Summary
Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.
Abstract
Live Cell time-lapse Imaging is een belangrijk hulpmiddel in celbiologie dat inzicht geeft in cellulaire processen die anders zouden kunnen worden vergeten, verkeerd begrepen of verkeerd geïnterpreteerd door de analyse van de vaste cel. Hoewel de vaste celbeeldvorming en-analyse robuust en voldoende zijn om cellulaire stationaire toestand te observeren, kan deze worden beperkt bij het definiëren van een tijdelijke volgorde van gebeurtenissen op cellulair niveau en is slecht uitgerust om de voorbijgaande aard van dynamische processen te beoordelen, waaronder mitotische progressie. Live-celbeeldvorming daarentegen is een welsprekend hulpmiddel dat kan worden gebruikt om cellulaire processen in de loop van de tijd op het eencellige niveau te observeren en heeft de capaciteit om de dynamiek van processen vast te leggen die anders slecht zouden worden weergegeven in vaste celbeeldvorming. Hier beschrijven we een aanpak voor het genereren van cellen die fluorescentisch gelabelde markers van chromatine en microtubuli dragen en hun gebruik in Live Cell Imaging benaderingen om de metafase-chromosoom uitlijning en de mitotische uitgang te bewaken. We beschrijven Imaging-gebaseerde technieken om de dynamiek van spil vorming en mitotische progressie te beoordelen, inclusief de identificatie van cellen in verschillende stadia in mitose, identificatie en tracking van mitotische defecten, en analyse van spil dynamiek en mitotische cel lot na de behandeling met mitotische remmers.
Introduction
Op afbeeldingen gebaseerde analyse van vaste cellen wordt vaak gebruikt om de celpopulatie veranderingen te beoordelen in reactie op verschillende verstoringen. In combinatie met celsynchronisatie, gevolgd door de verzameling en imaging van seriële tijdpunten, kunnen dergelijke benaderingen worden gebruikt om een cellulaire opeenvolging van gebeurtenissen voor te stellen. Niettemin, vaste celbeeldvorming is beperkt in die tijdelijke relaties worden geïmpliceerd voor een populatie en niet aangetoond op het niveau van individuele cellen. Op deze manier, terwijl vaste celbeeldvorming en-analyse voldoende zijn om robuuste fenotypes en steady-state veranderingen te observeren, is de mogelijkheid om voorbijgaande veranderingen na verloop van tijd te detecteren en veranderingen die alleen een subpopulatie van de cellen beïnvloeden, onvolmaakt. Live-celbeeldvorming daarentegen is een welsprekend hulpmiddel dat kan worden gebruikt om cellulaire en subcellulaire processen binnen een enkele cel of cellulaire populatie te observeren, na verloop van tijd en zonder de hulp van synchronisatie benaderingen die zelf invloed kunnen hebben op cellulair gedrag 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
De vorming van een bipolaire mitotische spil is essentieel voor de juiste chromosoomsegregatie tijdens celdeling, resulterend in twee genetisch identieke dochtercellen. Defecten in de mitotische spil structuur die corrupte mitotische progressie en het compromitteren van de getrouwheid van chromosoomsegregatie kan resulteren in catastrofale celsplitsingen en verminderde levensvatbaarheid van de cel. Om deze reden, mitotische gifstoffen die spindel vorming veranderen zijn veelbelovende Therapeutics om de snelle proliferatie van kankercellen7,8,9te beperken. Niettemin, vaste celanalyse van spil structuur na de toevoeging van mitotische gifstoffen is beperkt in zijn vermogen om het dynamische proces van spindel vorming te beoordelen en kan niet aangeven of waargenomen veranderingen in spil structuur permanent zijn of in plaats van voorbijgaande en kan worden overwonnen om succesvolle celdeling toe te staan.
In dit protocol beschrijven we een benadering voor het beoordelen van de dynamiek van mitose na spindle-perturbaties door Live-celbeeldvorming. Met behulp van de htert vereeuwigd RPE-1 cellijn ontworpen om een RFP-Tagged histone 2b uit te drukken om chromatine te visualiseren, samen met een met EGFP gelabelde α-tubuline om microtubuli te visualiseren, de timing van metafase-chromosoom uitlijning, anafhase aanvang, en uiteindelijk het lot van de mitotische cellen wordt beoordeeld aan de hand van visuele aanwijzingen van chromosoom beweging, verdichting en nucleaire morfologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opwekking van hTERT-RPE-1 cellen die op rendabele wijze RFP-histone 2B (RFP-H2B) en α-tubulin-EGFP (tub-EGFP) uitdrukken
Opmerking: alle stappen volgen aseptische technieken en vinden plaats in een veiligheidskast van bioveiligheid Level II + (BSL2 +).
- Genereer retrovirus met de genen van belang (α-tubulin-EGFP en RFP-H2B) door de transfectie van 293T cellen met de juiste linvirale plasmiden volgens de instructies van de fabrikant van het op lipide gebaseerde transfectie-toedieningssysteem.
- Dag 1: gebruik een wegwerp glazen Pasteur-pipet om het celkweekmedium uit een plaat van sub-confluente 293T-cellen te zuigen en het rest medium met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) af te spoelen door 5 mL PBS toe te voegen. Draai om PBS over de bodem van het plaatje te verdelen en zuig vervolgens de PBS op met een steriele, wegwerp glazen Pasteur-pipet.
- Voeg 2 mL 0,05% trypsine toe die vooraf is opgewarmd tot 37 °C en geef de plaat terug naar een bevoficeerde incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2 tot 5 minuten, zodat aanhangers van het celkweek oppervlak kunnen worden vrijgelaten.
- Voeg 8 mL vers Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) toe, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicillaire/streptomycine op de plaat die trypsine bevat.
- Rebreng de cellen door met het zachtjes pipetteren en breng de suspensie over naar een steriele 15 mL conische buis. Plaats de conische buis in een gebalanceerde centrifuge en spin op 161 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen zachtjes te pellet.
- Aspirate de medium/trypsine-oplossing uit gepelleteerde cellen en respendeer cellen in 10 mL DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicillaire/streptomycine. Gebruik een hemocytometer om te tellen van de 293T celsuspensie en plaat 2 x 106 293t cellen per goed van een 6 goed plaat.
- Kweekcellen in een totaal volume van 2 mL van het gemodificeerde Eagle medium van Dulbecco (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicillaire/streptomycine en onderhouden in een bevoficeerde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Dag 2: Pipetteer 7 μL op lipide-gebaseerde transfectie afgifte reagens en 100 μL verlaagd serum medium in een micro centrifugebuis van 1,5 mL en laat het gedurende 5 minuten op kamertemperatuur inbrotten (buis #1).
- Pipetteer 1 μg RFP-H2B-expressie vector (of 1 μg α-tubulin-EGFP-expressie vector) in een aparte micro centrifuge-buis van 1,5 mL (zoals vereist volgens de richtlijnen van de fabrikant), 0,5 μg pMD2. G en 1 μg psPAX2 en 100 μL verlaagd serum medium (buis #2).
- Combineer de inhoud van stap 1.1.7 en stap 1.1.8 door zorgvuldig Pipetteer buis #2 in buis #1 en inincuberen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: de reactie kan zo nodig worden geschaald voor de transfectie van cellen in extra putjes. - Pipetteer de transfectie-reactie druppelsgewijs naar het gewenste goed met 293t cellen in 2 ml medium en retourneer het gerecht in de bevoficeerde incubator bij 37 °c met 5% Co2.
Opmerking: voor het genereren van cellen uitdrukken van zowel RFP-H2B en α-tubulin-EGFP, genereren van afzonderlijke virus voor elke expressie construct (stappen 1.1.7-1.1.9). - Dag 3: aspireren en vervangen van het medium met 2 mL verse DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicillaire/streptomycine. Keer de schaal terug naar de bevoficeerde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Dag 4: Verzamel het medium met uitgesproken virusdeeltjes, wees voorzichtig om niet te verstoren of te verwijderen 293T cellen. Filtreer het medium met virusdeeltjes door het door te geven via een filter van 0,45 μM dat aan een injectiespuit van 5 mL is bevestigd. Aliquot virus voor korte termijn opslag bij 4 °C, of lange termijn opslag bij-80 °C.
Opmerking: virale deeltjes die op deze manier worden verkregen, zullen aanwezig zijn in een bereik van ~ 1 x 107 tot 1 x 108 transducing-eenheden/ml. Als de virale-producerende cellen en cellen worden geïnfecteerd zijn beide gekweekt in hetzelfde medium, virale concentratie ter vervanging van het medium is niet vereist en gefilterde virale deeltjes kunnen direct worden gebruikt om cellen te infecteren. - Zaad 2 x 105 HTERT-RPE-1 cellen per put van een 6-goed gerecht in voorbereiding op de virale infectie. Kweekcellen in 2 mL DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicillaire/streptomycine en onderhouden in een bevoficeerde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Dag 5: Voeg hexadimethrine bromide (bijv. polybrene) toe aan de hTERT-RPE-1 cellen tot een eindconcentratie van 8 μg/mL. Besmetten cellen met een mengsel van 500 μL virus verdund in 500 μL celkweekmedium.
Opmerking: Hexadimethrine bromide stamoplossing wordt bereid in steriel gedestilleerd water en vervolgens gefilterd door een 0,45 μm filter. - Dag 6: met behulp van een wegwerp glas Pasteur Pipet, aspireren het medium uit putten met het virus geïnfecteerde cellen. Vervang het celkweekmedium door 2 mL DMEM met 10% FBS, 1% penicillaire/streptomycine, en geschikte concentraties van antibioticum om te selecteren voor de plasmide integratie en expressie.
Opmerking: de α-tubulin-EGFP-expressie plasmide die in de beschreven experimenten wordt gebruikt, draagt een puromycine-resistentie-gen en de RFP-H2B Expression plasmide draagt een blasticidin-resistentie-gen. Daarom worden 10 μg/mL puromycine en 2 μg/mL blasticidin gebruikt voor de selectie van α-tubulin-EGFP, RFP-H2B die hTERT RPE-1-cellen uitdrukken. De concentraties van antibiotica die voor de selectie worden gebruikt, kunnen verschillen voor verschillende gebruikte cellijnen. - Houd de cellen onder antibioticum selectie gedurende 5-7 dagen bij, waarbij het medium elke 3 dagen wordt vervangen door een vers medium dat geschikte selectie reagentia bevat.
Opmerking: cellen moeten tijdens de selectie in subsamenvloeiing worden gehandhaafd en moeten zo nodig worden uitgevouwen, zoals beschreven in stappen 1.1.1 tot en met 1.1.4. - Gebruik immunofluorescentie Imaging om de expressie van gelabelde constructies te bevestigen.
Opmerking: indien gewenst kunnen eencellige klonen worden afgeleid om uniforme uitdrukkings niveaus binnen de celpopulatie te verkrijgen. Zodra stabiele klonen worden bevestigd, kunnen cellen worden gehandhaafd onder de standaardcultuur omstandigheden bij afwezigheid van antibiotica selectie.
2. voorbereiding van cellen voor levende celbeeldvorming na mitotische spindel verstoringen
Opmerking: gebruik aseptische technieken en voer de stappen uit in een BSL2 veiligheidskast.
- Gebruik een steriele Pipet van het wegwerp glas Pasteur en zuig het medium op uit de kweek plaat met de cellijn die de uitdrukkings constructie (en) draagt (vanaf stap 1,7). Was de cellen kort met 10 mL steriele PBS. Draai om PBS over de bodem van het plaatje te verdelen en laat PBS met een steriele wegwerp glazen Pasteur pipet.
- Voeg 2 mL 0,05% trypsine toe aan de 10 cm plaat. Incuberen de plaat bij 37 °C gedurende 2-5 min of totdat de cellen van het plaat oppervlak zijn losgemaakt.
- Voeg 8 mL vers medium toe aan de plaat die trypsine bevat. Rebreng de cellen door met het zachtjes pipetteren en breng de suspensie over naar een steriele 15 mL conische buis. Plaats de conische buis in een gebalanceerde centrifuge en spin op 161 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen zachtjes te pellet.
- Zuig de supernatant voorzichtig op en regende in 10 mL PBS door voorzichtig te pipetteren met een serologische Pipet van 10 mL. Plaats de conische buis in een gebalanceerde centrifuge en spin op 161 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen zachtjes te pellet.
- Zuig de supernatant voorzichtig op en regende in 10 mL van het verse medium door voorzichtig te pipetteren met een serologische Pipet van 10 mL.
- Tel cellen, Bereken vervolgens het celgetal met behulp van een hemacytometer en Verdun tot een concentratie van 1-2 x 105 cellen/ml in het celkweekmedium. Zaad 500 μL van de celsuspensie aan elke put van een steriele 12-well beeld bodemplaat. Plaats de plaat in de celkweek incubator en laat de cellen zich aan het plaat oppervlak houden.
Opmerking: voor Live-celbeeldvorming moeten cellen goed worden nageleefd, zodat ze tijdens het verzamelen van afbeeldingen aan het Imaging-vlak blijven gekoppeld. De duur van de tijd die nodig is voor cellen om te hechten na plating kan verschillen van de ene cellijn naar de volgende en moet worden geoptimaliseerd voor de cellijn onder studie. - Tot 30 minuten voorafgaand aan het initiëren van timelapse-beeldvorming, voeg een relevante concentratie van een mitotische geneesmiddel toe aan een of meer van de putjes die met cellen zijn geseeldigd. Om rekening te houden met de potentiële impact van het organische oplosmiddel op cellulair gedrag, voegt u een gelijk volume van het verdunnings materiaal van de remmer toe aan cellen als besturingselementen. Zorg er bijvoorbeeld voor dat de toevoeging van 100 nM van de specifieke remmer van de mitotische kinase Aurora A (bijv. alisertib) wordt geëvenaard met een gelijk volume DMSO, het verdunningsmiddel voor dit medicijn, in een goed besturingselement van cellen.
Opmerking: vergelijkende analyse van dynamische veranderingen in de mitotische progressie vereist putten van cellen die moeten worden bereid bij afwezigheid van verstoringen, om de beeldvorming van normale behandeling parallel aan experimentele omstandigheden mogelijk te maken.
3. Microscoop ingesteld voor timelapse-beeldvorming van RFP-H2B, α-tubulin-GFP dat cellen uitdrukt (Figuur 1, Figuur 2)
- Plaats de celkweek plaat met de RFP-H2B, α-tubulin-GFP die de hTERT RPE-1-cellen uitdrukt om te worden afgebeeld in een geschikte fase insert op een omgekeerde epifluorescentie Microscoop die is uitgerust met een hoge resolutie camera (pixelgrootte van 0,67 μm bij 20x), een omgevings kamer voorverwarmd tot 37 °C, en een toedieningssysteem voor bevoficeerd 5% CO2.
Opmerking: de ingesloten omgevings kamers of de door een temperatuur geregelde wisselplaten kunnen geschikt worden geleverd met bevoficatie 5% CO2 kan worden geleverd en stabiele temperatuurregeling verkregen. - Gebruik een 20x lucht doelstelling met een numerieke opening van 0,5 en uitgerust voor het hoge contrast fluorescentie-en fase contrast of brightfield-beeldvorming. Bekijk cellen met het fase contrast of brightfield en pas de koers aan en zet de focus op de Microscoop om de cellen scherp te maken.
- Identificeer en stel de optimale belichtingstijden in voor de beeld verwerving van brightfield, GFP en RFP door de respectieve filter kubus te selecteren met de juiste excitatie en emissie voor de geimagde fluor Foren. U ook op de knop automatische belichting klikken om een vooraf bepaalde belichtingstijd in te voeren. Als het signaal niet intens genoeg is, selecteert u pixel binning om kortere belichtingstijden in te schakelen door te klikken op het tabblad binning en 2 x 2 pixel binning te selecteren in het vervolgkeuzemenu.
Opmerking: fototoxiciteit kan de mitotische progressie en de levensvatbaarheid van cellen aantasten. Het falen van mitotische cellen in controle populaties om normale behandeling te voltooien, kan een indicatie zijn dat de blootstellings tijden en/of de beeldvormings duur verder moeten worden geoptimaliseerd. - Gebruik een acquisitie-en analyse software waarmee multi-coördinaat, multi-well Imaging gelijktijdig kan worden verkregen en de parameters voor de beeld verwerving kan worden gedefinieerd.
- Selecteer en Kalibreer de Microscoop fase naar de multi-well schaal volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik de software voor het verzamelen van afbeeldingen om de putten te markeren of anderszins te selecteren die worden afgebeeld door op de betreffende putjes in het diagram van het plaat formaat te klikken dat wordt gebruikt.
- Definieer onder het Configuratiescherm Generatedpoints (afbeelding 2) de coördinaten binnen elke put die worden afgebeeld door op het tabblad punt plaatsing te klikken en vooraf gedefinieerde of willekeurige coördinaat plaatsing te selecteren van het vervolgkeuzemenu. Selecteer het tabblad werkgebied en selecteer beperkt in het vervolgkeuzemenu om het coördinaten selectiegebied te beperken om de grenzen van de put uit te sluiten. Klik op de tabbladen aantal en distributie om het aantal en de verdeling van de punten die moeten worden vastgelegd per put, respectievelijk te selecteren.
Opmerking: het aantal coördinaten dat per put kan worden afgebeeld binnen de tijdsinterval van 5 min wordt beperkt door het aantal putjes dat moet worden afgebeeld, evenals de belichtingstijd voor elk kanaal. Typisch, 5-8 coördinaten per goed zijn voldoende om te observeren ten minste 50 cellen in elke toestand voortgang via mitose binnen 4 h. - Selecteer en voer het tijdsinterval en de duur voor het verzamelen van afbeeldingen door te klikken op en invoeren van de waarden in de time sequence Configuratiescherm.
Opmerking: het verwerven van beelden om de 1 tot 5 minuten is geschikt om de dynamiek van de mitotische progressie te bewaken. De totale duur van de beeldvorming moet het gewenste eindpunt en proliferatie percentage van de cellijn weergeven. Bijvoorbeeld, 4 uur is voldoende om te zien veel cellen vooruitgang door middel van mitose, 16 uur is voldoende om te zien van de meeste RPE-1 cellen in een asynchrone populatie voortgang door middel van mitose.
4. time-lapse beeldanalyse om te bepalen metafase timing en mitotische cel lot na mitotische spindel verstoringen
Opmerking: Voer de beeldanalyse uit met behulp van een software voor het verzamelen van afbeeldingen (tabel met materialen), imagej of vergelijkbare beeldanalyse software.
- Visualiseer RFP-H2B met het label chromatine door de afbeeldingen te selecteren die zijn vastgelegd met de RFP-filter kubus. Identificeer een cel die mitose invoert, zoals aangegeven door initiële chromatide verdichting (Figuur 2C, blauwe pijlpunt) en afbreken van de nucleaire envelop (wanneer α-tubuline-EGFP niet langer wordt uitgesloten door de nucleaire grens).
- Bepaal de mitotische timing van metafase uitlijning en anafhase aanvang in afzonderlijke cellen: Volg de cel door opeenvolgende tijdspunten in de verworven film om het aantal tijdpunten/minuten van de mitotische invoer te bepalen tot RFP-H2B-gelabeld chromatine voltooit de uitlijning op de celevenaar tijdens de metafase (Figuur 2C, gele pijlpunt).
- Om de mitotische timing, mitotische getrouwheid en het lot van cellen te bewaken, blijft u de cel volgen door opeenvolgende tijdspunten om de tijd coördinaat te identificeren waarbij anafhase chromosoomsegregatie zichtbaar is (Figuur 2C, witte pijlpunt) en/of waar chromatine decompactie en nucleaire envelop Reformatie (zoals aangegeven door tubuline-uitsluiting van de Nucleus) is opgetreden.
Opmerking: perturbaties in spindel assemblage of mitotische progressie kunnen worden beoordeeld als een functie van de tijd die nodig is om een bipolaire mitotische spil te verkrijgen en volledige chromosoom uitlijning te bereiken, of om anafase chromosoomsegregatie te voltooien. - Visualiseer RFP-H2B om cellen in elke populatie te identificeren die mitotische defecten vertonen, waaronder achterblijvende chromosomen en chromatide bruggen tijdens anafase chromosoomsegregatie.
Opmerking: gecompromitteerde mitotische getrouwheid kan ook resulteren in meerkernige of met micronuclei dochtercellen en kan worden gevisualiseerd in cellen na een mitotische uitgang, zoals in Figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beoordeling van de mitotische progressie in de aanwezigheid van spil perturbaties
De regulering van spil paal focus is een essentiële stap in de juiste bipolaire spindel vorming. Verstoring in dit proces door eiwit depletie, remming van de drug, of wijzigingen in centrosoom aantal corrupte spil structuur en vertragen of stoppen mitotische progressie10,11,12,13. Niettemin, sommige verstoringen alleen tijdelijk vertragen spindel vorming met cellen uiteindelijk door middel van mitose te voltooien anafase chromosoomsegregatie14. Bij afwezigheid van celsynchronisatiebenaderingen, diezelf indirect van invloed zijn mitotische processen1,2, cellenvooruitgang door mitose asynchroon (Figuur 2C). Met behulp van RFP-H2B om chromatine te identificeren, kunnen mitotische cellen met compact chromatine worden opgevoerd als zijnde in tijdens (die voorafgaand aan het voltooien van de metafase uitlijning: Figuur 2C, blauwe pijlpunten), metafase (volledige chromosoom uitlijning: Figuur 2 C, gele pijlpunten) en anafase (chromosomen worden gescheiden naar spil palen: Figuur 2C, witte pijlpunten). De inname van 5-8 coördinaten over 4 h is voldoende om de progressie van ten minste 50 cellen door middel van mitose in een bepaalde toestand te volgen. Om te onderzoeken van de dynamiek van spindel assemblage na wijzigingen in centroeen aantal en/of remming van Aurora een kinase, een belangrijke regulator van spil Pole focus14,15,16, 17, we gebruikten de Live-cel time-lapse beeldvorming van menselijke cellen met 2 centrosomes, of die met een overtallige centrosomes. Cellen werden gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van de Aurora een kinase remmer voorafgaand aan het begin van de beeldvorming. Cellen met 2 nucleotiderende ervaren de verstoring in de mitotische progressie bij behandeling met Aurora een kinase remmer, maar zijn uiteindelijk in staat metafase chromosoom uitlijning te bereiken (Figuur 2C, gele pijlpunt). In tegenstelling, cellen met > 2 nucleotiderende zijn prachtig gevoelig voor Aurora een remming en vertonen een toename van de tijdens cellen en een afwezigheid van metafasecellen, wat duidt op een vertraging in spindel assemblage en mitotische progressie.
Figuur 3 toont aan dat dergelijke timelapse-beeldvormings benaderingen volstaan om zowel spil assemblage als mitotische getrouwheid te bewaken. Door het visualiseren van α-tubulin-EGFP, werd waargenomen dat cellen die de spil verstoring ervaren (hier weergegeven als gevolg van centrosoom overduplicatie) dynamische veranderingen ondergaan naarmate de scherpstelling van de spil paal wordt bereikt en een bipolaire mitotische spil wordt gevormd ter voorbereiding van Cell Division. Gelijktijdig met spindel assemblage, kan chromosoom beweging worden gevisualiseerd met RFP-H2B om chromosoom uitlijning en segregatie getrouwheid te beoordelen. Mitotische cellen die last hebben van voorbijgaande spil-multipolariteit zijn vatbaar voor fouten in de bijlage die resulteren in achterblijvende chromosomen tijdens anafase en vormen micronuclei in de daaropvolgende G1-fase van de celcyclus. Dergelijke gebreken zijn duidelijk met deze Live Cell Imaging benaderingen.
Veranderingen in de dynamische progressie van mitose Alter mitotische timing en impact mitotische cel lot
Na de afbraak van de nucleaire envelop kunnen spindel vorming en chromosoom bewegingen worden gevolgd door de stadia van mitose om de mitotische progressie, de duur en het lot van cellen te beoordelen die in anafhase vorderen. Centrosome amplificatie, een functie die vaak voorkomt in vele soorten kanker, wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van extra nucleotiderende en multipolaire spindel vorming18,19,20. Aangezien multipolaire divisies resulteren in zeer aneuploïde en waarschijnlijk onlevensvat bare dochtercellen, clusteren kankercellen actief extra nucleotiderende om een bipolaire spindel te vormen en een bipolaire divisie te ondergaan5,20,21, 22,23,24. Met behulp van Live Cell Imaging benaderingen, onze representatieve resultaten tonen aan dat cellen met een normale centrosoom inhoud kunnen overgaan van nucleaire envelop afbraak via metafase uitlijning en anafhase aanvang om een bipolaire divisie in minder dan 30 minuten ( Figuur 4 A, D, E). In aanwezigheid van extra centrosomes is bijna 50% van de cellen in staat om een voorbijgaande multipolaire mitotische spil te overwinnen en een bipolaire spindel en volledige celdeling te vormen (Figuur 4C, D). De overgebleven cellen zijn niet in staat om een bipolaire spindel te bereiken en als gevolg daarvan sluit mitose door een multipolaire verdeling (Figuur 4B, D). Ongeacht of de bipolariteit van de spindel wordt bereikt, vertonen cellen met extra nucleotiderende een significant verhoogde duur van de mitose in vergelijking met cellen met 2 nucleotiderende, wat aangeeft dat de dynamiek van de mitotische progressie kan worden gewijzigd, zelfs wanneer veranderingen in de mitotische uitkomst is niet duidelijk (Figuur 4E).
Figuur 1: selectie van Microscoop-en camera parameters. (A) weergave van het venster om de gewenste doelstelling en de juiste filter kubus te selecteren met behulp van een beeldverwervings software. Getoond is de selectie van de 20x vergrotings doelstelling en de brightfield filter Cube. B) cellen in de monster plaat worden gevonden en in de focus gebracht met behulp van brightfield of phase contrast microscopie. (C) weergave van het venster om belichtings parameters in te stellen voor elke beeldopname. Pixel binning kan, indien nodig, worden gebruikt om de belichtingstijd per opname te verkorten en foto-schade aan cellen te minimaliseren. De schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: beeldopname en analyse van timelapse-microscopie. (A en B) weergave van het venster dat aangeeft hoe parameters voorbeeld verwerving worden ingesteld met behulp van NIS-elementen HCA-taken software voor het verzamelen van afbeeldingen. Deze software maakt multi-coördinaat, multi-well Imaging na verloop van tijd mogelijk. Elke taak kan worden gewijzigd om putten en coördinaten op te geven die moeten worden vastgelegd. C) enkelvoudige tijdsbestekken uit vier voorwaarden van één experiment. RFP-H2B wordt gebruikt om Chromatin te volgen. Chromatide verdichting en positionering worden gebruikt om verschillende stadia van de mitose te identificeren: Prometaphase (verdichting bij afwezigheid van chromosoom uitlijning, blauwe pijlpunt), metafase (volledige chromosoom uitlijning bij de cel evenaar, gele pijlpunt), en Anafhase (na aanvang van synchrone chromosoomsegregatie, witte pijlpunt). De schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: time-lapse Imaging visualiseert defecten in mitotische getrouwheid. Cellen met extra nucleotiderende vormen multipolaire spindels en clusteren ze vaak in een bipolaire spil voordat de celdeling wordt voltooid. Hier voert een cel mitose in met zeven verschillende spil palen (witte sterretjes) die na verloop van tijd geclusterd zijn in twee hoofdspil palen. Op dit punt, chromosomen kunnen uitlijnen langs de spindel evenaar, en de cel gaat naar anaphase. De voorbijgaande multipolariteit heeft een mal gehechtheid van een enkelvoudig chromosoom toegestaan. Deze onopgeloste fout resulteert in een achterblijvende chromosoom tijdens anafhase die wordt opgenomen in een micronucleus in een dochtercel (gelabeld met een pijl). Chromatin wordt gevisualiseerd met RFP-histone 2b en microtubuli zijn gevisualiseerd met α-tubuline-EGFP. Tijdstempels in elk paneel geven notulen aan met betrekking tot de kennelijke afbraak van kernsplijtstof, zoals beoordeeld door de opsporing van tubuline binnen de nucleaire grens. De schaalbalk is 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: veranderingen in de dynamische progressie van de mitose veranderen mitotische timing en impact mitotische cel lot. RFP-H2B, in het rood weergegeven, wordt gebruikt om de chromatine beweging te volgen en α-tubuline-GFP, weergegeven in het groen, wordt gebruikt om het zwaartepunt/spil paal nummer en de organisatie te bewaken. Verlies van GFP-tubuline uitsluiting van de Nucleus, gelijktijdig met vroege chromatide verdichting is een indicatie dat de nucleaire envelop is afgebroken (NEB) ter voorbereiding op de mitotische celdeling. De nucleaire uitsluiting van GFP-tubulin blijkt uit de mitotische uitgang en de hervorming van de nucleaire enveloppe. A) eencel met twee nucleotiderende vormt een bipolaire spil en vordert door anafase om twee dochtercellen te vormen. (B en C) Cellen met extra nucleotiderende voeren mitose in om een multipolaire spil te vormen. B) sommige van deze cellen met extra nucleotiderende vertragen in mitose zonder een bipolaire spil te bereiken en vooruitgang te boeken om multipolaire anaphase te voltooien. C) andere cellen met extra zwaartepunten vertonen een voorbijgaande vertraging in de mitotische progressie terwijl zij extra nucleotiderende clusteren om bipolaire anaphase mogelijk te maken. D) cellen met extra zwaartepunten kunnen ongeveer 50% van de tijd een bipolaire divisie ondergaan, terwijl de overblijvende cellen met extra nucleotiderende een multipolaire deling ondergaan. E) cellen met extra centroomen hebben een verhoogde mitotische timing, ongeacht het uiteindelijke mitotische lot (bipolaire of multipolaire anafhase). De schaalbalk is 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tijdelijke resolutie die wordt geleverd door de time-lapse Imaging zorgt voor de visualisatie en beoordeling van sequentiële cellulaire gebeurtenissen binnen enkele cellen. Benaderingen die gebruikmaken van cellulaire synchronisatie gevolgd door het verzamelen en fixeren van cellen op opeenvolgende tijdstippen zijn beperkt in die vergelijkingen worden uiteindelijk gemaakt tussen populaties van cellen. In contexten waar de cellulaire respons op verstoringen niet uniform kan zijn, of waar het proces dat wordt gevisualiseerd dynamisch is, is de time-lapse-beeldweergave van de Live-cel beter toegerust om zowel de dynamiek van afzonderlijke cellen te volgen en te analyseren, als de heterogeniteit binnen een cellulaire populatie. Op deze manier is timelapse-beeldvorming vooral nuttig bij het bewaken van de celprogressie door de dynamische stadia van mitose en het beoordelen van hoe verstoringen van deze progressie uiteindelijk van invloed zijn op de getrouwheid van de mitotische celdeling en het daaropvolgende Cellot.
Hoewel er een aantal voordelen zijn voor Live-celbeeldvorming, worden belangrijke uitdagingen geassocieerd die indien mogelijk moeten worden overwogen en verzacht. Een uitdaging is het handhaven van passende milieuomstandigheden om de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen tijdens beeldvorming te waarborgen. Om dit te bereiken moet de Imaging-opstelling een milieu kamer bevatten die zowel de temperatuur als de CO2 regelt. Als alternatief kunnen cellen worden afgebeeld voor een korte termijn met alleen temperatuurregeling als dit wordt gedaan in een gesloten kamer. In beide gevallen moet gebruik van een antitrillingstabel en/of hardwaregebaseerde benaderingen om axiale focus schommelingen te verzachten (bijv. de perfecte focus van Nikon) worden gebruikt om de plaat focus gedurende de duur van het experiment te behouden. Een tweede belangrijke zorg met Live-celbeeldvorming is het potentieel voor foto beschadiging en fotobleaching. Fotobleking is een zorg waarbij de fluorescentie-intensiteit geleidelijk afneemt naarmate de fluorofior wordt afgebeeld, naarmate de beeldvorming vordert. Echter, de blootstelling aan een hoge intensiteit excitatie licht dat resulteert in photobleaching is ook giftig voor cellen en zorg moet worden gemaakt om celblootstelling te minimaliseren door het verminderen van de blootstellings tijden, beeld acquisitie intervallen, en de totale duur van de Imaging sequentie 25. de gevolgen van het niet optimaliseren van beeldvormende omstandigheden om fototoxiciteit te minimaliseren kunnen de AANMAAK van DNA-schade en andere cellulaire veranderingen omvatten die op hun beurt de interpretatie en het begrip van het experiment in gevaar kunnen brengen. Als de levensvatbaarheid van de cel een zorg wordt met langdurige beeldvorming, moet worden gestreefd naar het gebruik van pixel binning (om kortere belichtingen mogelijk te maken) en de duur tussen volgende beeldopnamen te vergroten. Een bijkomend punt van zorg is dat de fluorescerende tag het gedrag van het eiwit waarmee het wordt gesmolten kan veranderen, of dat de integratie van de virale expressie in het genoom zelf invloed kan hebben op cellulair gedrag. Om rekening te houden met de mogelijkheid dat de toevoeging van een fluorescerende tag de eiwit functie kan beïnvloeden, is een beoordeling van de eiwit functie na de toevoeging van een N-of C-Terminal fluorescerende tag en vergelijking met een niet-gelabelde eiwit functie noodzakelijk. Om te bepalen of er nadelige effecten zijn op het gedrag van de cellen als gevolg van de perturbatie van de genomische Locus waarin de virale constructie is geïntegreerd, moeten meerdere klonen van één cel worden afgeleid, vergeleken met die welke niet het gelabelde eiwit hebben, en getest om te controleren dat cellulaire fitheid en mitotische progressie niet perturbed zijn. Als alternatief kunnen de doel effecten van willekeurige integratie van de virale expressie construct worden verzacht door gerichte integratie van het fusie-eiwit in de endogene Locus, of andere bekende regio's van het genoom, met behulp van CRISPR gebaseerde benaderingen.
Benaderingen voor het identificeren en karakteriseren van belangrijke regulatoren van mitotische progressie hebben zich sterk gebaseerd op vaste celbeeldvorming. Mitotische regulatoren die op deze manier zijn geïdentificeerd, zijn vervolgens uitgebuit in therapeutische doelgroepen die snel prolifererende kankercellen7,8,9. Echter, antimitotische geneesmiddelen presteren niet altijd uniform in verschillende kankers en in veel gevallen is inzicht in de mitotische fenotypes die voorafgaan aan succesvolle of mislukte chemotherapeutische benaderingen onduidelijk. Live Cell time-lapse Imaging om mitotische cellen bij te houden in de aanwezigheid en afwezigheid van spil-perturbing medicijnen heeft het potentieel om het inzicht te bieden dat nodig is om die modulatoren te identificeren die het meest waarschijnlijk resulteren in catastrofale behandeling en gecompromitteerde levensvatbaarheid van kankercellen met een minimale impact op normale cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
DLM wordt ondersteund door een NSF GRFP. ALM wordt ondersteund door financiering uit de Smith Family Award for Excellence in biomedisch onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M.
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
