Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma dynamiken i spindel bildning och mitotisk progression. Vår tillämpning av tidsförlopp Imaging gör det möjligt för användaren att identifiera celler i olika stadier av Mitos, spåra och identifiera mitotiska defekter, och analysera spindel dynamik och mitotiska cell öde vid exponering för anti-mitotiska läkemedel.
Abstract
Live cell Time-lapse Imaging är ett viktigt verktyg i cellbiologi som ger insikt i cellulära processer som annars kan förbises, missförstås eller misstolkas av den fasta cell analys. Medan den fasta cell avbildning och analys är robust och tillräcklig för att observera cellulära steady-state, kan det begränsas i att definiera en temporal ordning av händelser på cellnivå och är dåligt rustad för att bedöma den övergående karaktären av dynamiska processer, inklusive mitotisk progression. Däremot är Live cell Imaging ett vältaligt verktyg som kan användas för att observera cellulära processer på encelliga nivå över tid och har kapacitet att fånga dynamiken i processer som annars skulle vara dåligt representerade i fasta cell avbildning. Här beskriver vi en metod för att generera celler som transporterar Fluorescent märkta markörer för kromatin och mikrotubuli och deras användning i levande cell avbildning metoder för att övervaka metafas kromosom justering och mitotisk utgång. Vi beskriver Imaging-baserade tekniker för att bedöma dynamiken i spindel bildning och mitotisk progression, inklusive identifiering av celler i olika stadier i Mitos, identifiering och spårning av mitotiska defekter och analys av spindeldynamik och mitotiska cellers öde efter behandlingen med mitotiska hämmare.
Introduction
Bildbaserad analys av fasta celler används ofta för att bedöma förändringar i cell populations nivån som svar på olika störningar. I kombination med cellsynkronisering, följt av insamling och avbildning av seriella tidspunkter, kan sådana metoder användas för att föreslå en cellulär sekvens av händelser. Icke desto mindre, fast cell avbildning är begränsad i att temporala relationer är underförstått för en population och inte visas på nivån för enskilda celler. På detta sätt, medan fast cell avbildning och analys är tillräcklig för att iaktta robusta fenotyper och steady-state förändringar, förmågan att upptäcka övergående förändringar över tid och förändringar som påverkar endast en subpopulation av cellerna är ofullkomlig. I motsats, Live cell Imaging är ett vältaligt verktyg som kan användas för att observera cellulära och subcellulära processer inom en enda cell, eller cellulära befolkningen, över tid och utan hjälp av synkroniseringsmetoder som själva kan påverka cellulära beteende 1 , 2 , 3 , 4 , ,5 , 6.
Bildandet av en bipolär mitotisk spindel är avgörande för korrekt kromosom segregering under celldelningen, vilket resulterar i två genetiskt identiska dotterceller. Defekter i mitotisk spindel struktur som korrupt mitotisk progression och äventyra trohet av kromosom segregering kan resultera i katastrofala celldelningar och minskad cell lönsamhet. Av denna anledning, mitotiska gifter som förändrar spindel bildning är lovande Therapeutics att begränsa den snabba spridningen av cancerceller7,8,9. Icke desto mindre, fast cell analys av spindel struktur efter tillsats av mitotiska gifter är begränsad i sin förmåga att bedöma den dynamiska processen av spindel bildning och kan inte indikera om observerade förändringar i spindel struktur är permanenta eller är i stället övergående och kan övervinnas för att möjliggöra framgångsrik celldelning.
I detta protokoll beskriver vi en metod för att bedöma dynamiken i Mitos efter spindel störningar genom levande cell avbildning. Använda hTERT förevigat RPE-1 cellinjer konstruerade för att uttrycka en RFP-märkt Histone 2B att visualisera kromatin, tillsammans med en EGFP-märkta α-tubulin att visualisera mikrotubuli, tidpunkten för metafas kromosom justering, Anaphasen debut, och i slutändan mitotiska cellers öde bedöms med hjälp av visuella ledtrådar av kromosom rörelse, kompakaktion och nukleär morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering av hTERT-RPE-1-celler som stabilt uttrycker RFP-Histone 2B (RFP-H2B) och α-tubulin-EGFP (tub-EGFP)
Anmärkning: alla steg följer aseptiska tekniker och sker i ett säkerhetsskåp för biosäkerhetsnivå II + (BSL2 +).
- Generera retrovirus som transporterar gener av intresse (α-tubulin-EGFP och RFP-H2B) genom transfektion av 293T celler med lämpliga lentivirala plasmider enligt tillverkarens instruktioner av lipidbaserade transfektion leveranssystem.
- Dag 1: Använd ett engångsglas Pasteur pipett för att aspirera cell odlingsmediet från en platta av sub-confluent 293T celler och tvätta bort resterande medium med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att tillsätta 5 mL PBS. Snurra för att fördela PBS över plattan botten, sedan aspirera PBS med en steril engångsglas Pasteur pipett.
- Tillsätt 2 mL 0,05% trypsin som har förvärmts till 37 ° c och returnera plattan till en fuktad inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 i 2 till 5 min för att tillåta att anhängare av cellerna frigörs från cellkulturens skålen.
- Tillsätt 8 mL färsk Dulbecco ' s modifierade Eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin till plattan som innehåller trypsin.
- Omsuspendera cellerna genom att försiktigt Pipettera och överför suspensionen till ett sterilt 15 mL koniskt rör. Placera det koniska röret i en balanserad centrifug och snurra på 161 x g i 5 min vid rumstemperatur för att försiktigt pelleten cellerna.
- Aspirera medel/trypsinlösningen från pelleterade celler och Omsuspendera celler i 10 mL DMEM kompletterad med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin. Använd en hemocytometern för att räkna 293T cellsuspensionen och plattan 2 x 106 293t celler per brunn av en 6 väl tallrik.
- Kultur celler i en total volym av 2 mL av Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin och underhålla i en fuktad inkubator vid 37 ° c med 5% CO2.
- Dag 2: Pipettera över 7 μL lipidbaserat transfektionsreagens och 100 μL reducerat serum medium till ett 1,5 mL microcentrifugerör och låt det Inkubera i rumstemperatur under 5 min (tub #1).
- I ett separat 1,5 mL microcentrifugerör, Pipettera 1 μg RFP-H2B Expression Vector (eller 1 μg α-tubulin-EGFP Expression Vector), tillsammans med 5 μL Enhancer reagens (enligt tillverkarens riktlinjer), 0,5 μg pMD2. G och 1 μg psPAX2 och 100 μL reducerad serum medium (tub #2).
- Kombinera innehållet i steg 1.1.7 och Step 1.1.8 genom att noggrant Pipettera röret #2 in i röret #1 och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
Anmärkning: reaktionen kan skalas vid behov för transfektion av celler i ytterligare brunnar. - Pipettera över transfektionreaktionen droppvis till den önskade brunnen som innehåller 293t-celler i 2 ml medium och returnera skålen till den befuktade inkubatorn vid 37 ° c med 5% Co2.
Anmärkning: för att generera celler som uttrycker både RFP-H2B och α-tubulin-EGFP, generera separata virus för varje uttryck konstruera (steg 1.1.7-1.1.9). - Dag 3: aspirera och ersätt mediet med 2 mL färskt DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin. Returnera skålen till den befuktade inkubatorn vid 37 ° c med 5% CO2.
- Dag 4: samla mediet som innehåller uttryckta viruspartiklar, är försiktig att inte störa eller ta bort 293T celler. Filtrera mediet som innehåller viruspartiklar genom att skicka det genom ett 0,45 μM-filter som fästs på en 5 mL-spruta. Aliquot-virus för korttidsförvaring vid 4 ° c eller långtidsförvaring vid-80 ° c.
Anmärkning: virala partiklar som erhålls på detta sätt kommer att finnas i ett intervall på ~ 1 x 107 till 1 x 108 transducing enheter/ml. Eftersom virusproducerande celler och celler som skall smittas båda odlas i samma medium, är viral koncentration att ersätta mediet inte krävs och filtrerade virala partiklar kan användas direkt för att infektera celler. - Utsäde 2 x 105 hTERT-RPE-1 celler per brunn av en 6-väl skålen som förberedelse för virusinfektion. Odlings celler i 2 mL DMEM kompletterad med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin och underhåller i en fuktad inkubator vid 37 ° c med 5% CO2.
- Dag 5: Tillsätt hexadimethrine (t. ex. polybrene) till hTERT-RPE-1-cellerna till en slutlig koncentration på 8 μg/mL. Infektera celler med en blandning av 500 μL virus utspädd i 500 μL cell odlingssubstrat.
Anmärkning: stamlösning av Hexadimetrin bromid bereds i sterilt destillerat vatten och filtreras sedan genom ett 0,45 μm-filter. - Dag 6: Använd ett engångsglas Pasteur pipett, aspirera mediet från brunnar som innehåller virusinfekterade celler. Byt ut cell odlingsmediet mot 2 mL DMEM som innehåller 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin och lämpliga koncentrationer av antibiotika för att välja plasmid-integrering och-uttryck.
Anmärkning: α-tubulin-EGFP uttrycket plasmid används i de beskrivna experimenten bär en puromycin-resistens gen och RFP-H2B Expression plasmid bär en blasticidin motstånds gen. Därför används 10 μg/mL puromycin och 2 μg/mL blasticidin för val av α-tubulin-EGFP, RFP-H2B som uttrycker hTERT RPE-1-celler. Koncentrationer av antibiotika som används för urvalet kan variera för olika cellinjer som används. - Behåll celler under antibiotikum val för 5-7 dagar, ersätter mediet var 3 dagar med färskt medium som innehåller lämpliga reagenser.
Anmärkning: celler bör bibehållas vid underflödet under urvalet och bör utökas vid behov, enligt beskrivningen i steg 1.1.1 till 1.1.4. - Använd immunofluorescensavbildning för att bekräfta uttrycket av taggade konstruktioner.
ANMÄRKNINGAR: om så önskas kan enstaka cell kloner härledas för att erhålla enhetliga uttrycks nivåer inom cellpopulationen. När stabila kloner bekräftas, celler kan upprätthållas under standardkulturen villkor i avsaknad av antibiotikum urval.
2. beredning av celler för levande cell avbildning efter perturbationer av mitotisk spindel
Obs: Använd aseptisk teknik och utför stegen i ett BSL2 säkerhetsskåp.
- Med hjälp av en steril engångsglas Pastorpipett, aspirera mediet från odlingsplattan som innehåller den cellinjer som bär uttrycket konstruera (s) (från steg 1,7). Tvätta snabbt cellerna med 10 mL steril PBS. Snurra för att fördela PBS över plattan botten, sedan aspirera PBS med en steril disponibel glas Pasteur pipett.
- Tillsätt 2 mL 0,05% trypsin till 10 cm plattan. Inkubera plattan vid 37 ° c i 2-5 min eller tills cellerna har lossnat från plattytan.
- Tillsätt 8 mL färskt medium till plattan som innehåller trypsin. Omsuspendera cellerna genom att försiktigt Pipettera och överför suspensionen till ett sterilt 15 mL koniskt rör. Placera det koniska röret i en balanserad centrifug och snurra på 161 x g i 5 min vid rumstemperatur för att försiktigt pelleten cellerna.
- Sug försiktigt upp supernatanten och Omsuspendera i 10 ml PBS genom att Pipettera försiktigt med en 10 ml serologiska pipett. Placera det koniska röret i en balanserad centrifug och snurra på 161 x g i 5 min vid rumstemperatur för att försiktigt pelleten cellerna.
- Sug försiktigt upp supernatanten och Omsuspendera i 10 ml av det friska mediet genom att Pipettera försiktigt med en 10 ml serologiska pipett.
- Räkna celler, sedan beräkna cellnumret med hjälp av en hemacytometer och späd till en koncentration av 1-2 x 105 celler/ml i cell odlingsmediet. Utsäde 500 μL av cellsuspensionen till varje brunn av en steril 12-brunn Imaging bottenplattan. Placera plattan i cellkulturens inkubator och låt cellerna hålla sig till plattytan.
Obs: levande cell avbildning kräver att celler är väl förbundna så att de förblir associerade med bildplanet under bild anskaffningen. Varaktigheten av den tid som behövs för celler att följa efter bordläggningen kan skilja sig från en cellinjer till nästa och bör optimeras för cell linjen under studie. - Upp till 30 min innan du påbörjar fotografering med tidsfördröjning, tillsätt en relevant koncentration av ett mitotiskt läkemedel till en eller flera av brunnarna som är seedade med celler. För att redogöra för den potentiella effekten av det organiska lösningsmedlet på cellulära beteenden, tillsätt en likvärdig volym av inhibitoren spädningsvätska till celler som kontroller. Till exempel, se till att tillsatsen av 100 nM av den specifika hämmare av mitotiska Kinas Aurora A (t. ex., alisertib) är parallellt med en lika volym av DMSO, spädningsvätskan för detta läkemedel, i en kontroll väl av celler.
Anmärkning: jämförande analys av dynamiska förändringar i mitotisk progression kräver brunnar av celler som skall förberedas i avsaknad av störningar att möjliggöra avbildning av normala mitoser parallellt med experimentella förhållanden.
3. Mikroskop som inrättats för fotografering med tidsförlopp av RFP-H2B, α-tubulin-GFP-uttryck celler (figur 1, figur 2)
- Placera cell odlingsplattan som innehåller RFP-H2B, α-tubulin-GFP som uttrycker hTERT RPE-1-celler som ska avbildas i ett lämpligt skede Infoga på ett inverterat epifluorescensmikroskop som är utrustat med en högupplöst kamera (pixelstorlek 0,67 μm vid 20x), en miljökammare förvärmd till 37 ° c, och ett leveranssystem för befuktade 5% CO2.
Anmärkning: antingen slutna miljökammare eller temperaturstyrda steg skär kan vara lämpliga förutsatt att befuktade 5% CO2 kan levereras och stabil temperaturkontroll erhålls. - Använd ett 20x luft mål med en numerisk bländare på 0,5 och utrustad för hög kontrast fluorescens och faskontrast eller brightfield Imaging. Visa celler med fas kontrasten eller brightfield och justera banan och fokusera på mikroskopet för att få cellerna att fokusera.
- Identifiera och Ställ in optimala exponeringstider för brightfield, GFP och RFP bild anskaffning genom att välja respektive filterkub med lämplig excitation och emission för de fluoroforer som kommer att avbildas. Du kan också klicka på knappen automatisk exponering för att ange en förutbestämd exponeringstid. Om signalen inte är tillräckligt intensiv väljer du pixel-Binning för att aktivera kortare exponeringstider genom att klicka på fliken Binning och välja 2 x 2 pixel Binning från rullgardinsmenyn.
Anmärkning: fototoxicitet kan försämra mitotisk progression och cellernas lönsamhet. Fel på mitotiska celler i kontrollpopulationer för att slutföra normala mitoser kan vara en indikation på att exponeringstider och/eller bildbehandlings tid måste optimeras ytterligare. - Använd en förvärvs-och analysprogramvara som gör att multikoordinat, multi-well avbildning kan förvärvas samtidigt och definiera parametrarna för bild anskaffningen.
- Välj och kalibrera mikroskopet scenen till multi-well skålen, enligt tillverkarens anvisningar. Använd programvaran för bild anskaffning för att markera eller på annat sätt välja de brunnar som ska avbildas genom att klicka på de relevanta brunnarna i diagrammet över det plattformat som används.
- Under den Generatedpoints Kontrollpanelen (figur 2), definiera koordinaterna inom varje brunn som kommer att avbildas genom att klicka på fliken punkt placering och välja fördefinierade eller slumpmässig koordinat placering från den nedrullningsbara menyn. Välj fliken arbetsområde och välj begränsad från den nedrullningsbara menyn för att begränsa koordinatmarkeringsområdet så att gränserna för brunnen utesluts. Klicka på flikarna antal och fördelning för att välja antal och fördelning av poäng som ska fångas per brunn respektive.
Anmärkning: antalet koordinater som kan avbildas per brunn inom 5 min tidpunkten ökning kommer att begränsas av antalet brunnar som skall avbildas, samt exponeringstiden för varje kanal. Typiskt, 5-8 koordinater per brunn är tillräckliga för att observera minst 50 celler i varje tillstånd framsteg genom Mitos inom 4 h. - Välj och ange tidsintervall och varaktighet för att samla in bilder genom att klicka på och mata in värdena i Timesequence -Kontrollpanelen.
Obs: förvärv av bilder var 1 till 5 minuter är lämpligt att övervaka dynamiken i mitotisk progression. Den totala varaktigheten för avbildning bör återspegla den önskade slutpunkten och spridnings frekvensen för cellinlinjen. Till exempel, 4 timmar är tillräckligt för att se många celler framsteg genom Mitos, 16 timmar är tillräckligt för att se de flesta RPE-1 celler i en asynkron population framsteg genom Mitos.
4. tidsfördröjning bildanalys för att fastställa metafas timing och mitotiska cell öde efter mitotiska spindel störningar
Obs: utför bildanalys med hjälp av en bild förvärvs programvara (tabell över material), imagej, eller jämförbar bildanalysprogram vara.
- Visualisera RFP-H2B märkt kromatin genom att välja de bilder som tagits med RFP-filterkuben på plats. Identifiera en cell som kommer in i Mitos, vilket indikeras av initial kromatin-kompaktpackning (figur 2C, Blå pilspets) och brytning av kärn kuvert (när α-tubulin-egfp inte längre utesluts av kärnkrafts gränsen).
- Bestäm den mitotiska tidpunkten för metafasjustering och Anaphasen debut i enskilda celler: spåra cellen genom på varandra följande tidspunkter i den förvärvade filmen för att bestämma antalet tidspunkter/minuter från mitotisk inmatning tills RFP-H2B-märkt kromatin Slutför justeringen vid cell ekvatorn under metafas (figur 2C, gul pilspets).
- För att övervaka mitotisk timing, mitotisk trohet och cellöde, Fortsätt att spåra cellen genom på varandra följande tidpunkter för att identifiera den tidkoordinat vid vilken Anaphasen-kromosom segregering är uppenbar (figur 2C, vit pilspets) och/eller om reformationen av kromatin och det nukleära kuvertet (som indikeras av tubulinexkludering från kärnan) har inträffat.
Anmärkning: Perturbations i spindel montering eller mitotisk progression kan bedömas som en funktion av den tid som krävs för att få en bipolär mitotisk spindel och uppnå fullständig kromosom justering, eller för att slutföra Anaphasen kromosom segregering. - Visualisera RFP-H2B att identifiera celler i varje population som uppvisar mitotiska defekter inklusive släpar kromosomer och kromatin broar under Anaphasen kromosom segregering.
Obs: försämrad mitotisk trohet kan också resultera i multinukleerade eller mikrokärnade dotterceller och kan visualiseras i celler efter mitotisk utgång, som i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bedömning av mitotisk progression i närvaro av spindel störningar
Regleringen av spindel stång fokusering är ett viktigt steg i korrekt bipolär spindel bildning. Störningar i denna process genom protein uttömningar, drog hämning, eller förändringar i centrosom nummer korrupta spindel struktur och fördröja eller stoppa mitotisk progression10,11,12,13. Ändå, vissa störningar endast transitivt fördröja spindel bildning med celler slutligen fortsätter genom Mitos att slutföra Anaphasen kromosom segregering14. I avsaknad av cellsynkroniseringsmetoder, somsjälva indirekt kan påverka mitotiska processer1,2, utvecklascellerna genom Mitos asynkront (figur 2C). Använda RFP-H2B för att identifiera kromatin, mitotiska celler med kompakta kromatin kan iscensatta som i av (de före fullständig metafase justering: figur 2C, blå pilspetsar), metafas (fullständig kromosom justering: Figur 2 C, gula pilspetsar) och Anaphasen (kromosomer är segregerade mot spindel stolpar: figur 2C, vita pilspetsar). Fångst av 5-8 koordinater över 4 h är tillräcklig för att följa utvecklingen av minst 50 celler genom Mitos i ett givet tillstånd. För att undersöka dynamiken i spindel enheten efter förändringar i centrosom antal och/eller hämning av Aurora A Kinas, en viktig regulator av spindel stång fokusering14,15,16, 17använde vi levande cell Time-lapse Imaging av mänskliga celler med 2 centrosomes, eller de som innehåller överflödiga centrosomes. Celler odlades i närvaro eller frånvaro av Aurora en kinashämmare före starten av avbildning. Celler med 2 centrosomes uppleva störningar i mitotisk progression när de behandlas med Aurora en kinashämmare, men i slutändan kan uppnå metafas kromosom justering (figur 2C, gul pilspets). I kontrast, celler med > 2 centrosomes är utsökt känsliga för Aurora en hämning och uppvisar en ökning av av celler och frånvaro av metafor celler, indikerar en fördröjning i spindel montering och mitotisk progression.
Figur 3 visar att sådana tidsförlopp Imaging metoder är tillräckliga för att övervaka både spindel montering och mitotisk trohet. Genom att visualisera α-tubulin-egfp, observerades det att celler som upplever spindel störningar (visas här på grund av centrosom överduplicering) genomgår dynamiska förändringar som spindel stång fokusering uppnås och en bipolär mitotisk spindel bildas som förberedelse för Celldelning. Samtidig med spindel församling, kromosom rörelse kan visualiseras med RFP-H2B att bedöma kromosom justering och segregering trohet. Mitotiska celler som upplever övergående spindel multipolaritet är mottagliga för bilagor fel som resulterar i släpar kromosomer under Anaphasen och bilda mikrokärnor i den efterföljande G1 fasen av cellcykeln. Sådana defekter är uppenbara med dessa levande cell avbildning metoder.
Förändringar i den dynamiska progressionen av Mitosen Alter mitotisk timing och påverkan mitotisk cell öde
Efter den nukleära kuvert uppdelning, spindel bildning och kromosom rörelse kan spåras genom stadier av Mitos att bedöma mitotisk progression, varaktighet, och ödet för celler som framsteg i Anaphase. Centrosome amplifiering, en funktion som är vanlig i många typer av cancer, kännetecknas av närvaron av extra centrosomes och multipolär spindel bildning18,19,20. Som multipolär divisioner resultera i mycket aneuploid och sannolikt olivskraftiga dotterceller, cancerceller aktivt kluster extra centrosomes att bilda en bipolär spindel och genomgå en bipolär Division5,20,21, 22,23,24. Med hjälp av levande cell avbildning metoder, våra representativa resultat visar att celler med en normal centrosom innehåll kan gå vidare från nukleära kuvert uppdelning genom metafase anpassning och Anaphasen debut för att uppnå en bipolär Division i under 30 minuter ( Figur 4 A, D, E). I närvaro av extra centrosomes, nästan 50% av cellerna kan övervinna en övergående multipolär mitotisk spindel och att bilda en bipolär spindel och fullständig celldelning (figur 4C, D). De återstående cellerna är oförmögna att uppnå en bipolär spindel och som ett resultat avsluta Mitos genom en multipolär Division (figur 4B, D). Oavsett om spindel bipolaritet uppnås uppvisar celler med extra centrosomes en signifikant ökad varaktighet av Mitos jämfört med celler med 2 centrosomes, vilket indikerar att dynamiken i mitotisk progression kan ändras även när förändringar i mitotiskt utfall är inte uppenbara (figur 4E).
Bild 1: val av Mikroskop-och kamera parametrar. (A) representation av fönstret för att välja önskat mål och lämplig filterkub med hjälp av en bild förvärvs programvara. Visas är valet av 20x förstoring mål och brightfield filterkub. Bceller i prov plattan hittas och fokuseras med hjälp av brightfield-eller Phase-kontrastmikroskopi. (C) representation av fönstret för att ställa in exponeringsparametrar för varje bildfångst. Pixel Binning kan användas, om det behövs, för att uppnå minska exponeringstid per fångst och minimera foto-skador på celler. Skalstapeln är 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bildinsamling och analys av tidsfördröjning mikroskopi. (A och B) representation av fönstret som anger hur bild förvärvs parametrarna ställs in med hjälp av NIS-element HCA Jobs bild insamlingsprogram. Denna programvara tillåter multi-koordinat, multi-well Imaging över tiden. Varje jobb kan ändras för att ange brunnar och koordinater som ska fångas. C) enstaka tidsramar från fyra villkor för ett experiment. RFP-H2B används för att spåra kromatin. Kromatin packning och positionering används för att identifiera olika stadier av Mitos: prometaphase (packning i avsaknad av kromosom justering, blå Arrowhead), metafas (fullständig kromosom justering på cell ekvatorn, gul pilspets), och Anaphase (efter initiering av synkron kromosom segregering, vit pilspets). Skalstapeln är 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: fotografering med tidsfördröjning visualiserar defekter i mitotisk trohet. Celler som innehåller extra centrosomes bildar multipolär spindlar och ofta kluster dem till en bipolär spindel innan du slutför celldelning. Här kommer en cell in Mitos med sju distinkta spindel poler (vita asterisker) som, med tiden, är grupperade i två huvudspindel stolpar. Vid denna punkt, kromosomer kan anpassa sig längs spindeln ekvatorn, och cellen fortsätter till Anaphase. Den övergående multipolaritet har tillåtit en mal fastsättning av en enda kromosom. Detta olösta fel resulterar i en släpar kromosom under Anaphasen som blir införlivas i en mikrokärnor i en dotter cell (märkt med en pil). Kromatin visualiseras med RFP-Histone 2B och mikrotubuli visualiseras med α-tubulin-EGFP. Tidsstämplar i varje panel anger minuter avseende skenbar uppdelning av kärn kuvert som bedöms genom detektion av tubulin inom kärnkrafts gränsen. Skalstapeln är 5 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: förändringar i den dynamiska progressionen av Mitosen förändrar mitotisk timing och påverkar ödet för mitotiska celler. RFP-H2B, visas i rött, används för att spåra kromatin rörelse och α-tubulin-GFP, visas i grönt, används för att övervaka centrosome/spindel Pole nummer och organisation. Förlust av GFP-tubulin uteslutning från kärnan, samtidig med tidig kromatin kompakaktion är en indikation på att det nukleära kuvertet har brutit ner (NEB) som förberedelse för mitotiska cell division. Nukleär uteslutning av GFP-tubulin är uppenbar vid mitotisk utgång och reformationen av det nukleära kuvertet. (A) en cell med två centrosomes bildar en bipolär spindel och fortskrider genom Anaphasen att bilda två dotterceller. (B och C) Celler med extra centrosomes anger Mitosen för att bilda en multipolär spindel. (B) några av dessa celler med extra centrosomes fördröjning i Mitos utan att uppnå en bipolär spindel och framsteg för att slutföra multipolär Anaphase. (C) andra celler med extra centrosomes uppvisar en övergående fördröjning av mitotisk progression medan de kluster extra centrosomes att möjliggöra bipolär Anaphase. (D) celler med extra centrosomes kan genomgå en bipolär division cirka 50% av tiden, medan de återstående cellerna med extra centrosomes genomgår en multipolär division. (E) celler med extra centrosomes har ökad mitotisk timing oavsett det eventuella mitotiska ödet (bipolär eller multipolär Anaphase). Skalstapeln är 5 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den temporala upplösningen som tillhandahålls av Time-lapse Imaging möjliggör visualisering och bedömning av sekventiella cellulära händelser inom enskilda celler. Metoder som utnyttjar cellulär synkronisering följt av insamling och fixering av celler vid sekventiella tidpunkter är begränsade i att jämförelser i slutändan görs mellan populationer av celler. I sammanhang där cellulära svar på störningar kan vara icke-enhetliga, eller där den process som visualiseras är dynamisk, Live cell Time-lapse Imaging är bättre rustade för att följa och analysera både dynamiken i enskilda celler, samt heterogenitet inom en cellulär population. På detta sätt är Time-lapse Imaging särskilt användbart för att övervaka cellernas progression genom de dynamiska stadierna av Mitos och bedöma hur störningar till denna progression slutligen påverka trohet av mitotiska celldelning och efterföljande cell öde.
Även om det finns ett antal fördelar med levande cell avbildning, är betydande utmaningar förknippade som måste övervägas och mildras när det är möjligt. En utmaning är att bibehålla lämpliga miljöförhållanden för att säkerställa cellernas lönsamhet och spridning vid avbildning. För att åstadkomma detta måste avbildnings uppsättningen innehålla en miljökammare som reglerar både temperatur och CO2. Alternativt kan celler avbildas på kort sikt med endast temperaturreglering om det görs i en sluten kammare. I båda fallen, användning av en antivibrationstabellen och/eller maskinvarubaserade metoder för att lindra axiella fokus svängningar (t. ex., Nikons perfekt fokus) bör användas för att bibehålla plattan fokus under hela experimentet. En andra viktig fråga med levande cell avbildning är potentialen för foto skador och foto blekning. Photoblekning är ett bekymmer där fluorophore som avbildas gradvis minskar i fluorescensintensitet som avbildning fortskrider. Men exponeringen för hög intensitet excitation ljus som resulterar i photoblekning är också giftigt för celler och försiktighet måste göras för att minimera cell exponeringen genom att minska exponeringstider, bild förvärvs intervall, och den totala varaktigheten av bildsekvensen 25. konsekvenserna av att inte optimera bildförhållanden för att minimera fototoxicitet kan innefatta generering av DNA-skador och andra cellulära förändringar som i sin tur kan äventyra tolkningen och förståelsen av experimentet. Bör cell lönsamhet bli ett bekymmer med långsiktig avbildning, bör ansträngning göras för att utnyttja pixel Binning (för att möjliggöra kortare exponeringar) och öka varaktigheten mellan efterföljande bild fångar. En ytterligare oro är att den fluorescerande taggen kan förändra beteendet hos det protein som den är smält, eller att integrationen av viral Expression konstruera i genomet kan själv påverka cellulära beteende. För att redogöra för möjligheten att tillägg av en fluorescerande tagg kan påverka proteinfunktion, en bedömning av proteinfunktion efter tillsats av en N eller C Terminal fluorescerande tagg och jämförelse med icke-märkta proteinfunktion är nödvändig. För att avgöra om negativa effekter på cell beteende uppstår på grund av den störning av genomisk Locus där viral konstruktionen har integrerats, flera enda cell kloner bör härledas, jämfört med celler som saknar det taggade proteinet, och testas för att övervaka att cellulär kondition och mitotisk progression inte är perturbed. Alternativt, av mål effekter av slumpmässig integration av viral Expression konstruera kan mildras genom riktad integration av fusionsproteinet i endogena Locus, eller andra kända regioner i arvsmassan, med hjälp av CRISPR-baserade metoder.
Metoder för att identifiera och karakterisera stora regulatorer av mitotisk progression har i hög grad förlitat sig på fast cell avbildning. Mitotiska tillsynsmyndigheter som identifierats på detta sätt har därefter utnyttjats i Therapeutics riktade snabbt prolifererande cancerceller7,8,9. Emellertid, antimitotiska läkemedel fungerar inte alltid enhetligt i olika cancerformer och i många fall insikt i de mitotiska fenotyper som föregår antingen framgångsrika eller misslyckade kemoterapeutiska metoder förblir oklara. Levande cell tid-lapse Imaging att spåra mitotiska celler i närvaro och avsaknad av spindel-perturbing droger har potential att ge den insikt som krävs för att identifiera de modulatorer som mest sannolikt kommer att resultera i katastrofala mitoser och nedsatt lönsamhet av cancerceller med minimal påverkan på normala celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
DLM stöds av en NSF GRFP. ALM stöds av finansiering från Smith Family Award för excellens inom biomedicinsk forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M.
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
