Summary
Dit protocol beschrijft hoe de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegansmeten. Deze methode is nuttig voor fundamenteel biologisch onderzoek naar intestinale gezondheid in verband met de interactie tussen darmbacteriën en hun gastheer en voor screening om te identificeren van probiotische en chemische agentia te genezen van lekkende gut syndroom en inflammatoire darmziekten.
Abstract
In levende organismen is intestinale hyperpermeabiliteit een ernstig symptoom dat leidt tot veel ontstekings darmziekten (Ibd's). Caenorhabditis elegans is een diermodel van nonzoogdieren dat op grote schaal wordt gebruikt als een testsysteem vanwege de korte levensduur, transparantie, kosteneffectiviteit en gebrek aan ethische problemen met dieren. In deze studie, een methode werd ontwikkeld om te onderzoeken van de effecten van verschillende bacteriën en 3, 3 '-diindolylmethane (DIM) op de intestinale permeabiliteit van C. elegans met een hoge doorvoer beeldanalyse systeem. De wormen werden geïnfecteerd met verschillende darmbacteriën of met Dim behandeld voor 48 h en gevoed met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-dextran 's nachts. Vervolgens werd de intestinale permeabiliteit onderzocht door de fluorescentie beelden en de intensiteit van de fluorescentie in de worm lichamen te vergelijken. Deze methode kan ook het potentieel hebben om te identificeren van probiotische en pathogene darmbacteriën die invloed hebben op de intestinale permeabiliteit in het diermodel en is effectief voor het onderzoeken van de effecten van schadelijke of gezondheidsbevorderende chemicaliën op intestinale permeabiliteit en intestinale gezondheid. Dit protocol heeft echter ook een aantal aanzienlijke beperkingen op het genetisch niveau, vooral om te bepalen welke genen worden gewijzigd om ziekte te beheersen, omdat deze methode meestal wordt gebruikt voor fenotypische bepaling. Bovendien is deze methode beperkt tot het bepalen van precies welke pathogene ondergronden ontstekingen veroorzaken of de doorlaatbaarheid van de darmen van de wormen verhogen tijdens infectie. Daarom, verdere diepgaande studies, met inbegrip van onderzoek van het moleculaire genetische mechanisme met behulp van mutant bacteriën en nematoden evenals chemische component analyse van bacteriën, zijn vereist voor het volledig evalueren van de functie van bacteriën en chemicaliën bij het bepalen van de intestinale permeabiliteit.
Introduction
Intestinale permeabiliteit wordt beschouwd als een van de belangrijkste barrières in verband met de intestinale microbiota en mucosale immuniteit en is waarschijnlijk worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals gut microbiota modificaties, epitheliale stoornis, of slijm laagwijzigingen1. Recente papers hebben gerapporteerd effectieve protocollen voor het meten van de intestinale permeabiliteit van gekweekte menselijke intestinale cellen door het analyseren van de fluorescentie flux tarieven over de intestinale cel Layer2, maar minder onderzoek papers presenteren een geschikte procedure voor het meten van de darm permeabiliteit in nematoden, met name in C. elegans, met behulp van FITC-dextran kleuring.
Er zijn twee representatieve protocollen voor het meten van de darm permeabiliteit in C. elegans met behulp van Nile Red3 en erioglaucine Dinatrium (of de Smurf assay)4,5. In dit protocol gebruikten we FITC-dextran (gemiddeld molecuulgewicht 10.000), dat een veel hoger molecuulgewicht heeft dan Nijl rood (MW = 318,37) en erioglaucine Dinatrium (MW = 792,85). FITC-dextran is meer vergelijkbaar dan de Nijl rode of erioglaucine dinatriumkleurstoffen aan werkelijke macromoleculaire voedingsstoffen zoals koolhydraten, die worden geabsorbeerd door de intestinale laag. De intestinale permeabiliteit van C. elegans gevoed met erioglaucine Dinatrium(blauwe Smurf kleurstof) kan eenvoudig worden geëvalueerd zonder fluorescentiemicroscopie. Echter, in de Smurf Assay, kwantitatieve analyse van intestinale permeabiliteit is moeilijk te wijten aan het gebrek aan standaardisatie en moet handmatig worden geëvalueerd4,5. In het geval van de Nijl rode Assay, Nile Red ook vlekken lipide druppels in cellen, die kunnen interfereren met de exacte bepaling van de darm permeabiliteit in C. elegans6. De huidige protocollen maken snelle en nauwkeurige kwantitatieve analyse mogelijk van intestinale permeabiliteit in C. elegans behandeld met verschillende intestinale bacteriën en chemicaliën terwijl het vermijden van onspecifieke lipide-kleuring.
C. elegans is een typisch model in biologische gebieden vanwege de betaalbare prijs, eenvoudige manipulatie, beperkte dierlijke ethische kwesties en een korte levensduur, wat gunstig is voor snelle experimenten7. In het bijzonder, nadat de gehele c. elegans genoom werd gepubliceerd, bleek bijna 40% van de genen in de C. elegans genoom orthologous te zijn voor genen die menselijke ziekten8veroorzaken. Bovendien maakt het transparante lichaam observatie in het organisme mogelijk, wat voordelig is voor het onderzoeken van cellulaire gebeurtenissen en voor fluorescentie toepassingen in celbiologie, zoals stamcel kleuring met DAPI of immunohistochemie9. C. elegans wordt vaak gebruikt als een experimenteel dier om de interactie tussen de darm microbiota en de gastheer te bestuderen; Bovendien, C. elegaNS wordt gebruikt voor het scherm gezondheidsbevorderende probiotische bacteriën10,11,12 evenals dieet chemicaliën bevordering van intestinale gezondheid13,14.
Pseudomonas aeruginosa en enterococcus faecalis zijn bekende gut bacteriën die negatieve invloed op het gastro-intestinale systeem, vooral de Colon cellen van het darmkanaal15,16. Daarom, het meten van de darm permeabiliteit veroorzaakt door deze bacteriën is noodzakelijk voor de screening en de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen die kunnen herstellen en de schade veroorzaakt door bacteriële ontsteking en infectie te verminderen. In dit protocol, We testten de effecten van deze intestinale bacteriën op de intestinale permeabiliteit van C. elegans.
We rapporteren ook een geoptimaliseerd protocol voor het testen van chemicaliën op de intestinale permeabiliteit van C. elegans. Voor dit doel, we gebruikten 3, 3 '-diindolylmethane (Dim) als een model chemische omdat Dim is een bioactieve metaboliet samengestelde afgeleid van indool-3-carbinol, die aanwezig is in Brassica voedsel planten, en is gemeld dat therapeutische effecten op IBD in muizen17,18. Bovendien, we onlangs ontdekt dat DIM verbetert intestinale permeabiliteit dysfunctie in zowel gekweekte menselijke intestinale cellen, alsmede het model nematode C. elegans19.
In deze studie gebruikten we drie verschillende experimentele condities. Eerst, we gemeten de effecten van de verschillende bacteriën, P. aeruginosa en E. faecalis, op intestinale permeabiliteit (Figuur 1). Ten tweede, we gemeten de effecten van levende en hitte-geïnactiveerd P. aeruginosa op intestinale permeabiliteit (Figuur 2). Ten derde, we gemeten de effecten van DIM (een model chemisch) op de intestinale permeabiliteit van C. elegans gevoed met P. aeruginosa (Figuur 3).
Het doel van deze studie was om geoptimaliseerde protocollen te ontwikkelen die de intestinale permeabiliteit van C. elegansmeten, die wordt gewijzigd door behandeling met verschillende intestinale bacteriën en met chemicaliën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van P. aeruginosa PAO1 en Escherichia coli OP50 cultuur
- Bereid 500 mL gesteriliseerde Luria-Bertani (LB) medium (tabel 1) en inoculeren een enkele kolonie van P. aeruginosa in het medium. Inbroed de kweek van 14 tot 15 uur bij 37 °C met een trillende snelheid van 150 rpm.
- Verdeel de bacteriecultuur gelijkmatig in 2 500 mL centrifugebuizen en centrifugeer de buisjes op 3.220 x g bij 4 °c gedurende 30 minuten.
- Verwijder het supernatant tot het volume 50 mL (een tiende van het aanvankelijke volume) is en de bacteriële pellet rebrengt.
- Bewaar de geconcentreerde bacteriecultuur bij 4 °C tot het gebruik. De bewaartermijn van P. aeruginosa cultuur kan maximaal 1 maand, maar verse cultuur is beter voor het induceren van intestinale schade.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Naast de hele levende bacteriën kan de supernatant van de bacteriecultuur worden gebruikt om de effecten van de darmbacteriën19te testen. - Om e. coli OP50 voor te bereiden, cultuur e. coli OP50 in Dyt medium (tabel 1) en pas vervolgens soortgelijke stappen toe als hierboven beschreven, maar verlaag het volume tot een zesde van het oorspronkelijke volume. Bijvoorbeeld, als het eerste volume 500 mL, na het verwijderen van supernatant, het resterende volume is ongeveer 83 mL.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.
2. bereiding van enterococcus faecalis kctc 3206 cultuur
- Bereid 500 mL gesteriliseerde hersen hart infusie (BHI) Bouillon (tabel 1).
- Inoculeren één kolonie in 500 mL BHI Bouillon en incuberen de cultuur voor 14 – 15 h in een schud incubator bij 37 °C en 150 rpm.
- Verdeel de bacteriecultuur gelijkmatig in 2 500 mL centrifugebuizen en centrifugeer de buisjes op 3.220 x g bij 4 °c gedurende 30 minuten.
- Verwijder het supernatant tot het volume 50 mL (een tiende van het aanvankelijke volume) is en rehervat de pellet.
- Bewaar de geconcentreerde bacteriecultuur bij 4 °C tot het gebruik. De verse cultuur is beter voor het testen van de effecten op de intestinale permeabiliteit.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.
3. bereiding van warmte-geïnactiveerd E. coli OP50 en warmte-geïnactiveerd P. aeruginosa PAO1 culturen
- Kweek en oogst de bacteriën zoals hierboven beschreven (stappen 1.1 – 1.3).
- Heat-inactiveren van de E. coli OP50 of P. aeruginosa PAO1 cultuur zoals eerderbeschreven 20,21,22. Voor het inactiveren van de warmte, incuberen de geresuspendeerde bacteriën bij 65 °C (waterbad) gedurende 30 minuten.
- Koel de geconcentreerde bacteriecultuur af op kamertemperatuur en bewaar deze bij 4 °C tot het gebruik. De opslagperiode kan maximaal 1 maand zijn.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.
4. bereiding van nematode groei medium (NGM) platen voor het testen van de effecten van verschillende bacteriën op de intestinale permeabiliteit van C. elegans
- Breng 1,25 g peptone, 1,5 g NaCl, 8,5 g agar, een magneetroerder en 487,5 mL gedistilleerd water in een glazen fles van 500 mL (tabel 1).
- Meng het mengsel goed, autoclaaf het mengsel gedurende 15 minuten bij 121 °C en koel het mengsel tot 55 °C in een waterbad gedurende 30 minuten.
- Verwijder het medium uit het waterbad, voeg de componenten (0,5 mL van 1 M CaCl2, 0,5 ml cholesterol, 0,5 ml MgSO4, 12,5 ml KPO4) (tabel 1) toe aan de NGM en meng goed.
Opmerking: Alle afzonderlijke componenten moeten worden geautoclaveerd met uitzondering van cholesterol (opgelost in absolute ethanol), en elke experimentele stap moet worden uitgevoerd op een schone Bank. - Verdeel 20 mL NGM per 90 x 15 mm Petri schaaltje en laat de agar op een schone Bank op kamertemperatuur (ongeveer 20 °C) stollen. De NGM platen kunnen maximaal één maand worden bewaard bij 4 °C.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. De NGM-platen die worden gebruikt voor de kleuring van FITC-dextran werden volgens dezelfde procedure opgesteld (van de stappen 4.1 – 4.3). 10 mL NGM werd gedistribueerd naar elk 60 x 15 mm Petri schaaltje en kon op een schone bankje op kamertemperatuur (ongeveer 20 °C) stollen. - Haal de bacteriecultuur uit de koelkast van 4 °C en Vortex de cultuur grondig voordat u de cultuur op de NGM-platen verspreidt.
- Voeg in totaal 800 μL van de bacteriecultuur toe aan elke nieuwe NGM-plaat en laat de platen 's nachts drogen in een incubator van 20 °C.
Opmerking: Voor het eerste experiment (Figuur 1) werden twee NGM-platen met e. coli OP50, één NGM-plaat met P. aeruginosa PAO1 en één NGM-plaat met e. fecalis -KCTC3206 bereid. Voor het tweede experiment (Figuur 2), twee NGM platen met levende E. coli OP50, één NGM plaat met live P. aeruginosa PAO1, en één NGM plaat met warmte-geïnactiveerd P. aeruginosa PAO1 werden voorbereid.
5. bereiding van NGM-platen voor het testen van de effecten van een chemische stof (DIM) op de intestinale permeabiliteit van C. elegans gevoed met P. aeruginosa
- Voeg 0,5 g peptone, 0,6 g NaCl, 195 mL gedistilleerd water, een magneetroerder en 6,8 g agar toe aan een glazen fles van 500 mL (NGM agar).
- Voeg 0,5 g peptone, 0,6 g NaCl, 195 mL gedistilleerd water en een magnetische roerder zonder agar toe aan een andere glazen fles van 500 mL (NGM Broth).
- Autoclaaf de twee flessen (uit stappen 5.1 – 5.2), een lege glazen fles van 100 mL en een lege glazen fles van 500 mL gedurende 15 minuten bij 121 °C. Laat vervolgens het medium met flessen afkoelen tot 55 °C in het waterbad gedurende 30 minuten. Houd het agar-medium in het waterbad en verwijder de fles met Bouillon (vanaf stap 5,2) voor de volgende stap.
- Voeg de additieve chemicaliën toe aan de NGM-Bouillon: 0,4 mL van 1 M CaCl2, 0,4 ml cholesterol in ethanol (ml), 0,4 ml van 1 m MgSO4 en 10 ml van 1 m KPO4 (al deze componenten moeten worden gesteriliseerd met uitzondering van het cholesterol in ethanol). Roer het mengsel vervolgens grondig met een magneetroerder op 55 °C.
- Label de geautoclaveerd lege 500 mL glazen fles met dimethylsulfoxide (DMSO) en de geautoclaveerd lege glazen fles van 100 mL met DIM.
- Breng 50 mL NGM Bouillon over in de DIM-gelabelde fles van 100 mL. Voeg 500 μL van 20 mM DIM Stock in de fles en meng goed.
Opmerking: DIM is opgelost in DMSO (20 mM DIM Stock). - Verwijder snel het NGM agar medium uit het waterbad, voeg 50 mL NGM agar medium toe aan de DIM-gelabelde fles en meng grondig.
- Plaats een 20 mL aliquot DIM-bevattende NGM medium in elke 90 mm x 15 mm Petri schaaltje. Vanaf deze stap kunnen ongeveer vijf DIMBEVATTENDE NGM-platen worden gemaakt.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van DIM in elke NGM plaat zal zijn 100 μM. - Om de DMSO-bevattende NGM-plaat voor te bereiden, breng 150 mL NGM-Bouillon over in de DMSO-gelabelde 500 mL fles. Voeg 1,5 mL DMSO toe aan de fles en meng goed.
- Voeg 150 mL NGM agar medium toe aan de DMSO-gelabelde fles en meng grondig.
- Plaats een 20 mL aliquot DMSO-bevattende NGM medium in elke 90 mm x 15 mm Petri schaaltje. Vanaf deze stap kunnen ongeveer vijftien DMSO-bevattende NGM-platen worden gemaakt.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van DMSO in elke NGM-plaat zal 0,5% zijn. - Versterk de platen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 3 uur en bewaar ze bij 4 °C tot het gebruik.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. - Verwijder de E. coli OP50 of P. aeruginosa PAO1 cultuur uit de koelkast van 4 °c (vanaf stap 1,4) en Vortex de cultuur naar behoren voordat u de NGM-platen verspreidt.
- Breng 800 μL van de E. coli OP50 of P. aeruginosa PAO1 bacteriële cultuur op elke verse NGM agar plaat en laat de platen 's nachts drogen in een 20 ° c incubator.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Voor het derde experiment (Figuur 3), twee DMSO-bevattende NGM platen bedekt met levende E. coli OP50, een DMSO-bevattende NGM plaat bedekt met levende p. aeruginosa PAO1, en één Dim-bevattende NGM plaat gecoat met levende p. aeruginosa PAO1 werden voorbereid.
6. bereiding van de leeftijd gesynchroniseerde C. elegans
- Kweek wormen op een vaste NGM plaat en voed ze met E. coli OP50 totdat de gewenste populatie bereikt is.
- Synchroniseer de eieren met behulp van de getimed Eier legmethode of de behandeling van de bleek oplossing zoals eerder beschreven20,23,24.
7. behandeling van bacteriën of DIM-en FITC-dextran-voeding
- Inbroed de eieren met de leeftijd gesynchroniseerd bij 20 °C voor 64 h op NGM-platen aangevuld met levende E. coli OP50 als voedsel.
- Was de op de leeftijd gesynchroniseerde L4 larve met S-buffer en breng ze over (meer dan ongeveer 500 wormen) naar de behandeling NGM platen met verschillende bacteriën en chemicaliën (beschreven in noot volgende stap 4,6 en 5,14,). Incuberen ze bij 20 °C gedurende 48 uur.
Opmerking: De behandelingstijd kan variëren van 24 tot 72 uur, volgens de gebruikte bacteriën en chemicaliën. Het therapeutische of preventieve effect van DIM kan ook worden geëvalueerd door voor behandeling van de wormen met pathogenen en vervolgens behandelen van de wormen met DIM (het therapeutische effect) of door het voor behandelen van de wormen met DIM en vervolgens behandelen met pathogenen (het preventieve effect)19. - Om de FITC-dextran-aangevuld platen voor te bereiden, Meng 2 mL warmte-geïnactiveerd E. coli OP50 met 4 mg FITC-dextran. Verdeel vervolgens 100 μL van het FITC-dextran en E. coli OP50 mengsel in twintig verse NGM agar platen (60 mm x 15 mm) en laat de platen 1 uur drogen op een schone Bank.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van FITC-dextran in elke NGM-plaat zal 20 μg/mL zijn. - Bereid vijf E. coli OP50-bevattende NGM platen zonder FITC-dextran voor de voertuigcontrole behandeling. Verdeel hiervoor 100 μL warmte-geïnactiveerde E. coli OP50 op elke nieuwe NGM agar plaat (60 mm x 15 mm) en laat de platen 1 uur drogen op een schone Bank.
Opmerking: Voor elk onafhankelijk experiment zijn vijftien NGM-platen en vijf NGM-platen zonder FITC-dextran nodig. - Na 48 h van de behandeling (vanaf stap 7,2), was de wormen met S-buffer, breng de wormen over naar de FITC-dextran aangevuld platen en de NGM platen zonder FITC-dextran, en inbroed de platen 's nachts (14 – 15 h).
Opmerking: Voor elke behandelingsgroep zijn 5 replicaties van FITC-dextran-kleuring (of voertuig controle voeding) vereist. - Was de wormen met S-buffer en laat ze gedurende 1 uur in de verse NGM agar-plaat kruipen.
Opmerking: Voor elk onafhankelijk experiment zijn in totaal 20 verse NGM-platen nodig. In deze stap u de NGM-plaat gebruiken, aangevuld zonder of met E. coli OP50. - Voeg 50 μL van 4% formaldehyde oplossing toe aan elke put van een zwarte 96-goed vlakke bodemplaat. Breng ongeveer 50 wormen over van elke NGM-plaat in elke put voor fluorescentie metingen. Verwijder na 1 tot 2 minuten alle formaldehyde grondig van elk putje en voeg 100 μL afdekmedium toe om de putjes te Coat.
Opmerking: Formaldehyde oplossing (4%) wordt gebruikt om de wormen te immobiliseren en op te lossen. Voor elke behandelingsgroep worden 5 Wells (5 replicaten) gebruikt voorbeeld analyse.
8. Imaging C. elegans met het operette Imaging System en bepaling van de intestinale permeabiliteit door meting van de FITC-dextran fluorescentie opname
Opmerking: Fluorescerende stereomicroscopie kan worden gebruikt voorbeeld analyse in plaats van het operette systeem.
- Vang fluorescentie beelden op en meet de intensiteit van de fluorescentie met behulp van het operetta High-content Imaging System en analyseer de beelden met Harmony-software.
- Druk in de Harmony-software op het pictogram open deksel om het deksel te openen en de plaat in de machine te plaatsen.
- Stel de parameters in.
- Klik op instellen, selecteer het plaat type (96-well Corning plat-bottom) en voeg de kanalen toe (Bright-Field en EGFP-kanalen).
- Pas de lay-out aan. Ga naar de lay-outselectieen selecteer vervolgens bijhouden en aanpassen van de parameters (eerste foto bij 1 μm, aantal vlakken zijn 10, afstand is 1 μm).
- Selecteer een van de behandelings bronnen en één opname veld en druk op test om te controleren of de afbeeldingen bevredigend zijn in de sectie experiment uitvoeren .
- Als de Foto's bevredigend zijn, keert u terug naar het gedeelte instellen en drukt u op het pictogram resetten aan het einde van het scherm. Selecteer vervolgens alle doel putten en een geschikt aantal opname velden.
- Ga naar experiment uitvoeren opnieuw en voer de naam van de plaat en druk vervolgens op Start om te beginnen met verwerken.
- Om de intensiteit van de fluorescentie te meten, ga naar de beeldanalyse sectie en voer de afbeelding in. Zoek de cel door het EGFP-kanaal en de methode B te kiezen. Stel de gemeenschappelijke drempelwaarde in op 0,5, gebied tot > 200 μm2, gesplitste factor naar 3,0, individuele drempelwaarde tot 0,18 en contrast met meer dan 0,18. Bereken vervolgens de intensiteit-eigenschappen en kies het gemiddelde als de uitvoer. Druk op het pictogram toepassen om de instellingen op te slaan.
- Ga naar de sectie evaluatie om de intensiteit te meten door een heatmap en een gegevenstabel te verkrijgen. Stel de parameter Readout in op cellen — het EGFP-gemiddelde van de intensiteit — gemiddelde per put en start de evaluatie.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. - Als u de gegevens uit operetta wilt extraheren, klikt u op de knop instellingen en kiest u Gegevensbeheer.
- Kies Archief schrijvenen open vervolgens de blader en selecteer het bestand.
- Als u het bestand wilt selecteren, klikt u op het kleine + signaal in de linkerhoek en vervolgens op meting en kiest u naam plaat.
- Selecteer het bestand en klik op OK.
- Selecteer het pad om het bestand op te slaan door op het Browse -signaal op het actieve pad te klikken.
- Klik op Start om het gegevensbestand op te slaan.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.
9. statistische analyse van de FITC-dextran fluorescentie van C. elegans
- Importeer de gegevens en bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD) met behulp van een statistiek software.
- Analyseer het significante verschil met eenrichtings analyse van variantie (ANOVA) gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Tukey.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na incubatie met P. aeruginosa PAO1 vertoonden C. elegans een significante toename van de FITC-dextran-fluorescentie in het worm lichaam in vergelijking met de fluorescentie die werd getoond na incubatie met de andere twee bacteriestammen (Figuur 1). De fluorescentie intensiteiten van wormen gevoed met e. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 en e. faecalis KCTC3206 waren respectievelijk 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9 en 105,6 ± 10,6%. De gegevens benadrukken dat P. aeruginosa meer vitale schade aan de epitheliale darm barrière veroorzaakte, en daarom vertoonden de wormen een dramatische toename van hun intestinale permeabiliteit. Op basis van dit resultaat kan FITC-dextran gemakkelijk door de intestinale laag dringen, dus P. aeruginosa werd geselecteerd als potentiële kandidaat-pathogeen voor het screenen van de effecten van Dim. Hoewel e. faecalis een darmpathogeen is dat extracellulaire superoxide en waterstofperoxide kan produceren, die de Colon epitheliale cel DNA15beschadigen, in sommige gevallen, e. fecalis is ook bekend als een potentiële probiotische bacteriën als gevolg van haar vermogen om te produceren Bacteriocinen tegen sommige pathogenen25,26. De functies van een probiotische omvatten naleving van epitheliale oppervlakken, persistentie in het menselijk maagdarmkanaal, immuun stimulatie en antagonistische activiteit tegen intestinale pathogenen26. Daarom bleef de darm permeabiliteit van wormen geïnineerd met E. faecalis onveranderd in vergelijking met die van de voertuig besturings wormen. Dit resultaat toont aan dat de hoeveelheid van de infectie kan worden bestudeerd door de toename van de intensiteit van de fluorescentie, en P. aeruginosa veroorzaakt meer intestinale permeabiliteit dan andere stammen.
Figuur 2 toont het verschil tussen levend en warmte-geïnactiveerd P. aeruginosa PAO1 op basis van de intensiteit van FITC-dextran fluorescentie in het worm lichaam. Zowel de fluorescentie beelden als de statistische gegevens duiden erop dat de ziekteverwekker na het inactiveren van de warmte geen toxiciteit voor nematoden kon veroorzaken. P. aeruginosa kan exotoxine a produceren — een krachtig extracellulair cytotoxine dat voor veel dieren dodelijk is27. Exotoxine A kan snel worden afgeschaft door verwarming bij 45 °C tot 60 °C28. Daarom was warmte-geïnactiveerd P. aeruginosa niet in staat de permeabiliteit van de intestinale epitheelie van de wormen te beschadigen. De supernatant van P. aeruginosa PAO1 cultuur aanzienlijk beschadigd intestinale permeabiliteit, en daarom, de cultuur supernatant in plaats van hele p. aeruginosa cellen kunnen worden gebruikt voor het opwekken van intestinale permeabiliteit dysfunctie19. Het supernatant bevat endotoxines, exotoxine A, en lipopolysacchariden29, en deze componenten zijn bekend om celtoxiciteit te induceren30,31. Daarom kunnen deze componenten van de supernatant invloed hebben op de intestinale permeabiliteit, hoewel we niet het directe effect van exotoxines en lipopolysacchariden op de intestinale permeabiliteit in C. eleganscontroleren.
DIM cotreatment voor 48 h aanzienlijk verlaagd de FITC-dextran fluorescentie intensiteit in de darmen van wormen in vergelijking met de P. aeruginosa enkelvoudige behandeling (Figuur 3C, D). Statistische analyse door one-way ANOVA en Tukey's meervoudige vergelijkingstest toonde aan dat na behandeling met DIM de gemiddelde fluorescentie intensiteit significant daalde in vergelijking met de fluorescentie intensiteit van de P. aeruginosa-only behandeling. De fluorescentie intensiteiten van de wormen die behandeld werden met p. aeruginosa-only en p. aeruginosa plus Dim waren respectievelijk 486,3 ± 41,7 en 414,2 ± 25,0% (Figuur 3E). Op basis van dit resultaat, DIM kan worden beschouwd als een goed natuurlijk product te genezen intestinale permeabiliteit dysfunctie veroorzaakt door bacteriële infecties. Dit resultaat gaf aan dat DIM celontsteking in darmcellen kan verzachten, wat de permeabiliteit van de darm19vermindert. Dit resultaat is vergelijkbaar met de resultaten verkregen in een muismodel, waarin DIM toonde een significante vermindering van ontsteking in de dikke darm32.
Figuur 1: de effecten van verschillende bacteriën op de intestinale permeabiliteit van C. elegans. Microscopie beelden van de wormen, waaronder helder-veld, FITC fluorescentie (groen kanaal), en samengevoegde beelden. Microscopie beelden van wormen uit (a) e. coli OP50 zonder FITC-dextran voeding, (B) e. coli met FITC-dextran Feeding, (C) P. aeruginosa PAO1 met FITC-dextran Feeding, en (D) e. faecalis KCTC3206 met FITC-dextran voeding. Schaal staaf = 1 mm (wit) en 200 μm (zwart). De met de leeftijd gesynchroniseerde L4 larven werden voor 48 h geïnbroed in NGM-platen met e. coli (A, B), P. aeruginosa (C) en E. faecalis (D). Vervolgens werden de wormen overgebracht naar platen die FITC-dextran (B-D) bevatten, met uitzondering van de voertuigbesturing (a). E) de intensiteit van de FITC fluorescentie van de verschillende bacteriële behandelingen. Een hoger percentage FITC fluorescentie gaf een hogere darm permeabiliteit aan. Kolommen en foutbalken geven de gemiddelde ± SD * * *P < 0,001 aan voor een significant verschil met de voertuigbesturing. # # #P < 0,001 voor significant verschil met de FITC-dextran-behandelde wormen gevoed met P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Deze grafiek is representatief voor twee onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: de effecten van levende en hitte-geïnactiveerd P. aeruginosa PAO1 op de intestinale permeabiliteit van C. elegans. Microscopie beelden van wormen van (a) levende e. coli OP50 zonder FITC-dextran Feeding, (B) levende e. coli met FITC-dextran Feeding, (C) levende p. aeruginosa PAO1 met FITC-dextran voeding, en (D) warmte-geïnactiveerd P. aeruginosa met FITC-dextran voeding. Schaal staaf = 1 mm (wit) en 200 μm (zwart). De met de leeftijd gesynchroniseerde L4 larven werden voor 48 h geïnbroed in NGM-platen met levende E. coli (A, B), levende p. aeruginosa (C), en hitte-geïnactiveerd p. aeruginosa (D). Vervolgens werden de wormen overgebracht naar platen die FITC-dextran (B-D) bevatten, met uitzondering van de voertuigbesturing (a). E) de intensiteit van de FITC-fluorescentie vergelijking van levende en hitte-geïnactiveerde P. aeruginosa PAO1. Kolommen en foutbalken geven het gemiddelde aan van ± SD * * *p < 0,001 en * *p < 0,01 voor een significant verschil met de voertuigbesturing. # # #P < 0,001 voor significant verschil met de FITC-dextran-behandelde wormen gevoed met levende P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Deze grafiek is representatief voor twee onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: het effect van DIM op de intestinale permeabiliteit van C. elegans gevoed P. aeruginosa. Microscopie beelden van wormen uit (a) E. coli OP50 zonder FITC-dextran-voeding, (B) E. coli met FITC-dextran-voeding, (C) p. aeruginosa PAO1 met FITC-dextran-voeding, en (D) p. aeruginosa en Dim (100 μM) cobehandeling met FITC-dextran-voeding. Schaal staaf = 1 mm (wit) en 200 μm (zwart). De door de leeftijd gesynchroniseerde L4 larven werden voor 48 h geïnbroed in NGM-platen met levende E. coli (A, B), levende p. aeruginosa (C), levende p. aeruginosa en Dim (D). Vervolgens werden de wormen overgebracht naar platen die FITC-dextran (B-D) bevatten, met uitzondering van de voertuigbesturing (a). E) de intensiteit van de FITC fluorescentie geeft aan dat de doorlaatbaarheid van de darmen van C. elegans werd beïnvloed door Dim. Kolommen en foutbalken geven de gemiddelde ± SD * * *P < 0,001 aan voor een significant verschil met de voertuigbesturing. # # #P < 0,001 en # #p < 0,01 voor significant verschil met de FITC-dextran-behandelde wormen gevoed met P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Deze grafiek is representatief voor twee onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Door gebruik te maken van deze nieuwe methode voor het bepalen van de doorlaatbaarheid van de darmen in C. elegans, die geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse combineert, kunnen de verschillen veroorzaakt door intestinale micro-organismen of chemicaliën in vivo worden bepaald, met name in de darm C. elegans . Dit protocol is nuttig voor onderzoeken van de darm permeabiliteit en toepasbaar op vele taken, zoals het bepalen van reactieve zuurstof soorten (ROS) onder stressomstandigheden en morfologische onderzoeken, vanwege het gemak en de gemakkelijke manipulatie. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de effecten van therapeutische en preventieve methoden tegen meerdere pathogenen in C. elegans te bepalen. In het bijzonder kan het een efficiënt protocol zijn om de mechanismen van verschillende bacteriële stammen te onderzoeken, waaronder zowel schadelijke als nuttige bacteriën. Sommige pathogenen en probiotische bacteriën met soortgelijke structuren uitoefenen verschillende effecten op de gastheer33,34. Deze procedure kan helpen bij het evalueren van welk mechanisme de bacteriën worden gebruik en waar de beoogde substraten extracellulair of intracellulair kunnen worden uitgescheiden. Bovendien kan deze methode ook helpen om de hypothese te versterken dat warmtebehandeling een vitale rol speelt bij het inactiveren van pathogenen.
Er zijn echter ook problemen tijdens deze procedure. Ten eerste is het aantal wormen in elke plaat belangrijk voor statistisch zinvolle resultaten en robuuste worm detectie, dus 70 – 90% confluentie (ten minste 50 wormen per put) wordt aanbevolen. Dienovereenkomstig moeten proef experimenten worden uitgevoerd om geschikte wormen te verkrijgen. Ten tweede zijn de plaat eigenschappen een van de belangrijke factoren die van invloed zijn op de kwaliteit van beelden en intensiteits bepaling, met name voor het bodem materiaal. In sommige geavanceerde experimenten is een glazen bodem de beste optie voor het meten van fluorescentie door zijn uitstekende optische kwaliteit. Echter, vanwege de hoge prijs, een polystyreen bodem wordt vaak gebruikt, hoewel de kwaliteit is niet zo hoog als die van de glazen bodem. Tot slot, de plaat coating methoden voor C. elegans vereisen optimalisatie. In dit experiment werd fluorescerende afdekmedium aangebracht omdat het de labeling van weefsel secties kan behouden en verbeteren, maar het is niet in staat om de wormen op de plaat bodem goed te bevestigen.
Dit protocol heeft beperkingen; Aangezien C. elegans een nematode is, moeten verdere experimenten, zoals evaluatie in humane intestinale celmonolagen en bij zoogdieren, worden uitgevoerd. Bij deze methode werden de fenotypische veranderingen in C. elegans gevoed pathogene bacteriën en chemicaliën vastgesteld. Daarom, de moleculaire en genetische mechanismen onderliggende de pathogene of probiotische effecten van intestinale bacteriën, alsmede de therapeutische effecten van chemicaliën moeten verder worden opgehelderd. Specifieke signalering trajecten uitgeoefend door pathogene bacteriële infectie en therapeutische effecten van chemicaliën kunnen worden geëvalueerd met behulp van zowel verschillende Mutante bacteriën en Mutant wormen. Bovendien, verdere diepgaande studies identificeren van de chemische componenten die verantwoordelijk zijn voor de pathogene en probiotische effecten van intestinale bacteriën zou gunstig zijn.
Hier rapporteren we een experimenteel protocol voor het meten van de intestinale permeabiliteit in C. elegans behandeld met verschillende bacteriën en chemicaliën met behulp van FITC-dextran voeden. Wij geloven dat deze protocollen nuttig zijn voor fundamenteel biologisch onderzoek, zoals het bestuderen van de interactie tussen de intestinale microbiota en de gezondheid van de darm, evenals voor de ontwikkeling van probiotica en nutraceuticals voor de preventie en behandeling van intestinale gezondheidsproblemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door een Korea Institute of Science and Technology intramurale Research Grant (2E29563).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
