Summary
Detta protokoll beskriver hur man mäter intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans. Denna metod är till hjälp för grundläggande biologisk forskning om intestinal hälsa relaterade till samspelet mellan tarmbakterier och deras värd och för screening för att identifiera probiotiska och kemiska agenter för att bota läckande tarm syndrom och inflammatoriska tarmsjukdomar.
Abstract
I levande organismer, intestinal hyperpermeabilitet är ett allvarligt symptom som leder till många inflammatoriska tarmsjukdomar (IBDs). Caenorhabditis elegans är en icke däggdjur djurmodell som ofta används som ett analyssystem på grund av dess korta livslängd, transparens, kostnadseffektivitet, och brist på djur etikfrågor. I denna studie, en metod har utvecklats för att undersöka effekterna av olika bakterier och 3, 3 '-diindolylmethane (DIM) på intestinal permeabilitet av C. elegans med ett högt dataflöde bildanalys system. Maskarna var infekterade med olika tarmbakterier eller cobehandlad med DIM för 48 h och utfodras med fluorescein isotiocyanat (FITC)-dextran över natten. Därefter undersöktes tarm permeabiliteten genom att jämföra fluorescensbilderna och fluorescensintensiteten inuti mask kropparna. Denna metod kan också ha potential att identifiera probiotiska och patogena tarmbakterier som påverkar intestinal permeabilitet i djur modellen och är effektiv för att undersöka effekterna av skadliga eller hälsofrämjande kemikalier på intestinal permeabilitet och intestinal hälsa. Detta protokoll har emellertid också vissa avsevärda begränsningar på genetisk nivå, särskilt för att bestämma vilka gener som ändras för att kontrollera sjukdom, eftersom denna metod används främst för fenotypisk bestämning. Dessutom är denna metod begränsad till att bestämma exakt vilka patogena substrat orsaka inflammation eller öka permeabiliteten av maskar tarmarna under infektion. Därför krävs ytterligare djupgående studier, inklusive undersökning av den molekylära genetiska mekanismen med muterade bakterier och nematoder samt kemisk komponent analys av bakterier, för att fullt ut utvärdera funktionen hos bakterier och kemikalier vid bestämning av tarmpermeabilitet.
Introduction
Intestinal permeabilitet anses vara en av de viktigaste hindren i samband med intestinal bakterieflora och slemhinnor immunitet och kommer sannolikt att påverkas av flera faktorer, såsom Gut bakterieflora modifieringar, epitelial försämring, eller slemskikt förändringar1. De senaste tidningarna har rapporterat effektiva protokoll för att mäta intestinal permeabilitet av odlade mänskliga tarmceller genom att analysera fluorescensen Flux priser över tarmen cell Layer2, men färre forskningsrapporter presentera ett lämpligt förfarande för att mäta tarmpermeabilitet i nematoder, särskilt i C. elegans, genom att använda FITC-dextran färgning.
Det finns två representativa protokoll för att mäta tarmpermeabiliteten i C. elegans med hjälp av Nile Red3 och erioglaucine dinatrium (eller Smurf-analysen)4,5. I detta protokoll använde vi FITC-dextran (medelmolekylvikt 10 000), som har en mycket högre molekylvikt än Nile Red (MW = 318,37) och erioglaucine dinatrio (MW = 792,85). FITC-dextran är mer liknande än Nile röd eller erioglaucine dinatriumfärgämnen till faktiska makromolekylära näringsämnen såsom kolhydrater, som absorberas genom tarm lagret. Den intestinala permeabiliteten hos C. elegans matas med erioglaucine dinatrium (blå Smurf Dye) kan enkelt utvärderas utan fluorescens mikroskopi. Men i Smurf analysen, kvantitativ analys av intestinal permeabilitet är svårt på grund av bristen på standardisering och bör utvärderas manuellt4,5. När det gäller Nilens röda analys fläckar Nilen Red också lipiddroppar i celler, vilket kan störa den exakta bestämningen av Gut permeabilitet i C. elegans6. De nuvarande protokollen möjliggör snabb och exakt kvantitativ analys av intestinal permeabilitet i C. elegans som behandlats med olika tarmbakterier och kemikalier samtidigt som man undviker ospecifik lipidfärgning.
C. elegans är en typisk modell i biologiska områden på grund av dess rimliga priser, enkel manipulation, begränsade djur etikfrågor, och kort livslängd, vilket är fördelaktigt för snabb experiment7. I synnerhet, efter att hela c. elegans genomet publicerades, nästan 40% av gener i C. elegans genomet befanns vara ortologous för gener som orsakar mänskliga sjukdomar8. Dessutom medger den genomskinliga kroppen observation inuti organismen, vilket är fördelaktigt för att forska cellulära händelser och för fluorescenstillämpningar i cellbiologi, till exempel, stamcells färgning med DAPI eller immunohistokemi9. C. elegans används ofta som försöksdjur för att studera samspelet mellan tarmfloran och värden; Dessutom, C. rymlns används för att skärmen hälsofrämjande probiotiska bakterier10,11,12 samt kost kemikalier främja intestinal hälsa13,14.
Pseudomonas aeruginosa och Enterococcus faecalis är välkända tarmbakterier som negativt påverkar det gastrointestinala systemet, särskilt kolon epitelceller i tarmkanalen15,16. Därför är att mäta den Gut permeabilitet utlöses av dessa bakterier är nödvändigt för screening och utveckling av nya läkemedel som kan återhämta sig och minska skadorna orsakade av bakteriell inflammation och infektion. I detta protokoll testade vi effekterna av dessa tarmbakterier på tarm permeabiliteten hos C. elegans.
Vi rapporterar också ett optimerat protokoll för att testa kemikalier på tarm permeabiliteten hos C. elegans. För detta ändamål, vi använde 3, 3 '-diindolylmethane (dim) som en modell kemikalie eftersom dim är en bioaktiva metabolit förening som härrör från indol-3-carbinol, som finns i Brassica mat växter, och har rapporterats ha terapeutiska effekter på IBD hos möss17,18. Dessutom upptäckte vi nyligen att DIM förbättrar intestinal permeabilitet dysfunktion i både odlade mänskliga tarmceller samt modellen Nematoden C. elegans19.
I denna studie använde vi tre olika försöksbetingelser. Först mätte vi effekterna av de olika bakterierna, P. aeruginosa och E. faecalis, på tarm permeabilitet (figur 1). För det andra mätte vi effekterna av levande och Värmeinaktiverade P. aeruginosa på tarm permeabilitet (figur 2). För det tredje mätte vi effekterna av DIM (en modell kemisk) på intestinal permeabilitet av C. elegans matas med P. aeruginosa (figur 3).
Syftet med denna studie var att utveckla optimerade protokoll som mäter tarm permeabiliteten hos C. elegans, som ändras genom behandling med olika tarmbakterier samt med kemikalier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av P. aeruginosa PAO1 och Escherichia coli OP50 kultur
- Förbered 500 mL av steriliserat Luria-Bertani (LB) medium (tabell 1) och Inokulera en enda koloni av P. aeruginosa i mediet. Inkubera kulturen i 14 till 15 h vid 37 ° c med en skakhastighet på 150 RPM.
- Fördela bakteriekulturen jämnt i 2 500 mL centrifugrör och centrifugera rören vid 3 220 x g vid 4 ° c i 30 min.
- Ta bort supernatanten tills volymen är 50 mL (en tiondel av den initiala volymen) och Omsuspendera den bakteriella pelleten.
- Förvara den koncentrerade bakteriekulturen vid 4 ° c tills den används. Lagringsperioden för P. aeruginosa kulturen kan vara upp till 1 månad, men färsk kultur är bättre för att inducera tarm skador.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. Förutom hela levande bakterier, supernatanten av bakteriekulturen kan användas för att testa effekterna av tarmbakterier19. - Att förbereda e. coli OP50, kultur e. coli OP50 i DYT medium (tabell 1) och sedan tillämpa liknande steg till de som beskrivs ovan men minska volymen till en sjättedel av den ursprungliga volymen. Till exempel, om den initiala volymen är 500 mL, efter att ha avlägsnat supernatanten, är den återstående volymen cirka 83 mL.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här.
2. beredning av Enterococcus faecalis kctc 3206 kultur
- Bered 500 mL av den steriliserade buljongen av hjärtinfusion (BHI) (tabell 1).
- Inokulera en koloni i 500 mL BHI-buljong och inkubera kulturen i 14 – 15 timmar i en skakande inkubator vid 37 ° c och 150 RPM.
- Fördela bakteriekulturen jämnt i 2 500 mL centrifugrör och centrifugera rören vid 3 220 x g vid 4 ° c i 30 min.
- Ta bort supernatanten tills volymen är 50 mL (en tiondel av den initiala volymen) och Omsuspendera pelleten.
- Förvara den koncentrerade bakteriekulturen vid 4 ° c tills den används. Den friska kulturen är bättre för att testa effekterna på tarm permeabilitet.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här.
3. beredning av Värmeinaktiverade E. coli OP50 och Värmeinaktiverade P. aeruginosa PAO1 kulturer
- Odla och skörda bakterierna enligt beskrivningen ovan (steg 1.1 – 1.3).
- Värm-inaktivera E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 kulturen som beskrivits tidigare20,21,22. För Värmeinaktivering, inkubera de återsuspenderade bakterierna vid 65 ° c (vattenbad) i 30 min.
- Kyl den koncentrerade bakteriekulturen till rumstemperatur och förvara den vid 4 ° c tills den används. Lagringsperioden kan vara upp till 1 månad.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här.
4. beredning av nematode Growth medium (NGM) plattor för att testa effekterna av olika bakterier på intestinal permeabilitet av C. elegans
- Placera 1,25 g Peptone, 1,5 g NaCl, 8,5 g av agar, en magnetisk omrörare och 487,5 mL destillerat vatten i en 500 mL glas flaska (tabell 1).
- Blanda blandningen väl, autoklav blandningen i 15 min vid 121 ° c och kyla blandningen till 55 ° c i ett vattenbad för 30 min.
- Ta bort mediet från vattenbadet, tillsätt komponenterna (0,5 mL 1 M CaCl2, 0,5 ml kolesterol, 0,5 ml av MgSO4, 12,5 ml av KPO4) (tabell 1) till NGM, och blanda väl.
Anmärkning: Alla enskilda komponenter måste autoklaveras med undantag för kolesterol (upplöst i absolut etanol), och varje experiment steg måste utföras på en ren bänk. - Fördela 20 mL NGM till varje 90 x 15 mm petriskål och låt agar stelna på en ren bänk i rumstemperatur (ca 20 ° c). NGM-plattorna kan förvaras i upp till en månad vid 4 ° c.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. De NGM-plåtar som används till FITC-dextran-färgning har utarbetats på samma sätt (från steg 4.1 – 4.3). 10 mL NGM delades ut till varje 60 x 15 mm petriskål och fick stelna på en ren bänk i rumstemperatur (ca 20 ° c). - Ta bort bakteriekulturen från kylskåpet på 4 ° c och Vortexblanda kulturen grundligt innan kulturen sprids på NGM-plattorna.
- Tillsätt totalt 800 μL av bakteriekulturen till varje ny NGM-platta och låt plattorna torka i en 20 ° c inkubator över natten.
Anmärkning: För det första experimentet (figur 1), två NGM plattor med e. coli OP50, en NGM tallrik med P. aeruginosa PAO1, och en NGM tallrik med E. faecalis KCTC3206 var beredda. För det andra experimentet (figur 2), två NGM-plattor med Live E. coli OP50, en NGM-platta med Live p. aeruginosa PAO1, och en NGM-platta med Värmeinaktiverade p. aeruginosa PAO1 var beredda.
5. beredning av NGM plattor för att testa effekterna av en kemisk (DIM) på intestinal permeabilitet av C. elegans matas med P. aeruginosa
- Tillsätt 0,5 g Peptone, 0,6 g NaCl, 195 mL destillerat vatten, en magnetisk omrörare och 6,8 g agar till en 500 mL glas flaska (NGM agar).
- Tillsätt 0,5 g Peptone, 0,6 g NaCl, 195 mL destillerat vatten och en magnetisk omrörare utan agar till en annan 500 mL glas flaska (NGM buljong).
- Autoklav de två flaskorna (från steg 5.1 – 5.2), en tom 100 mL glas flaska, och en tom 500 mL glas flaska för 15 min vid 121 ° c. Låt sedan mediet innehållande flaskor svalna till 55 ° c i vattenbadet i 30 min. Förvara agarmediet i vattenbadet och ta bort flaskan som innehåller buljong (från steg 5,2) för nästa steg.
- Tillsätt tillsats kemikalier till NGM buljong: 0,4 mL av 1 M CaCl2, 0,4 ml kolesterol i etanol (ml), 0,4 ml 1 m MgSO4 och 10 ml 1 m KPO4 (alla dessa komponenter måste steriliseras bortsett från kolesterol i etanol). Rör sedan blandningen noggrant med en magnetomrörare vid 55 ° c.
- Märk den autoklaverade tomma 500 mL glas flaska med dimetylsulfoxid (DMSO) och den autoklaverade tomma 100 mL glas flaska med DIM.
- Överför 50 mL NGM-buljong till den DIM-märkta 100 mL-flaskan. Tillsätt 500 μL 20 mM svagt lager i flaskan och blanda väl.
Anmärkning: DIM är upplöst i DMSO (20 mM DIM lager). - Ta snabbt bort NGM-agarmediet från vattenbadet, tillsätt 50 mL av NGM-agarmediet i den DIM-märkta flaskan och blanda ordentligt.
- Placera en 20 mL alikvot av DIM-innehållande NGM-medium i varje 90 mm x 15 mm petriskål. Ungefär fem DIM-innehållande NGM-plattor kan göras från detta steg.
Anmärkning: Den slutliga koncentrationen av DIM i varje NGM-platta kommer att vara 100 μM. - För att förbereda den DMSO-innehållande NGM-plattan, överför 150 mL NGM-buljong till den DMSO-märkta 500 mL flaskan. Tillsätt 1,5 mL DMSO till flaskan och blanda väl.
- Tillsätt 150 mL av NGM-agarmediet till den DMSO-märkta flaskan och blanda noggrant.
- Placera en 20 mL alikvot av DMSO-innehållande NGM-medium i varje 90 mm x 15 mm petriskål. Cirka femton DMSO-innehållande NGM-plattor kan göras från detta steg.
Anmärkning: Den slutliga koncentrationen av DMSO i varje NGM tallrik kommer att vara 0,5%. - Stelna plattorna vid rumstemperatur i minst 3 timmar och förvara dem vid 4 ° c tills de används.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. - Ta bort E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 kulturen från kylskåpet på 4 ° c (från steg 1,4) och Vortexblanda kulturen ordentligt innan den sprids på NGM-plattorna.
- Sätt 800 μL av E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 bakterieodling på varje färsk NGM-agarplatta och låt plattorna torka i en 20 ° c inkubator över natten.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. För det tredje experimentet (figur 3), två DMSO-innehållande NGM-plattor belagda med levande E. coli OP50, en DMSO-innehållande NGM-platta belagd med levande p. aeruginosa PAO1, och en Dim-innehållande NGM-platta belagd med levande p. aeruginosa PAO1 var beredd.
6. förberedelse av Ålderssynkroniserad C. elegans
- Odla maskar på en solid NGM-platta och mata dem med E. coli OP50 tills önskad population uppnås.
- Synkronisera äggen genom att använda antingen den tidsinställda ägg läggnings metoden eller bleknings lösnings behandlingen som beskrivits tidigare20,23,24.
7. behandling av bakterier eller DIM och FITC-dextran utfodring
- Inkubera de ålderssynkroniserade äggen vid 20 ° c i 64 h på NGM-plattor kompletterade med levande E. coli OP50 som föda.
- Tvätta åldern-synkroniserade L4 larv med S-buffert och överföra dem (mer än cirka 500 maskar) till behandling NGM plattor som innehåller olika bakterier och kemikalier (beskrivs i anmärkning följande steg 4,6 och 5,14,). Inkubera dem vid 20 ° c för 48 h.
Anmärkning: Behandlingstiden kan variera från 24 till 72 h, enligt de bakterier och kemikalier som används. Den terapeutiska eller förebyggande effekten av DIM kan också utvärderas genom att förbehandla maskar med patogener och sedan behandla maskar med DIM (den terapeutiska effekten) eller genom att förbehandla maskar med DIM och sedan behandla med patogener (den förebyggande effekten)19. - För att förbereda FITC-dextran-kompletterade plattor, blanda 2 mL Värmeinaktiverade E. coli OP50 med 4 mg FITC-dextran. Dividera sedan 100 μL av FITC-dextran och E. coli OP50 blandningen i tjugo färska NGM-agar-plattor (60 mm x 15 mm) och låt plattorna torka i 1 h på en ren bänk.
Anmärkning: Den slutliga koncentrationen av FITC-dextran i varje NGM-platta kommer att vara 20 μg/mL. - Förbered fem E. coli OP50-innehållande NGM-plattor utan FITC-dextran för kontroll behandling av fordon. För detta ändamål, dividera 100 μL Värmeinaktiverade E. coli OP50 till varje färsk NGM agar plattor (60 mm x 15 mm) och låt plattorna torka i 1 h på en ren bänk.
Anmärkning: För varje självständigt experiment krävs femton FITC-dextran-kompletterade NGM-plattor och fem NGM-plattor utan FITC-dextran. - Efter 48 h av behandling (från steg 7,2), tvätta maskar med S-buffert, överföra maskar till FITC-dextran kompletterade plattor och NGM plattorna utan FITC-dextran, och inkubera plattorna över natten (14-15 h).
Anmärkning: För varje behandlingsgrupp krävs 5 replikat av FITC-dextran-färgning (eller kontroll av fordons matning). - Tvätta maskar med S-buffert och låta dem krypa i den färska NGM agar plattan för 1 h.
Anmärkning: För varje självständigt experiment behövs totalt 20 färska NGM-plattor. I detta steg kan du använda NGM plattan kompletterad utan eller med E. coli OP50. - Tillsätt 50 μL 4% formaldehydlösning till varje brunn i en svart 96-väl platt bottenplatta. Överför cirka 50 maskar från varje NGM-platta till varje brunn för fluorescensmätningar. Efter 1 till 2 min, grundligt ta bort alla formaldehyd från varje brunn och tillsätt 100 μL av monteringsmedel för att belägga brunnarna.
Anmärkning: Formaldehydlösning (4%) används för att immobilisera och fixa maskarna. För varje behandlingsgrupp används 5 brunnar (5 replikat) för bildanalys.
8. avbildning C. elegans med operettas avbildnings system och bestämning av Tarmpermeabilitet genom mätning av FITC-dextran-fluorescensupptaget
Anmärkning: Fluorescerande stereomikroskop kan användas för bildanalys istället för Operettasystemet.
- Fånga Fluorescensbilder och mät fluorescensintensiteten med hjälp av operettas högupplösta avbildnings system och analysera bilderna med Harmony-programvaran.
- I Harmony-programvaran trycker du på ikonen Öppna locket för att öppna locket och placera plattan i maskinen.
- Ställ in parametrarna.
- Klicka på Ställ in, Välj platttyp (96-Tja Corning platt-botten) och Lägg till kanalerna (Bright-Field och egfp kanaler).
- Justera layouten. Gå till layoutalternativoch välj sedan spåra och justera parametrarna (första bilden på 1 μm, antalet plan är 10, avståndet är 1 μm).
- Välj ett av behandlings brunnarna och ett infångnings fält och tryck på test för att kontrollera om bilderna är tillfredsställande i avsnittet Kör experiment .
- Om bilderna är tillfredsställande går du tillbaka till avsnittet Ställ in och trycker på Reset -ikonen i slutet av skärmen. Välj sedan alla mål brunnar och ett lämpligt antal infångstfält.
- Gå till Kör experiment igen och ange namnet på plattan och tryck sedan på Start för att börja bearbetningen.
- För att mäta intensiteten i fluorescensen, gå till sektionen bildanalys och mata in bilden. Hitta cellen genom att välja EGFP-kanalen och metod B. Justera den gemensamma tröskeln till 0,5, Area till > 200 μm2, Split factor till 3,0, individuell tröskel till 0,18 och kontrast till mer än 0,18. Beräkna sedan intensitetsegenskaperna och välj medelvärdet som utdata. Tryck på Apply -ikonen för att spara inställningarna.
- Gå till avsnittet utvärdering för att mäta intensiteten genom att få en heatmap och datatabell. Ställ in parametern readout på celler-intensitet cell egfp medelvärde-medelvärde per brunn och starta utvärderingen.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. - Om du vill extrahera data från Operett klickar du på knappen Inställningar och väljer datahantering.
- Välj Skriv Arkivoch öppna sedan bläddra och välj filen.
- Om du vill markera filen klickar du på den lilla + signalen i det vänstra hörnet och klickar sedan på mått och väljer platnamn.
- Markera filen och klicka på OK.
- Välj sökvägen för att spara filen genom att klicka på Bläddra signalen på den aktiva sökvägen.
- Klicka på Start för att spara datafilen.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här.
9. statistisk analys av den FITC-dextran fluorescens av C. elegans
- Importera data och beräkna medelvärdet och standardavvikelsen (SD) med hjälp av en statistik programvara.
- Analysera den signifikanta skillnaden med enkelriktad analys av varians (ANOVA) följt av Tukey ' s multipeljämförelse test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter inkubering med P. aeruginosa PAO1 visade C. elegans en signifikant ökning i FITC-dextran-fluorescens i mask kroppen jämfört med fluorescensen som visades efter inkubering med de andra två bakteriestammarna (figur 1). Fluorescensintensiteten hos maskar som matas med e. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 och e. faecalis KCTC3206 var 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9 och 105,6 ± 10,6%. Data betona att P. aeruginosa orsakat mer vitala skador på epitelial tarmbarriären, och därför, maskar uppvisade en dramatisk ökning av deras tarm permeabilitet. Baserat på detta resultat, FITC-dextran kan lätt tränga igenom tarm lagret, så P. aeruginosa valdes som en potentiell kandidat patogen för screening effekterna av dim. Även om E. faecalis är en Gut patogen som kan producera extracellulära superoxid och väteperoxid, som skadar kolon epitelceller DNA15, i vissa fall , E. faecalis är också känd som en potentiell probiotiska bakterier på grund av dess förmåga att producera bacteriocins mot vissa patogener25,26. Funktionerna i en probiotiska inkluderar anslutning till epitelial ytor, uthållighet i den mänskliga mag-tarmkanalen, immun stimulering och antagonistiska aktivitet mot intestinal patogener26. Därför förblev tarmpermeabiliteten hos maskar som inkuberats med E. faecalis oförändrad jämfört med fordonets kontroll maskar. Detta resultat visar att mängden av infektionen kan studeras av ökningen av fluorescensintensiteten, och P. aeruginosa orsakar mer intestinal permeabilitet än andra stammar.
Figur 2 visar skillnaden mellan levande och Värmeinaktiverade P. aeruginosa PAO1 baserat på intensiteten av FITC-dextran fluorescens i masken kroppen. Både fluorescensbilder och statistiska data indikerar att patogenen inte kan utlösa någon toxicitet för nematoder efter värmeinaktive ring. P. aeruginosa kan producera exotoxin a-en potent extracellulära cell som är dödlig för många djur27. Exotoxin A kan snabbt avskaffas genom upphettning vid 45 ° c till 60 ° c28. Därför Värmeinaktiverade P. aeruginosa kunde inte skada permeabiliteten av maskar intestinal epithelia. Den supernatanten av p. aeruginosa PAO1 kultur betydligt skadad tarm permeabilitet, och därför, kulturen supernatanten i stället för hela p. aeruginosa celler kan användas för att inducera intestinal permeabilitet dysfunktion19. Supernatanten innehåller endotoxiner, exotoxin A, och lipopolysackarider29, och dessa komponenter är kända för att inducera celltoxicitet30,31. Därför kan dessa komponenter i supernatanten påverka tarm permeabiliteten, även om vi inte kontrollera den direkta effekten av exotoxiner och lipopolysackarider på tarm permeabiliteten i C. elegans.
Dim samtidig för 48 h minskade signifikant FITC-dextran-fluorescensintensiteten inuti tarmen hos maskar jämfört med singelbehandlingen P. aeruginosa (figur 3C, D). Statistisk analys av enkelriktad ANOVA och Tukey: s multipla jämförelse test visade att efter behandling med DIM minskade den genomsnittliga fluorescensintensiteten signifikant i jämförelse med fluorescensintensiteten hos P. aeruginosa-endast behandling. Fluorescensintensiteten hos de maskar som behandlades med p. aeruginosa-Only och p. aeruginosa plus DIM var 486,3 ± 41,7 respektive 414,2 ± 25,0% (figur 3E). Baserat på detta resultat, DIM kan betraktas som en bra naturprodukt för att bota intestinal permeabilitet dysfunktion orsakad av bakteriella infektioner. Detta resultat visade att DIM kan dämpa cell inflammation i tarmceller, vilket minskar permeabiliteten i tarmen19. Detta resultat liknar de resultat som erhållits i en musmodell, där DIM visade en signifikant minskning av inflammation i tjocktarmen32.
Figur 1: effekterna av olika bakterier på intestinal permeabilitet av C. elegans. Mikroskopi bilder av maskar inklusive Bright-Field, FITC fluorescens (grön kanal), och sammanslagna bilder. Mikroskopi bilder av maskar från (a) e. coli OP50 utan FITC-dextran utfodring, (B) e. coli med FITC-dextran utfodring, (C) P. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran utfodring, och (D) e. faecalis KCTC3206 med FITC-dextran utfodring. Skalstapeln = 1 mm (vit) och 200 μm (svart). Ålderssynkroniserade L4-larver inkuberades för 48 h i NGM-plattorsomär seedade med e. coli (A, B), P. aeruginosa (C) och e. faecalis (D). Sedan, maskar överfördes till plattor som innehåller FITC-dextran (B-D), med undantag för fordonets kontroll (a). Eden FITC fluorescensintensiteten hos de olika bakteriella behandlingarna. En högre procent av FITC fluorescens indikerade en högre tarm permeabilitet. Kolumner och felstaplar indikerar medelvärdet ± SD. * * *P < 0,001 för signifikant skillnad från fordonets kontroll. # # #P < 0,001 för signifikant skillnad från FITC-dextran-behandlade maskar som utfodrats med P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Detta diagram är representativt för två oberoende experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: effekterna av levande och Värmeinaktiverade P. aeruginosa PAO1 på tarm permeabiliteten hos C. elegans. Mikroskopi bilder av maskar från (a) Live e. coli OP50 utan FITC-dextran utfodring, (B) leva e. coli med FITC-dextran utfodring, (C) levande P. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran utfodring, och (D) Värmeinaktiverade P. aeruginosa med FITC-dextran utfodring. Skalstapeln = 1 mm (vit) och 200 μm (svart). Ålderssynkroniserade L4-larver inkuberades för 48 h i NGM-plattor seedade med levande E. coli (a, B), Live p. aeruginosa (C) och Värmeinaktiverade p. aeruginosa (D). Sedan, maskar överfördes till plattor som innehåller FITC-dextran (B-D), med undantag för fordonets kontroll (a). (E) FITC fluorescens intensitet jämföra levande och Värmeinaktiverade P. aeruginosa PAO1. Kolumner och felstaplar anger medelvärdet ± SD. * * *p < 0,001 och * *P < 0,01 för signifikant skillnad från fordonets kontroll. # # #P < 0,001 för signifikant skillnad från FITC-dextran-behandlade maskar som utfodrats med levande P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Detta diagram är representativt för två oberoende experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: effekten av DIM på tarm permeabiliteten hos C. elegans Fed P. aeruginosa. Mikroskopi bilder av maskar från (a) E. coli OP50 utan FITC-dextran utfodring, (B) E. coli med FITC-dextran utfodring, (C) p. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran utfodring, och (D) p. aeruginosa och dim (100 μm) samtidig behandling med FITC-dextran utfodring. Skalstapeln = 1 mm (vit) och 200 μm (svart). Ålderssynkroniserade L4 larver inkuberades för 48 h i NGM plattor seedade med levande E. coli (A, B), Live p. aeruginosa (C), Live p. aeruginosa och dim (D). Sedan, maskar överfördes till plattor som innehåller FITC-dextran (B-D), med undantag för fordonets kontroll (a). (E) intensiteten i FITC-fluorescensen indikerar att den Gut permeabiliteten hos C. elegans påverkades av dim. Kolumner och felstaplar indikerar medelvärdet ± SD. * * *P < 0,001 för signifikant skillnad från fordonets kontroll. # # #P < 0,001 och # #p < 0,01 för signifikant skillnad från FITC-dextran-behandlade maskar som utfodrats med P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Detta diagram är representativt för två oberoende experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genom att utnyttja denna nya metod för att bestämma Gut permeabilitet i c. elegans, som kombinerar automatiserad fluorescens mikroskopi och kvantitativ bildanalys, kan de skillnader som orsakas av intestinal mikroorganismer eller kemikalier bestämmas in vivo, särskilt i C. elegans tarmen. Detta protokoll är användbart för Gut permeabilitet utredningar och gäller för många uppgifter, såsom reaktiva syreradikaler (ROS) bestämning under stressförhållanden och morfologiska undersökningar, på grund av dess bekvämlighet och enkel manipulation. Dessutom kan denna metod användas för att bestämma effekterna av terapeutiska och förebyggande metoder mot flera patogener i C. elegans. I synnerhet kan det vara ett effektivt protokoll för att undersöka mekanismerna för olika bakteriestammar, inklusive både skadliga och nyttiga bakterier. Vissa patogener och probiotiska bakterier med liknande strukturer utövar olika effekter på värd33,34. Detta förfarande kan hjälpa till att utvärdera vilken mekanism bakterierna utnyttjar och där de riktade substrat kan utsöndras extracellulärt eller intracellulärt. Dessutom kan denna metod också bidra till att stärka hypotesen att värmebehandling spelar en viktig roll i patogen inaktivering.
Men det finns också vissa svårigheter under detta förfarande. För det första är antalet maskar i varje tallrik viktigt för statistiskt betydelsefulla resultat och robust mask detektering, så 70 – 90% confluency (minst 50 maskar per brunn) rekommenderas. Försöks experiment bör därför utföras för att erhålla lämpliga maskar. För det andra är plattan egenskaper en av de viktiga faktorer som påverkar kvaliteten på bilder och intensitet beslutsamhet, särskilt för botten materialet. I vissa avancerade experiment är en glasbotten det bästa alternativet för mätning av fluorescens på grund av dess utmärkta optiska kvalitet. Men på grund av det höga priset, en polystyren botten används ofta, även om kvaliteten är inte lika hög som den i glaset botten. Slutligen kräver plattbeläggnings metoderna för C. elegans optimering. I detta experiment, fluorescerande monteringsmedium tillämpades eftersom det kan bevara och förbättra märkningen av vävnad sektioner, men det är oförmögen att fixa maskar på plattan botten ordentligt.
Detta protokoll har begränsningar; eftersom C. elegans är en nematode, bör ytterligare experiment, såsom utvärdering i mänskliga intestinal cellmonolayers och hos däggdjur, utföras. I denna metod, fenotypiska förändringar i C. elegans matas patogena bakterier och kemikalier bestämdes. Därför bör de molekylära och genetiska mekanismerna bakom de patogena eller probiotiska effekterna av tarmbakterier samt de terapeutiska effekterna av kemikalier vara ytterligare klarlagd. Specifika signaleringsvägar som utövas av patogena bakterieinfektioner och terapeutiska effekter av kemikalier kan utvärderas med hjälp av både olika muterade bakterier och muterade maskar. Dessutom, ytterligare fördjupade studier identifiera de kemiska komponenterna som ansvarar för patogena och probiotiska effekterna av tarmbakterier skulle vara fördelaktigt.
Här rapporterar vi ett experimentellt protokoll för mätning av tarmpermeabilitet i C. elegans som behandlats med olika bakterier och kemikalier genom att använda FITC-dextran utfodring. Vi tror att dessa protokoll kommer att vara till hjälp för grundläggande biologisk forskning, såsom att studera samspelet mellan intestinal bakterieflora och Gut hälsa, samt för utvecklingen av probiotika och nutraceuticals för förebyggande och behandling av intestinala hälsoproblem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av ett Korea Institute of Science and Technology interna Research Grant (2e29563).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
