Summary
이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.
Abstract
발달의 역학은 특정 조직 또는 세포에 형광을 발현하는 살아있는 형질전환 제브라피시 배아의 공초점 시간 경과 현미경 검사법에 의해 뒤따를 수 있습니다. 화상 진찰 전체 배아 발달을 가진 어려움은 zebrafish 태아가 길이에서 실질적으로 증가한다는 것입니다. 0.3-1% 낮은 용융 아가로스에서 정기적으로 장착할 때, 아가로세는 성장 제한을 가하여 부드러운 배아 체체의 왜곡을 초래합니다. 그러나 공초점 시간 경과 현미경 검사를 수행하려면 배아를 고정시켜야합니다. 이 기사에서는 무제한 성장을 허용하면서 배아의 운동성을 제한하는 제브라피시 배아의 층상 장착 방법을 설명합니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다. 이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 전체 배아 혈관, 신경 및 근육 발달은 55시간 연속으로 형질전환 어류에서 영상화되었다. 이 장착 방법은 금형이나 특수 장비의 요구 사항없이 반전 된 현미경을 사용하여 전체 얼룩말 배아의 쉽고 저렴한 이미징에 사용할 수 있습니다.
Introduction
제브라피쉬는 오랫동안 발달 생물학의 모델 유기체였으며, 현미경 검사법은 배아 발달을 시각화하는 주요 방법입니다. 발달 연구를 위해 zebrafish 배아를 사용하는 장점은 작은 크기, 광학 선명도, 빠른 개발 및 성인 어류의 높은 배변성을 포함합니다. 특정 조직 또는 세포에서 형광을 발현하는 형질전환 제브라피시 라인의 생성은 더 큰 척추동물로는 불가능한 방법으로 조직 발달을 직접 시각화할 수 있게 하였다. 시간 경과 현미경 검사법과 함께, 조직 발달의 세부 사항 및 역학을 쉽게 연구 할 수 있습니다.
화상 진찰 zebrafish 발달을 가진 어려움은 배아가 길이에서 실질적으로 증가한다는 것입니다; 태아는 수명1의첫번째 3 일 안에 그것의 길이를 4 시간 연장합니다. 또한, 초기 배아의 몸은 부드럽고 성장이 제한되면 쉽게 왜곡됩니다. 그러나 공초점 현미경 검사를 수행하려면 배아를 고정시켜야합니다. 공초점 시간 경과 화상 진찰을 위한 고정된 위치에 배아를 지키기 위하여는, 그(것)들은 정규로 마취되고 0.3-1% 저용융 아가로즈에 거치됩니다. 이것은 태아의 운동을 제한하는 동안 특정 기간 동안 화상 진찰 도중 약간의 성장을 허용하는 이점이 있습니다. 배아의 부분은 이같이 능면화될 수 있습니다. 그러나, 장기간 동안 전체 배아의 화상 진찰을 위해 이 방법을 사용할 때, agarose에 기인한 제한된 성장 때문에 왜곡이 관찰됩니다. 따라서 다른 장착 방법이 필요합니다. Kaufmann 및 동료는 가로오스 또는 메틸셀룰로오스 2의 낮은 농도를 포함하는 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP) 튜브에 배아를 장착함으로써 선택적 평면 조명 현미경 검사법 (SPIM)과 같은 가벼운시트 현미경 검사법에 대한 제브라피시 배아의 대체 장착을 설명했다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 배아 발생의 뛰어난 시각화를 생성합니다. Schmid 등은 1개의 화상 진찰 세션에서 몇몇 태아의 가시화를 제공하는 빛 시트 현미경 검사법3를 위한 FEB 관에 있는 아가로제에 있는 최대 6개의 배아의 설치를 기술합니다. 금형은 배아의 큰 숫자의 효율적인 장착을위한 배아 배열을 만드는 데 사용되었습니다4. Masselkink 등은 다양한 단계에서 제브라피시 배아를 배치할 수 있는 실리콘 주조를 만드는 데 사용할 수 있는 3D 프린팅 플라스틱 금형을 구성하여 공초점이미징을포함한 이미징을 위한 일정한 위치에 장착할 수 있습니다 5. 3D 프린팅은 또한 96웰 포맷6에서제브라피시 배아의 일관된 포지셔닝을 위한 금형을 만드는 데 사용되었습니다. 일부 금형은 특정 단계에 맞게 사용자 정의되며 장기간 무제한 성장을 허용하지 않을 수 있지만 다른 금형은 더 유연합니다. 최근, Weijts 등은 제브라피시 배아의 라이브 이미징을 위한 4웰 접시의 설계 및제작을7. 이 요리에서는 마취 된 물고기 배아의 꼬리와 줄기가 커버 유리 바로 위에 부착 된 투명한 실리콘 지붕 아래에 수동으로 배치되어 주머니를 형성합니다. 배아는 0.4% 아가로스를 첨가하여 이 위치에 고정된다. 이 장착은 배아의 약 2 mm 긴 후방 부분 (트렁크 및 꼬리)의 이미징을 허용하고, 최대 12 개의 배아가 잘 당 장착 될 수 있으므로, 방법은 여러 샘플의 이미징을 허용합니다. 마찬가지로, Hirsinger와 Steventon은 최근 꼬리가 자유롭게 자랄 수 있는 동안 물고기의 머리가 아가로오스에 장착되는 방법을 제시했으며,이 방법은 또한 배아8의트렁크 및 꼬리 부위의 이미징을 효율적으로 용이하게합니다.
이 기사에서는 무제한 성장을 허용하면서 배아의 움직임을 제한하는 제브라피시 배아의 층상 장착 방법을 설명합니다. 이 장착 방법의 장점은 모든 반전 된 현미경을 사용하여 이미징을위한 다양한 단계의 배아를 장착하는 저비용, 빠르고 쉬운 방법입니다. 장착은 배아 발달 도중 전신 (머리, 트렁크 및 꼬리)의 장기 적인 화상 진찰을 허용합니다. 이 방법의 유용성을 보여주기 위해, 전체 배아 혈관, 신경 및 근육 발달은 형질전환 어류에서 이미지화되었다. 세션당 2개의 배아, 3D의 2개의 파장에서 55시간 연속시간 경과 현미경검사법에 의해 이미지화되어 조직 발달의 영상을 렌더링하였습니다.
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Protocol
여기에 제시 된 동물 작품은 휴스턴 대학과 인디애나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUCs)에 의해 승인되었습니다.
1. 생선 축산
참고: 척추동물 모델로 작업하려면 IACUC 승인 프로토콜이 필요합니다. 관련 국내 및 국제 지침에 따라 수행해야 합니다.
- 이전에 출판된 문헌9에설명된 바와 같이 성체 얼룩말어를 유지한다.
- 오후에는 성인용 제브라피시를 번식탱크에 놓습니다. 1:2의 비율로 암컷에 남성을 번식.
2. 솔루션 준비
- 배아 매체에서 1% 낮은 용융 아가로즈의 스톡 용액을 만드십시오 (E3 : 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2,0.33 mM MgSO4,pH 7.0으로 조정). 스톡 용액을 1.5 mL 튜브에 Aliquot하고 4 °C에 보관하십시오.
- 증류수에서 4%(v) 트리카인(MS-222)의 재고 용액을 만드십시오. 어두운 병에 4 °C에서 보관하십시오.
주의: 트리카인은 독성이 있으며 무게를 측정하고 연기 후드에 용해시켜야 합니다. - 증류수에서 20 mM N-페닐티우레아 (PTU)의 재고 용액을 만드십시오. -20 °C에서 보관하십시오.
3. 배아의 준비
- 짝짓기 후, 페트리 접시에 E3에서 배아를 수확하고 장착하기 전에 약 28 시간 동안 26.5 °C에서 배양한다.
참고: 이것은 태아가 화상 진찰의 시작에 대략 30 somite 단계에 이다 는 것을 그래서 태아의 발달을 감속합니다. - E3에서 0.016-0.020 % 트리카인에서 배아를 마취하십시오. 색소 침착을 억제하려면 PTU를 200 μM의 농도에 추가하십시오.
- 해부 현미경으로 집게를 사용하여 배아를 초질. 두 개의 집게를 사용하여, 그립과 부드럽게 배아를 해제 하기 위해 떨어져 융기를 당겨.
4. 아가로즈에 장착
참고: 개발된 마운팅 방법은 필요에 따라 0.02% 트리카인과 PTU를 가진 E3에서 저용융 아가로스의 두 가지 농도가 필요합니다. 첫 번째 아가로즈 용액은 왜곡과 운동성이 최소한인 아가로스의 최적의 농도를 함유하고 있습니다. 최적화는 아래 5단계에서 설명합니다.
- 두 층(5단계에서 정의된 농도) 및 1%에 대해 아가로즈 용액을 가열합니다. 65 °C. 아가로즈를 장착 직전에 약 30°C까지 식혀 배아가 열에 의해 해를 입지 않도록 하십시오. 장착시, No. 0 커버 유리 바닥이 있는 35mm 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 접시의 바닥에 부착 된 커버 유리는 배아를 배치할 10mm 얕은 (약 1.2mm 깊이)을 잘 만듭니다.
참고: 이 경우, 운동성 및 왜곡이 가장 적은 농도는 0.025~0.040% 아가로즈 사이였다. - 유리 피펫이나 마이크로 파이펫을 사용하여 접시의 바닥으로 측면 중 하나를 사용하여 dechorioned 배아를 부드럽게 놓습니다. 마이크로파이펫을 사용하는 경우, 배아에 맞게 개구부 크기를 증가시키기 위해 팁의 바깥 부분을 절단한다(도1A). 마이크로파이펫으로 남은 E3를 조심스럽게 제거하십시오.
- 배아를 덮기 위해 접시의 바닥에 부착된 커버 유리에 의해 생성된 작은 우물에 제1 아가로즈 용액을 첨가한다(Layer 1)(도1B). 아가로즈가 작은 우물을 덮지만 넘지 않도록 하십시오.
- 커버 글래스(22 mm x 22 mm)로 작은 우물을 덮어(도1C)를두 개의 커버 안경 사이에 배아로 채워진 좁은 아가로즈 공간을 조성한다.
- 접시 의 바닥 전체에 커버 유리의 상단에 1 % 아가로즈 용액의 층을 놓습니다 (층 2)(그림 1D). 이 층이 굳어지면 커버 유리를 제자리에 고정시됩니다.
- 접시의 나머지 부분을 0.02% 트리카인을 함유한 E3로 채우어 시스템을 수화(층 3)(도1E)로유지한다.
참고: 이 설정에서 커버 글래스와 1% 아가로즈는 바닥 층이 희석되지 않도록 보호합니다.
5. 계층 1에 대한 아가로즈 솔루션의 최적화
- 계층 1에 대한 아가로즈의 최적 농도를 식별하려면 다중 스케일 그리드 검색 방법을 사용합니다. 아가로즈의 농도가 0.01%에서 1%로 증가하는 데 서 배아를 탑재한 다음, 시야에서 배아 성장 제한 및 운동성의 시간 경과 이미징이 뒤따릅니다. 왜곡과 운동성이 모두 최소인 농도를 식별합니다.
- 아가로즈의 농도를 더욱 최적화하기 위해, 5.1단계에서 가장 좋은 것으로 밝혀진 농도에 따라 아가로스의 농도(예를 들어, 0.025~0.040% 아가로즈)의 미세한 농도 범위를 사용하여 배아를 장착한다(예를 들어, 0.025%, 0.028%, 0.031%, 등).
참고 : 우리의 실험실에서, 최적의 아가로즈 농도는 약 이었다 0.03%.
6. 타임랩스 이미징
참고: 이 장착 방법은 형광 및 밝은 필드 이미징을 위한 타임랩스 기능을 갖춘 모든 반전된 현미경에 작동합니다.
- 최대 55 시간 동안 전체 배아 또는 그것의 부분에 대한 시간 경과 이미징을 수행합니다. 여러 배아의 이미징을 위해 접시당 하나의 배아가 장착된 여러 접시를 담는 스테이지 어댑터를 사용하십시오. 배아가 눈으로 결정된 대로 대략 수평으로 위치되도록 접시를 하나씩 회전시다. 최적의 배아 성장 및 발달을 위해 28.5°C로 설정된 인큐베이터를 사용하여 현미경 단계를 사용하십시오.
- 현미경 소프트웨어에서 낮은 배율 목표를 선택합니다. 눈 조각 아래에서 밝은 필드 조명을 사용하여 접시를 회전시켜 배아를 수평으로 찾고 미세하게 정렬하고 소프트웨어에서 위치를 기록합니다. 데이터를 자동으로 저장하기 위한 파일 이름을 만듭니다.
참고: 본 실험에서, 계획 apo λ 4x 0.2 NA 대물및 ND 획득 창 내의 XY 탭을 사용하여 배아의 위치를 기록하였다. 데이터는 .nd2 형식으로 저장되었습니다. 목표는 Ti 패드 탭에서 아이콘을 클릭하여 선택되었습니다. - 핀홀 크기, 스캔 속도, 이미지 크기 및 확대/축소를 설정합니다. 다음으로 이미지를 캡처할 때 더 높은 배율 목표를 선택합니다.
참고: 본 실험에서, 전체 배아의 이미징에 계획-아포 10x 0.45 NA 목표가 사용되었고, 초형플루어 20x 0.75 NA 대물렌즈를 배아 부분의 더 높은 배율 이미징에 사용하였다. 핀홀은 1.2AU(10x 렌즈의 경우 19.2 μm)로 설정되었으며, 스캔 속도는 2.4 μs의 픽셀 거주 시간 동안 설정되었고 이미지 크기는 스캔 줌으로 1024 x 1024 픽셀로 설정되었으며, 10x 렌즈의 경우 1.24 μm의 픽셀 크기를 제공하며, 20x 렌즈의 경우 0.62 μm. - 이미지할 형광 채널을 선택합니다. 한 번에 하나의 채널에 이미지 캡처 설정을 조정합니다. 각 형광 채널에 대해 레이저 전력과 검출기 고전압을 조정하여 채도를 피하고 광 표백을 제한하면서 가능한 최상의 동적 범위를 수집하십시오.
참고: 본 실험에서, GFP는 488 개의 녹색 채널(488 nm 레이저 및 500~550nm 사이 방출) 및 561 적색 채널(561 nm 레이저 및 570~600 nm 사이 방출)을 이용한 RFP로 이미지화되었고, 전송 이미지는 561 nm 레이저 및 투과광검출기(T)를 사용하여 수집하였다. - 전체 배아를 10배 의 목표로 이미지화하기 위해, 현미경 소프트웨어를 사용하여 여러 시야를 겹치게 하고 함께 스티치합니다.
참고: 배아가 이미징 중에 크기가 상당히 커지기 때문에 배아의 전방 및 후방 시야에 공간이 있는지 확인하십시오. ND 수집 창의 큰 이미지 스캔 탭을 사용하고 10% 겹치는 4 x 1 패턴을 선택하여 인접한 4개의 뷰 필드를 캡처합니다. - 현미경 소프트웨어를 사용하여 Z 스택을 캡처하기 위한 설정을 구성합니다.
참고 : 배아는 유리 접시의 바닥에 가깝게 장착되기 때문에, 그 중심은 성장함에 따라 바닥에서 멀리 이동합니다. ND 수집 창의 Z 탭을 사용하고 비대칭 상대 범위를선택합니다. 이 방법을 사용하면 현재 포커스 평면이 참조 평면으로 사용되고 나머지 평면은 Z 스택 부피 내에서 전체 배아를 포함하기 위해 위와 아래에 비대칭으로 분포되어 표본의 성장을 고려할 충분한 공간이 있습니다. 모든 실험에서, 간격은 11 μm및 약 45개의 평면으로 총 범위를 설정하였다. - 장기 시간 경과 화상 진찰 도중 다중 태아의 초점을 유지하기 위하여는, 자동화한 포커스를 이용하십시오. 여러 배아를 이미징하는 경우 각 배아의 개별 오프셋 수준을 조정하여 참조 평면에초점을 맞춥니다.
참고: 이 실험에서는 레이저 기반 초점 안정화 시스템이 사용되었습니다. - 약 1시간 간격으로 55시간 동안 현미경 소프트웨어 및 이미지에서 타임랩스 파라미터를 설정합니다. 각 주기마다 두 개의 배아 데이터 집합을 순차적으로 캡처하고 각 주기 후에 자동으로 데이터를 저장합니다.
- 현미경 소프트웨어의 온라인 또는 오프라인 버전을 사용하여 이미지를 처리합니다. 하나 이상의 배아가 이미지화된 경우, 이미징 위치에 따라 데이터 집합을 분할하여 각 배아에 대해 독립적인 파일을 만듭니다. 최대 강도 투영 또는 이와 유사한 도구를 사용하여 3D 시간 데이터 세트를 2D 시간 데이터 세트로 변환합니다. 메뉴로 저장 옵션을 사용하여 .avi를 파일 형식으로 선택하여 동영상 파일을 만듭니다. 5프레임/s의 재생 속도에 대해 200ms 간격으로 압축 없음 옵션을 선택합니다.
참고 : 이 실험에서 두 배아의 원래 데이터 세트는 소프트웨어의 분할 위치 함수를 사용하여 분할되었습니다(파일 | 가져오기/내보내기 | 멀티포인트 분할). 3D 시간 데이터 세트를 최대 강도 프로젝션 기능을 사용하여 2D 시간 데이터 세트로 변환했습니다(이미지| ND 프로세싱 | Z)에서 최대 강도 투영 이미지를 만듭니다.
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Representative Results
마운팅 방법의 개발
이 작업의 주요 목적은 장기간 제브라피시 개발의 시간 경과 이미징을 위한 저비용 장착 기술을 개발하는 것이었습니다. 층상 장착 방법은 깨지기 쉬운 얼룩말 배아 몸체의 완전한 성장을 허용하면서 움직임을 제한하기 위해 개발되었습니다. 층 1의 아가로즈 농도가 너무 높으면 배아가 왜곡되고 구부러지게됩니다(그림 2). 0.1%와 0.5%로 자란 배아는 꼬리, 왜곡된 지느러미 및 구부러진 머리를 줄였습니다. 반대로, 아가로오스 농도가 너무 낮으면, 성장하는 꼬리가 배아 몸에서 밖으로 스윙하고 움직이게 하기 때문에, 그(것)들이 마취되더라도, 시간 경과 현미경 검사법 도중 시야에서 밖으로 이동합니다. 우리의 손에, 최적의 아가로즈 농도 사이 변화 0.028% 그리고 0.034% 아가로즈의 다른 배치 사이 아가로즈. 0.025% 이하의 아가로즈를 장착하는 것은 배아가 시야에 머무를 수 있는 충분한 저항성을 제공하지 못했다.
혈관, 신경 및 근육 발달의 연장된 시간 경과 화상 진찰
위에서 설명한 장착 방법을 최적화한 후, 시간 경과 공초점 현미경 이미지를 55시간 의 범위에 걸쳐 캡처하였다. 우리는 다른 조직에서 GFP 또는 RFP를 표현하는 살아있는 형질전환 제브라피시를 이미지화했습니다. 시간 경과 화상 진찰을 위한 내인성 형광을 가진 형질전환 물고기를 사용하는 이점은 GFP 와 RFP와 같은 형광 분자가 살아있는 배아에서 연속해서 생성되고, 따라서, 쉽게 사진 표백을 하지 않습니다. 먼저, Tg(kdr1: EGFP)의십자가의 배아를 mitfab692/b69210 및 유비-제브라보우(11)의 배아를 이미지화하였다. 이러한 배아에서, RFP는 배아의 모든 세포에서 발현되며, 이는 일반적인 배아 구조의 시각화를 허용한다. GFP는 혈관구조의 내피 세포에서 발현된다. 이중 트랜스제닉 배아는 0.45 NA를 가진 10x 목적을 사용하여 머리와 몸의 혈관 발달을 가시화하기 위해 약 30소미트 단계에서 55시간 동안 영상을하였다(도 3 및 보충 영화 S1). 2개의 배아/세션은 2개의 다른 파장에서 첫번째 태아를 화상 진찰한 후에, 그 후에 첫번째 태아가 그 후에 다시 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 후에 그 때 그 것 인 루프에 있는 z 스택 및 시간 경과로 심상했습니다. 도 3은 트렁크 연장과 함께 세분화간 혈관(ISV) 발아, 하수 혈관 및 머리 혈관 구조의 개발, 및 꼬마 정맥 신경총 응축을 나타낸다. 혈관 구조로 전체 배아의 이미징은 ISV 발아가 소미테 사이에서 시작하여 신경관의 지점까지 등쪽으로 자라며, ISV는 다른 경로를 취하고 다음 전방 소미트 경계로 향하는 방향으로 새싹을 내립니다.
다음으로, Tg(mnx:GFP)의십자가의 배아를 mg(mnx:GFP)m692/b629 및 유비-제브라보우는 운동신경 발달을 가시화하기 위해 30somite 단계에서 약 55시간 동안 영상을 촬영하였다(도4 및 보조 영화 S2). Tg (mnx:GFP)는 먼저 Mitfab692 / b692 (오리건 대학의 Zebrafish 국제 자원 센터에서 모두) Tg(mnx: GFP)mitfab692 / b629를생산하기 위해 교차했다. 모터 뉴런 축세포는 배아의 복부 쪽으로 somites를 통해 복부 신경 관에서 새싹. 소미테 사이에 새싹이 나는 분단혈관과는 달리, 축색은 갈매기로 형성된 소미트 위에 중간에 새싹을 내민다. 발아는 신경관의 앞쪽 끝을 향해, 신경관에서 직선 각으로 시작하고, 후방을 퍼냅니다. somite /노른자 인터페이스에 의해 발아는 전방 및 후방 발아로 방향을 바꿉습니다. 전방 신경염에 의해 발달 하는 심장의 내심을 주목하십시오.
또한, Tg(kdr:enl.memRFP)의십자가의 배아b692/b692(Tg의 십자가(kdr:enl.memRFP 및 mitfab692/b692)와 Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692를 이미지화하였다. 이전 배아에서, 적색 혈관 형광은 36 시간 후 수정 (hpf)까지 보이지 않았고, 따라서 우리는 2 dpf에서 나중에 이미징을 시작했다. 우리는 더 높은 배율 (20 배 대물)을 사용하여 노른자 낭 확장에 등도트의 일부를 이미지했습니다. 이 영화는 배아가 더 높은 배율에서 좋은 이미징 품질을 위해 여전히 충분히 누워 있음을 보여줍니다. 세그먼트간 혈관의 위치와 관련하여 모터뉴런 축색의 등쪽 발아의 공동 개발이 뒤따랐다(도5 및 보충 영화 S3). 이 영화에서는 복부 축색아발아의 미세한 세부 사항뿐만 아니라 신경 관에서 발아하는 등쪽 축슨을 신경 축색과 세그먼트 간 혈관이 함께 이동하는 지점으로 볼 수 있습니다. 꼬리 정맥 신경총 응축도 명확하게 표시됩니다. neurite 새싹이 꼬리의 후방 끝을 향해 누락됨에 따라 (오른쪽에서 12번째 neurite의 위치에), 가장 가까운 후방 뉴런은 뉴라이트 11과 13 사이의 영역을 커버하기 위해 배아의 앞쪽 부분으로 확장됩니다.
마지막으로, HGn39b12,13 및 유비-제브라보우의 십자가가 이미지화되었습니다. HGn39b는 열 충격 단백질 ATPase 호모로그 1(AHA1)유전자(http://kawakami.lab.nig.ac.jp/)의활성제에 GFP 삽입을 가진 zTRAP 라인이며 소미트의 근육에서 GFP를 발현한다(도6 및 보충 영화 S4). 소미트 숫자가 증가함에 따라 소미트도 길이와 너비를 확장합니다. 이 영화는 또한 유비 얼룩말 물고기 라인에서 붉은 형광의 심장 발달을 멋지게 보여줍니다.
그림 1 : 장착 방법에 대한 설명. (A)35mm 접시에 유리 바닥에 의해 만들어진 작은 우물에 제브라피쉬 배아를 추가합니다. (B)아가로즈층 1을 작은 우물에 첨가하여 배아를 덮는다. (C)작은 우물 위에 뚜껑 유리를 조심스럽게 놓습니다. (D)아가로즈 층 2를 35mm 접시의 바닥 전체에 넣습니다. (E)접시에 E3를 추가합니다. (F)마운팅의 단면의 개략도면이 설정됩니다. (G)최종 몽타주에서 제브라피쉬 배아의 현미경 이미지(5배 객관적). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 아가로스의 상이한 농도에서의 배아 성장 제한 및 발달 지연. 배아는 48 hpf에서 상이한 아가로즈 농도 및 그들의 크기 및 발달에 장착되었다. 디지털 현미경 컬러 카메라 (2.5 배 목표)와 함께 제공되는 현미경 소프트웨어가 장착 된 현미경으로 캡처 한 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 혈관 구조의 발달을 시각화합니다. Tg (kdr1: EGFP)의십자가 는 공초점 현미경상에서 약 30 소미트 스테이지에서 55시간 동안 촬영된 mitfab692/b692 및 유비-제브라보우를 상연하였다. 녹색과 빨간색의 다른 모든 세포의 혈관 구조. 배율 바 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 뉴런 및 뉴라이트 발아의 발달을 시각화합니다. Tg (mnx:GFP)의 십자가 mitfab692/b629 및 유비-제브라보우는 공초점 현미경상에서 55시간 동안 약 30개의 소미트 스테이지에서 이미지화되었다. 녹색의 운동 신경 세포, 빨간색의 다른 모든 세포. 배율 바 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 뉴런과 혈관구조의 공동 개발의 시각화. Tg(kdr:enl.memRFP)의십자가b692/b692 및 Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692는 공초점 현미경상에서 약 2 dpf로부터 55시간 동안 이미지화되었다. 빨간색 혈관, 녹색 의 운동 신경 세포. 배율 바 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 소미트에서 근육 GFP 발현의 시각화. HGn39b와 유비-제브라보우의 십자가는 약 30소미트 스테이지에서 55시간 동안 공초점 현미경으로 이미지화되었다. 녹색근육, 다른 모든 세포는 빨간색으로. 배율 바 500 μm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 S1: Tg(kdr1:EGFP)의 십자가의 배아의 동영상 (kdr1:EGFP)mitfab692/b692 및 유비-제지보우는 10x 목적을 사용하여 공초점 현미경상에서 55시간 동안 약 30소미트 스테이지에서 이미지화하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 S2: Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 및 유비-제지보우의 십자가의 배아의 영상은 10x 목적을 사용하여 공초점 현미경상에서 55시간 동안 약 30소미트 스테이지에서 이미지화되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 S3: Tg의 십자가의 배아의 영화 (kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 및 Tg (mnx:GFP)mitfab692/b692 20x 목표를 사용 하 여 공초점 현미경에 55 h에 대 한 약 2 dpf에서 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 S4: HGn39b및 유비-제브라보우의 십자가의 배아의 영상은 10배 목적을 사용하여 공초점 현미경상에서 55시간 동안 약 30개의 소미트 스테이지에서 이미지화되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전체 제브라피시 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법에 대한 장착 방법이 여기에 설명되어 있다. 장착 방법에 대한 가장 중요한 단계는 무제한 제브라피시 배아 성장을 허용하는 아가로즈의 최적 농도를 식별하는 동시에 공초점 이미징을 위해 배아를 완전히 고정 된 위치에 유지하는 것입니다. 아가로즈의 최적 농도가 매우 좁기 때문에, 이 값은 용액을 제조하는 동안 아가로오스의 중량 및 E3의 부피의 측정 오류에 매우 민감하다. 최적 농도는 또한 배아의 온도 및 단계에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 최적 농도는 상이한 농도의 시험의 반복을 통해 아가로스 용액의 각각의 새로운 배치에 대해 재정의될 필요가 있을 것이다.
또 다른 중요한 단계는 아가로즈의 제2층을 첨가하는 마운팅 방법에 있다. 두 번째 레이어는 커버 글래스를 제자리에 놓습니다. 커버 유리가 움직이지 않도록 한 번에 조금씩 신중하게 접시에 추가해야합니다. 두 번째 층은 E3의 투과성 장벽역할을 합니다. E3가 없으면 배아가 이미징 중에 건조됩니다. 아가로즈의 두 번째 층없이, 커버 유리와 배아는 부동 시작됩니다.
제안된 장착 방법의 한계는 반전된 현미경을 위해 잘 작동하지만, 수직 현미경을 위해 작동하지 않는다는 것입니다. 유리 바닥 접시를 E3로 채우고 파라필름으로 밀봉하고 거꾸로 뒤집어 서 수직 현미경을 사용하여 타임랩스 이미징을 수행하기 위해 여러 번 시도했습니다. 그러나, 종종 이것은 마운팅이 이미징을 통해 중간에 붕괴되는 결과를 초래했다. 이것은 레이저 빛에 장시간 노출 한 후 샘플의 열 증가로 인해 고형화된 아가로즈 층이 녹아 발생했을 수 있습니다.
시간 경과 현미경 검사법의 끝으로 배아는 심낭 부종을 보여주기 시작했습니다. 상이한 실험 들 사이 변화, 부 종 사이 관찰 되었다 35 그리고 50 이미징의 시간. 이것이 배아 고정에 기인했다는 것을, 또는 마취의 효력은, 현재 알려지지 않습니다. 트리카인은 골격과 심장 근육의 수축을 억제하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 트리카인은 성인 어류14및 배아15의심박수에 영향을 미칩니다. 다른 연구는 또한 트리카인 처리가 제브라피시 배아에 있는 심낭 부종을 일으키는 원인이 된다는 것을보고했습니다 2,16. 이 기사에서는 트리카인 (0.016-0.020 %)의 농도 일반적으로 제브라피시 연구에 사용되는 데 사용되었다; 여전히, 심낭 부종은 우리의 이미징 기간의 끝에 의해 발생. 심낭 부종은 더 긴 기간 동안 배아의 이미징을 가능하게하기위한 주요 제한을 구성. 이 심장 독성을 감소시키는 잠재적인 방법은 2개의 다른 마취제를 결합하고, 예컨대 트리카인과 유제놀, 또는 마취제에 대한 α-bungarotoxin mRNA 주사를 사용하는16; 결합 또는 대체 마취 화합물의 유익한 효과는 제브라피시 발달의 연장된 시간 경과 이미징을 위해 추가로 조사될 필요가 있습니다.
결론적으로, 설명된 장착 방법은 빠르고, 쉽고, 비용 효율적이며 모든 거꾸로 된 현미경에서 작동합니다. 일반 유리 바닥 접시와 낮은 용융 아가로즈를 사용할 수 있으며 특별한 금형, 장비 또는 계측이 필요하지 않습니다. 층상 장착 방법은 배아를 고정된 위치에 유지하면서 동시에 배아 성장을 허용합니다. 전체 유기체의 연장된 시간 경과 이미징을 사용하여 조직 발달에 대한 새로운 지식을 얻을 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 알버트 팬과 아른트 시에크만에게 형질전환 생선 선물을 주셔서 감사합니다. 일본 문화체육관광부의 국립생물자원사업인 국립유전학원의 가와카미 고이치(Koichi Kawakami)에게 형질전환 제브라피쉬 HGn39b의선물에 감사드립니다. 우리는 또한 공초점 현미경 검사법에 대한 도움을 파티마 상인과 캐슬린 Gajewski, 사진에 대한 트레이시 테리아울트에 감사드립니다.
이 작품은 국립 보건원의 국립 환경 보건 과학 연구소의 보조금에 의해 지원되었다 (보조금 번호 P30ES023512 및 계약 번호 HHSN2732015000010C). SU는 Keck 전산 암 생물학 프로그램 (걸프 코스트 컨소시엄 CPRIT 교부금 RP140113)과 휴 로이와 릴리 인다우먼트 기금의 펠로우십에 의해 지원되었습니다. J-Å G는 로버트 A. 웰치 재단 (E-0004)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
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