Summary
توضح هذه المقالة طريقه لتحميل الاجنه الضعيفة الهشة للحصول علي المجهر البؤري المطول الفاصل الزمني. هذه الطريقة منخفضه التكلفة سهله الأداء باستخدام الاطباق المجهرية العادية بالزجاج السفلي للتصوير علي اي مجهر مقلوب. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه.
Abstract
ويمكن ان يعقب ديناميات التنمية المجهر الزمني الفاصل بين الاجنه الحية المحورة وراثيا التي تعبر عن الفلورية في انسجه أو خلايا محدده. صعوبة في التصوير تطوير الجنين كله هو ان الاجنه الزرد تنمو بشكل كبير في الطول. عندما شنت علي النحو الذي تم بانتظام في 0.3-1 ٪ ذوبان منخفضه نشات ، والاجنه يفرض قيود النمو ، مما يؤدي إلى تشوات في جسم الجنين لينه. ومع ذلك ، للقيام بالمجهر الزمني الفاصل ، يجب ان يتم شل الجنين. توضح هذه المقالة طريقه تركيب طبقات لأجنه الزيبرافيش التي تقيد حركيه الاجنه مع السماح بالنمو غير المقيد. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه. لإثبات قابليه استخدام هذه الطريقة ، كان الجنين كله الاوعيه الدموية ، والخلايا العصبية وتنميه العضلات في الأسماك المحورة وراثيا لمده 55 ساعات متتالية. ويمكن استخدام هذه الطريقة المتصاعدة للتصوير سهله ومنخفضه التكلفة من الاجنه الزرد كله باستخدام المجاهر المقلوبة دون متطلبات قوالب أو المعدات الخاصة.
Introduction
ومنذ فتره طويلة كان الزبرافيش كائنا نموذجيا لعلم الاحياء التنموي ، والمجهر هو الطريقة الرئيسية لتصور التطور الجنيني. وتشمل مزايا استخدام الاجنه الزبرافيش للدراسات التنموية صغر الحجم ، والوضوح البصري ، والتطور السريع ، والخصوبة العالية للأسماك البالغة. وقد سمح الجيل من خطوط الزرد المحورة وراثيا التعبير عن الفلوري في بعض الانسجه أو الخلايا لتصور مباشر لتطوير الانسجه بطرق غير ممكنة مع أكبر الفقاري الحيوانية. الاقتران مع المجهر الزمني ، يمكن دراسة تفاصيل وديناميكيات تطور الانسجه بسهوله.
صعوبة مع التصوير التنمية الزرد هو ان الاجنه تنمو بشكل كبير في الطول; يمدد الجنين طوله أربعه أوقات ضمن الاولي 3 أيام الحياة1. كما ان جسم الجنين المبكر لين ، ويصبح مشوها بسهوله إذا كان النمو مقيدا. ومع ذلك ، للقيام بالمجهر البؤري ، يجب ان يتم شل الجنين. للحفاظ علي الاجنه في وضع ثابت للتصوير الفاصل الزمني البؤري ، يتم تخديرها بانتظام وتركيبها في 0.3-1 ٪ منخفضه الذوبان التي نشات. هذا له ميزه السماح لبعض النمو اثناء التصوير لفتره معينه من الزمن ، في حين تقييد تحركات الجنين. يمكن ان تكون أجزاء من الجنين فعاله مثل هذا. ومع ذلك ، عند استخدام هذه الطريقة لتصوير الجنين بأكمله لفترات زمنيه طويلة ، لوحظت تشوات بسبب النمو المحدود الناجم عن الاجنه. التالي ، هناك حاجه إلى أساليب التركيب الأخرى. وقد وصف كوفمان وزملاءه بديلا لتركيب الاجنه الخفيفة للحصول علي المجهر المجهري للضوء ، مثل المجهر الضوئي الانتقائي للطائرة (SPIM) ، عن طريق تركيب الاجنه في أنابيب الاثيلين البروبيلين (إثراء) المشبعة بالفلور التي تحتوي علي تركيزات منخفضه من الاغثار أو ميثيل سيلولوز2. وتنتج هذه التقنية تصورا رائعا لتولد الاجنه علي مر الزمن. ويصف شميد وآخرون تركيب ما يصل إلى سته أجنه في الأنابيب المجهرية للضوء بالورقة الخفيفة3 التي تقدم تصورا لعده أجنه في جلسة تصوير واحده. وقد استخدمت قوالب لإنشاء صفائف الاجنه لتركيب فعال لاعداد أكبر من الاجنه4. وقد شيدت masselkink وآخرون قوالب البلاستيك المطبوعة 3d التي يمكن استخدامها لجعل يلقي السيليكون ان الاجنه الزرد في مراحل مختلفه يمكن وضعها في ، وتمكين تصاعد في موقف ثابت للتصوير ، بما في ذلك التصوير البؤري5. وقد استخدمت الطباعة 3d أيضا لجعل قوالب لتحديد المواقع متسقة من الاجنه الزرد في شكل 96-بئر6. يتم تخصيص بعض القوالب لمراحل معينه ، وقد لا تسمح النمو غير المقيد لفترات زمنيه طويلة ، في حين ان قوالب أخرى أكثر مرونة. وفي الاونه الاخيره ، نشرت Weijts et al. تصميم وتصنيع طبق من أربعه ابار للتصوير الحي لأجنه الزيبرافيش7. في هذا الطبق ، يتم وضع ذيل وجذع الاجنه السمكية التخدير يدويا تحت سقف السيليكون واضحة المرفقة فقط فوق الزجاج غطاء لتشكيل جيب. ثبتت الجنين بعد ذلك في هذا موقعه بالاضافه من 0.4% [اغبرز]. هذا التصاعد يسمح للتصوير حوالي 2 مم الجزء الخلفي طويلة (الجذع والذيل) من الجنين ، وبما يصل إلى 12 الاجنه يمكن تركيبها في بئر ، وطريقه يسمح للتصوير من عينات متعددة. المثل ، قدم Hirsinger و Steventon مؤخرا طريقه حيث يتم تركيب راس السمكة في اجنشا ، في حين ان الذيل يمكن ان تنمو بحريه ، وهذا الأسلوب أيضا يسهل بكفاءة التصوير من الجذع ومنطقه الذيل من الجنين8.
توضح هذه المقالة طريقه متصاعدة من الطبقات لأجنه الزيبرافيش التي تقيد حركات الاجنه مع السماح بالنمو غير المقيد. مزايا هذه الطريقة المتصاعدة هي انها طريقه منخفضه التكلفة وسريعة وسهله لتحميل الاجنه من مختلف المراحل للتصوير باستخدام اي المجهر المقلوب. التركيب يسمح التصوير علي المدى الطويل من الجسم كله (الراس والجذع والذيل) اثناء تطوير الجنين. لعرض قابليه استخدام هذه الطريقة ، كان الجنين كله الاوعيه الدموية ، والخلايا العصبية وتنميه العضلات في الأسماك المحورة وراثيا. وقد أصيب اثنان من الاجنه في الدورة الواحدة ، في فترتين موجيتين ثلاثيتي الابعاد ، بالمجهر الزمني لمده 55 ساعة متتالية لتقديم أفلام عن تطور الانسجه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة علي العمل الحيواني المعروض هنا من قبل المؤسسات المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها (Acucs) في جامعه هيوستن وجامعه إنديانا.
1-تربيه الأسماك
ملاحظه: يتطلب العمل مع نماذج فقاري بروتوكول معتمد IACUC. وينبغي ان تجري وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والدولية ذات الصلة.
- الحفاظ علي الزرد الكبار كما هو موضح في المؤلفات المنشورة سابقا9.
- في فتره ما بعد الظهر ، مكان الزرد الكبار في تربيه الدبابات. تولد الذكور إلى الإناث بنسبه 1:2.
2-اعداد الحلول
- جعل حل الأسهم من 1 ٪ منخفضه ذوبان اجنشا في وسائل الاعلام الجنين (E3:5 مم كلوريد الصوديوم ، 0.17 mM KCl ، 0.33 mM CaCl2، 0.33 Mm mgso4، تعديلها لدرجه الحموضة 7.0). Aliquot حل الأسهم في أنابيب 1.5 mL وتخزينها في 4 درجه مئوية.
- جعل حل الأسهم من 4 ٪ (ث/ف) Tricaine (MS-222) في الماء المقطر. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية في زجاجه داكنه.
تحذير: Tricaine سامه وينبغي وزنها وحلها في غطاء الدخان. - جعل حل الأسهم من 20 مم ن-فينيلثيريا (PTU) في الماء المقطر. يخزن عند-20 درجه مئوية.
3-اعداد الاجنه
- بعد التزاوج ، حصاد الاجنه في E3 في طبق بيتري واحتضانها في 26.5 درجه مئوية لحوالي 28 ساعة قبل التركيب.
ملاحظه: هذا يبطئ تطور الاجنه بحيث تكون الاجنه تقريبا في 30 مرحله الجسيده في بداية التصوير. - تخدير الاجنه في 0.016-0.020 ٪ Tricaine في E3. لمنع تصبغ ، أضافه PTU إلى تركيز 200 μM.
- ديتشوريوناتي الاجنه باستخدام ملقط تحت المجهر التشريح. باستخدام اثنين من الملقط ، وقبضه وسحب بلطف المشيماء بعيدا للإفراج عن الجنين.
4. تصاعد في اجنشا
ملاحظه: تتطلب طريقه التركيب المطورة تركيزين مختلفين من الذوبان المنخفض في E3 مع 0.02% Tricaine و PTU حسب الحاجة. ويحتوي الحل الأول علي التركيز الأمثل للنشا الذي يكون فيه التشوه والحركية عند الحد الأدنى. يتم وصف التحسين في الخطوة 5 أدناه.
- سخن المحاليل التي نشات للطبقين (التركيز المحدد في الخطوة 5 أدناه و 1%) إلى 65 درجه مئوية. السماح لل الاغاروزها تهدئه إلى ما يقرب من 30 درجه مئوية فقط قبل المتصاعدة بحيث لا يضر الجنين من الحرارة. للتركيب ، استخدم الاطباق الزجاجية السفلية 35 مم مع الغطاء الزجاجي السفلي رقم 0. الغطاء الزجاجي المرفق بالجزء السفلي من الطبق يخلق 10 ملم الضحلة (حوالي 1.2 مم عمق) جيدا ، والتي يتم وضع الجنين.
ملاحظه: في هذه الحالة ، كان التركيز مع اقل الحركة والتشوات بين 0.025 إلى 0.040 ٪ اجنشا. - ضع الجنين برفق مع أحد جوانبه الجانبية باتجاه أسفل الطبق باستخدام ماصه زجاجيه أو ماصه مجهريه. في حاله استخدام الماصة المجهرية ، اقطع الجزء الخارجي من الطرف لزيادة حجم الفتحة لتناسب الجنين (الشكل 1ا). قم بازاله اي E3 المتبقية بعناية مع الماصات المجهرية.
- قم باضافه الحل الأول إلى البئر الصغير الذي تم إنشاؤه بواسطة الغطاء الزجاجي المرفق بالجزء السفلي من الطبق لتغطيه الجنين (الطبقة 1) (الشكل 1ب). التاكد من ان الاجثار يغطي البئر الصغيرة ولكن لن تجاوز ذلك.
- تغطيه البئر الصغيرة بغطاء زجاجي (22 مم × 22 مم) (الشكل 1ج) لإنشاء مساحة مملوءة ضيقه مع الجنين بين نظارتي الغطاء.
- وضع طبقه من 1 ٪ محلول اجنشا علي راس الغطاء الزجاجي في جميع انحاء الجزء السفلي من الطبق (طبقه 2) (الشكل 1د). ومع تصلب هذه الطبقة ، فانها تحمل زجاج الغطاء في مكانها.
- ملء الجزء المتبقي من الطبق مع E3 التي تحتوي علي 0.02 ٪ Tricaine للحفاظ علي نظام رطب (طبقه 3) (الشكل 1ه).
ملاحظه: في هذا الاعداد ، والزجاج غطاء و 1 ٪ اجنشا حماية الطبقة السفلي من الحصول علي المخفف.
5. الأمثل للحل اجنشا للطبقة 1
- لتحديد التركيز الأمثل للطبقة 1 ، استخدم نهج بحث شبكه متعددة المقاييس. وقد نشات أجنه الجبل بتركيزات متزايدة تتراوح بين 0.01 في المائة و 1 في المائة تليها التصوير بالفواصل الزمنيه لتقييد نمو الاجنه والحركية في مجال الرؤية. تحديد التركيزات حيث كل من التشويه والحركية هي في الحد الأدنى.
- ولتحسين تركيز الاجنه بشكل أكبر ، يتم تركيب الجنين باستخدام مجموعه أدق من تركيزات الاغثار (علي سبيل المثال ، بين 0.025 و 0.040 في المائة) اعتمادا علي التركيز الذي وجد انه الأفضل في الخطوة 5.1 (علي سبيل المثال ، 0.025 في المائة ، 0.028 في المائة ، 0.031 في المائة ، الخ).
ملاحظه: في المختبر الخاص بنا ، كان تركيز اجنشا الأمثل حول 0.03 ٪.
6-التصوير بالفواصل الزمنيه
ملاحظه: هذه الطريقة المتصاعدة يعمل لأي المجهر المقلوب مع وظيفة الفاصل الزمني للتصوير الميدانية ومشرق التصوير.
- أداء التصوير بالفاصل الزمني للجنين كله أو أجزاء منه لتصل إلى 55 h. لتصوير العديد من الاجنه ، استخدم محول المرحلة الذي يحتوي علي العديد من الاطباق مع جنين واحد لكل طبق. تدوير الاطباق واحدا تلو الآخر بحيث يتم وضع الاجنه تقريبا أفقيا كما تحددها العين. لنمو الجنين الأمثل والتنمية ، واستخدام مرحله المجهر مع مجموعه حاضنه في 28.5 درجه مئوية.
- حدد هدفا منخفض التكبير في برنامج المجهر. تحت قطعه العين ، حدد موقع ومحاذاة ناعما الاجنه أفقيا عن طريق تدوير الاطباق باستخدام الاضاءه الميدانية الساطعة وتسجيل مواقعها في البرنامج. إنشاء اسم ملف لحفظ البيانات تلقائيا.
ملاحظه: في هذه التجربة ، تم استخدام خطه apo λ 4x 0.2 NA الهدف وعلامة التبويب XY داخل نافذه الاستحواذ الثانية لتسجيل مواقع الاجنه. تم حفظ البيانات بتنسيق nd2. تم اختيار الهدف من خلال النقر علي الرموز الخاصة به في علامة التبويب Ti Pad . - تعيين حجم الثقب ، وسرعه المسح الضوئي ، وحجم الصورة ، والتكبير. بعد ذلك ، حدد هدف تكبير اعلي للتقاط الصور.
ملاحظه: في هذه التجربة ، تم استخدام خطه-apo 10x 0.45 NA الهدف لتصوير الاجنه كامله ، وتم استخدام السوبر فلور 20x 0.75 NA الهدف للتصوير اعلي التكبير من أجزاء من الجنين. تم تعيين الثقب إلى 1.2 الاتحاد الافريقي (19.2 μm للعدسة 10x) ، تم تعيين سرعه المسح الضوئي لفتره السكون بكسل من 2.4 μs وتم تعيين حجم الصورة إلى 1024 x 1024 بكسل مع التكبير المسح الضوئي واحد ، وإعطاء حجم بكسل من 1.24 μm لعدسه 10x و 0.62 ميكرومتر للعدسة 20x. - حدد القناات لتكون مضانه. اضبط إعدادات التقاط الصور علي قناه واحده في كل مره. لكل قناه مضان ضبط قوه الليزر وكاشف الجهد العالي ، والتاكد من جمع أفضل مجموعه ديناميكية ممكنة مع تجنب التشبع والحد من التصوير الضوئي.
ملاحظه: في هذه التجربة ، تم التصوير gfp مع قناه خضراء 488 ، (488 nm الليزر والانبعاثات بين 500 و 550 nm) ، وعروض العروض مع القناة الحمراء 561 (561 nm الليزر والانبعاثات بين 570 و 600 nm) ، وتم جمع صوره الإرسال باستخدامالليزر 561 nm وكاشف الضوء المرسلة (TD قناه) - لصوره الجنين كله مع الهدف 10x ، صوره عده مجالات الرؤية مع التداخل وغرزه لهم معا باستخدام البرنامج المجهر.
ملاحظه: بما ان الاجنه سوف تنمو بشكل كبير في الحجم اثناء التصوير ، تاكد من وجود مساحة في مجال الرؤية الاماميه والخلفية للجنين. استخدم علامة التبويب الصورة الكبيرة للمسح الضوئي في نافذه الاستحواذ الثانية وحدد نمط 4 × 1 مع تراكب 10% للتقاط أربعه حقول عرض متجاورة. - تكوين الإعدادات للتقاط المكدسات Z باستخدام برنامج المجهر.
ملاحظه: لان الجنين يتم تركيبه بالقرب من الجزء السفلي من الطبق الزجاجي ، فان مركزه سينتقل بعيدا عن القاع لأنه ينمو. استخدم علامة التبويب Z من نافذه الاستحواذ الثانية وحدد النطاق النسبي غير المتناظر. مع هذا الأسلوب ، يتم استخدام الطائرة التركيز الحالي كما الطائرة المرجعية وبقية الطائرات يتم توزيعها غير متماثل أعلاه واقل لتشمل الجنين كله داخل الحجم Z-كومه ، مع مساحة كافيه لحساب نمو العينة. في جميع التجارب ، تم تعيين الفاصل الزمني إلى 11 ميكرومتر والنطاق الإجمالي إلى حوالي 45 الطائرات. - من أجل الحفاظ علي تركيز الاجنه المتعددة اثناء التصوير بالفواصل الزمنيه طويلة الأمد ، استخدم تركيزا تلقائيا. في حاله تصوير عده أجنه ، اضبط مستويات الازاحه الفردية لكل جنين للتركيز علي الطائرة المرجعية.
ملاحظه: في هذه التجربة ، تم استخدام نظام تثبيت التركيز القائم علي الليزر. - اعداد معلمات الفاصل الزمني في البرنامج المجهر والصورة لمده 55 h في حوالي 1 h فترات. في كل دوره ، والتقاط اثنين من مجموعات الاجنه بالتتابع وحفظ البيانات تلقائيا بعد كل دوره.
- معالجه الصور باستخدام إصدار علي الخط أو خارج الخط من برنامج المجهر. وإذا كان أكثر من جنين واحد قد وضع ، فقم بإنشاء ملفات مستقله لكل جنين عن طريق تقسيم مجموعه البيانات استنادا إلى موقع التصوير. استخدم الحد الأقصى لتوقعات الكثافة أو أداه مشابهه لتحويل مجموعات بيانات الوقت ثلاثي الابعاد إلى مجموعات بيانات الوقت ثنائيه الابعاد. إنشاء ملفات الأفلام باستخدام الخيار حفظ باسم القائمة ، تحديد .avi كتنسيق الملف. حدد الخيار لا ضغط مع فواصل ms 200 لسرعه تشغيل 5 إطارات/s.
ملاحظه: تم تقسيم مجموعه البيانات الاصليه من اثنين من الاجنه في هذه التجربة باستخدام وظيفة تقسيم المواقع في البرنامج (ملف | استيراد/تصدير | تقسيم النقاط المتعددة). تم تحويل مجموعات بيانات الوقت الثلاثية الابعاد إلى مجموعتين للبيانات الزمنيه ثنائيه الابعاد باستخدام وظيفة الحد الأقصى من الكثافة (Image | المعالجة الثانية | إنشاء الحد الأقصى كثافة الصورة الإسقاط في Z).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تطوير طريقه التركيب
وكان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو تطوير تقنيه التركيب منخفضه التكلفة للتصوير بالفواصل الزمنيه للتطوير الإشعاعي لفترات طويلة من الزمن. تم تطوير أسلوب التركيب الطبقي للسماح بالنمو الكامل للجسم الجنيني الهش ، مع تقييد تحركاته. إذا كان تركيز الطبقة 1 مرتفعا جدا ، فان الاجنه ستصبح مشوه ومنحنيه (الشكل 2). وقد قلصت الاجنه المزروعة بنسبه 0.1 في المائة و 0.5 في المائة الذيول ، والزعانف المشوهة ، والرؤوس المنحنية. وعلي العكس من ذلك ، إذا كان التركيز الموضعي منخفضا جدا ، فان الاجنه ستنتقل من مجال الرؤية خلال المجهر الزمني الفاصل ، علي الرغم من انها تخضع لتخدير ، حيث ان الذيل المتزايد يتارجح من جسم الجنين ويتسبب في نقله. في ايدينا ، تباينت تركيز اجنشا الأمثل بين 0.028 ٪ و 0.034 ٪ اجنشا بين دفعات مختلفه من اجنشا. تصاعد أدناه 0.025 ٪ لم تقدم المقاومة كافيه للجنين للبقاء في مجال الرؤية.
التصوير بفواصل زمنيه ممتدة لتطوير الاوعيه الدموية والخلايا العصبية والعضلات
بعد تحسين طريقه المتصاعدة الموصوفة أعلاه ، تم التقاط صور المجهر البؤري الفاصل الزمني علي مدي فتره 55 ساعة. نحن تصوير يعيش الزرد الوراثية التعبير عن gfp أو عروض المناقصة في انسجه مختلفه. ميزه استخدام الأسماك المحورة وراثيا مع مضان الذاتية للتصوير الفاصل الزمني هو ان جزيئات مضان ، مثل GFP وعروض العروض ، يتم إنتاجها بشكل مستمر في الجنين الحي ، التالي ، فانه لا بسهوله التبييض الصورة. أولا ، الاجنه من الصليب من Tg (kdr1: EGFP) mitfab692/B69210 و ubi-zeبرابانت11 كانت imaged. في هذه الاجنه ، يتم التعبير عن عروض العروض في جميع خلايا الجنين ، والتي تسمح بتصور للهيكل العام للجنين. يتم التعبير عن GFP في الخلايا البطانية من الاوعيه الدموية. وكانت الاجنه المزدوجة المحورة وراثيا لمده 55 ساعة من حوالي 30 مرحله الجسيده لتصور تطور الاوعيه الدموية في الراس والجسم (الشكل 3 والفيلم التكميلي S1) باستخدام هدف 10x مع 0.45 NA. اثنان أجنه/جلسة كان [ايمسن] مع [ز-كددس] و[تيم-فلف] في انشوطه [س ثت] بعد تصوير الجنين اولي في اثنان أطوال موجية مختلفه, الثانية كان بعد ذلك [ايمسن] وبعد ذلك الاولي واحده ثانيه. ويبين الشكل 3 السفينة المتداخلة (ISV) ، وتطوير الاوعيه دون المعوية والاوعيه الدموية الراس ، والتكثيف الضفيرة الوريد الذيليه مع تمديد الجذع. التصوير من الجنين كله مع الاوعيه الدموية يظهر ان ISV تنتشر يبدا بين الجسيدات وينمو دورسالي تصل إلى نقطه من الأنبوب العصبي ، حيث ياخذ isvs مسارا مختلفا وبراعم في اتجاه أكثر من الحدود التالية الاماميه الجسيدات.
بعد ذلك ، كانت أجنه الصليب من Tg (mnx: gfp) mitfab692/b629 و ubi-zeبرابانت لمده 55 ساعة تقريبا من مرحله الجسيده 30 لتصور تطوير الخلايا العصبية (الشكل 4 والتكميلية الفيلم S2). Tg (mnx: gfp) قد عبرت لأول مره إلى مدفعb692/b692 (كلا من مركز الموارد الدولية zebrafish في جامعه اوريغون ، أو) لإنتاج Tg(mnx: gfp) مدفعb692/b629. وتنبت الخلايا العصبية المتنقلة من الأنبوب العصبي البطني علي الجسيدات نحو الجانب البطني من الجنين. علي عكس الاوعيه المتشابكة التي تنبت بين الsomites ، تنبت المحاور فوق الوسط علي الsomites التي شكلتها شيفرون. يبدا تنتشر نحو الطرف الامامي من الأنبوب العصبي ، في زاوية مستقيمة من الأنبوب العصبي ، وينتشر الخلفي. بواسطة واجهه somite/صفار ، تنتشر التغييرات الاتجاه إلى الامامي والخلفي تنتشر. لاحظ ان العصب الامامي هو الذي ينميل القلب النامي.
أيضا ، الاجنه من الصليب من tg (kdr: enl. memrfp) مدفعb692/b692 (الصليب من tg (kdr: enl. ميمو و مدفعb692/b692) و tg (mnx: gfp) مدفعb692/b692 كانت imaged. في الاجنه السابقة ، لم يكن فلوري الاوعيه الدموية الحمراء مرئية حتى 36 ساعة بعد الإخصاب (hpf) ، التالي بدانا التصوير في وقت لاحق نقطه في 2 dpf. نحن تصوير جزء من الجذع ، ظهري لتمديد الكيس صفار البيض ، وذلك باستخدام اعلي التكبير (20x الهدف). يظهر هذا الفيلم ان الاجنه لا تزال كافيه لجوده التصوير الجيدة في التكبير الأعلى. وقد اتبعت التنمية المشتركة للسمسار الظهري لمحاور الخلايا العصبية المتنقلة فيما يتعلق بموقف السفن البينية (الشكل 5 والفيلم التكميلي S3). في هذه الأفلام ، والتفاصيل الدقيقة من محور عصبي بطني مرئية ، وكذلك محور عصبي الظهرية تنتشر من الأنبوب العصبي إلى نقطه حيث محاور الخلايا العصبية والسفن المشتركة في الهجرة. كما يظهر بوضوح التكثيف الضفيرة الوريد الذيليه. لاحظ انه باعتباره برعم العصب مفقود نحو النهاية الخلفية لذيل (في موقف العصب12 من الجانب الأيمن) ، يمتد العصبية الخلفية الأقرب نحو الجزء الامامي من الجنين لتغطيه المنطقة بين العصب 11 و 13.
وفي النهاية ، كان هناك صليب من HGn39b12و13 و ubi-zeبرابانت . HGn39b هو خط ztrap مع ادراج gfp في المنشط من البروتين صدمه الحرارة atpase homolog 1 (AHA1) الجينات (http://kawakami.lab.nig.ac.jp/) وانه يعبر عن gfp في عضلات الجسيدات (الشكل 6 والتكميلية الفيلم S4). كما زيادة الأرقام الجسيده ، والجسيده تمتد أيضا في الطول والعرض. هذا الفيلم أيضا يظهر بشكل جيد تطور القلب في فلوري احمر من خط السمك Ubi-zeبرابانت .
الشكل 1: وصف طريقه التركيب. (ا) أضافه الجنين الزيبرافيش إلى البئر الصغيرة التي تم إنشاؤها بواسطة أسفل الزجاج في طبق 35 مم. (ب) أضافه طبقه الاغاروز 1 إلى البئر الصغيرة لتغطيه الجنين. (ج) وضع بعناية زجاج الغطاء علي البئر الصغيرة. (د) أضافه طبقه الاغاروز 2 علي الجزء السفلي من الطبق 35 مم. (ه) أضافه E3 إلى الطبق. (و) رسم تخطيطي لمقطع عرضي لمجموعه التركيب. (ز) صوره المجهر (5x الهدف) من الجنين الزرد في المونتاج النهائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييد نمو الاجنه والتاخر التنموي في التركيزات المختلفة التي نشات. وكانت الاجنه تركب في تركيزات مختلفه وحجمها وتطورها في 48 hpf. الصور الملتقطة بواسطة مجهر مجهز بكاميرا ملونه بالمجهر الرقمي (هدف 2.5 x) وبرنامج المجهر المصاحب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصور لتطور الاوعيه الدموية. الصليب من Tg (kdr1: egfp) mitfab692/b692 و ubi-زيبرابو تصوير من حوالي 30 الجسيده المرحلة ل 55 h علي المجهر البؤري. الاوعيه الدموية في الأخضر وجميع الخلايا الأخرى باللون الأحمر. شريط مقياس 500 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التصور لتطوير الخلايا العصبية والأعصاب sprouting. الصليب من Tg (mnx: gfp) mitfab692/b629 و ubi-زيبرابو تصوير من حوالي 30 الجسيده المرحلة ل 55 h علي المجهر البؤري. المركبات العصبية باللون الأخضر ، وجميع الخلايا الأخرى باللون الأحمر. شريط مقياس 500 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصور للتنمية المشتركة للخلايا العصبية والاوعيه الدموية. الصليب من tg (kdr: enl. memrfp) mitfab692/b692 و tg (mnx: gfp) mitfab692/b692 تصوير لمده 55 ساعة من حوالي 2 dpf علي المجهر البؤري. الاوعيه الدموية باللون الأحمر ، الخلايا العصبية باللون الأخضر. شريط مقياس 500 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تصور العضلات GFP التعبير في الsomites. وكانت الصليب من HGn39b و ubi-zeبرابانت علي المجهر البؤري ل 55 h من حوالي 30 الجسيده المرحلة. العضلات باللون الأخضر ، وجميع الخلايا الأخرى باللون الأحمر. شريط مقياس 500 μm الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الفيلم التكميلي S1: فيلم من الجنين من الصليب من Tg (kdr1: egfp) mitfab692/b692 و ubi-زيبرابو تصوير من حوالي 30 الجسيده المرحلة ل 55 h علي المجهر البؤري باستخدام هدف 10x. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الفيلم التكميلي S2: فيلم من الجنين من الصليب من Tg (mnx: gfp) mitfab692/b629 و ubi-زيبرابو تصوير من حوالي 30 الجسيده المرحلة ل 55 h علي المجهر البؤري باستخدام هدف 10x. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الفيلم التكميلي S3: فيلم من الجنين من الصليب من tg (kdr: enl. memrfp) mitfab692/b692 و tg (mnx: gfp) mitfab692/b692 تصوير من حوالي 2 dpf ل 55 h علي المجهر البؤري باستخدام هدف 20x. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الفيلم التكميلي S4: فيلم من جنين صليب من HGn39b و ubi-زيبرابو تصوير من حوالي 30 الجسيده المرحلة ل 55 h علي المجهر البؤري باستخدام هدف 10x. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويرد هنا طريقه متصاعدة لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة. الخطوة الأكثر اهميه بالنسبة لطريقه التركيب هي تحديد التركيز الأمثل للنشا الذي سيسمح بنمو الجنين الزبرفيش غير المقيد ، وفي الوقت نفسه إبقاء الاجنه في وضع ثابت تماما للتصوير البؤري. ونظرا لان التركيز الأمثل للاغثار ضيق جدا ، فان هذه القيمة حساسة جدا للأخطاء في قياس وزن الأثير وحجم E3 اثناء اعداد الحل. وقد يعتمد التركيز الأمثل أيضا علي درجه الحرارة ومرحله الجنين. التالي ، فان التركيز الأمثل سيحتاج إلى أعاده تحديد لكل دفعه جديده من الحلول التي نشات من خلال تكرار اختبارات تركيزات مختلفه.
خطوه حاسمه أخرى في طريقه المتصاعدة هو أضافه الطبقة الثانية من اجنشا. الطبقة الثانية تحمل الزجاج الغطاء في المكان. يجب ان يضاف بعناية إلى الطبق قليلا في وقت بحيث لا يسبب الزجاج الغطاء للتحرك. الطبقة الثانية أيضا بمثابه حاجز نفاذيه ل E3. بدون E3 ، ستجف الاجنه اثناء التصوير. وبدون الطبقة الثانية من الاغثار ، سيبدا الغطاء الزجاجي والجنين في الطفو.
الحد من طريقه المتصاعدة المقترحة هو انه في حين انه يعمل بشكل جيد لمجاهر مقلوبه ، فانه لا يعمل لمجاهر تستقيم. وقد بذلت عده محاولات لأداء التصوير بالفاصل الزمني باستخدام المجهر المستقيم ، وذلك بملء الطبق الزجاجي السفلي مع E3 ، وختمها بواسطة parafilm ، وتحويلها راسا علي عقب. ومع ذلك ، غالبا ما ادي ذلك إلى انهيار المتصاعدة في منتصف الطريق من خلال التصوير. وقد يكون هذا بسبب زيادة الحرارة في العينة بعد التعرض الطويل للضوء بالليزر ، والذي يؤدي إلى ذوبان الطبقة التي نشات.
وبنهاية المجهر الزمني ، بدات الاجنه تظهر الوذمه التامور. متفاوتة بين التجارب المختلفة ، ولوحظ وذمه بين 35 و 50 ساعة من التصوير. ولا يعرف حاليا ما إذا كان ذلك ناجما عن تجميد الاجنه أو عن تاثير التخدير. ومن المعروف tricaine لقمع انكماش عضلات الهيكل العظمي والقلب. ونتيجة لذلك ، Tricaine يؤثر علي معدل ضربات القلب في الأسماك البالغين14 والاجنه15. وأفادت دراسات أخرى أيضا ان علاج التريايين يسبب وذمه التامور في الاجنه زيبرافيش2,16. في هذه المقالة ، تركيز Tricaine (0.016-0.020 ٪) وقد استخدمت التي يشيع استخدامها في البحوث الزرد ؛ لا يزال ، وقعت الوذمه التامور في نهاية فتره التصوير لدينا. وقد شكلت الوذمه التاموره قيدا رئيسيا لتمكين تصوير الاجنه لفترات زمنيه أطول. الطرق المحتملة لخفض هذه السمية القلبية والجمع بين اثنين من التخدير مختلفه ، مثل Tricaine مع اوجينول ، أو باستخدام α-bungarتوكسين mRNA حقن للتخدير16؛ الآثار المفيدة للدمج أو بدائل التخدير المركبات تحتاج إلى مزيد من التحقيق في التصوير المطول الفاصل الزمني للتنمية الزرد.
وفي الختام ، فان طريقه التركيب الموصوفة سريعة وسهله وفعاله من حيث التكلفة وتعمل علي اي مجهر مقلوب. ويمكن استخدام الاطباق العادية أسفل الزجاج وذوبان منخفضه ، وليس هناك حاجه إلى قوالب خاصه ، والمعدات أو الاجهزه. طريقه التركيب الطبقات يسمح لنمو الجنين وفي الوقت نفسه الحفاظ علي الاجنه في وضع ثابت. باستخدام التصوير المطول الفاصل الزمني للكائن الحي كله المعرفة الجديدة لتطوير الانسجه يمكن الحصول عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
نشكر البرت بان و أردت Sieakmann علي هدايا الأسماك المحورة وراثيا. نشكر كويشي كاواكامي في المعهد الوطني لعلم الوراثة ، المشروع الوطني للموارد البيولوجية التابع لوزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان علي هديه الHGn39bالمحورة وراثيا. ونشكر أيضا فاطمة ميرشانت وكاثلين غايجوسكي علي المساعدة في المجهر البؤري ، وعلي تريسي ثيرتيولت للصور الفوتوغرافية.
وقد دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (المنحة رقم P30ES023512 ورقم العقد HHSN273201500010C). وقد دعمت الرابطة زمالة من برنامج البيولوجيا الحاسوبية للسرطان (Keck) (اتحاد ساحل الخليج كبريت منحه RP140113) ومن قبل صندوق هبات هيو روي وليلي. وقد دعمت مؤسسه روبرت ا. ويلش (0004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
