГП. Временные штампы в каждой панели указывают на минуты в отношении очевидного распада ядерного конверта, о чем свидетельствует обнаружение тубулина в пределах ядерной границы. Шкала бар 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Изменения в динамическом прогрессировании митоза изменяют митотическое время и влияют на судьбу митотических клеток. RFP-H2B, показанный красным цветом, используется для отслеживания движения хроматина, а з-тубулин-ГФП, показанный зеленым цветом, используется для мониторинга числа и организации столба центросомы/спинделя. Потеря исключения ГФП-тубулин из ядра, одновременно с ранним уплотнением хроматина является признаком того, что ядерная оболочка сломалась (NEB) в рамках подготовки к разделению митотических клеток. Ядерное исключение GFP-tubulin очевидно на mitotic выходе и реформировании ядерной оболочки. (A) Клетка с двумя центросомами образует биполярный шпиндель и прогрессирует через анафазу, образуя две дочерние клетки. (B и C) Клетки с дополнительными центросомы вводят митоз, образуя многополярный шпиндель. (B) Некоторые из этих клеток с дополнительными центросомы задержки в митоза без достижения биполярного шпинделя и прогресса для завершения многополярной анафазы. (C) Другие клетки с дополнительными центросомы обладают преходящими задержками в митотической прогрессии в то время как они кластера дополнительных центросом, чтобы биполярное анафазы. (D) Клетки с дополнительными центросомы способны пройти биполярное деление приблизительно 50% времени, в то время как остальные клетки с дополнительными центросомы проходят многополярное деление. (E) Клетки с дополнительными центросомы увеличили митотическое время, независимо от возможной митотической судьбы (биполярной или многополярной анафазы). Шкала бар 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Временное разрешение, обеспечиваемые замедленной визуализацией, позволяет визуализировать и оценивать последовательные клеточные события в одиночных клетках. Подходы, которые используют клеточной синхронизации с последующим сбором и фиксацией клеток в последовательных временных точках, ограничены тем, что сравнения в конечном счете проводятся между популяциями клеток. В условиях, когда клеточная реакция на возмущения может быть неравномерной, или когда процесс визуализации является динамичным, живой клеточной замедленной визуализации лучше оснащены для последующей и анализа как динамика одиночных клеток, а также неоднородность в клеточной популяции. Таким образом, замедленное изображение особенно полезно для мониторинга прогрессирования клеток через динамические этапы митоза и оценки того, как возмущения к этой прогрессии в конечном счете влияют на верность деления митотических клеток и последующую судьбу клеток.
Хотя существует ряд преимуществ для визуализации живых клеток, связаны значительные проблемы, которые должны быть рассмотрены и смягчены, когда это возможно. Одна из проблем заключается в поддержании надлежащих экологических условий для обеспечения жизнеспособности и пролиферации клеток во время визуализации. Для достижения этой цели, настройка изображений должна включать в себя экологическую камеру, которая регулирует как температуру, так и CO2. Кроме того, клетки могут быть изображены на короткий срок только с регулированием температуры, если это делается в закрытой камере. В обоих случаях для поддержания фокусировки пластин к столу и/или аппаратных подходов для смягчения колебаний осевой фокусировки (например, Perfect Focus компании Nikon) следует использовать для поддержания фокусировки пластин на протяжении всего эксперимента. Вторая существенная проблема с живой визуализации клеток является потенциал для фотоповреждения и фотоотбелевания. Photobleaching является озабоченность, где флюорофор время изображения постепенно уменьшается в интенсивности флуоресценции, как изображение прогрессирует. Тем не менее, воздействие высокой интенсивности возбуждания света, что приводит к фотоотбелению также токсичны для клеток и уход должен быть сделан, чтобы свести к минимуму воздействие клеток за счет уменьшения времени экспозиции, увеличение изображения интервалы, и общая продолжительность изображения последовательности 25. Последствия неоптимизации условий изображения для минимизации фототоксичности могут включать в себя генерацию повреждения ДНК и другие клеточные изменения, которые, в свою очередь, могут скомпрометировать интерпретацию и понимание эксперимента. Если жизнеспособность клеток становится проблемой с долгосрочной визуализации, следует приложить усилия для использования пиксельного связывания (для обеспечения более коротких экспозиций) и увеличения продолжительности между последующими захватами изображений. Дополнительная озабоченность заключается в том, что флуоресцентный тег может изменить поведение белка, к которому он сливается, или что интеграция вирусной конструкции выражения в геном может сама повлиять на клеточное поведение. Для учета возможности того, что добавление флуоресцентного тега может повлиять на функцию белка, необходима оценка функции белка после добавления флуоресцентного тега Терминала N или C и сравнение с функцией белка, не отмеченной по метки. Чтобы определить, если неблагоприятное воздействие на поведение клеток возникают из-за возмущения геномного локуса, в котором вирусная конструкция была интегрирована, несколько одноклеточных клонов должны быть получены, по сравнению с клетками, которые не имеют помечены белка, и испытания для мониторинга что клеточные фитнес и митотической прогрессии не возмущены. Кроме того, от целевых эффектов случайной интеграции вирусной конструкции экспрессии может быть смягчена путем целенаправленной интеграции белка синтеза в эндогенный локус, или другие известные области генома, используя CRISPR основе подходов.
Подходы к выявлению и характеристике основных регуляторов митотической прогрессии в значительной степени опирались на визуализацию фиксированных клеток. Mitotic регуляторов, выявленных таким образом, впоследствии были использованы в терапии ориентации быстро размножающихся раковых клеток7,8,9. Тем не менее, противомитические препараты не всегда выполняют равномерно в различных раковых заболеваний и во многих случаях понимание митотических фенотипов, которые предшествуют либо успешные или неудачные химиотерапевтические подходы остаются неясными. Визуализация времени в живых клетках для отслеживания митотических клеток в присутствии и отсутствии шпиндельных наркотиков может обеспечить понимание, необходимое для выявления этих модуляторов, которые, скорее всего, приведут к катастрофическим митозам и скомпрометированной жизнеспособности раковых клеток с минимальным воздействием на нормальные клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
DLM поддерживается GRFP NSF. ALM поддерживается финансированием из Смит семьи премии за выдающиеся достижения в области биомедицинских исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M.
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
