Summary
このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いたヒト一次食細胞によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの貪食を定量的に測定し、単なる接着から白血球へのコニジアの貪食を判別するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。
Abstract
カビアスペルギルス・フミガトゥスによる侵襲性肺感染は、免疫不全患者に大きな脅威をもたらす。吸入された真菌コニジア(胞子)は、先天性単球および/または好中球によって貪食されることによってヒト肺肺胞からクリアされる。このプロトコルは、ヒト白血球との共インキュベーションのためのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識コニディアを用いたフローサイトメトリーによるファゴサイトシスの迅速かつ信頼性の高い測定を提供し、その後の抗FITC抗体によるアンチステインを可能にし、内部および細胞付着性コニジアの判別を可能にする。このプロトコルの主な利点は、その急速さ、目的の他の細胞マーカーの細胞測定体分析とアッセイを組み合わせる可能性、単一のサンプルからの単球および好中球の同時分析および他の細胞壁を有する真菌または細菌への適用性である。食細胞の食細胞のパーセンテージの決定は、病原体の毒性を評価するための微生物学者や、病原体の野生型と突然変異体を比較するための手段を提供するだけでなく、病原体と戦うためにヒト白血球能力を調査するための免疫学者に提供する。
Introduction
侵襲性肺アスペルギルス症は、治療オプションが限られており、早期診断時にのみ成功し、高い死亡率につながる免疫不全患者にとって大きな脅威です。感染剤は、ほとんどの生息地にユビキタスである金型アスペルギルス・フミガトゥスのコニディア(胞子)である2.コニディアは吸入され、気道を通過し、最終的に肺肺胞に入ることができます。免疫能力の高いヒトにおいて、これらのコニディアは、単球またはマクロファージおよび好中球顆粒球などの自然免疫細胞によってクリアされ、これは病原体を取り込み(貪食)および消化する3である。食細胞症は、宿主と病原体の相互作用に興味を持つ微生物学者や免疫学者にとっても重要です。白血球およびコニジアの共インキュベーションのような対立アッセイは、しばしばフルオレセインまたはその誘導体フルオレセインイソチオシアネート(FITC)による胞子の標識を含む。顕微鏡を使用して、内部化された蛍光コニディアを識別し、付着/付着性のコニディアを決定するのは簡単ですが、このアプローチは面倒で現実的に数百個の細胞4に制限されています。しかし、数十万の細胞を数分以内に容易に分析できるフローサイトメトリーでは、食細胞および付着性コニジアの微分染色が不可欠である。したがって、多くのプロトコルは、付着コニディア5、6、7、8からFITC蛍光をクエンチするためにトリパンブルーに依存しています。別のアプローチは、付着コニディア9、10、11から緑色蛍光の代わりに赤色を放出するために臭化エチジウムおよびFITCの蛍光共鳴エネルギー移動を利用する。特定の抗体が利用可能な場合、一部の細菌の場合と同様に、細胞結合粒子は12、13に直接染色することができる。
ここでは、アロフィコシアニン(APC)結合抗FITC抗体を用いて、ヒト白血球によるFITC標識A.フミガトゥスコニジアの貪食を細胞への胞子の付着と相互作用の欠如と共に迅速かつ定量的に評価するプロトコルを提示する。この方法はまた、同じサンプルからの単球および好中球による食細胞症の別々の分析に使用することができるさらなる細胞マーカーの同時フローサイトメトリック分析を可能にする。
このプロトコルは、真菌系株(例えば、ここで提示されるムコラレ属からのいくつかの種のアスペルギルスおよび他の型)および免疫不全個体からの白血球などの食細胞に関する変異体14および免疫学的研究に適用することができる。
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Protocol
このプロトコルは、輸血医学研究所から得られたヒトバフィーコートの使用、イエナ大学病院および患者から引き出された新鮮な静脈血の使用を含み、いずれも倫理委員会の承認4357-03/15に従ってドナーの書面によるインフォームド・コンセントの後に。
1.アスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの調製
- 1.5%モルト寒天ペトリ料理でA.フミガトゥスをCO2なしで37°Cで5日間栽培する。
注意: A. フミガトゥスはバイオセーフティレベル2の微生物であり、バイオセーフティキャビネットを使用し、ラボコート、手袋、フィルターマスクを着用して適切な施設で取り扱う必要があります。
メモ:プレートは、コニディアの緑色の灰色の層で完全に覆われるべきです。白い文化は散発しない。麦芽寒天の組成:4%(w/v)麦芽エキス、酵母エキス0.4%(w/v)、寒天1.5%(w/v)、アクアデスト。 - 収穫コニディア
- 消毒剤で濡らしたペーパータオルをバイオセーフティキャビネットに入れ、プレートを上に置いて揮発性コニディアの過剰分布を防ぎます。
- 真菌の上に10mLのリン酸緩衝生理食塩分(PBS)+0.01%洗剤を加え、ドリガルスキスパチュラを使用してプレート上に液体を広げ、濃い色のコニディアをこすり落とします。白い菌糸体を取り除かないように注意してください。
- 30μmの細胞ストレーナーを使用して50mLチューブにコニディア懸濁液を入れ、残留菌糸体を除去します。
- 手順 1.2.2 と 1.2.3 を繰り返し、同じ 50 mL チューブで収集します。
- 室温で2,600 x gで5分間スピン。
- 上清を取り除き、滅菌アクアデストの20mLで再サスペンドします。
- トマカウントチャンバーでコニディア濃度を決定します。
メモ:プロトコルはここで一時停止することができ、コニディアサスペンションは蓋をしっかりとねじ込んで4°Cで最大1ヶ月間保存されます。
- FITC ラベリング
- 滅菌0.1MNa2CO3(PBSに溶解)でFITC粉末の0.1mM溶液を調製する。
注意: FITC粉末は危険であり、手袋、ゴーグル、フィルターマスクで処理する必要があります。現地の規制に従って廃棄物を回収する。
メモ: この間、およびコニディアを含む次の手順では、人工光を省略します。 - 15 mLチューブ内のFITC溶液の5 mLで1 x 108(またはそれ以下)のコニディアを再サスペンドします。回転子で37°Cで20分間インキュベートします。
- 負のコントロールの場合は、0.1 M Na2CO3(FITCなし)でコニディアを15 mLチューブに再サスペンドします。回転子で37°Cで20分間インキュベートします。
メモ:染色するコニディアの量を計算する場合は、染色、腫脹およびすべての必要な洗浄ステップ中に最大70%の損失を考慮に入れます。ローテーターがない場合は、インキュベーション中にサスペンションを3回振る必要があります。 - 洗浄には、10 mLのPBS + 0.01%の洗剤を懸濁液に加え、室温で2,600 x gで5分間回転させます。
- 上清を取り除き、10mLのPBS+0.01%洗剤で2回洗浄を繰り返します。
- 滅菌0.1MNa2CO3(PBSに溶解)でFITC粉末の0.1mM溶液を調製する。
- コニディアの腫脹(望ましくない場合は省略してもよい)
- ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地+10%胎児子牛血清(FCS)の5mLでFITCラベル付けされたFITCを再サスペンドし、所望の時間(例えば、2時間、4時間)の回転子でインキュベートする。
メモ:ローテーターがない場合は、インキュベーション中に少なくとも20分ごとにサスペンションを振る必要があります。 - 10 mL の PBS + 0.01% 洗剤をサスペンションに加え、室温で 2,600 x gで 5 分間回転させます。
- 上清を取り除き、10mLのPBS+0.01%洗剤で2回洗います。
- 30μmのセルストレーナーを通してフィルター処理し、コニディアの大きな塊を除去します。
- ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地+10%胎児子牛血清(FCS)の5mLでFITCラベル付けされたFITCを再サスペンドし、所望の時間(例えば、2時間、4時間)の回転子でインキュベートする。
- コニディアの固定(望ましくない場合は省略してもよい)
- FITCラベルを付け、1 mLのホルムアルデヒドでコニディアを膨潤させ、室温で1時間インキュベートする。
- 10 mL の PBS + 0.01% 洗剤をサスペンションに加え、室温で 2,600 x gで 5 分間回転させます。
- 上清を取り除き、10mLのPBS+0.01%洗剤で2回洗います。
注:プロトコルはここで一時停止することができ、暗闇の中でPBSに保存されたコニディア(アルミ箔で包まれたチューブ)は、4 °Cで最大1週間。
2. ヒト原発性白血球の調製
- 50 mLの管に5 mLのバフィーコートを入れます。あるいは、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)モノベット(50mLチューブあたり10mL)に引き込まれた新鮮なヒト末梢静脈血を使用する。
注意: ヒト血液は、ヒト免疫不全ウイルスやB型肝炎ウイルスなどのウイルスを媒介する可能性があります。B型肝炎の予防接種を受けた後にのみ、ラボコートと手袋を着用したバイオセーフティキャビネットのハンドルを取り扱います。 - 赤血球溶解(EL)バッファーでチューブを充填し、3回反転し、混合物の乳白色の外観が明確になるまで水平に5〜8分間インキュベートします。
メモ:時折、血液がライズに時間がかかることがあります。外観で行く。同じ血液の2本の管が異なる時間をかけてライズを取ることは珍しいことではない。EL緩衝液の組成: 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA - 室温で300 x gで10分間スピン。上清を捨てる。
- ピペットを配管してELバッファの1 mLでペレットを再サスペンドします。次に、さらに 24 mL の EL バッファを追加し、数回反転します。
- 室温で300 x gで5分間スピン。
- 上清を廃棄し、1 mL の RPMI + 10% FCS で細胞を再サスペンドします。
- ノイバウアー計数室で細胞濃度を決定します。
3. 食細胞症アッセイ
- 12ウェル細胞培養プレート中のRPMI+10%FCSの1.5mLで、2 x 106白血球および4 x 106 FITC標識コニディア(感染の多重度=2)をインキュベートする。コントロールとして、細胞のみ(コニディアなし)と細胞+標識されていないコニディアを含めます。
- 加湿したCO2インキュベーターを37°Cに入れ、所望の期間(例えば、0.5時間、2時間、4時間)インキュベートします。
- インキュベーション後、細胞スクレーパーで細胞を収穫し、15mLチューブに入れます。
- 室温で300 x gで5分間スピン。
- サイトカイン分析のために上清を収集するか、望まない場合は廃棄します。各サンプルを100μLのPBS + 2 mM EDTAで再サスペンドします。
4. 抗体染色
- 各サンプルについて、APC抗FITC抗体を含む抗体ミックスの100μLを調製し、表1に従って。
- 100°Lサンプルを96ウェルV底板の1ウェルに入れます。洗浄用に150μLのPBS + 2 mM EDTAを加えます。
- 色補正を行う場合は、96 ウェル V 底板のさらにウェルに各色に 1 x 106セルを配置します。未染色のままにした細胞の井戸を含めます。洗浄用に150μLのPBS + 2 mM EDTAを加えます。
- 粘着箔でプレートをカバーします。
- 室温で300 x gで5分間スピン。ホイルを取り外します。
- 洗面台や使い捨てのペーパータオルの上に一度だけプレートを素早く強制的に反転させることで上清を捨てます。
メモ:乾燥するまでプレートを繰り返したりノックしたりしないでください。 - 100μL抗体ミックス中の細胞を再サスペンドし、ピペットによりよく混合する。
- 色補正のために、PBS+ 2 mM EDTAの100 μLでそれぞれの細胞を再中断し、抗体ミックスで使用されるのと同じ量で各ウェルに単一の抗体を追加します。
- 粘着箔で覆い、暗闇の中の室温で20分間インキュベートします。
- ホイルを取り外します。150 μL の PBS + 2 mM EDTA を各ウェルに加え、洗浄用に追加します。粘着箔で覆います。
- 室温で300 x gで5分間スピン。ホイルを取り外します。流しや使い捨てのペーパータオルの上にプレートを素早く強制的に反転させることで上清を捨てます。
- PBS + 2 mM EDTA の 200 μL で再サスペンドし、各ウェルから別々の丸底チューブにセルを転送します。サスペンションにセルクラスタがないことを確認します。それ以外の場合は、クラスターを削除します。
メモ:目が見えるほど大きいクラスタは、サイトメーターを詰まらせるほどの大きさです。
5. フローサイトメトリー
- フローサイトメーターを開始し、それをウォームアップさせます。取得ソフトウェアを起動します。
- 新しい実験を作成し、サンプルを設定してラベルを付けます。
- フルオロフォレスFITC、APC、BUV395、V500、PerCP-Cy5.5のパラメータ(FSC 250、SSC 250)と検出器を設定します。
- 報酬の設定
- 報酬の設定を開きます。
- 個々の色を示します。
- コントロールセルを未染色のままにするか、個々の染色を使用して、PMT検出器電圧をスケール内のすべてのイベントを含むように設定します。
- 各コントロールの少なくとも 10,000 個のイベントを記録します。
- 補償設定を使用して蛍光体のスピルオーバーを計算し、実験のサイトメーター設定に適用します。
- サンプル データの記録
- 取得ソフトウェアでFSCとSSCを表示し、白血球の周りにゲートを設定します。
- 白血球ゲートに基づいて、コニディアから分離するCD45+細胞のドットプロットSSC/CD45とゲートを表示します。
- CD45+ 細胞をドットプロット CD14/CD66b とゲート単球 (CD14+) と好中球 (CD66b+) で別々に表示します。
- ドットプロット抗FITC/FITCで好中球を表示します。
- ラベルのないコニディアを含むサンプルを使用して、抗FITC信号およびFITCシグナルの象限を設定し、それぞれの象限内の細胞の最大1%を可能にします。
- 単球ゲートに対して手順5.5.4と5.5.5を繰り返します。
- 白血球ゲートに少なくとも20,000イベントを持つすべてのサンプルを記録します。
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Representative Results
ヒト貪食細胞によるA.フミガトゥス・コニディアの貪食を測定する際には、特にフローサイトメトリーなどのハイスループット法に関しては、本物の内在化と単なるコニディアの細胞への付着との間の判別が障害となる。このハードルを克服するために、細胞とコニディアの共インキュベーションの前に蛍光色素FITCによるコニディアの染色に基づく高速で信頼性の高いプロトコルを提示し、続いてインキュベーション後にAPC標識抗FITC抗体を用いて反染色を行う(図1A)。図1Bに示すように、FITC標識コニディアは、細胞に緑色シグナルを提供するヒト単球および好中球によって貪食される。これらのコニディアは抗FITC抗体に対してアクセス不能であり、したがって、抗体を結合することができず、細胞はAPC陰性(FITC+、APC-)に現れる。非相互作用細胞はFITC標識コニディアから緑色の信号を取得せず、FITC-、APC-のままです。いくつかのセルは FITC-、APC+と表示されます。抗FITC APC抗体はFITC標識コニディアなしで細胞を結合できないはずであるため、これらの事象は染色アーティファクトと考えられる。FITC標識コニディアは、細胞に付着しているが内部化されていないが、細胞もFITCに対して陽性であるが、FITCおよびAPC(FITC+、APC+)に対してこれらの細胞を二重陽性にする抗FITC抗体の標的を提供する。顕微鏡的に分析した場合、この集団は、我々の実験でのみコニディアが付着した細胞の最大20%を含んでいた。
このプロトコルに記載された抗体を用いて、図1Dのゲーティング戦略に従って、FSCおよびSSC特性によるヒト白血球の一般的なゲーティングに続いて、汎白血球マーカーCD45による白血球と遊離コニジアの分離が続く。特に腫れたコニディアや長いインキュベーション時間を使用する場合、コニディアはフローサイトメトリーの時点でほぼ細胞サイズに達し、したがってバイアス分析を行うことができます。ヒト一次単球と好中球はコニディアを異なる方法で取り込むため、このプロトコルは、単球用の確立された細胞系統マーカーCD14と好中球用のCD66bによる染色に基づいて、これらの細胞集団を別々に分析することを可能にする。食素細胞集団および付着細胞集団のゲーティングは、FITCおよび抗FITC APCシグナルを運び行わない標識されていないコニディアを有する対照サンプルに基づいて行われる。APC と FITC が互いにプロットされる場合、象限は、対象のゲートで最大 1% のセルが許可されるように設定されます。
コニディアを内在化するヒト一次食細胞の割合は、献血者の間で非常に可変であり得るが、また、インキュベーション時間やコニジアの腫脹状態などの実験因子に依存する。胞子内在化は、既に0.5時間の共インキュベーション後に検出することができ、時間とともに増加する(図2A)。前に腫れたコニディアは、短時間のインキュベーション時でも胞子を休ませる(腫れしない)よりも容易に取り込まれる(図2B)。コニディアがホルムアルデヒドで固定されている場合、食細胞症は天然のコニディアに比べて減少する(図2C)。
| 試薬 | サンプルあたりの°L |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0.5 |
| CD66b パーCP-サイ5.5 | 1.5 |
| アンチフィットC APC | 0.5 |
| PBS + 2 mM EDTA | 97 |
| 合計 | 100 |
表1:フローサイトメトリーのための抗体ミックス。各試薬の量は、分析されるサンプル(1 x 106細胞)当たりマイクロリットルとして与えられる。
図1:フローサイトメトリック食細胞症アッセイの設定と分析(A)コニディアおよび細胞調製および対染色を含むプロトコルのスキーム。(B)食細胞症は、抗FITC APC反染色に対するFITC標識コニディアのフローサイトメトリックデータをプロットすることによって分析される。得られた集団は、非相互作用性白血球(FITC-、APC-)、付着性コニジア(FITC+、APC+)および貪食白血球(FITC+、APC-)を有する白血球および染色性アーティファクト(FITC-、APC+)の割合を示す。(C)3つの異なるドナーを用いた3つの異なる実験からの二重陽性細胞集団(そのうちの2つは重複して行われ、1つは単一で行われた)を顕微鏡的に内部化し、コニディアのみを添付した。(D)白血球(CD45)を検出し、単球(CD14)および好中球(CD66b)を同定し、相互作用集団(FITC、抗FITC)を決定するためのフローサイトメトリックデータの代表的なゲーティング戦略。この図は、Hartungらから改変されており、サイトメトリーA、95:3、p. 332-338(2019)14.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ヒト原発性食細胞によるコニジアの貪食は、いくつかの条件に依存する。(A) 休息コニディアを内在化する細胞の割合は、共インキュベーション時間とともに増加した。(B)食細胞症は、0.5時間共インキュベートした時の心膜腫脹時間とともに増加し、天然コニジアは固定コニディアよりもより良い食細胞化であった。データは、10(A,B)または5(C)独立実験において10種類のドナー(A,B)または5種類のドナー(C)から得られた。誤差範囲は SD を示します。この図は、Hartungらから改変されており、サイトメトリーA、95:3、p. 332-338(2019)14.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:食細胞症の分析は、ヒト原発性食細胞の機能性を評価し、臨床的に関連する型を特徴付ける手段である。(A)健康なドナーと免疫抑制患者からの単球の例示的な比較(造血幹細胞移植後)を0.5時間、2時間および4時間の休息コニディアを食べる食細胞(B)休息真菌コニディアのファゴサイシスは、臨床的に関連するアスペルギルスおよびムコラレ種について決定した。データは、それぞれ5または3の独立した実験において5(アスペルギルス)または3(ムコラレス)異なるドナーから得られた。誤差範囲はSD.略語を示す: A.アスペルギルス, L.リヒテミア, M.ミューコール, R.リゾプスこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、一般的な顕微鏡プロトコルでは不可能な多数の一次ヒト白血球とのA.フミガトゥス・コニディアの相互作用を測定する高速フローサイトメトリ法を提示する。顕微鏡で細胞をイメージングし、内部化されたコニディアを手動でカウントすることは面倒で、数百個の細胞に対してのみ現実的に行うことができます。フローサイトメトリーは、数分以内に数千の細胞を測定することにより、この問題を克服します。両方のアプローチに共通するハードルは、それぞれ細胞内または細胞上の貪食と付着性コニジアの区別である。顕微鏡検査では、色素カルコフルオホワイトは付着コニディアを染色するためによく使用されますが、その使用法はキチン含有細胞壁を有する微生物に限定されます。
対照的に、このプロトコルは、系統マーカーCD45、CD14およびCD66bのようなさらなる細胞マーカーの追加を可能にする相互作用イベントの特徴付けのために異なる蛍光葉を使用した。これにより、単球および好中球による病原体の貪食を単一試料で区別することもできる。細胞同定のためのマーカーと蛍光色素の選択は、実験のニーズと利用可能なサイトメーターの容量に適応することができますが、このプロトコルで言及された特定のAPC抗FITC抗体の使用は、このプロトコルのように推奨されます。私たちの手の中で最も信頼性の高い抗体。
ホルムアルデヒド固定コニディアは等しく内部化されていないので、食細胞症アッセイには天然胞子が推奨される。しかし、天然のコニディアは、ヒト白血球との共インキュベーション中に腫脹を開始または継続し、最終的に発芽する。典型的には、A.フミガトゥス・コニジアは、37°Cでグルコース含有媒体で約8〜9時間後に発芽する。卵細胞との膨潤時間と共インキュベーション時間の組み合わせは、発芽がコニディア表面のFITCの損失を引き起こすので、この時間枠を超えてはならない。さらに重要なのは、単球や好中球によってもはや卵細胞化することができない。代わりに、これらの食細胞は周囲に蓄積し、細胞計を詰まらせる細胞クラスターを産生する生殖に固執する。同様に、4時間の腫れたコニディアは、細胞間および細胞の間でクラスターを生成する傾向がある。多くの場合、これらのクラスターは機械的に分離できなくなり、フローサイトメトリック解析のために中のセルが失われます。
ゲーティングは最初は簡単で簡単ですが、より多くのコニディアが細胞によって内部化され、ぼやけたゲーティングがなることがあります。MOI > 2 を使用すると、最初の時点で食素症が増加しますが、ゲーティングの問題も早く発生する可能性があります。したがって、MOIは、目的の特定の細胞および病原体で慎重に決定されるべきである。
このプロトコルの制限は、付着性コニディア(FITC+ APC+)を有する細胞集団の二重性であり、また、付着性と内部化されたコニディアを有する細胞を収容している可能性がある。さらなる判別の可能性は、フローサイトメーターで測定されたすべての細胞の視覚イメージングを可能にするイメージングフローサイトメトリー15の適用である。
心膜細胞壁の非特異的FITC標識のために、この方法は、ムラテレス属または酵母カンジダアルビカンスの臨床的に関連する型のような目的の他の真菌に容易に移動可能である。また、細胞壁軸受菌もFITC標識化することができる。抗FITC抗体による普遍的な反染色は、多数のヒト白血球によるこれらすべての病原体の貪食の迅速かつ容易な測定を可能にする。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
ピア・スティエ夫人の優れた技術支援に感謝します。M. フォン・リリエンフェルト・トーアルは敗血症管理ケアセンター(ドイツ連邦教育保健省、BMBF、FKZ 01E01002)および感染性Gnostics研究キャンパス(BMBF、FKZ 13GW0096D)によってサポートされています。ティ・ゴック・マイ・ホアンは、イエナ・スクール・オブ・微生物通信(ドイツ・フォルシュチュンゲマイインシャフト、FKZ 214/2)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
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