Summary
Qui presentiamo un protocollo per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica. La nostra applicazione di imaging time-lapse consente all'utente di identificare le cellule in varie fasi della mitosi, monitorare e identificare i difetti mitotici e analizzare la dinamica del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo l'esposizione a farmaci anti-mitotici.
Abstract
L'imaging time-lapse delle cellule vive è uno strumento importante nella biologia cellulare che fornisce informazioni sui processi cellulari che potrebbero altrimenti essere trascurati, fraintesi o mal interpretati dall'analisi a cellule fisse. Sebbene l'imaging e l'analisi delle celle fisse siano robuste e sufficienti per osservare lo stato costante cellulare, può essere limitata nella definizione di un ordine temporale di eventi a livello cellulare ed è mal equipaggiata per valutare la natura transitoria dei processi dinamici, tra cui progressione mitotica. Al contrario, l'imaging delle cellule vive è uno strumento eloquente che può essere utilizzato per osservare i processi cellulari a livello di singola cellula nel tempo e ha la capacità di catturare le dinamiche dei processi che altrimenti sarebbero scarsamente rappresentati nell'imaging di cellule fisse. Qui descriviamo un approccio per generare cellule che trasportano marcatori fluorescenti etichettati di cromatina e microtubuli e il loro uso in approcci di imaging a cellule vive per monitorare l'allineamento del cromosoma metafase e l'uscita mitotica. Descriviamo tecniche basate sull'imaging per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica, compresa l'identificazione delle cellule in varie fasi della mitosi, l'identificazione e il monitoraggio dei difetti mitotici, nonché l'analisi delle dinamiche del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo il trattamento con inibitori mitotici.
Introduction
L'analisi basata sull'immagine delle cellule fisse è comunemente usata per valutare i cambiamenti del livello della popolazione cellulare in risposta a varie perturbazioni. In combinazione con la sincronizzazione delle celle, seguita dalla raccolta e dall'imaging di punti temporali seriali, tali approcci possono essere utilizzati per suggerire una sequenza cellulare di eventi. Tuttavia, l'imaging a cellule fisse è limitato in quanto le relazioni temporali sono implicite per una popolazione e non dimostrate a livello di singole cellule. In questo modo, mentre l'imaging e l'analisi delle cellule fisse sono sufficienti per osservare fenotipi robusti e cambiamenti di stato costante, la capacità di rilevare cambiamenti transitori nel tempo e cambiamenti che influenzano solo una sottopopolazione delle cellule è imperfetta. Al contrario, l'imaging delle cellule vive è uno strumento eloquente che può essere utilizzato per osservare i processi cellulari e subcellulari all'interno di una singola cellula, o popolazione cellulare, nel tempo e senza l'aiuto di approcci di sincronizzazione che possono avere un impatto sul comportamento cellulare 1 : il nome del , 2 Il nome del sistema , 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6.
La formazione di un mandrino mitotico bipolare è essenziale per la corretta segregazione cromosomica durante la divisione cellulare, con conseguente due cellule figlie geneticamente identiche. I difetti nella struttura del mandrino mitotico che corrompono la progressione mitotica e compromettono la fedeltà della segregazione cromosomica possono portare a divisioni cellulari catastrofiche e a una riduzione della vitalità cellulare. Per questo motivo, i veleni mitotici che alterano la formazione del mandrino sono promettenti terapie per limitare la rapida proliferazione delle cellule tumorali7,8,9. Tuttavia, l'analisi a cellule fisse della struttura del mandrino dopo l'aggiunta di veleni mitotici è limitata nella sua capacità di valutare il processo dinamico di formazione del mandrino e non può indicare se i cambiamenti osservati nella struttura del mandrino sono permanenti o sono invece transitorio e può essere superato per consentire la divisione cellulare di successo.
In questo protocollo, descriviamo un approccio per valutare la dinamica della mitosi in seguito alle perturbazioni del mandrino mediante l'imaging delle cellule vive. Utilizzando la linea cellulare RPE-1 immortalata hTERT progettata per esprimere un Histone 2B con tag RFP per visualizzare la cromatina, insieme a una z-tubulina con tag EGFP per visualizzare i microtubuli, la tempistica dell'allineamento del cromosoma della metafase, l'insorgenza dell'anfase e, infine, l'insorgenza il destino delle cellule mitotiche viene valutato utilizzando segnali visivi di movimento cromosomico, compattazione e morfologia nucleare.
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Protocol
1. Generazione di cellule hTERT-RPE-1 che esprimono stabilmente RFP-Histone 2B (RFP-H2B) e z-tubulin-EGFP (tub-EGFP)
NOTA: Tutti i passi seguono tecniche asettiche e si svolgono in un armadio di sicurezza di livello di biosicurezza II (BSL2).
- Generare retrovirus che trasporta i geni di interesse (z-tubulina-EGFP e RFP-H2B) con la trasfezione di 293T cellule con le plasmiche lentivirali appropriate secondo le istruzioni del produttore del sistema di erogazione della trasfezione a base di lipidi.
- Giorno 1: Utilizzare una pastortta di vetro usa e getta per aspirare il mezzo di coltura cellulare da una piastra di cellule 293T sub-confluente e lavare via il mezzo residuo con salina tamponata fosfato (PBS) aggiungendo 5 mL di PBS. Swirl per distribuire PBS sul fondo della piastra, quindi aspirare il PBS con una pipetta pasteur in vetro usa e getta sterile.
- Aggiungete 2 mL di 0,05% di cipina che è stata preriscaldata a 37 gradi centigradi e riportare la piastra su un'incubatrice umidificata a 37 sC con 5% di CO2 per 2-5 min per consentire il rilascio delle cellule aderenti dalla superficie del piatto di coltura cellulare.
- Aggiungere 8 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina/streptomicina alla piastra contenente la trippsina.
- Risospendere le cellule con il tubo e trasferire delicatamente la sospensione in un tubo conico sterile da 15 mL. Posizionare il tubo conico in una centrifuga bilanciata e ruotare a 161 x g per 5 min a temperatura ambiente per spingere delicatamente le cellule.
- Aspirare la soluzione media/trippsina da cellule pellettate e resospendere le cellule in 10 mL di DMEM integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina. Utilizzare un emocitometro per contare le sospensioni cellulari 293T e la piastra 2 x 106 293T cellule per pozzo di un 6 pozzo.
- Cellule di coltura in un volume totale di 2 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrate con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina/streptomicina e mantenute in un incubatore umido a 37 gradi centigradi con 5% di CO2.
- Giorno 2: Pipette 7 - L di reagente di consegna trasfezione a base di lipidi e 100 l di mezzo siero ridotto in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e permettergli di incubare a temperatura ambiente per 5 min (tubo #1).
- In un tubo di microcentrismo da 1,5 mL separato, la pipetta 1 g di vettore di espressione RFP-H2B (o 1 g di vettore di espressione di z-tubulina-EGFP), insieme a 5 reagenti di potenziatore (come richiesto dalle linee guida del produttore), 0,5 g di pMD2.G e 1 psPAX2 e 100 medio siero (#2 tubo).
- Combinare il contenuto dei gradi 1.1.7 e 1.1.8 con il tubo pipettando attentamente #2 in #1 del tubo e incubare per 20 min a temperatura ambiente.
NOTA: La reazione può essere scalata in base alle esigenze per la trasfezione delle cellule in pozzi aggiuntivi. - Pipetta la reazione di trasfezione dropwise al pozzo desiderato contenente 293T cellule in 2 mL di media e riportare il piatto all'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi con 5% CO2.
NOTA: per generare celle che esprimono sia RFP-H2B che z-tubulina-EGFP, generare virus separati per ogni costrutto di espressione (passaggi 1.1.7- 1.1.9). - Giorno 3: Aspirata e sostituire il mezzo con 2 mL di DMEM fresco integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomiacina. Riportare il piatto nell'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
- Giorno 4: Raccogliere il mezzo contenente particelle virali espresse, essendo cauti a non interrompere o rimuovere 293T cellule. Filtrare il mezzo contenente particelle di virus passandolo attraverso un filtro da 0,45 M collegato a una siringa da 5 mL. Virus dell'aliquota per l'immagazzinamento a breve termine a 4 gradi centigradi, o di stoccaggio a lungo termine a -80 gradi centigradi.
NOTA: Le particelle virali ottenute in questo modo saranno presenti in un intervallo compreso tra 1 x 107 e 1 x 108 Unità trasduttrice/mL. Poiché le cellule e le cellule che producono virali da infettare sono entrambe coltivate nello stesso mezzo, la concentrazione virale per sostituire il mezzo non è necessaria e le particelle virali filtrate possono essere utilizzate direttamente per infettare le cellule. - Seme 2 x 105 cellule hTERT-RPE-1 per pozzo di un piatto di 6 po 'in preparazione per l'infezione virale. Cellule di coltura in 2 mL di DMEM integrate con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina e mantenere in un incubatore umidificato a 37 c con 5% CO2.
- Giorno 5: Aggiungere bromuro di esadimethrine (ad esempio, polibrene) alle cellule hTERT-RPE-1 ad una concentrazione finale di 8 g/mL. Infettare le cellule con una miscela di 500 l di virus diluito in 500 - L di mezzo di coltura cellulare.
NOTA: La soluzione di bromuro di hexadimethrine viene preparata in acqua distillata sterile, quindi filtrata attraverso un filtro da 0,45 m. - Giorno 6: Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro usa e getta, aspirare il mezzo da pozzi contenenti le cellule infette dal virus. Sostituire il mezzo di coltura cellulare con 2 mL di DMEM contenente 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina e concentrazioni appropriate di antibiotici da selezionare per l'integrazione e l'espressione plasmide.
NOTA: Il plasmide di espressione z-tubulina-EGFP utilizzato negli esperimenti descritti porta un gene della resistenza alla fornella e il plasmide di espressione RFP-H2B porta un gene di resistenza blasticidin. Pertanto, per la selezione delle cellule hTERT RPE-1 vengono utilizzati 10 g/mL di puromycin e 2 g/mL di blasticidin, RFP-H2B. Le concentrazioni di antibiotici utilizzati per la selezione possono differire per varie linee cellulari utilizzate. - Mantenere le cellule sotto selezione antibiotica per 5-7 giorni, sostituendo il mezzo ogni 3 giorni con un supporto fresco contenente reagenti di selezione appropriati.
NOTA: le celle devono essere mantenute alla sottoconfluenza durante la selezione e devono essere espanse in base alle esigenze, come descritto nei passaggi da 1.1.1 a 1.1.4. - Utilizzare l'imaging immunofluorescenza per confermare l'espressione dei costrutti contrassegnati.
NOTA: se lo si desidera, è possibile derivare cloni di celle singole per ottenere livelli di espressione uniformi all'interno della popolazione di celle. Una volta confermati i cloni stabili, le cellule possono essere mantenute nelle condizioni di coltura standard in assenza di selezione antibiotica.
2. Preparazione delle cellule per l'imaging delle cellule vive a seguito di perturbazioni del mandrino mitotico
NOTA: utilizzare tecniche asettiche ed eseguire i passaggi in un cabinet di sicurezza BSL2.
- Utilizzando una sterile pipetta Pasteur in vetro usa e getta, aspirare il mezzo dalla piastra di coltura contenente la linea cellulare che trasporta i costrutti di espressione (dal punto 1.7). Lavare brevemente le cellule con 10 mL di PBS sterile. Swirl per distribuire PBS sul fondo della piastra, quindi aspirare PBS con una pipetta Pasteur in vetro usa e getta sterile.
- Aggiungere 2 mL di 0,05% di prova alla piastra da 10 cm. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 2-5 min o fino a quando le cellule si sono staccate dalla superficie della piastra.
- Aggiungere 8 mL di mezzo fresco alla piastra contenente la cappina. Risospendere le cellule con il tubo e trasferire delicatamente la sospensione in un tubo conico sterile da 15 mL. Posizionare il tubo conico in una centrifuga bilanciata e ruotare a 161 x g per 5 min a temperatura ambiente per spingere delicatamente le cellule.
- Aspirare con attenzione il superatante e risospendere in 10 mL di PBS pipetting delicatamente con una pipetta sierologica da 10 mL. Posizionare il tubo conico in una centrifuga bilanciata e ruotare a 161 x g per 5 min a temperatura ambiente per spingere delicatamente le cellule.
- Aspirare con attenzione il supernatante e risospendere in 10 mL del mezzo fresco pipeting delicatamente con una pipetta sierologica da 10 mL.
- Contare le celle, quindi calcolare il numero di cella utilizzando un emacytometro e diluire ad una concentrazione di 1-2 x 105 cellule / mL nel mezzo di coltura cellulare. Semina 500 l della sospensione cellulare per ogni pozzo di una piastra inferiore sterile da 12 pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatrice a coltura cellulare e consentire alle cellule di aderire alla superficie della piastra.
NOTA: l'imaging a celle vive richiede che le cellule siano ben aderenti in modo che rimangano associate al piano di imaging durante l'acquisizione dell'immagine. La durata del tempo necessario affinché le cellule aderiscano dopo la placcatura possono differire da una linea cellulare a quella successiva e devono essere ottimizzate per la linea cellulare in fase di studio. - Fino a 30 minuti prima di inizializzare l'imaging time-lapse, aggiungere una concentrazione rilevante di un farmaco mitotico a uno o più pozzi seminato con le cellule. Per tenere conto del potenziale impatto del solvente organico sul comportamento cellulare, aggiungere lo stesso volume del diluente dell'inibitore alle cellule come controlli. Ad esempio, assicurarsi che l'aggiunta di 100 nM dell'inibitore specifico della chinasi mitotica Aurora A (ad esempio, alisertib) sia parallela a un volume uguale di DMSO, il diluente per questo farmaco, in un pozzo di controllo delle cellule.
NOTA: L'analisi comparativa dei cambiamenti dinamici nella progressione mitotica richiede la preparazione di pozzi di cellule in assenza di perturbazioni per consentire l'imaging di mitosi normali in parallelo alle condizioni sperimentali.
3. Microscopio impostato per l'imaging time-lapse di RFP-H2B, cellule esprimibili di z-tubulina-GFP (Figura 1, Figura 2)
- Posizionare la piastra di coltura cellulare contenente RFP-H2B, con cellule hTERT RPE-1 che esprimono le cellule hTERT RPE-1 in un inserto di fase appropriato su un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di una fotocamera ad alta risoluzione (dimensione in pixel di 0,67 camera ambientale preriscaldata a 37 gradi centigradi, e un sistema di erogazione per umidificato 5% CO2.
NOTA: sia le camere ambientali chiuse che gli inserti a fase controllata dalla temperatura possono essere appropriati a condizione che sia possibile fornire il 5% di CO2 umidificato e ottenere un controllo stabile della temperatura. - Utilizzare un obiettivo d'aria 20x con un'apertura numerica di 0,5 e attrezzato per la fluorescenza ad alto contrasto e il contrasto di fase o l'imaging del campo luminoso. Visualizzare le celle con il contrasto di fase o il campo luminoso e regolare il percorso e la messa a fuoco fine sul microscopio per mettere a fuoco le cellule.
- Identificare e impostare i tempi di esposizione ottimali per l'acquisizione di immagini di campo luminoso, GFP e RFP selezionando il rispettivo cubo di filtro con eccitazione ed emissione appropriate per i fluorofori che verranno fotografati. In alternativa, fare clic sul pulsante di esposizione automatica per immettere un tempo di esposizione predeterminato. Se il segnale non è sufficientemente intenso, selezionare il binning dei pixel per consentire tempi di esposizione più brevi facendo clic sulla scheda binning e selezionando 2 x 2 pixel binning dal menu a discesa.
NOTA: La fototossicità può compromettere la progressione mitotica e la vitalità cellulare. Il fallimento delle cellule mitotiche nelle popolazioni di controllo nel completare le mitosi normali può essere un'indicazione che i tempi di esposizione e/o la durata dell'imaging devono essere ulteriormente ottimizzati. - Utilizzare un software di acquisizione e analisi che consente di acquisire contemporaneamente l'imaging multi-coordinate e multi-pozzetto e definire i parametri per l'acquisizione dell'immagine.
- Selezionare e calibrare lo stadio del microscopio al piatto multi-bene, secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare il software di acquisizione delle immagini per evidenziare o selezionare in altro modo i pozze che verranno immagini facendo clic sui pozzi rilevanti nel diagramma del formato piastra che viene utilizzato.
- Sotto il pannello di controllo GeneratedPoints (Figura 2), definire le coordinate all'interno di ogni pozzo che verrà visualizzato facendo clic sulla scheda Posizionamento punti e selezionando il posizionamento delle coordinate predefinite o casuali da dal menu a discesa. Selezionare la scheda Area di lavoro e selezionare limitata dal menu a discesa per limitare l'area di selezione delle coordinate per escludere i contorni del pozzo. Fare clic sulle schede Conteggio e Distribuzione per selezionare rispettivamente il numero e la distribuzione dei punti da acquisire.
NOTA: Il numero di coordinate che possono essere imagete per bene all'interno dell'incremento del tempo di 5 min sarà limitato dal numero di pozzi da immaginare, nonché dal tempo di esposizione per ogni canale. Tipicamente, 5-8 coordinate per pozzo sono sufficienti per osservare almeno 50 cellule in ogni condizione di progresso attraverso la mitosi entro 4 h. - Selezionare e immettere l'intervallo di tempo e la durata per raccogliere le immagini facendo clic e immettendo i valori nel pannello di controllo TimeSequence.
NOTA: L'acquisizione di immagini ogni 1-5 minuti è appropriata per monitorare le dinamiche della progressione mitotica. La durata complessiva dell'imaging deve riflettere l'endpoint desiderato e la velocità di proliferazione della linea cellulare. Ad esempio, 4 ore sono sufficienti per vedere molte cellule progredire attraverso la mitosi, 16 ore sono sufficienti per vedere la maggior parte delle cellule RPE-1 in una popolazione asincrona progredire attraverso la mitosi.
4. Analisi dell'immagine time-lapse per determinare la temporizzazione della metafase e il destino delle cellule mitotiche a seguito di perturbazioni del mandrino mitotico
NOTA: eseguire l'analisi delle immagini utilizzando un software di acquisizione immagini (Table of Materials), ImageJ o un software di analisi delle immagini comparabile.
- Visualizza la cromatina etichettata RFP-H2B selezionando le immagini acquisite con il cubo del filtro RFP sul posto. Identificare una cella che entra in mitosi come indicato dalla compattazione iniziale della cromatina(Figura 2C,freccia blu) e l'inviluppo nucleare si rompe (quando la z-tubulina-EGFP non è più esclusa dal confine nucleare).
- Determinare la temporizzazione mitotica dell'allineamento della metafase e dell'insorgenza dell'anafase nelle singole celle: traccia reperino la cella attraverso i tempi consecutivi nel filmato acquisito per determinare il numero di punti temporali/minuti dall'immissione mitotica fino alla cromatina con etichetta RFP-H2B completa l'allineamento in corrispondenza dell'equatore cellulare durante la metafase (Figura 2C, punta della freccia gialla).
- Per monitorare la temporizzazione mitotica, la fedeltà mitotica e il destino delle cellule, continuare a tracciare la cella attraverso tempi consecutivi per identificare la coordinata temporale in cui è evidente la segregazione del cromosoma anaphase(Figura 2C, freccia bianca) e/o dove si è verificata la decompazione della cromatina e la riforma dell'involucro nucleare (come indicato dall'esclusione della tubulina dal nucleo).
NOTA: le perturbazioni nell'assemblaggio del mandrino o nella progressione mitotica possono essere valutate in funzione del tempo necessario per ottenere un mandrino mitotico bipolare e ottenere un allineamento cromosomico completo o per completare la segregazione del cromosoma anaphase. - Visualizza RFP-H2B per identificare le cellule in ogni popolazione che presentano difetti mitotici, tra cui cromosomi in ritardo e ponti cromatici durante la segregazione cromosomica anafase.
NOTA: La fedeltà mitotica compromessa può anche provocare cellule figlie multinucleate o micronucleate e può essere visualizzata nelle celle dopo l'uscita mitotica, come nella Figura 3.
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Representative Results
Valutazione della progressione mitotica in presenza di perturbazioni del mandrino
La regolazione della messa a fuoco del mandrino è un passo essenziale nella corretta formazione del mandrino bipolare. Interruzione in questo processo attraverso l'esaurimento delle proteine, inibizione dei farmaci, o alterazioni nel numero centroso centroso struttura del mandrino corrotto e ritardare o arrestare la progressione mitotica10,11,12,13. Tuttavia, alcune perturbazioni ritardano solo transitoriamente la formazione del mandrino con le cellule che alla fine procedono attraverso la mitosi per completare la segregazione del cromosoma anafase14. In assenza di approcci di sincronizzazione cellulare, che possono avere un impatto indiretto sui processi mitotici1,2, le celle avanzano attraverso la mitosi in modo asincrono (Figura 2C). Utilizzando RFP-H2B per identificare la cromatina, le cellule mitotiche con cromatina compatta possono essere attribuite alla prometafase (quelle precedenti all'allineamento completo della metafase: Figura 2C, punte di freccia blu), metafase (allineamento cromosomico completo: Figura 2 C, punte di freccia gialle) e anaphase (i cromosomi vengono separati verso i poli del mandrino: Figura 2C, punte di freccia bianche). La cattura di 5-8 coordinate superiori a 4 h è sufficiente per seguire la progressione di almeno 50 cellule attraverso la mitosi in una determinata condizione. Per studiare la dinamica dell'assemblaggio del mandrino in seguito ad alterazioni del numero centrosomie e/o dell'inibizione dell'Aurora Una chinasi, un importante regolatore di messa a fuoco del mandrino di messa a fuoco14,15,16, 17, abbiamo usato l'imaging time-lapse delle cellule vive di cellule umane con 2 centrosomi, o di quelle contenenti centrisomi supernumerari. Le cellule sono state coltivate in presenza o assenza dell'inibitore della chinasi Aurora A prima dell'inizio dell'imaging. Le cellule con 2 centrisomi sperimentano l'interruzione della progressione mitotica quando vengono trattate con l'aurora Un inibitore della chinasi, ma sono in ultima analisi in grado di ottenere l'allineamento del cromosoma metafase (Figura 2C, punta di freccia gialla). Al contrario, le cellule con >2 centrosomi sono squisitamente sensibili all'inibizione dell'Aurora A e presentano un aumento delle cellule prometaphase e un'assenza di cellule metafase, indicando un ritardo nell'assemblaggio del mandrino e nella progressione mitotica.
La figura 3 dimostra che tali approcci di imaging time-lapse sono sufficienti per monitorare sia l'assemblaggio del mandrino che la fedeltà mitotica. Con la visualizzazione di z-tubulina-EGFP, è stato osservato che le cellule che sperimentano l'interruzione del mandrino (mostrato qui a causa della sovraduplicazione del centrosome) subiscono cambiamenti dinamici mentre si ottiene la messa a fuoco del palo del mandrino e si forma un mandrino mitotico bipolare in preparazione per divisione f cellulare. Simultaneo all'assemblaggio del mandrino, il movimento cromosomico può essere visualizzato con RFP-H2B per valutare l'allineamento del cromosoma e la fedeltà della segregazione. Le cellule mitotiche che sperimentano il multipolarismo del mandrino transitorio sono soggette a errori di attaccamento che causano cromosomi in ritardo durante l'anafase e formano micronuclei nella successiva fase G1 del ciclo cellulare. Tali difetti sono evidenti con questi approcci di imaging delle cellule vive.
Cambiamenti nella progressione dinamica della mitosi alter tempicromici e impatto destino delle cellule mitotiche
In seguito alla rottura dell'involucro nucleare, la formazione del mandrino e il movimento cromosomico possono essere tracciati attraverso le fasi della mitosi per valutare la progressione mitotica, la durata e il destino delle cellule che progrediscono in anaphase. L'amplificazione centroso, caratteristica comune in molti tipi di cancro, è caratterizzata dalla presenza di centrosomi extra e dalla formazione di mandrini multipolari18,19,20. Poiché le divisioni multipolari si traducono in cellule figlie altamente aneuploidi e probabilmente non redditizie, le cellule tumorali amcolinoso centrisori extra per formare un mandrino bipolare e sottoporsi a una divisione bipolare5,20,21, 22,23,24. Utilizzando approcci di imaging delle cellule vive, i nostri risultati rappresentativi mostrano che le cellule con un normale contenuto centrosomi sono in grado di procedere dalla rottura delle buste nucleari attraverso l'allineamento della metafase e l'insorgenza di anaphase per raggiungere una divisione bipolare in meno di 30 minuti ( Figura 4 A,D,E). In presenza di centrioni extra, quasi il 50% delle cellule sono in grado di superare un mandrino mitotico mitotico transiente e di formare un mandrino bipolare e una divisione cellulare completa (Figura 4C,D). Le cellule rimanenti non sono in grado di ottenere un mandrino bipolare e di conseguenza uscita mitosi attraverso una divisione multipolare (Figura 4B,D). Indipendentemente dal fatto che si otturi il bipolarismo del mandrino, le cellule con centrine extra presentano una durata significativamente aumentata della mitosi rispetto alle cellule con 2 centrosomi, indicando che la dinamica della progressione mitotica può essere alterata anche quando i cambiamenti esito mitotico non sono evidenti (Figura 4E).
Figura 1: Selezione dei parametri del microscopio e della fotocamera. (A) Rappresentazione della finestra per selezionare l'obiettivo desiderato e il cubo del filtro appropriato utilizzando un software di acquisizione immagini. Mostrata la selezione dell'obiettivo di ingrandimento 20x e del cubo del filtro brightfield. (B) Le cellule nella piastra campione vengono trovate e portate a fuoco utilizzando la microscopia a contrasto di fase o di campo luminoso. (C) Rappresentazione della finestra per impostare i parametri di esposizione per ogni acquisizione di immagini. Il binning dei pixel può essere utilizzato, se necessario, per ridurre il tempo di esposizione per acquisizione e ridurre al minimo i danni alle foto. Barra della scala è di 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: acquisizione di immagini e analisi della microscopia time-lapse. (A e B) Rappresentazione della finestra che indica come vengono impostati i parametri di acquisizione delle immagini utilizzando NIS Elements HCA utilizza il software di acquisizione delle immagini di NIS Elements HCA. Questo software consente l'imaging multi-coordinate e multi-pozzo nel tempo. Ogni lavoro può essere modificato per specificare pozzi e coordinate da acquisire. (C) Singolo intervallo di tempo da quattro condizioni di un esperimento. RFP-H2B viene utilizzato per tenere traccia della cromatina. La compattazione e il posizionamento della cromatina sono utilizzati per identificare diverse fasi della mitosi: Prometafase (compazione in assenza di allineamento cromosomico, punta della freccia blu), Metafase (allineamento cromosomico completo all'equatore cellulare, punta della freccia gialla) e Anafase (a seguito dell'avvio della segregazione cromosomica sincrona, punta di freccia bianca). Barra della scala è 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'imaging time-lapse visualizza i difetti nella fedeltà mitotica. Le cellule contenenti centrisori extra formano fusi multipolari e spesso li raggruppano in un mandrino bipolare prima di completare la divisione cellulare. Qui, una cella entra nella mitosi con sette distinti pali del mandrino (asterischi bianchi) che, nel tempo, sono raggruppati in due poli mandrino principali. A questo punto, i cromosomi sono in grado di allinearsi lungo l'equatore del mandrino e la cellula procede verso l'anafase. La multipolarità transitoria ha permesso un malattaccamento di un singolo cromosoma. Questo errore irrisolto provoca un cromosoma in ritardo durante l'anafase che viene incorporato in un micronucleo in una cellula figlia (etichettato con una freccia). La cromatina viene visualizzata con RFP-Histone 2B e i microtubuli sono visualizzati con z-tubulina-EGFP. I timestamp di ciascun pannello indicano i verbali relativi all'apparente ripartizione delle buste nucleari, come giudicato dal rilevamento della tubulina all'interno del confine nucleare. Barra della scala è 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: I cambiamenti nella progressione dinamica della mitosi alterano la tempistica mitotica e il destino delle cellule mitotiche. RFP-H2B, mostrato in rosso, viene utilizzato per monitorare il movimento della cromatina e la z-tubulina-GFP, mostrata in verde, viene utilizzata per monitorare il numero di palo centroso/spindle e l'organizzazione. La perdita di esclusione GFP-tubulina dal nucleo, in concomitanza con la compattazione precoce della cromatina è un'indicazione che l'involucro nucleare si è rotto (NEB) in preparazione per la divisione delle cellule mitotiche. L'esclusione nucleare della GFP-tubulina è evidente dopo l'uscita mitotica e la riforma dell'involucro nucleare. (A) Una cellula con due centrosori forma un mandrino bipolare e progredisce attraverso l'anafase per formare due cellule figlie. (B e C) Le cellule con centrine extra entrano nella mitosi per formare un mandrino multipolare. (B) Alcune di queste cellule con centrisori extra ritardano la mitosi senza ottenere un mandrino bipolare e progressi verso il completamento dell'anafase multipolare. (C) Altre cellule con centrisori supplementari presentano un ritardo transitorio nella progressione mitotica mentre si raggruppano centrisori extra per consentire l'anafase bipolare. (D) Le cellule con centrisori supplementari sono in grado di subire una divisione bipolare circa il 50% delle volte, mentre le cellule rimanenti con centrisori extra subiscono una divisione multipolare. (E) Le cellule con centrisori supplementari hanno aumentato la tempistica mitotica indipendentemente dall'eventuale destino mitotico (anafase bipolare o multipolare). Barra della scala è 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La risoluzione temporale fornita dall'imaging time-lapse consente la visualizzazione e la valutazione degli eventi cellulari sequenziali all'interno di singole cellule. Gli approcci che fanno uso della sincronizzazione cellulare seguita dalla raccolta e dalla fissazione delle cellule nei punti temporali sequenziali sono limitati in quanto i confronti vengono infine effettuati tra popolazioni di cellule. Nei contesti in cui la risposta cellulare alle perturbazioni può essere non uniforme, o in cui il processo visualizzato è dinamico, l'imaging time-lapse delle cellule vive è meglio attrezzato per seguire e analizzare sia la dinamica delle singole cellule, sia l'eterogeneità all'interno di una popolazione cellulare. In questo modo, l'imaging time-lapse è particolarmente utile nel monitorare la progressione cellulare attraverso le fasi dinamiche della mitosi e valutare come le perturbazioni a questa progressione in ultima analisi influiscono sulla fedeltà della divisione cellulare mitotica e del successivo destino cellulare.
Mentre ci sono una serie di vantaggi per l'imaging delle cellule vive, sono associate sfide significative che devono essere considerate e mitigate quando possibile. Una sfida consiste nel mantenere condizioni ambientali adeguate per garantire la vitalità e la proliferazione delle cellule durante l'imaging. A tale scopo, il set-up di imaging deve includere una camera ambientale che regola sia la temperatura che la CO2. In alternativa, le cellule possono essere immagine per un breve termine con solo regolazione della temperatura se fatto in una camera chiusa. In entrambi i casi, l'uso di una tabella antivibrazione e/o di approcci basati sull'hardware per mitigare le fluttuazioni di messa a fuoco assiali (ad esempio, Perfect Focus di Nikon) deve essere impiegato per mantenere la messa a fuoco della piastra per tutta la durata dell'esperimento. Una seconda preoccupazione significativa per l'imaging delle cellule vive è il potenziale di fotodanno e fotosbiancamento. Il fotosbiancamento è una preoccupazione in cui il fluoroforo che viene fotografato diminuisce gradualmente nell'intensità della fluorescenza man mano che l'imaging progredisce. Tuttavia, l'esposizione alla luce di eccitazione ad alta intensità che si traduce nel fotosbiancamento è anche tossica per le cellule e occorre curare per ridurre al minimo l'esposizione delle cellule riducendo i tempi di esposizione, gli intervalli di acquisizione delle immagini e la durata totale della sequenza di imaging 25.Le conseguenze della non ottimizzazione delle condizioni di imaging per ridurre al minimo la fototossicità possono includere la generazione di danni al DNA e altri cambiamenti cellulari che a loro volta possono compromettere l'interpretazione e la comprensione dell'esperimento. Se la vitalità cellulare dovesse diventare un problema con l'imaging a lungo termine, è necessario sforzarsi di utilizzare il binning dei pixel (per consentire esposizioni più brevi) e aumentare la durata tra le successive acquisizioni di immagini. Un'ulteriore preoccupazione è che il tag fluorescente può alterare il comportamento della proteina a cui è fusa, o che l'integrazione del costrutto dell'espressione virale nel genoma stesso può influenzare il comportamento cellulare. Per tenere conto della possibilità che l'aggiunta di un tag fluorescente possa avere un impatto sulla funzione proteica, è necessaria una valutazione della funzione proteica dopo l'aggiunta di un tag fluorescente terminale N o C e il confronto con la funzione proteica non marcata. Per determinare se gli effetti avversi sul comportamento cellulare sorgono a causa della perturbazione del locus genomico in cui è stato integrato il costrutto virale, devono essere derivati più cloni di una singola cellula, rispetto alle cellule che non hanno la proteina marcata, e testati per monitorare che la forma fisica cellulare e la progressione mitotica non sono perturbate. In alternativa, gli effetti fuori target dell'integrazione casuale del costrutto di espressione virale possono essere attenuati attraverso l'integrazione mirata della proteina di fusione nel locus endogeno, o in altre regioni conosciute del genoma, utilizzando approcci basati su CRISPR.
Gli approcci per identificare e caratterizzare i principali regolatori della progressione mitotica si sono molto basati sull'imaging a cellule fisse. I regolatori mitotici identificati in questo modo sono stati successivamente sfruttati nelle terapie che si prendono di mira le cellule tumorali a rapida proliferazione7,8,9. Tuttavia, i farmaci antimitotici non sempre funzionano in modo uniforme in diversi tipi di cancro e in molti casi la comprensione dei fenotipi mitotici che precedono approcci chemioterapici di successo o non riusciti rimangono poco chiare. L'imaging time-lapse delle cellule vive per tracciare le cellule mitotiche in presenza e l'assenza di farmaci perturbanti dal mandrino ha il potenziale per fornire le informazioni necessarie per identificare quei modulatori più suscettibili di provocare mitosi catastrofici e cellule tumorali con un impatto minimo sulle cellule normali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
DLM è supportato da una NSF GRFP. ALM è supportato dal finanziamento dello Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
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