Summary
Este protocolo descreve como medir a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método é útil para a pesquisa biológica básica sobre a saúde intestinal relacionada à interação entre bactérias intestinais e seu hospedeiro e para triagem para identificar agentes probióticos e químicos para curar a síndrome do intestino com vazamento e doenças inflamatórias intestinais.
Abstract
Em organismos vivos, a hiperpermebilidade intestinal é um sintoma grave que leva a muitas doenças inflamatórias intestinais (DII). Caenorhabditis elegans é um modelo animal não mamífero que é amplamente utilizado como um sistema de ensaio devido à sua curta vida útil, transparência, custo-eficácia e falta de questões éticas animais. Neste estudo, um método foi desenvolvido para investigar os efeitos de diferentes bactérias e 3,3'-diindolylmethane (DIM) sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans com um sistema de análise de imagem de alta produção. Os vermes foram infectados com diferentes bactérias do intestino ou cotratados com DIM por 48 h e alimentados com isotiocianato de fluorescena (FITC)-dextran durante a noite. Em seguida, a permeabilidade intestinal foi examinada comparando as imagens de fluorescência e a intensidade da fluorescência dentro dos corpos do verme. Este método também pode ter o potencial de identificar bactérias intestinais probióticas e patogênicas que afetam a permeabilidade intestinal no modelo animal e é eficaz para examinar os efeitos de produtos químicos nocivos ou promotores da saúde sobre permeabilidade intestinal e saúde intestinal. No entanto, este protocolo também tem algumas limitações consideráveis a nível genético, especialmente para determinar quais genes são alterados para controlar a doença, porque este método é usado principalmente para determinação phenotípica. Além disso, este método é limitado a determinar exatamente quais substratos patogênicos causam inflamação ou aumentam a permeabilidade dos intestinos dos vermes durante a infecção. Portanto, são necessários mais estudos aprofundados, incluindo a investigação do mecanismo genético molecular usando bactérias mutantes e nematóides, bem como a análise de componentes químicos de bactérias, são necessários para avaliar plenamente a função de bactérias e produtos químicos na determinação da permeabilidade intestinal.
Introduction
A permeabilidade intestinal é considerada como uma das principais barreiras relacionadas à microbiota intestinal e à imunidade mucosa e é provável que seja afetada por vários fatores, como modificações de microbiota intestinal, comprometimento epitelial ou alterações de camada de muco1. Trabalhos recentes relataram protocolos eficazes para medir a permeabilidade intestinal das células intestinais humanas cultivadas, analisando as taxas de fluxo de fluorescência em toda a camada de células intestinais2,mas menos trabalhos de pesquisa apresentam um procedimento adequado para medir a permeabilidade intestinal em nematóides, particularmente em C. elegans, usando manchas fitc-dextran.
Existem dois protocolos representativos para medir a permeabilidade intestinal em C. elegans usando vermelho Nilo3 e dissodium erioglaucine (ou o ensaio Smurf)4,5. Neste protocolo, usamos FITC-dextran (peso molecular médio 10.000), que tem um peso molecular muito maior do que o vermelho do Nilo (MW = 318,37) e dissodium erioglaucine (MW = 792,85). FITC-dextran é mais semelhante ao vermelho do Nilo ou corantes dissimeses erioglaucinos aos nutrientes macromoleculares reais, como carboidratos, que são absorvidos através da camada intestinal. A permeabilidade intestinal de C. elegans alimentada com disódio erioglaucine (corcel azul Smurf) pode ser facilmente avaliada sem microscopia de fluorescência. No entanto, no ensaio do Smurf, a análise quantitativa da permeabilidade intestinal é difícil devido à falta de padronização e deve ser avaliada manualmente4,5. No caso do ensaio vermelho do Nilo, o vermelho do Nilo também mancha sídropis lipídicos nas células, o que pode interferir com a determinação exata da permeabilidade intestinal em C. elegans6. Os protocolos atuais permitem a análise quantitativa rápida e precisa da permeabilidade intestinal em C. elegans tratados com várias bactérias e produtos químicos intestinais ao evitar a coloração lipid inespecífica.
C. elegans é um modelo típico em campos biológicos devido ao seu preço acessível, manipulação fácil, questões limitadas de ética animal, e vida útil curta, que é benéfico para a experimentação rápida7. Em particular, depois que todo o genoma de C. elegans foi publicado, quase 40% dos genes no genoma de C. elegans foram encontrados para ser ortologous aos genes que causam doenças humanas8. Além disso, o corpo transparente permite a observação dentro do organismo, que é vantajoso para pesquisar eventos celulares e para aplicações de fluorescência na biologia celular, por exemplo, manchas de células-tronco com DAPI ou imunohistoquímica9. C. elegans é frequentemente usado como um animal experimental para estudar a interação entre a microbiota intestinal e o hospedeiro; além disso, C. elegans é usado para rastrear bactérias probióticas promotoras de saúde10,11,12, bem como produtos químicos dietéticos que promovem a saúde intestinal13,14.
Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis são bactérias intestinais bem conhecidas que afetam negativamente o sistema gastrointestinal, especialmente as células epiteliais colônicas do trato intestinal15,16. Portanto, medir a permeabilidade intestinal desencadeada por essas bactérias é necessário para o rastreamento e desenvolvimento de novos medicamentos que podem recuperar e reduzir os danos causados pela inflamação bacteriana e infecção. Neste protocolo, testamos os efeitos dessas bactérias intestinais sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans.
Também relatamos um protocolo otimizado para testar produtos químicos sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans. Para este fim, usamos 3,3'-diindolylmethane (DIM) como um modelo químico porque DIM é um composto de metabólito bioativo derivado do indole-3-carbinol, que está presente em plantas alimentares Brassica, e tem sido relatado para ter efeitos terapêuticos sobre ibd em camundongos17,18. Além disso, descobrimos recentemente que dim melhora a disfunção de permeabilidade intestinal em ambas as células intestinais humanas cultivadas, bem como o modelo nematódeo C. elegans19.
Neste estudo, utilizámos três condições experimentais diferentes. Primeiro, medimos os efeitos das diferentes bactérias, P. aeruginosa e E. faecalis, sobre permeabilidade intestinal(Figura 1). Em segundo lugar, medimos os efeitos do P. aeruginosa inativo ao vivo e inativado pelo calor sobre a permeabilidade intestinal(Figura 2). Em terceiro lugar, medimos os efeitos do DIM (um modelo químico) sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans alimentados com P. aeruginosa (Figura 3).
O objetivo deste estudo foi desenvolver protocolos otimizados que medem a permeabilidade intestinal de C. elegans,que é alterado pelo tratamento com várias bactérias intestinais, bem como com produtos químicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de P. aeruginosa PAO1 e Escherichia coli OP50 Cultura
- Prepare 500 mL de médio esterilizado de Luria-Bertani (LB)(Tabela 1)e inocule uma única colônia de P. aeruginosa no meio. Incubar a cultura para 14 a 15 h em 37 °C com uma velocidade de agitação de 150 rpm.
- Distribua igualmente a cultura bacteriana em dois tubos de centrífuga de 500 mL e centrífugas os tubos a 3.220 x g a 4 °C por 30 min.
- Retire o supernatant até que o volume é de 50 mL (um décimo do volume inicial) e resuspender a pelota bacteriana.
- Guarde a cultura bacteriana concentrada a 4 °C até o uso. O período de armazenamento da cultura P. aeruginosa pode ser de até 1 mês, mas a cultura fresca é melhor para induzir danos intestinais.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Além de toda a bactéria viva, o supernatant da cultura bacteriana pode ser usado para testar os efeitos das bactérias intestinais19. - Para preparar E. coli OP50, cultura E. coli OP50 no meio DYT(Tabela 1)e, em seguida, aplicar etapas semelhantes às descritas acima, mas diminuir o volume para um sexto do volume original. Por exemplo, se o volume inicial for de 500 mL, após a remoção do supernatant, o volume restante é de aproximadamente 83 mL.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Preparação de Enterococcus faecalis KCTC 3206 Cultura
- Prepare 500 mL de infusão cardíaca cerebral esterilizada (BHI) caldo(Tabela 1).
- Inocule uma colônia em 500 mL de caldo de BHI e incubar a cultura para 14-15 h em uma incubadora tremendo em 37 °C e 150 rpm.
- Distribua igualmente a cultura bacteriana em dois tubos de centrífuga de 500 mL e centrífugas os tubos a 3.220 x g a 4 °C por 30 min.
- Retire o supernatant até que o volume é de 50 mL (um décimo do volume inicial) e resuspender a pelota.
- Guarde a cultura bacteriana concentrada a 4 °C até o uso. A cultura fresca é melhor para testar os efeitos na permeabilidade intestinal.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Preparação de Culturas P. coli OP50 inativadas de calor e P. aeruginosa PAO1
- Cultura e colheita das bactérias, conforme descrito acima (passos 1.1-1.3).
- Calor-inativar o E. coli OP50 ou P. aeruginosa PAO1 cultura como descrito anteriormente20,21,22. Para inativação de calor, incubam as bactérias resuspensas a 65 °C (banho de água) por 30 min.
- Arrefecer a cultura bacteriana concentrada à temperatura ambiente e guardá-lo em 4 °C até o uso. O período de armazenamento pode ser de até 1 mês.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Preparação de placas de crescimento de nematóides (NGM) para testar os efeitos de diferentes bactérias sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans
- Coloque 1,25 g de peptone, 1,5 g de NaCl, 8,5 g de ágar, um agitador magnético e 487,5 mL de água destilada em uma garrafa de vidro de 500 mL (Tabela 1).
- Misture bem a mistura, autoclave a mistura de 15 min a 121 °C e arrefecer a mistura para 55 °C em um banho de água por 30 min.
- Retire o meio do banho de água, adicione os componentes (0,5 mL de 1 M CaCl2,0,5 mL de colesterol, 0,5 mL de MgSO4, 12,5 mL de KPO4) (Tabela 1) para o NGM, e misture bem.
Nota: Todos os componentes individuais devem ser autocllavados, exceto para o colesterol (dissolvido em etanol absoluto), e cada etapa experimental deve ser realizada em um banco limpo. - Distribua 20 mL de NGM para cada placa de Petri de 90 x 15 mm e permita que a ágar se solidifique em um banco limpo à temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). As placas NGM podem ser armazenadas por até um mês a 4 °C.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As placas NGM utilizadas para coloração FITC-dextran foram preparadas pelo mesmo procedimento (a partir dos passos 4,1-4,3). 10 mL de NGM foi distribuído para cada placa de Petri de 60 x 15 mm e autorizados a solidificar em um banco limpo à temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). - Retire a cultura bacteriana da geladeira de 4 °C e vórtice a cultura completamente antes de espalhar a cultura para as placas NGM.
- Adicione um total de 800 μL da cultura bacteriana a cada placa NGM fresca e permita que as placas sequem em uma incubadora de 20 °C durante a noite.
Nota: Para o primeiro experimento (Figura 1),duas placas NGM com E. coli OP50, uma placa NGM com P. aeruginosa PAO1, e uma placa NGM com E. faecalis KCTC3206 foram preparadas. Para o segundo experimento (Figura 2),duas placas NGM com E. coli OP50 ao vivo, uma placa NGM com P. aeruginosa PAO1 ao vivo e uma placa NGM com P. aeruginosa PAO1 inativada pelo calor.
5. Preparação de placas NGM para testar os efeitos de um produto químico (DIM) sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans Alimentado com P. aeruginosa
- Adicione 0,5 g de peptone, 0,6 g de NaCl, 195 mL de água destilada, um agitador magnético e 6,8 g de ágar a uma garrafa de vidro de 500 mL (gargar NGM).
- Adicione 0,5 g de peptone, 0,6 g de NaCl, 195 mL de água destilada e um agitador magnético sem ágar a outra garrafa de vidro de 500 mL (caldo NGM).
- Autoclave as duas garrafas (a partir de passos 5,1-5,2), uma garrafa de vidro vazia de 100 mL, e uma garrafa de vidro vazia de 500 mL por 15 min a 121 °C. Em seguida, deixe o meio contendo garrafas para esfriar a 55 °C no banho de água por 30 min. Mantenha o meio de ágar no banho de água e retire a garrafa contendo caldo (a partir do passo 5,2) para a próxima etapa.
- Adicione os produtos químicos aditivos ao caldo NGM: 0,4 mL de 1 M CaCl2,0,4 mL de colesterol em etanol (mL), 0,4 mL de 1 M MgSO4 e 10 mL de 1 M KPO4 (todos esses componentes devem ser esterilizados além do colesterol em etanol). Em seguida, mexa a mistura completamente com um agitador magnético a 55 °C.
- Rotular o autocllaved garrafa de vidro vazia 500 mL com sulfoxida dim dim e a garrafa de vidro vazia autocllavada de 100 mL com DIM.
- Transfira 50 mL de caldo NGM para a garrafa de 100 mL com rótulo DIM. Adicione 500 μL de 20 mM dim estoque na garrafa e misture bem.
Nota: Dim é dissolvido em DMSO (20 mM DIM estoque). - Retire rapidamente o médium de ágar NGM do banho de água, adicione 50 mL do médium ngm na garrafa de dim-rotuladoe minuciosamente.
- Coloque um alibato de 20 mL de dim contendo ngm médio em cada 90 mm x 15 mm placa de Petri. Aproximadamente cinco placas NGM contendo DIM podem ser feitas a partir desta etapa.
Nota: A concentração final de DIM em cada placa NGM será de 100 μM. - Para preparar a placa NGM contendo DMSO, transfira 150 mL de caldo ngm para a garrafa de 500 mL com rótulo DMSO. Adicione 1,5 mL de DMSO à garrafa e misture bem.
- Adicione 150 mL do médium de ágar NGM à garrafa rotulada pelo DMSO e misture bem.
- Coloque um alibato de 20 mL de dmso contendo ngm médio em cada 90 mm x 15 mm placa de Petri. Aproximadamente quinze placas NGM contendo DMSO podem ser feitas a partir desta etapa.
Nota: A concentração final de DMSO em cada placa ngm será de 0,5%. - Solidifice as placas à temperatura ambiente por pelo menos 3 h e armazená-las a 4 °C até o uso.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. - Retire a cultura E. coli OP50 ou P. aeruginosa PAO1 da geladeira 4 °C (do passo 1.4) e vórtice a cultura corretamente antes de se espalhar para as placas NGM.
- Coloque 800 μL da cultura bacteriana E. coli OP50 ou P. aeruginosa PAO1 em cada placa de ágar NGM fresca e permita que as placas sequem em uma incubadora de 20 °C durante a noite.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Para o terceiro experimento (Figura 3),duas placas NGM contendo DMSO revestidas com E. coli OP50 ao vivo, uma placa NGM contendo DMSO revestida com P. aeruginosa PAO1 ao vivo e uma placa NGM contendo DIM revestida com P. aeruginosa PAO1 ao vivo foram preparadas.
6. Preparação de C. elegans sincronizados com idade
- Crescer vermes em uma placa de NGM sólida e alimentá-los com E. coli OP50 até que a população desejada é alcançado.
- Sincronize os ovos usando o método cronometrado da colocação do ovo ou o tratamento da solução do descoramento como descrito previamente20,23,24.
7. Tratamento de bactérias ou DIM e FITC-dextran Alimentação
- Incubar os ovos sincronizados com idade a 20 °C por 64 h em placas NGM complementadas com E. coli OP50 ao vivo como alimento.
- Lave a larva L4 sincronizada com idade com tampão S e transfira-as (mais de aproximadamente 500 vermes) para as placas de TRATAMENTO NGM contendo diferentes bactérias e produtos químicos (descritos na NOTA após o passo 4.6 e 5.14). Incuba-los a 20 °C para 48 h.
Nota: O tempo de tratamento pode variar de 24 a 72 h, de acordo com as bactérias e produtos químicos utilizados. O efeito terapêutico ou preventivo do DIM também pode ser avaliado por pré-tratar os vermes com patógenos e, em seguida, tratar os vermes com DIM (o efeito terapêutico) ou por pré-tratar os vermes com DIM e, em seguida, tratar com patógenos (o efeito preventivo)19. - Para preparar as placas com suplementofitc-dextran, misture 2 mL de E. coli OP50 inativado de calor com 4 mg de FITC-dextran. Em seguida, divida 100 μL da mistura FITC-dextran e E. coli OP50 em vinte placas frescas de ágar NGM (60 mm x 15 mm) e permita que as placas sequem por 1 h em um banco limpo.
Nota: A concentração final de FITC-dextran em cada placa NGM será de 20 μg/mL. - Prepare cinco placas NGM contendo E. coli OP50 sem FITC-dextran para o tratamento de controle do veículo. Para este fim, divida 100 μL inativado de calor E. coli OP50 para cada placa fresca de ágar NGM (60 mm x 15 mm) e permitir que as placas sequem por 1 h em um banco limpo.
Nota: Para cada experimento independente, são necessárias quinze placas NGM suplementadas fitc-dextran e cinco placas NGM sem FITC-dextran. - Após 48 h de tratamento (do passo 7.2), lave os vermes com tampão S, transfira os vermes para as placas suplementadas FITC-dextran e as placas NGM sem FITC-dextran, e incubar as placas durante a noite (14-15 h).
Nota: Para cada grupo de tratamento, 5 réplicas de coloração FITC-dextran (ou alimentação de controle do veículo) são necessárias. - Lave os vermes com tampão S e permita que eles rastejem na placa de ágar NGM fresca por 1 h.
Nota: Para cada experimento independente, um total de 20 novas placas de NGM são necessárias. Nesta etapa, você pode usar a placa NGM complementada sem ou com E. coli OP50. - Adicione 50 μL de solução de formaldeído de 4% a cada poço de uma placa preta de 96 poços de fundo plano. Transfira aproximadamente 50 vermes de cada placa NGM para cada poço para medições de fluorescência. Após 1 a 2 min, retire completamente todo o formaldeído de cada poço e adicione 100 μL de montagem média para revestir os poços.
Nota: Solução de formaldeído (4%) é usado para imobilizar e corrigir os vermes. Para cada grupo de tratamento, 5 poços (5 replicações) são usados para análise de imagem.
8. Imagem C. elegans com o Sistema de Imagem de Opereta e determinação da permeabilidade intestinal medindo a captação de fluorescência FITC-dextran
Nota: A estereomicroscopia fluorescente pode ser usada para análise de imagem em vez do sistema de opereta.
- Capture imagens de fluorescência e meça a intensidade da fluorescência usando o Sistema de Imagens de Alto Conteúdo da Opereta e analise as imagens com o software Harmony.
- No software Harmony, pressione o ícone Open lid para abrir a tampa e colocar a placa na máquina.
- Configure os parâmetros.
- Clique na configuração,selecione o tipo de placa (96 bem de corning fundo plano) e adicione os canais (campo brilhante e canais EGFP).
- Ajuste o layout. Vá para a seleção de Layoute, em seguida, selecione Track e ajuste os parâmetros (primeira imagem em 1 μm, número de aviões é de 10, a distância é de 1 μm).
- Selecione um dos poços de tratamento e um campo de captura e teste de imprensa para verificar se as imagens são satisfatórias na seção de experimentos Run.
- Se as imagens forem satisfatórias, retorne à seção Set up e pressione o ícone Reset no final da tela. Em seguida, selecione todos os poços-alvo e um número adequado de campos de captura.
- Ir para executar experimento novamente e digite o nome da placa, em seguida, pressione Começar a começar a processar.
- Para medir a intensidade da fluorescência, acesse a seção de análise de imagem e insume a imagem. Encontre a célula escolhendo o canal e o método B do EGFP. Ajuste o limite comum para 0,5, área para >200 μm2, fator dividido para 3,0, limite individual para 0,18 e contraste com mais de 0,18. Em seguida, calcule as propriedades de intensidade e escolha a média como a saída. Pressione o ícone Aplicar para salvar a configuração.
- Vá à seção avaliação para medir a intensidade aobtendo um mapa de calor e uma tabela de dados. Defina o parâmetro de leitura para as células - intensidade egfp célula média - média por poço e iniciar a avaliação.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. - Para extrair os dados da Opereta, clique no botão configuração e escolha o gerenciamento de dados.
- Escolha o arquivo de escrevere, em seguida, abra a navegação e selecione o arquivo.
- Para selecionar o arquivo, clique no pequeno + sinal no canto esquerdo e, em seguida, clique em Measurement e escolha o nome da placa.
- Selecione o arquivo e clique ok.
- Selecione o caminho para salvar o arquivo clicando no sinal Browse no caminho ativo.
- Clique Comece a salvar o arquivo de dados.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
9. Análise Estatística da Fluorescência FITC-dextran de C. elegans
- Importe os dados e calcule o desvio médio e padrão (SD) usando um software de estatística.
- Analise a diferença significativa com uma análise de sentido único de variância (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Após a incubação com P. aeruginosa PAO1, C. elegans mostrou um aumento significativo na fluorescência FITC-dextran no corpo do verme em comparação com a fluorescência mostrada após a incubação com as outras duas cepas bacterianas (Figura 1). As intensidades de fluorescência dos vermes alimentados com E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 e E. faecalis KCTC3206 foram 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9 e 105,6 ± 10,6%, respectivamente. Os dados enfatizam que P. aeruginosa causou danos mais vitais à barreira do intestino epiteliais e, portanto, os vermes apresentaram um aumento dramático em sua permeabilidade intestinal. Com base neste resultado, FITC-dextran pode facilmente penetrar através da camada intestinal, então P. aeruginosa foi selecionado como um patógeno candidato potencial para triagem dos efeitos da DIM. Embora E. faecalis é um patógeno do intestino que pode produzir superóxido extracelular e peróxido de hidrogênio, que danificam o DNA de células epiteliais colônicas15, em alguns casos, E. faecalis também é conhecido como uma bactéria probiótica potencial devido à sua capacidade de produzir bacteriocinas contra alguns patógenos25,26. As funções de um probiótico incluem a adesão às superfícies epiteliais, persistência no trato gastrointestinal humano, estimulação imunológica e atividade antagônica contra patógenos intestinais26. Portanto, a permeabilidade intestinal dos vermes incubados com E. faecalis permaneceu inalterada em comparação com a dos vermes de controle do veículo. Este resultado mostra que a quantidade da infecção pode ser estudada pelo aumento da intensidade da fluorescência, e P. aeruginosa causa mais permeabilidade intestinal do que outras cepas.
A Figura 2 mostra a diferença entre p. aeruginosa PAO1 inativado ao vivo e térmico com base na intensidade da fluorescência FITC-dextran no corpo do verme. As imagens de fluorescência e os dados estatísticos indicam que o patógeno não poderia desencadear qualquer toxicidade para nematóides após a inativação do calor. P. aeruginosa pode produzir exotoxina A - uma potente citotoxina extracelular que é letal para muitos animais27. Exotoxina A pode ser rapidamente abolida pelo aquecimento a 45 °C a 60 °C28. Portanto, p. aeruginosa inativado pelo calor foi incapaz de danificar a permeabilidade da epília intestinal dos vermes. O supernatant de P. aeruginosa PAO1 cultura danificou significativamente a permeabilidade intestinal, e, portanto, a cultura supernatant em vez de células inteiras P. aeruginosa pode ser usado para induzir a disfunção de permeabilidade intestinal19. O supernatant contém endotoxinas, exotoxina A, e lipopolissacarídeos29, e esses componentes são conhecidos por induzir toxicidade celular30,31. Portanto, esses componentes do supernatant podem afetar a permeabilidade intestinal, embora não tenhamos verificado o efeito direto de exotoxinas e lipopolissacarídeos sobre a permeabilidade intestinal em C. elegans.
Dim cotreatment para 48 h diminuiu significativamente a intensidade fluorescência FITC-dextran dentro das entranhas de vermes em comparação com o tratamento único P. aeruginosa (Figura 3C,D). A análise estatística por um teste de comparação unidimensional da ANOVA e tukey mostrou que, após o tratamento com DIM, a intensidade média da fluorescência foi significativamente diminuída em comparação com a intensidade da fluorescência do tratamento p. aeruginosa-somente. As intensidades de fluorescência dos vermes tratados com P. aeruginosa- apenas e P. aeruginosa mais DIM foram 486,3 ± 41,7 e 414,2 ± 25,0%, respectivamente (Figura 3E). Com base neste resultado, dim pode ser considerado um bom produto natural para curar a disfunção de permeabilidade intestinal causada por infecções bacterianas. Este resultado indicou que dim pode atenuar a inflamação celular nas células do intestino, o que reduz a permeabilidade do intestino19. Este resultado é semelhante aos resultados obtidos em um modelo de camundongo, em que dim mostrou uma redução significativa na inflamação no cólon32.
Figura 1: Os efeitos de diferentes bactérias sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans. Imagens microscopia dos vermes, incluindo campo brilhante, fluorescência FITC (canal verde), e imagens fundidas. Imagens microscopia de vermes de (A) E. coli OP50 sem alimentação FITC-dextran, (B) E. coli com alimentação FITC-dextran, (C) P. aeruginosa PAO1 com alimentação FITC-dextran, e (D) E. faecalis KCTC3206 com alimentação FITC-dextran. Barra de escala = 1 mm (branco) e 200 μm (preto). As larvas L4 sincronizadas com idade foram incubadas por 48 h em placas NGM semeadas com E. coli (A, B), P. aeruginosa (C),e E. faecalis (D). Em seguida, os vermes foram transferidos para placas contendo FITC-dextran (B-D), exceto para o controle do veículo (A). (E)A intensidade da fluorescência FITC dos diferentes tratamentos bacterianos. Uma porcentagem mais elevada da fluorescência de FITC indicou uma permeabilidade mais elevada do intestino. Colunas e barras de erro indicam a média ± SD. ***P < 0,001 por diferença significativa do controle do veículo. ###P < 0.001 para a diferença significativa dos sem-fins FITC-dextran-tratados alimentados com P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Este gráfico é representativo de duas experiências independentes. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Os efeitos do p. aeruginosa PAO1 ao vivo e inativado pelo calor sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans. Imagens microscopia de vermes de (A)vivem E. coli OP50 sem alimentação FITC-dextran, (B) vivem E. coli com alimentação FITC-dextran, (C) viver P. aeruginosa PAO1 com alimentação FITC-dextran, e (D)p inativado de calor aeruginosa com alimentação FITC-dextran. Barra de escala = 1 mm (branco) e 200 μm (preto). As larvas L4 sincronizadas com idade foram incubadas por 48 h em placas NGM semeadas com E. coli vivo (A, B), p vivo aeruginosa (C),e P. aeruginosa (D). Em seguida, os vermes foram transferidos para placas contendo FITC-dextran (B-D), exceto para o controle do veículo (A). (E)Intensidade da fluorescência fitc comparando p. aeruginosa PAO1 ao vivo e inativado de calor. Colunas e barras de erro indicam a média ± SD. ***P < 0,001 e **P < 0,01 para a diferença significativa do controle do veículo. ###P < 0.001 para a diferença significativa dos sem-fins FITC-dextran-tratados alimentados com p. vivo aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Este gráfico é representativo de duas experiências independentes. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: O efeito de DIM sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans alimentados P. aeruginosa. Imagens microscopia de vermes de (A) E. coli OP50 sem alimentação FITC-dextran, (B) E. coli com alimentação FITC-dextran, (C) P. aeruginosa PAO1 com alimentação FITC-dextran, e (D) P. aeruginosa e DIM (100 μM) co-tratamento com alimentação FITC-dextran. Barra de escala = 1 mm (branco) e 200 μm (preto). As larvas L4 sincronizadas com idade foram incubadas por 48 h em placas NGM semeadas com E. coli vivo (A, B), p vivo aeruginosa (C), P vivo e DIM (D). Em seguida, os vermes foram transferidos para placas contendo FITC-dextran (B-D), exceto para o controle do veículo (A). (E)A intensidade da fluorescência FITC indica que a permeabilidade intestinal de C. elegans foi afetada pela DIM. Colunas e barras de erro indicam a média ± SD. ***P < 0,001 por diferença significativa do controle do veículo. ###P < 0.001 e ##P < 0.01 para a diferença significativa dos sem-fins FITC-dextran-tratados alimentados com P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Este gráfico é representativo de duas experiências independentes. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utilizando este novo método para determinar a permeabilidade intestinal em C. elegans, que combina microscopia fluorescência automatizada e análise quantitativa de imagem, as diferenças causadas por microorganismos intestinais ou produtos químicos podem ser determinadas in vivo, especificamente no intestino C. elegans. Este protocolo é útil para investigações de permeabilidade intestinal e aplicável a muitas tarefas, como determinação de espécies reativas de oxigênio (ROS) condições de estresse e exames morfológicos, devido à sua conveniência e fácil manipulação. Além disso, este método pode ser usado para determinar os efeitos de métodos terapêuticos e preventivos contra múltiplos patógenos em C. elegans. Em particular, pode ser um protocolo eficiente para investigar os mecanismos de diferentes cepas bacterianas, incluindo bactérias prejudiciais e úteis. Alguns patógenos e bactérias probióticas com estruturas semelhantes exercem efeitos diferentes sobre o hospedeiro33,34. Este procedimento pode ajudar na avaliação de qual mecanismo as bactérias estão utilizando e onde os substratos direcionados podem ser secretados extracelularmente ou intracelularmente. Além disso, esse método também pode ajudar a fortalecer a hipótese de que o tratamento térmico desempenha um papel vital na inativação de patógenos.
No entanto, existem também algumas dificuldades durante este procedimento. Primeiro, o número de vermes em cada placa é importante para resultados estatisticamente significativos e detecção robusta de vermes, portanto, recomenda-se confluência de 70 a 90% (pelo menos 50 vermes por poço). Assim, experimentos experimentais devem ser realizados para obter vermes adequados. Em segundo lugar, as propriedades da placa são um dos fatores importantes que afetam a qualidade das imagens e determinação de intensidade, particularmente para o material inferior. Em alguns experimentos avançados, um fundo de vidro é a melhor opção para a medição da fluorescência devido à sua excelente qualidade óptica. No entanto, por causa do alto preço, um fundo de poliestireno é frequentemente usado, embora a qualidade não seja tão alta quanto a do fundo de vidro. Finalmente, os métodos de revestimento de placa para C. elegans exigem otimização. Neste experimento, o meio de montagem fluorescente foi aplicado porque pode preservar e melhorar a rotulagem das seções de tecido, mas é incapaz de corrigir os vermes no fundo da placa corretamente.
Este protocolo tem limitações; como C. elegans é um nematóide, mais experimentos, como avaliação em monocamadas de células intestinais humanas e em mamíferos, devem ser realizados. Neste método, as mudanças phenotypic em C. elegans alimentados com bactérias patogênicas e produtos químicos foram determinados. Portanto, os mecanismos moleculares e genéticos subjacentes aos efeitos patogênicos ou probióticos das bactérias intestinais, bem como os efeitos terapêuticos dos produtos químicos devem ser ainda mais elucidados. Vias de sinalização específicas exercidas por infecção bacteriana patogênica e efeitos terapêuticos de produtos químicos podem ser avaliadas usando várias bactérias mutantes e vermes mutantes. Além disso, mais estudos aprofundados que identificam os componentes químicos responsáveis pelos efeitos patogênicos e probióticos das bactérias intestinais seriam benéficos.
Aqui, relatamos um protocolo experimental para medir a permeabilidade intestinal em C. elegans tratados com diferentes bactérias e produtos químicos usando a alimentação FITC-dextran. Acreditamos que esses protocolos serão úteis para pesquisas biológicas básicas, como o estudo da interação entre a microbiota intestinal e a saúde intestinal, bem como para o desenvolvimento de probióticos e nutracêuticos para a prevenção e tratamento de problemas de saúde intestinal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por uma bolsa de pesquisa intramural do Instituto de Ciência e Tecnologia da Coreia (2E29563).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
