Summary
Este protocolo describe cómo medir la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método es útil para la investigación biológica básica sobre la salud intestinal relacionada con la interacción entre las bacterias intestinales y su huésped y para la detección para identificar agentes probióticos y químicos para curar el síndrome del intestino con fugas y enfermedades inflamatorias intestinales.
Abstract
En los organismos vivos, la hiperpermeabilidad intestinal es un síntoma grave que conduce a muchas enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Caenorhabditis elegans es un modelo animal no mamífero que es ampliamente utilizado como un sistema de ensayo debido a su corta vida útil, transparencia, rentabilidad y falta de problemas de ética animal. En este estudio, se desarrolló un método para investigar los efectos de diferentes bacterias y 3,3'-diindolylmethane (DIM) en la permeabilidad intestinal de C. elegans con un sistema de análisis de imagen de alto rendimiento. Los gusanos fueron infectados con diferentes bacterias intestinales o cotratados con DIM durante 48 h y alimentados con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran durante la noche. Luego, se examinó la permeabilidad intestinal comparando las imágenes de fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia dentro de los cuerpos de gusanos. Este método también puede tener el potencial de identificar bacterias intestinales probióticas y patógenas que afectan la permeabilidad intestinal en el modelo animal y es eficaz para examinar los efectos de los productos químicos nocivos o que promueven la salud en la permeabilidad intestinal y la salud intestinal. Sin embargo, este protocolo también tiene algunas limitaciones considerables a nivel genético, especialmente para determinar qué genes se alteran para controlar la enfermedad, ya que este método se utiliza principalmente para la determinación fenotípica. Además, este método se limita a determinar exactamente qué sustratos patógenos causan inflamación o aumentan la permeabilidad de los intestinos de los gusanos durante la infección. Por lo tanto, se requieren más estudios en profundidad, incluida la investigación del mecanismo genético molecular utilizando bacterias y nematodos mutantes, así como el análisis de componentes químicos de bacterias, para evaluar completamente la función de las bacterias y los productos químicos para determinar la permeabilidad intestinal.
Introduction
La permeabilidad intestinal se considera como una de las principales barreras relacionadas con la microbiota intestinal y la inmunidad a la mucosa y es probable que se vea afectada por varios factores, como modificaciones de la microbiota intestinal, deterioro epitelial o alteraciones de la capa de moco1. Documentos recientes han reportado protocolos eficaces para medir la permeabilidad intestinal de las células intestinales humanas cultivadas mediante el análisis de las tasas de flujo de fluorescencia a través de la capa de células intestinales2, pero menos documentos de investigación presentan un procedimiento adecuado para medir la permeabilidad intestinal en los nematodos, particularmente en C. elegans,mediante el uso de la tinción FITC-dextran.
Existen dos protocolos representativos para medir la permeabilidad intestinal en C. elegans utilizando Rojo nilo3 y erioglaucina disódico (o el ensayo Pitufo)4,5. En este protocolo, utilizamos FITC-dextran (peso molecular medio 10.000), que tiene un peso molecular mucho mayor que el rojo del Nilo (MW 318,37) y el erioglaucina disódico (MW a 792,85). FITC-dextran es más similar a los colorantes disódicos rojos del Nilo o erioglaucina a nutrientes macromoleculares reales como los carbohidratos, que se absorben a través de la capa intestinal. La permeabilidad intestinal de C. elegans alimentados con erioglaucina disódico (tinte azul pitufo) se puede evaluar fácilmente sin microscopía de fluorescencia. Sin embargo, en el ensayo Pitufo, el análisis cuantitativo de la permeabilidad intestinal es difícil debido a la falta de estandarización y debe evaluarse manualmente4,5. En el caso del ensayo rojo del Nilo, el rojo del Nilo también tiñe las gotas de lípidos en las células, lo que puede interferir con la determinación exacta de la permeabilidad intestinal en C. elegans6. Los protocolos actuales permiten un análisis cuantitativo rápido y preciso de la permeabilidad intestinal en C. elegans tratados con diversas bacterias intestinales y productos químicos evitando la tinción de lípidos inespecíficos.
C. elegans es un modelo típico en campos biológicos debido a su precio asequible, fácil manipulación, problemas de ética animal limitada, y corta vida útil, que es beneficioso para la experimentación rápida7. En particular, después de que se publicó todo el genoma de C. elegans, casi el 40% de los genes en el genoma de C. elegans fueron encontrados como ortologos a los genes que causan enfermedades humanas8. Además, el cuerpo transparente permite la observación dentro del organismo, lo que es ventajoso para la investigación de eventos celulares y para aplicaciones de fluorescencia en biología celular, por ejemplo, la tinción de células madre con DAPI o inmunohistoquímica9. C. elegans se utiliza a menudo como un animal experimental para estudiar la interacción entre la microbiota intestinal y el huésped; además, C. elegans se utiliza para la pantalla de bacterias probióticas que promueven la salud10,11,12, así como productos químicos dietéticos que promueven la salud intestinal13,14.
Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis son bacterias intestinales bien conocidas que afectan negativamente el sistema gastrointestinal, especialmente las células epiteliales colónicas del tracto intestinal15,16. Por lo tanto, medir la permeabilidad intestinal desencadenada por estas bacterias es necesario para el cribado y desarrollo de nuevos fármacos que pueden recuperar y reducir el daño causado por la inflamación bacteriana y la infección. En este protocolo, probamos los efectos de estas bacterias intestinales en la permeabilidad intestinal de C. elegans.
También informamos de un protocolo optimizado para probar productos químicos sobre la permeabilidad intestinal de C. elegans. Para este propósito, utilizamos 3,3'-diindolylmethane (DIM) como un modelo químico porque DIM es un compuesto metabolito bioactivo derivado de indol-3-carbinol, que está presente en las plantas de alimentos Brassica, y se ha informado que tiene efectos terapéuticos sobre la EII en ratones17,18. Además, recientemente descubrimos que DIM mejora la disfunción de la permeabilidad intestinal tanto en las células intestinales humanas cultivadas como en el nematodo modelo C. elegans19.
En este estudio, utilizamos tres condiciones experimentales diferentes. En primer lugar, medimos los efectos de las diferentes bacterias, P. aeruginosa y E. faecalis, en la permeabilidad intestinal(Figura 1). En segundo lugar, medimos los efectos de P. aeruginosa en la permeabilidad intestinal(Figura 2). En tercer lugar, medimos los efectos de DIM (un modelo químico) en la permeabilidad intestinal de C. elegans alimentados con P. aeruginosa (Figura 3).
El objetivo de este estudio fue desarrollar protocolos optimizados que midan la permeabilidad intestinal de C. elegans,que se cambia por el tratamiento con diversas bacterias intestinales, así como con productos químicos.
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Protocol
1. Preparación de P. aeruginosa PAO1 y Escherichia coli OP50 Cultura
- Preparar 500 ml de medio esterilizado Luria-Bertani (LB)(Tabla 1) e inocular una sola colonia de P. aeruginosa en el medio. Incubar el cultivo durante 14 a 15 h a 37oC con una velocidad de agitación de 150 rpm.
- Distribuir igualmente el cultivo bacteriano en dos tubos centrífugos de 500 ml y centrifugar los tubos a 3.220 x g a 4 oC durante 30 min.
- Retire el sobrenadante hasta que el volumen sea de 50 ml (una décima parte del volumen inicial) y vuelva a suspender el pellet bacteriano.
- Conservar el cultivo bacteriano concentrado a 4oC hasta su uso. El período de almacenamiento del cultivo de P. aeruginosa puede ser de hasta 1 mes, pero el cultivo fresco es mejor para inducir daño intestinal.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Además de las bacterias vivas enteras, el sobrenadante del cultivo bacteriano se puede utilizar para probar los efectos de las bacterias intestinales19. - Para preparar E. coli OP50, el cultivo E. coli OP50 en el medio DYT(Tabla 1)y luego aplicar pasos similares a los descritos anteriormente, pero disminuir el volumen a una sexta parte del volumen original. Por ejemplo, si el volumen inicial es de 500 ml, después de eliminar el sobrenadante, el volumen restante es de aproximadamente 83 ml.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Preparación de Enterococcus faecalis KCTC 3206 Cultura
- Preparar 500 ml de caldo de infusión esterilizada del corazón cerebral (BHI) (Tabla 1).
- Inocular una colonia en 500 ml de caldo BHI e incubar el cultivo durante 14-15 h en una incubadora de temblores a 37 oC y 150 rpm.
- Distribuir igualmente el cultivo bacteriano en dos tubos centrífugos de 500 ml y centrifugar los tubos a 3.220 x g a 4 oC durante 30 min.
- Retire el sobrenadante hasta que el volumen sea de 50 ml (una décima parte del volumen inicial) y vuelva a suspender el pellet.
- Conservar el cultivo bacteriano concentrado a 4oC hasta su uso. El cultivo fresco es mejor para probar los efectos sobre la permeabilidad intestinal.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
3. Preparación de Cultivos De E. coli OP50 y Cultivos de P. aeruginosa PAO1 inactivados por calor
- Cultivo y cosecha de las bacterias como se describió anteriormente (pasos 1.1–1.3).
- Inactivar el calor del cultivo E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 como se describió anteriormente20,21,22. Para la inactivación del calor, incubar las bacterias resuspendidas a 65 oC (baño de agua) durante 30 min.
- Enfriar el cultivo bacteriano concentrado a temperatura ambiente y almacenarlo a 4 oC hasta su uso. El período de almacenamiento puede ser de hasta 1 mes.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
4. Preparación de placas de nematodo de crecimiento medio (NGM) para probar los efectos de diferentes bacterias en la permeabilidad intestinal de C. elegans
- Colocar 1,25 g de peptona, 1,5 g de NaCl, 8,5 g de agar, agitador magnético y 487,5 ml de agua destilada en una botella de vidrio de 500 ml(Tabla 1).
- Mezclar bien la mezcla, autoclave la mezcla durante 15 min a 121 oC y enfriar la mezcla a 55 oC en un baño de agua durante 30 min.
- Retire el medio del baño de agua, agregue los componentes (0,5 ml de 1 M CaCl2, 0,5 ml de colesterol, 0,5 ml de MgSO4,12,5 ml de KPO4) (Tabla 1) al NGM, y mezcle bien.
NOTA: Todos los componentes individuales deben ser autoclavedos excepto el colesterol (disuelto en etanol absoluto), y cada paso experimental debe llevarse a cabo en un banco limpio. - Distribuya 20 ml de NGM a cada plato petri de 90 x 15 mm y deje que el agar se solidifique en un banco limpio a temperatura ambiente (aproximadamente 20 oC). Las placas NGM se pueden almacenar durante un mes a 4 oC.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las placas NGM utilizadas para la tinción FITC-dextran fueron preparadas por el mismo procedimiento (de los pasos 4.1–4.3). 10 ml de NGM se distribuyeron a cada plato Petri de 60 x 15 mm y se permitió solidificar en un banco limpio a temperatura ambiente (aproximadamente 20 oC). - Retire el cultivo bacteriano del refrigerador de 4oC y vórtice el cultivo a fondo antes de extender el cultivo sobre las placas NGM.
- Añadir un total de 800 sl del cultivo bacteriano a cada placa NGM fresca, y dejar que las placas se sequen en una incubadora de 20 oC durante la noche.
NOTA: Para el primer experimento(Figura 1), se prepararon dos placas NGM con E. coli OP50, una placa NGM con P. aeruginosa PAO1 y una placa NGM con E. faecalis KCTC3206. Para el segundo experimento(Figura 2),se prepararon dos placas NGM con E. coli OP50 vivo, una placa NGM con PAO1 vivo P. aeruginosa y una placa NGM con P. aeruginosa PAO1 inactivada por calor.
5. Preparación de placas NGM para el ensayo de los efectos de un producto químico (DIM) en la permeabilidad intestinal de C. elegans Fed con P. aeruginosa
- Añadir 0,5 g de peptona, 0,6 g de NaCl, 195 ml de agua destilada, agitador magnético y 6,8 g de agar a una botella de vidrio de 500 ml (agar NGM).
- Añadir 0,5 g de peptona, 0,6 g de NaCl, 195 ml de agua destilada y un agitador magnético sin agar a otra botella de vidrio de 500 ml (caldo NGM).
- Autoclave las dos botellas (de los pasos 5.1–5.2), una botella de vidrio vacía de 100 ml y una botella de vidrio vacía de 500 ml durante 15 min a 121 oC. A continuación, deje que el medio que contiene botellas se enfríe a 55 oC en el baño de agua durante 30 minutos.
- Añadir los productos químicos aditivos al caldo NGM: 0,4 ml de 1 M CaCl2, 0,4 ml de colesterol en etanol (ml), 0,4 ml de 1 M MgSO4 y 10 ml de 1 M KPO4 (todos estos componentes deben esterilizarse aparte del colesterol en etanol). A continuación, revuelva bien la mezcla con un agitador magnético a 55 oC.
- Etiquete la botella de vidrio vacía autoclave de 500 ml con dimetil sulfóxido (DMSO) y la botella de vidrio vacía de 100 ml autoclave con DIM.
- Transfiera 50 ml de caldo NGM a la botella de 100 ml con etiqueta DIM. Añadir 500 ml de stock DIM de 20 mM en la botella y mezclar bien.
NOTA: DIM se disuelve en DMSO (20 mM DIM stock). - Retire rápidamente el medio de agar NGM del baño de agua, agregue 50 ml del medio de agar NGM en la botella etiquetada con DIM y mezcle bien.
- Coloque una alícuota de 20 ml de medio NGM que contiene DIM en cada plato Petri de 90 mm x 15 mm. Aproximadamente cinco placas NGM que contienen DIM se pueden hacer a partir de este paso.
NOTA: La concentración final de DIM en cada placa NGM será de 100 m. - Para preparar la placa NGM que contiene DMSO, transfiera 150 ml de caldo NGM a la botella de 500 ml con etiqueta DMSO. Añadir 1,5 ml de DMSO a la botella y mezclar bien.
- Agregue 150 ml del medio de agar NGM a la botella con etiqueta DMSO y mezcle bien.
- Coloque una alícuota de 20 ml de medio NGM que contiene DMSO en cada plato Petri de 90 mm x 15 mm. Aproximadamente quince placas NGM que contienen DMSO se pueden hacer a partir de este paso.
NOTA: La concentración final de DMSO en cada placa NGM será del 0,5%. - Solidificar las placas a temperatura ambiente durante al menos 3 h y almacenarlas a 4oC hasta su uso.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. - Retire el cultivo E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 del refrigerador de 4oC (del paso 1.4) y vórtice el cultivo correctamente antes de extenderse a las placas NGM.
- Poner 800 l del cultivo bacteriano E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 en cada placa de agar NGM fresca y dejar que las placas se sequen en una incubadora de 20 oC durante la noche.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Para el tercer experimento(Figura 3), se prepararon dos placas NGM que contienen DMSO recubiertas con E. coli OP50 vivo, una placa NGM que contiene DMSO recubierta con P. aeruginosa PAO1 vivo y una placa NGM que contiene DIM recubierta con P. aeruginosa PAO1 vivo.
6. Preparación de C. elegans sincronizados por la edad
- Cultivar gusanos en una placa sólida de NGM y alimentarlos con E. coli OP50 hasta que se alcance la población deseada.
- Sincronice los huevos utilizando el método de puesta de óvulos cronometrados o el tratamiento de la solución de blanqueo como se describió anteriormente20,23,24.
7. Tratamiento de bacterias o DIM y FITC-dextran Feeding
- Incubar los huevos sincronizados por la edad a 20 oC durante 64 h en placas NGM complementadas con E. coli OP50 vivo como alimento.
- Lavar la larva L4 sincronizada por la edad con S-buffer y transferirlas (más de 500 gusanos) al tratamiento de placas NGM que contienen diferentes bacterias y productos químicos (descrito en NOTA siguiendo los pasos 4.6 y 5.14,). Incubarlos a 20oC durante 48 h.
NOTA: El tiempo de tratamiento puede variar de 24 a 72 h, de acuerdo con las bacterias y productos químicos utilizados. El efecto terapéutico o preventivo de DIM también se puede evaluar pretratando los gusanos con patógenos y luego tratando los gusanos con DIM (el efecto terapéutico) o pretratando los gusanos con DIM y luego tratando con patógenos (el efecto preventivo)19. - Para preparar las placas suplementadas con FITC-dextran, mezcle 2 ml de E. coli OP50 inactivado sin calor con 4 mg de FITC-dextran. A continuación, divida 100 sl de la mezcla FITC-dextran y E. coli OP50 en veinte placas de agar NGM frescas (60 mm x 15 mm) y deje que las placas se sequen durante 1 h en un banco limpio.
NOTA: La concentración final de FITC-dextran en cada placa NGM será de 20 g/ml. - Prepare cinco placas NGM que contienen E. coli OP50 sin FITC-dextran para el tratamiento de control del vehículo. Para ello, divida 100 l de E. coli OP50 con inactivada sin calor a cada placa de agar NGM fresca (60 mm x 15 mm) y deje que las placas se sequen durante 1 h en un banco limpio.
NOTA: Para cada experimento independiente, se requieren quince placas NGM suplementadas con FITC-dextran y cinco placas NGM sin FITC-dextran. - Después de 48 h de tratamiento (del paso 7.2), lavar los gusanos con S-buffer, transferir los gusanos a las placas suplementadas FITC-dextran y las placas NGM sin FITC-dextran, e incubar las placas durante la noche (14-15 h).
NOTA: Para cada grupo de tratamiento, se requieren 5 réplicas de la tinción FITC-dextran (o alimentación de control del vehículo). - Lave los gusanos con S-buffer y permítales arrastrarse en la placa de agar NGM fresca durante 1 h.
NOTA: Para cada experimento independiente, se necesitan un total de 20 placas NGM frescas. En este paso, puede utilizar la placa NGM suplementada sin o con E. coli OP50. - Añadir 50 sl de solución de formaldehida al 4% a cada pocal de una placa negra de fondo plano de 96 pocillos. Transfiera aproximadamente 50 gusanos de cada placa NGM a cada pocal para mediciones de fluorescencia. Después de 1 a 2 min, retire a fondo todo el formaldehído de cada poca y agregue 100 s de medio de montaje para recubrir los pozos.
NOTA: Solución de formaldehide (4%) se utiliza para inmovilizar y arreglar los gusanos. Para cada grupo de tratamiento, se utilizan 5 pozos (5 réplicas) para el análisis de imágenes.
8. Imaging C. elegans con el sistema de imágenes de Operetta y la determinación de la permeabilidad intestinal mediante la medición de la absorción de fluorescencia de la fluorescencia FITC-dextran
NOTA: La estereomicroscopía fluorescente se puede utilizar para el análisis de imágenes en lugar del sistema Operetta.
- Capture imágenes de fluorescencia y mida la intensidad de la fluorescencia utilizando el sistema de imágenes de alto contenido de Operetta y analice las imágenes con el software Harmony.
- En el software Harmony, pulse el icono Abrir tapa para abrir la tapa y colocar la placa en la máquina.
- Configure los parámetros.
- Haga clic en Configurar, seleccione el tipo de placa (96 pocillos de fondo plano) y agregue los canales (canales de campo brillante y EGFP).
- Ajuste el diseño. Vaya a la selección Diseñoy, a continuación, seleccione Pista y ajuste los parámetros (primera imagen a 1 m, el número de planos es de 10, la distancia es de 1 m).
- Seleccione uno de los pozos de tratamiento y un campo de captura y pulse Prueba para comprobar si las imágenes son satisfactorias en la sección Ejecutar experimento.
- Si las imágenes son satisfactorias, vuelva a la sección Configurar y pulse el icono Restablecer al final de la pantalla. A continuación, seleccione todos los pozos de destino y un número adecuado de campos de captura.
- Vaya a Ejecutar experimento de nuevo e introduzca el nombre de la placa y, a continuación, presione Iniciar para comenzar a procesar.
- Para medir la intensidad de la fluorescencia, vaya a la sección de análisis de imagen e introduzca la imagen. Encuentre la celda eligiendo el canal EGFP y el método B. Ajuste el umbral común a 0,5, el área a >200 m2, el factor de división a 3.0, el umbral individual a 0.18 y el contraste a más de 0.18. A continuación, calcule las propiedades de intensidad y elija la media como salida. Pulse el icono Aplicar para guardar la configuración.
- Vaya a la sección Evaluación para medir la intensidad obteniendo un mapa de calor y una tabla de datos. Establezca el parámetro Readout en Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well e inicie la evaluación.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. - Para extraer los datos de Operetta, haga clic en el botón Configuración y elija Gestión de datos.
- Elija Write archive (Escribir archivo)y, a continuación, abra la exploración y seleccione el archivo.
- Para seleccionar el archivo, haga clic en la señal pequeña + en la esquina izquierda y, a continuación, haga clic en Medición y elija Nombre de placa.
- Seleccione el archivo y haga clic en Aceptar.
- Seleccione la ruta para guardar el archivo haciendo clic en la señal Examinar en la ruta activa.
- Haga clic en Iniciar para guardar el archivo de datos.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
9. Análisis estadístico de la fluorescencia FITC-dextran de C. elegans
- Importe los datos y calcule la media y la desviación estándar (SD) utilizando un software de estadísticas.
- Analice la diferencia significativa con el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.
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Representative Results
Después de la incubación con P. aeruginosa PAO1, C. elegans mostró un aumento significativo en la fluorescencia FITC-dextran en el cuerpo del gusano en comparación con la fluorescencia mostrada después de la incubación con las otras dos cepas bacterianas(Figura 1). Las intensidades de fluorescencia de los gusanos alimentados con E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 y E. faecalis KCTC3206 fueron de 100,0 a 6,6, 369,7 a 38,9 y 105,6 a 10,6%, respectivamente. Los datos subrayan que P. aeruginosa causó más daño vital a la barrera intestinal epitelial, y por lo tanto, los gusanos mostraron un aumento dramático en su permeabilidad intestinal. Sobre la base de este resultado, FITC-dextran puede penetrar fácilmente a través de la capa intestinal, por lo que P. aeruginosa fue seleccionado como un patógeno candidato potencial para la detección de los efectos de DIM. Aunque E. faecalis es un patógeno intestinal que puede producir superóxido extracelular y peróxido de hidrógeno, que dañan el ADN de células epiteliales colónicas15, en algunos casos, E. faecalis también es conocido como una bacteria probiótica potencial debido a su capacidad para producir bacteriocinas contra algunos patógenos25,26. Las funciones de un probiótico incluyen adherencia a las superficies epiteliales, persistencia en el tracto gastrointestinal humano, estimulación inmune y actividad antagónica contra patógenos intestinales26. Por lo tanto, la permeabilidad intestinal de los gusanos incubados con E. faecalis se mantuvo inalterada en comparación con la de los gusanos de control del vehículo. Este resultado muestra que la cantidad de la infección puede ser estudiada por el aumento en la intensidad de la fluorescencia, y P. aeruginosa causa más permeabilidad intestinal que otras cepas.
La Figura 2 muestra la diferencia entre P. aeruginosa PAO1 en vivo e inactivado por calor basado en la intensidad de la fluorescencia fitC-dextran en el cuerpo del gusano. Tanto las imágenes de fluorescencia como los datos estadísticos indican que el patógeno no pudo desencadenar ninguna toxicidad para los nematodos después de la inactivación del calor. P. aeruginosa puede producir exotoxina A, una potente citotoxina extracelular que es letal para muchos animales27. La exotoxina A se puede abolir rápidamente calentando a 45 oC a 60 oC28. Por lo tanto, P. aeruginosa inactivada por calor no pudo dañar la permeabilidad de la epitelia intestinal de los gusanos. El sobrenadante del cultivo de P. aeruginosa PAO1 dañó significativamente la permeabilidad intestinal, y por lo tanto, el sobrenadante de cultivo en lugar de células enteras de P. aeruginosa se puede utilizar para inducir la disfunción de la permeabilidad intestinal19. El sobrenadante contiene endotoxinas, exotoxina A y lipopolisacáridos29,y se sabe que estos componentes inducen toxicidad celular30,31. Por lo tanto, estos componentes del sobrenadante pueden afectar a la permeabilidad intestinal, aunque no comprobamos el efecto directo de las exotoxinas y lipopolisacáridos en la permeabilidad intestinal en C. elegans.
El cotratamiento DIM durante 48 h disminuyó significativamente la intensidad de fluorescencia FITC-dextran dentro de las tripas de los gusanos en comparación con el tratamiento único de P. aeruginosa (Figura 3C,D). El análisis estadístico mediante la prueba de comparación múltiple de ANOVA unidireccional y Tukey mostró que después del tratamiento con DIM, la intensidad media de fluorescencia disminuyó significativamente en comparación con la intensidad de fluorescencia del tratamiento solo para P. aeruginosa. Las intensidades de fluorescencia de los gusanos tratados con P. aeruginosa-only y P. aeruginosa más DIM fueron 486,3 a 41,7 y 414,2 a 25,0%, respectivamente(Figura 3E). Basado en este resultado, DIM puede considerarse un buen producto natural para curar la disfunción de permeabilidad intestinal causada por infecciones bacterianas. Este resultado indicó que DIM puede atenuar la inflamación celular en las células intestinales, lo que reduce la permeabilidad del intestino19. Este resultado es similar a los resultados obtenidos en un modelo de ratón, en el que DIM mostró una reducción significativa en la inflamación en el colon32.
Figura 1: Los efectos de diferentes bacterias en la permeabilidad intestinal de C. elegans. Imágenes de microscopía de los gusanos, incluyendo campo brillante, fluorescencia FITC (canal verde) e imágenes combinadas. Imágenes de microscopía de gusanos de (A) E. coli OP50 sin alimentación FITC-dextran, (B) E. coli con alimentación FITC-dextran, (C) P. aeruginosa PAO1 con alimentación FITC-dextran, y (D) E. faecalis KCTC3206 con alimentación FITC-dextran. Barra de escala de 1 mm (blanco) y 200 m (negro). Las larvas L4 sincronizadas por la edad se incubaron durante 48 h en placas NGM sembradas con E. coli (A, B), P. aeruginosa (C) y E. faecalis (D). A continuación, los gusanos se transfirieron a placas que contienen FITC-dextran (B-D), excepto para el control del vehículo (A). (E) La intensidad de fluorescencia FITC de los diferentes tratamientos bacterianos. Un mayor porcentaje de fluorescencia FITC indicó una mayor permeabilidad intestinal. Las columnas y las barras de error indican la media de SD. ***P < 0,001 para una diferencia significativa con respecto al control del vehículo. P< 0,001 para la diferencia significativa de los gusanos tratados con FITC-dextran alimentados con P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n.o 5). Este gráfico es representativo de dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los efectos de la p. aeruginosa PAO1 en vivo e inactivado por calor en la permeabilidad intestinal de C. elegans. Imágenes de microscopía de gusanos de (A) vivas e. coli OP50 sin alimentación FITC-dextran, (B) viven E. coli con alimentación FITC-dextran, (C) viva P. aeruginosa PAO1 con alimentación FITC-dextran, y (D) P. aeruginosa inactivada por calor con alimentación FITC-dextran. Barra de escala de 1 mm (blanco) y 200 m (negro). Las larvas L4 sincronizadas por la edad se incubaron durante 48 h en placas NGM sembradas con E. coli (A, B), P. aeruginosa (C)vivas y P. aeruginosa (D). A continuación, los gusanos se transfirieron a placas que contienen FITC-dextran (B-D), excepto para el control del vehículo (A). (E) Intensidad de fluorescencia FITC comparando la intensidad de fluorescencia en vivo y con inactivado térmicamente P. aeruginosa PAO1. Las columnas y las barras de error indican la media de SD. ***P < 0.001 y **P < 0.01 para una diferencia significativa con respecto al control del vehículo. P< 0,001 para la diferencia significativa de los gusanos tratados con FITC-dextran alimentados con P. aeruginosa PAO1 vivo (ANOVA, n.o 5). Este gráfico es representativo de dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El efecto de DIM en la permeabilidad intestinal de C. elegans alimentado P. aeruginosa. Imágenes de microscopía de gusanos de (A) E. coli OP50 sin alimentación FITC-dextran, (B) E. coli con alimentación FITC-dextran, (C) P. aeruginosa PAO1 con alimentación FITC-dextran, y (D ) P. aeruginosa y DIM (100 m) de cotratamiento con alimentación FITC-dextran. Barra de escala de 1 mm (blanco) y 200 m (negro). Las larvas L4 sincronizadas por la edad se incubaron durante 48 h en placas NGM sembradas con E. coli (A, B), p. aeruginosa viva(C), P. aeruginosa viva y DIM (D). A continuación, los gusanos se transfirieron a placas que contienen FITC-dextran (B-D), excepto para el control del vehículo (A). (E) La intensidad de la fluorescencia DEL FITC indica que la permeabilidad intestinal de C. elegans se vio afectada por DIM. Las columnas y las barras de error indican la media de SD. ***P < 0,001 para una diferencia significativa con respecto al control del vehículo. P< 0.001 y P< 0,01 para una diferencia significativa con respecto a los gusanos tratados con FITC-dextran alimentados con P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n.o 5). Este gráfico es representativo de dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mediante la utilización de este nuevo método para determinar la permeabilidad intestinal en C. elegans, que combina la microscopía de fluorescencia automatizada y el análisis cuantitativo de imágenes, las diferencias causadas por microorganismos intestinales o productos químicos se pueden determinar in vivo, específicamente en el intestino de C. elegans. Este protocolo es útil para las investigaciones de permeabilidad intestinal y aplicable a muchas tareas, como la determinación reactiva de especies de oxígeno (ROS) en condiciones de estrés y exámenes morfológicos, debido a su conveniencia y fácil manipulación. Por otra parte, este método se puede utilizar para determinar los efectos de los métodos terapéuticos y preventivos contra múltiples patógenos en C. elegans. En particular, puede ser un protocolo eficiente para investigar los mecanismos de diferentes cepas bacterianas, incluyendo bacterias dañinas y útiles. Algunos patógenos y bacterias probióticas con estructuras similares ejercen diferentes efectos sobre el huésped33,34. Este procedimiento puede ayudar a evaluar qué mecanismo están utilizando las bacterias y dónde los sustratos específicos se pueden secretar extracelular o intracelularmente. Además, este método también puede ayudar a fortalecer la hipótesis de que el tratamiento térmico desempeña un papel vital en la inactivación de patógenos.
Sin embargo, también hay algunas dificultades durante este procedimiento. En primer lugar, el número de gusanos en cada placa es importante para resultados estadísticamente significativos y detección robusta de gusanos, por lo que se recomienda una confluencia del 70-90% (al menos 50 gusanos por pozo). En consecuencia, se deben realizar experimentos de prueba para obtener gusanos adecuados. En segundo lugar, las propiedades de la placa son uno de los factores importantes que afectan a la calidad de las imágenes y la determinación de la intensidad, especialmente para el material inferior. En algunos experimentos avanzados, un fondo de vidrio es la mejor opción para la medición de la fluorescencia debido a su excelente calidad óptica. Sin embargo, debido al alto precio, un fondo de poliestireno se utiliza a menudo, aunque la calidad no es tan alta como la del fondo de vidrio. Por último, los métodos de recubrimiento de placas para C. elegans requieren optimización. En este experimento, se aplicó el medio de montaje fluorescente porque puede preservar y mejorar el etiquetado de las secciones de tejido, pero es incapaz de fijar los gusanos en el fondo de la placa correctamente.
Este protocolo tiene limitaciones; como C. elegans es un nematodo, se deben realizar más experimentos, como la evaluación en monocapas celulares intestinales humanas y en mamíferos. En este método, se determinaron los cambios fenotípicos en C. elegans alimentados con bacterias patógenas y productos químicos. Por lo tanto, los mecanismos moleculares y genéticos subyacentes a los efectos patógenos o probióticos de las bacterias intestinales, así como los efectos terapéuticos de los productos químicos deben ser más aclarados. Las vías de señalización específicas ejercidas por la infección bacteriana patógena y los efectos terapéuticos de los productos químicos pueden evaluarse utilizando tanto diversas bacterias mutantes como gusanos mutantes. Además, estudios más profundos que identifican los componentes químicos responsables de los efectos patógenos y probióticos de las bacterias intestinales sería beneficioso.
Aquí, informamos de un protocolo experimental para medir la permeabilidad intestinal en C. elegans tratados con diferentes bacterias y productos químicos mediante el uso de la alimentación FITC-dextran. Creemos que estos protocolos serán útiles para la investigación biológica básica, como el estudio de la interacción entre la microbiota intestinal y la salud intestinal, así como para el desarrollo de probióticos y nutracéuticos para la prevención y el tratamiento de problemas de salud intestinal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por una beca de investigación intramuros del Instituto de Ciencia y Tecnología de Corea (2E29563).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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