Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60488
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

Summary

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Abstract

Intracellulaire bacteriën scheiden virulentie factoren die Effector eiwitten worden genoemd in de gastheer cytosol die handelen om gastheer eiwitten en/of hun geassocieerde biologische trajecten te verdraaien ten voordele van de bacterie. Identificatie van vermoedelijke bacteriële Effector eiwitten is meer beheersbaar geworden als gevolg van vooruitgang in bacteriële genoom volgordebepaling en de opkomst van algoritmen die toelaten in silico identificatie van genen coderen van secretie kandidaten en/of eukaryotic-achtige Domeinen. De identificatie van deze belangrijke virulentie factoren is echter slechts een eerste stap. Het doel is natuurlijk om de moleculaire functie van Effector eiwitten te bepalen en te verhelderen hoe ze omgaan met de gastheer. In de afgelopen jaren hebben technieken zoals het gist-twee-hybride scherm en grootschalige immunoprecipitaties in combinatie met massaspectrometrie geholpen bij de identificatie van eiwit-eiwit interacties. Hoewel identificatie van een host binding partner de cruciale eerste stap is om de moleculaire functie van een bacterieel Effector eiwit te verhelderend, wordt soms vastgesteld dat het gastheer eiwit meerdere biologische functies heeft (bijv. actin, clathrin, tubuline) of het bacteriële eiwit kan niet fysiek binden gastheer eiwitten, het ontnemen van de onderzoeker van cruciale informatie over de precieze gastheer traject wordt gemanipuleerd. Een gemodificeerd gist toxiciteits scherm in combinatie met een suppressor scherm is aangepast om gastheer trajecten te identificeren die worden beïnvloed door bacteriële Effector eiwitten. Het toxiciteits scherm is afhankelijk van een toxisch effect in gist veroorzaakt door de Effector proteïne interfereren met de gastheer biologische trajecten, die vaak manifesteert als een groei fout. De uitdrukking van een gist genomische bibliotheek wordt gebruikt om gastheerfactoren te identificeren die de toxiciteit van het bacteriële Effector eiwit onderdrukken en zo eiwitten identificeren in het traject dat het Effector eiwit target. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies voor zowel de toxiciteits-als de suppressor-schermen. Deze technieken kunnen worden uitgevoerd in elk lab dat geschikt is voor moleculair klonen en teelt van gist en Escherichia coli.

Introduction

Het eerste rapport van procedures vergelijkbaar met die hier gepresenteerd gekenmerkt de Legionella pneumophila type IV Effector Sidd, een deAMPylase dat wijzigt Rab11. Er werden vergelijkbare technieken gebruikt voor de karakterisering van verschillende L. pneumophila Effectors1,2,3. De assay werd aangepast om een Coxiella burnetii type IV Effector proteïne4te karakteriseren, en onlangs werd het nut van deze techniek uitgebreid voor de karakterisering van Chlamydia trachomatis inclusie membraan eiwitten5 .

Dit protocol kan worden opgesplitst in twee belangrijke delen: 1) het gist toxiciteits scherm, waarin de bacteriële Effector proteïne van belangstelling wordt uitgedrukt in gist en klonen worden gescreend op een toxisch fenotype zoals blijkt uit een groei fout, en 2) het gist suppressor-scherm , waarin het toxische fenotype wordt onderdrukt door uitdrukking van een gist genomische bibliotheek in de toxische stam. Zo is het toxiciteits scherm een scherm voor toxische fenotypes dat zich manifesteert als groei fouten wanneer de bacteriële Effector van belang wordt overexpressie. Giftige klonen, succesvol getransformeerd met en uitdrukken van de bacteriële Effector, worden geselecteerd en opgeslagen voor de volgende stap. De tweede belangrijke stap is het overdrukken van een gedeeltelijk verteerde gist genomische bibliotheek in de giftige gist kloon. Plasmiden maken van de gist genomische Library voorgesteld voor het gebruik in dit protocol dragen 5 − 20 KB inserts, meestal overeenkomend met 3 − 13 gist open reading frames (ORF) van een gemiddelde gengrootte van ~ 1,5 KB over alle plasmiden, die het hele gist genoom bedekt ongeveer 10x. Dit deel van de test wordt het suppressor scherm genoemd, omdat het doel is om de toxiciteit van het bacteriële Effector eiwit te onderdrukken. Potentiële suppressor plasmiden zijn geïsoleerd van gist, Sequenced, en het onderdrukken van Orf's geïdentificeerd. De ratio die aan het onderdrukker scherm ten grondslag ligt, is dat de Effector proteïne bindt, samenwerkt met, en/of overweldt van componenten van het ontvangende pad dat het target, en dat het verstrekken van die gastheer eiwitten terug in overmaat het toxische effect op het traject kan redden en dus, de groei fout. Zo, geïdentificeerde Orf's die toxiciteit onderdrukken vaak vertegenwoordigen meerdere deelnemers van een host-traject. Orthogonale experimenten worden vervolgens uitgevoerd om te controleren of de bacteriële Effector inderdaad met het betrokken traject samenwerkt. Dit is vooral nodig als een bindende partner zoals clathrin of actine is geïdentificeerd, omdat deze eiwitten betrokken zijn bij een veelheid van hostprocessen. Verdere experimenten kunnen dan de fysiologische functie van het Effector eiwit verheldoen tijdens infectie. De toxiciteits-en suppressor schermen zijn ook krachtige hulpmiddelen voor het ontcijferen van de fysiologische functie van bacteriële Effector eiwitten die niet fysiek gastheer eiwitten binden met affiniteiten die voldoende zijn om te detecteren door immunoprecipitatie of die interageren met de host in enzymatische hit-and-run interacties die mogelijk niet worden gedetecteerd door een gist-twee hybride scherm.

Hoewel het suppressor-scherm een krachtige methode kan zijn om potentiële fysiologische interacties tussen bacteriële Effector eiwitten en hosttrajecten te onthullen, moet het bacteriële Effector eiwit een groei fout in gist induceren, anders gebruikt het in de het onderdrukker scherm zal weinig gebruikt worden. Bovendien moet het toxische fenotype resulteren in ten minste een 2 − 3 log10 -tekort in groei of het zal moeilijk zijn om suppressors te identificeren. Als een laboratorium is opgezet voor celkweek, screening Effector eiwitten voor toxiciteit in gemeenschappelijke cellijnen zoals HeLa kan vaak inzicht geven of het de moeite waard om door te gaan met de gist toxiciteit scherm. Ectopische uitdrukking van het Effector-eiwit in HeLa-cellen leidt soms tot toxiciteit die zeer sterk correleert met de toxiciteit in de gist stam die voor deze schermen wordt gebruikt4. Waarneembare kenmerken van stress in HeLa-cellen zijn verlies van stress vezels, celloslating van de plaat en nucleaire condensatie die apoptosis aangeeft. Elke visuele indicatie van stress in HeLa-cellen maakt het eiwit van belang een goede kandidaat voor het induceren van een groei fout in gist, die veel sneller repliceert en dus beter reageert op perturbatie van essentiële trajecten.

Opgemerkt moet worden dat het onderdrukker scherm niet altijd host binding partners identificeert als onderdrukkers, maar het kan nog steeds cruciale componenten van de beoogde host-traject (en) impliceren, wat een holistisch beeld oplevert van de biologische processen die worden gekaapt door de bacteriële Effector eiwitten. Op het oppervlak, dit lijkt contra-intuïtief, omdat het verstrekken van de bindende partner van de Effector eiwit in overmaat zou worden verwacht dat de groei defect te redden. Bij inspanningen om trajecten te identificeren die zijn getarget door de C. trachomatis Effector Protein CT229 (cpos), die bindt aan ten minste 10 verschillende Rab GTPases tijdens infectie5, onderdrukte geen van de bindende partners van Rab de toxiciteit van CT229. Er werden echter talrijke onderdrukkers geïdentificeerd die betrokken waren bij de handel met clathrin-Coated blaasje (CCV), wat leidde tot verder werk dat aantoont dat CT229 in het bijzonder Rab-afhankelijke CCV-mensenhandel ondermijnt. Evenzo, bij het onderzoeken van de C. burnetii Effector Protein Cbu0041 (CIRA) verschillende Rho gtpases die de gist groei defect gered werden geïdentificeerd, en het werd later gevonden dat CIRA fungeert als een GTPase activeren eiwit (Gap) voor rhoa4.

Het nut van de gist suppressor scherm voor verhelderende gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten kan niet worden overschat, en andere onderzoekers proberen te karakteriseren intracellulaire bacteriële Effector eiwitten kunnen sterk profiteren van deze technieken. Deze assays zijn van waarde als immunoprecipitaties en/of gist-twee hybride schermen hebben nagelaten een bindende partner te vinden en kunnen verheldoen welke trajecten zijn gericht op het bacteriële Effector eiwit. Hier, gedetailleerde protocollen voor de toxiciteit en suppressor schermen om gastheer biologische trajecten doelwit van intracellulaire bacteriële Effector eiwitten identificeren, evenals enkele van de gemeenschappelijke obstakels ervaren bij het gebruik van deze testen en hun bijbehorende oplossingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van de media en reagentia

Opmerking: platen moeten vóór de dag van de test worden bereid en zijn goed voor 1 maand. Media en reagentia kunnen op elk moment worden gemaakt en zijn goed voor 1 maand.

  1. Bereid 1 L van de glucoseoplossing (10% w/v) door 100 g van D-(+)-glucose op te lossen in 800 mL gedistilleerd water in een bekerglas van 1, 000 mL. Stel het volume in op 1 L met gedestilleerd water. Filtreer door een 0,2 μm steriel filter in een steriele 1 L media opslag fles.
  2. Bereid 1 L van de galactose oplossing (10% m/v) door het oplossen van 100 g D-(+)-galactose in 800 mL gedistilleerd water in een 1 L bekerglas. Stel het volume in op 1 mL met gedestilleerd water en filtreer door een steriel 0,2 μm-filter in een steriele fles van 1.000 mL voor media opslag.
  3. Bereid 1 L gistextract pepton dextrose (ypd) agar door het oplossen van 10 g gistextract, 20 g pepton, 20 g glucose en 20 g agar in 1.000 ml gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in 56 °C waterbad tot gekoeld. Giet in 100 mm platen met ~ 20 mL media per plaat.
  4. Bereid 1 L YPD- bouillon voor door 10 g gistextract, 20 g peptone en 20 g glucose in 1.000 ml gedistilleerd water op te lossen. Autoclaaf gedurende 20 min.
  5. Bereid de synthetische dropout (SD) uracil (Ura-) glucose agar. Voor 1 L, los 6,7 g van gist stikstof basis zonder aminozuren, 1,9 g van dropout supplement zonder uracil, en 15 g agar in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in een waterbad van 56 °C tot de temperatuur ~ 50 − 60 °C is. Voeg met een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 mL van de in stap 1,1 bereide glucoseoplossing toe. Meng goed door zachtjes te zwengelen of op roer plaat te plaatsen. Giet in 100 mm platen met ~ 20 mL media per plaat.
  6. Bereid de synthetische dropout (SD) uracil (Ura-) galactose agar. Voor 1 L, los 6,7 g van gist stikstof basis zonder aminozuren, 1,9 g van dropout supplement zonder uracil, en 15 g agar in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in een waterbad van 56 °C tot de temperatuur ~ 50 − 60 °C is. Voeg met behulp van een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 mL van de in stap 1,2 bereide galactose oplossing toe. Meng goed door zachtjes te draaien of op de roer plaat te plaatsen. Giet in 100 mm platen met ~ 20 mL media per plaat.
  7. Bereid de synthetische dropout (SD) uracil (Ura-) glucose Bouillon. Voor 1 L, los 6,7 g van gist stikstof basis zonder aminozuren en 1,9 g van dropout supplement zonder uracil in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in een waterbad van 56 °C tot de temperatuur ~ 50 − 60 °C is. Voeg met een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 ml van de in stap 1,1 bereide glucoseoplossing toe.
  8. Bereid de synthetische dropout (SD) uracil(Ura-)Leucine (Leu-) glucose agar. Voor 1 L, los 6,7 g van de gist stikstof basis zonder aminozuren; 1,9 g van dropout supplement zonder uracil, Leucine, en tryptofaan; 15 g agar; en 0,076 g tryptofaan in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in een waterbad van 56 °C tot de temperatuur ~ 50 − 60 °C is. Voeg met een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 mL van de in stap 1,1 bereide glucoseoplossing toe. Giet in 100 mm platen met ~ 20 mL media per plaat.
  9. Bereid synthetische dropout (SD) uracil(Ura-) Leucine (Leu-) galactose agar. Voor 1 L, los 6,7 g van gist stikstof basis zonder aminozuren; 1,9 g van dropout supplement zonder uracil, Leucine, en tryptofaan; 15 g agar; en 0,076 g tryptofaan in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in een waterbad van 56 °C tot de temperatuur ~ 50 − 60 °C is. Voeg met behulp van een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 mL van de in stap 1,2 bereide galactose oplossing toe. Meng goed door zachtjes te draaien of op een roer plaat te plaatsen. Giet in 100 mm platen met ~ 20 mL media per plaat.
  10. Bereid synthetische dropout (SD) uracil(Ura-) Leucine (Leu-) glucose Bouillon. Voor 1 L, los 6,7 g van gist stikstof basis zonder aminozuren; 1,9 g van dropout supplement zonder uracil, Leucine, tryptofaan; en 0,076 g tryptofaan in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 min en koel in een waterbad van 56 − 60 °C tot de temperatuur ~ 50 °C is. Voeg met een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 mL van de in stap 1,1 bereide glucoseoplossing toe.
  11. Bereid polyethyleenglycol (PEG) oplossing. Voeg 50% w/v polyethyleenglycol 3350 toe in gedistilleerd water. Steriliseren door autoclaven.
  12. Bereid 1 M Lithium acetaat (LiAc) door het oplossen van 10,2 g lithium acetaat dehydraat in 200 mL gedistilleerd water. Steriliseren door autoclaven.
  13. Bereid haring sperma DNA. Verdun 10 mg/mL haring sperma DNA naar 2 mg/mL met gedestilleerd water. Verwarm bij 100 °C gedurende 5 min en plaats onmiddellijk 5 min op het ijs.

2. klonen van het gen van belang in de gist toxiciteit plasmide pYesNTA-kan

Opmerking: op dit moment zijn er verschillende gist toxiciteits vectoren beschikbaar, zowel commercieel als academisch. Het gist suppressor-scherm kan worden gebruikt in combinatie met veel van deze vectoren, op voorwaarde dat de plasmide die de Effector-proteïne van belang uitdrukt, een andere dropout-selectie dan uracil en een andere antibioticum marker dan blaRgebruikt. Dit werk gebruikte een gemodificeerde pyesnta Vector4,die een kanamycine weerstands cassette bevat voor een eenvoudigere screening op mogelijke suppressors. Het kloon schema moet het mogelijk maken het Effector-eiwit in beeld te hebben met de promotor van de gal en zijn tag. De Chlamydia trachomatis inclusie membraan proteïne CT229 werd gebruikt als een bewijs van principe voor deze testen.

  1. Gebruik PCR om CT229 te versterken uit C. trachomatis genomische DNA volgens de instructies van de fabrikant met behulp van CT229 + 1 KPN F (CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) en CT229 Xhoi R (CCCTCGAGTTTTTTACGACGGGATGCC) primers. Gebruik de volgende PCR-voorwaarden: (1) 98 °C gedurende 30 sec.; (2) 98 °C gedurende 10 s, 55 °C gedurende 30 sec., 72 °C gedurende 2 min; (3) Herhaal stap 2 voor een totaal van 25x; (4) 72 °C gedurende 10 min; en (5) 4 °C vasthouden.
  2. Analyseer 5 μL van het PCR-product op een 1% agarose-gel (Figuur 1).
  3. Reinig de resterende 45 μL DNA met behulp van een PCR-zuiverings pakket volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Verteren de 50 μL gezuiverde PCR-wisselplaat en pYesNTA-kan (Figuur 2) gedurende 1 uur bij 37 °c in een waterbad met KpnI-HF en xhoi-HF.
    Opmerking: voor pYesNTA-kan, Digest 5 μg plasmide met 5 μL KpnI-HF, 5 μl XhoI-HF, en 6 μL buffer in een totaal volume van 60 μL. Verteren voor de wisselplaat het gehele 50 μL gezuiverde PCR-product met 2 μL KpnI-HF, 2 μL XhoI-HF en 6 μL buffer.
  5. Voer de hele plasmide Digest uit op een 1% agarose gel. Voer de zuivering van het verteerde plasmide uit met behulp van een gel-extractie Kit volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Reinig de verteerde PCR-wisselplaat met behulp van een PCR-reinigingsset volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Kloon de insert in pYesNTA-kan met 2 μL pYesNTA-kan (stap 2,5), 2 μL DNA-ligase buffer, 1 μL T4 ligase en 15 μL wisselplaat (stap 2,6). Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  8. Voeg de volledige kloon reactie toe aan 50 μL E. coli competente cellen en voer de transformatie reactie uit.
  9. Plaat de volledige transformatie reactie op een LB-plaat met 100 μg/mL carbenicilinin.
  10. Inoculeren 10 mL van de LB met 100 μg/mL carbenicileen met drie individuele kolonies. Incuberen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 150 rpm.
  11. Isoleer het plasmide met een plasmide miniprep Kit volgens de instructies van de fabrikant.
  12. Sequentie van de geïsoleerde plasmiden met behulp van genspecifieke primers (stap 2,1).

3. test het eiwit van belang voor toxiciteit in gist

  1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 op ypd agar (stap 1,3) om geïsoleerde kolonies te verkrijgen. Incuberen bij 30 °C gedurende 24 uur.
  2. Inoculeren 10 mL YPD Bouillon (stap 1,4) met één kolonie uit de agar plaat (stap 3,1). Incuberen bij 30 °C met schudden bij 150 rpm 's nachts.
  3. Voeg 0,5 mL van de overnachtings cultuur toe aan 10 mL YPD Bouillon (stap 1,4) en inincuberen bij 30 °C met schudden bij 150 rpm gedurende 4 uur.
    1. Pellet de 10 mL cultuur bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
    2. Regeer de pellet in 1 mL steriel water, breng over naar de microcentrifuge buis en pellet bij 3.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    3. Respendeer de pellet in 1 mL van 1 mM Lithium acetaat (LiAc) en pellet bij 3.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    4. Herhaal de LiAc Wash 2x.
    5. Verwijder de wassing. Respendeer de pellet in 2,4 mL 50% PEG 3350. Voeg 360 μl van 1M LiAc, 500 μL van 2 mg/ml haring sperma DNA en 400 μl steriel water toe.
      Opmerking: dit is voldoende voor 20 transformaties.
    6. Voeg 180 μL van de transformatie combinatie van stap 3.3.5 toe aan een micro centrifugebuis met 5 μL pYesNTA-kan CT229 plasmide DNA (100 − 500 ng) uit stap 2,12.
    7. Inbroed in een waterbad van 30 °C gedurende 30 minuten.
    8. Inincuberen in een waterbad van 42 °C gedurende 30 minuten.
    9. Pellet bij 3.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    10. Verwijder de transformatie combinatie met de pipet. Respendeer de pellet in 100 μL steriel water. Plaat de transformatie op SD Ura- agar met glucose (stap 1,5).
    11. Incuberen de platen bij 30 °C gedurende 48 uur.
  4. Inoculeren 5 mL SD Ura- bouillon met glucose (stap 1,7) met een enkele kolonie van de plaat. Inincuberen bij 30 °C met schudden bij 150 rpm. Omvatten gist getransformeerd met de vector alleen als een negatieve controle.
    1. Voeg 180 μL steriel water toe aan 5 putjes van een 96 putplaat (a2 − A6).
    2. Vortex de nachtelijke cultuur om te mengen.
    3. Voeg 180 μL gist toe aan de eerste put (a1). 1:10 (zes monsters in totaal inclusief onverdund) verdunnen.
    4. Spot met een multikanaalspipet 5 μL van elke verdunning op SD Ura- glucose (stap 1,5) en Ura-galactose (stap 1,6) agar- platen. Incuberen bij 30 °C gedurende 48 uur.
  5. Beoordeling van de toxiciteit door vergelijking van de groei van de gist die de Effector eiwit van belang geteeld op de galactose-bevattende media aan de groei van gist alleen uitdrukken van de vector.
  6. Bevestig de uitdrukking van de his-tag Fusion-proteïne door Western blotting.

4. Transformeer giftige gist met de gist genomische Library

  1. Inoculeren 100 mL SD Ura- glucose Bouillon (stap 1,7) met 1 ml van de kolf uit stap 3,4. Incuberen 16 − 24 uur bij 30 °C met schudden bij 150 rpm. Plaats 900 mL SD Ura- glucose Bouillon bij 30 °c 's nachts om de media vooraf te verwarmen.
  2. Voeg de hele 100 mL van de nachtelijke kweek toe aan de voorverwarmde kolf van 1 L. Inbroed voor 4 − 5 uur bij 30 °C met schudden bij 150 rpm.
    1. Pellet de cultuur bij 6.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
    2. Gooi het supernatant weg. Rebreng de pellet in 250 mL steriel water. Pellet de cultuur bij 6.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
    3. Gooi het supernatant weg. Respendeer de pellet in 250 mL LiAc van 1 mM. Pellet de cultuur bij 6.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
    4. Verwijder LiAc en rebreng de pellet in 9,6 mL 50% PEG 3350. Voeg 1,44 mL van 1M LiAc, 2 mL van 2 mg/mL haring sperma DNA, 50 μg van de pYep13 genomische Library (ATCC 37323). Stel het volume in op 15 mL met steriel water. Meng zachtjes door inversie.
    5. Inbroed in een waterbad van 30 °C gedurende 30 minuten.
    6. Voeg 750 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe om de efficiëntie van de transformatie te verbeteren. Inincuberen in een waterbad van 42 °C gedurende 30 min. Meng elke 10 min door zachte omversie.
    7. Pellet de gist op 3.000 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
    8. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in 10 mL steriel water. Pellet bij 3.000 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
    9. Rebreng de pellet in 8 mL steriel water.
    10. Om de transformatie-efficiëntie te bepalen, Verdun 1:10 en plaat 100 μL van elke verdunning op SD Ura- Leu- glucose agar (stap 1,8).
    11. Plaat 200 μL van het monster op SD Ura- Leu- galactose agar (stap 1,9) platen. Gebruik 50 platen in totaal.
    12. Incuberen bij 30 °C gedurende 48 − 96 uur of totdat er kolonies verschijnen.
      Opmerking: kolonies worden over het algemeen op glucose agar-platen op 48 − 72 uur en galactose-agar-platen weergegeven bij 72 − 96 uur.
  3. Patch kolonies (mogelijke Rescues) op SD Ura- Leu- galactose agar (stap 1,9) om uit te breiden en voorraad te maken. Incuberen bij 30 °C gedurende 24 − 48u.
  4. Inoculeren 5 mL SD Ura- Leu- glucose Bouillon (stap 1,10) met behulp van het deel van de pleister. Inincuberen bij 26 °C met schudden bij 150 rpm.
    1. Voeg 180 μL steriel water toe aan 5 putjes van een 96 putplaat (a2 − A6).
    2. Vortex de nachtelijke cultuur om te mengen.
    3. Voeg 180 μL gist toe aan de eerste put (a1). 1:10 (zes monsters in totaal inclusief onverdund) verdunnen.
    4. Spot met een multikanaalspipet 5 μL van elke verdunning op SD Ura- GLUCOSE en SD Ura-galactose agar- platen. Giftige Effector alleen als een controle opnemen.
    5. Incuberen bij 30 °C gedurende 48 uur.
  5. Vergelijk de groei van de gist die de toxische Effector alleen uitdrukt op gist die de mogelijke suppressors bevat. Ga alleen verder met potentiële suppressors die verminderde toxiciteit hebben in vergelijking met de gist die de Effector alleen uitdrukt.

5. Identificeer en bevestig suppressors

  1. Inoculeren 5 mL SD Ura- Leu- glucose Bouillon (stap 1,10) met 100 μL gist uit stap 4,4 en incuberen 's nachts bij 30 °c met schudden bij 150 rpm.
    1. Pellet de gist op 3.000 x g gedurende 2 min bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet.
    2. Isoleer het plasmide met een gist plasmide miniprep Kit volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Transformeer de geïsoleerde plasmide in de E. coli competente cellen en plaat de hele transformatie op lb agar met 100 μg/ml carbenicileen. Incuberen bij 37 °C gedurende 24 uur.
  3. Inoculeren 10 mL LB Bouillon bevattende 100 μg/mL carbenicileen, met drie kolonies van de plaat en incuberen bij 37 °C 's nachts met schudden bij 150 rpm.
    1. Pelletculturen bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Isoleer plasmide met een miniprep Kit volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Hertransformeer de giftige gist met de geïsoleerde plasmiden uit stap 5.3.1 volgens de stappen in deel 3 van het protocol.
    1. Inoculeren 5 mL SD Ura- Leu- glucose bouillon met een kolonie van de transformatie plaat. Inincuberen bij 30 °C met schudden bij 150 rpm.
    2. Plaats op Ura- Leu- glucose en galactose agar om de onderdrukking van toxiciteit te bevestigen.
  5. Volgorde met behulp van pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) en pYep13 R (TGATGCCGGCCACGATGC) primers om te identificeren van gist-Orf's.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voordat de werkelijke gist suppressor scherm kan worden uitgevoerd, de Effector eiwit van belang moet worden getest op toxiciteit in gist. Dit wordt bereikt door het uiten van het eiwit van belangstelling voor gist onder de controle van een galactose-inducible promotor. Groei van glucose (niet-inducerende voorwaarden) moet eerst worden vergeleken om ervoor te zorgen toxiciteit is specifiek te wijten aan de uitdrukking van het eiwit van belang en is niet een algemeen defect. Zoals weergegeven in Figuur 3, manifesteert toxiciteit zich als kleinere kolonies en/of verminderde groei. Een 2 − 3 log afname in gist groei is ideaal voor de gist suppressor schermen.

Zoals weergegeven in Figuur 4, kan het toxiciteits-en suppressor scherm in acht stappen worden uitgevoerd met behulp van de methoden die worden beschreven in de sectie Protocol. Het gen van belang wordt gekloond tot een geschikte vector1, en de resulterende constructies worden omgezet in gist om de toxiciteit te beoordelen. Deze studie gebruikte CT229 als het gen van belang en pYesNTA-kan als de vector. Daarnaast werd de uitdrukking van het zijn gelabelde fusie-eiwit bevestigd door Western blotting. Idealiter moet een 2 − 3 log reductie in gist geteeld op galactose-bevattende media worden waargenomen. Als het eiwit van belang is giftig voor gist (Figuur 3 en Figuur 4), de suppressor scherm kan worden uitgevoerd door het transformeren van de giftige stam met de gist genomische Library pYep13. Transformanten worden geplateerd op glucose agar om de transformatie-efficiëntie en galactose agar te bepalen om mogelijke suppressors te identificeren. Met dit protocol werd een minimale transformatie-efficiëntie van 5 x 105 bereikt met in totaal 10 − 250 kolonies op galactose agar. Het patchen van deze kolonies op SD Ura- Leu- galactose agar (Figuur 4) geholpen bij de identificatie van echte suppressors, omdat veel valse positieven niet zullen groeien wanneer gepatched. Hier werden 50 kolonies gepatched en acht klonen die Effector toxiciteit onderdrukte werden verkregen (Figuur 4). Het spotten van suppressors op SD Ura- Leu- galactose agar werd gedaan om de onderdrukking van toxiciteit te bevestigen. Zoals weergegeven in Figuur 4, PSup1 en psup 2 onderdrukt de toxiciteit van het Effector eiwit, terwijl pSup3 niet. Daarom is pSup3 verwijderd. Plasmiden werden vervolgens geïsoleerd van de onderdrukkers en omgevormd tot E. coli om het plasmide rendement te verhogen. Het plasmide kan vervolgens worden omgevormd tot de giftige gist om te bevestigen dat het geïsoleerde plasmide Effector toxiciteit definitief onderdrukt (Figuur 4). Hoewel de meeste geïsoleerde plasmiden toxiciteit zouden moeten redden, wordt soms een plasmide die de toxiciteit niet onderdrukt wanneer deze in de toxische gist stam wordt omgezet, verkregen. Die plasmiden worden weggegooid, en alleen degenen die toxiciteit onderdrukken na hertransformatie moeten worden gesequentieerd.

Het geïsoleerde plasmide zal meerdere gist ORFs4bevatten. Om te bepalen welke de echte suppressor is, kan elke ORF individueel worden gekloond en uitgedrukt in de toxische gist stam zoals eerder beschreven1,2,3,4.

Figure 1
Figuur 1: PCR-amplificatie van het doel gen. CT229 van Chlamydia trachomatis Serovar L2 was PCR versterkt van GENOMISCH DNA. PCR-producten werden geanalyseerd op een 1% agarose gel gekleurd met ethidiumbromide bromide. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: pYesNTA-kan plasmide kaart. Het beoogde gen van belang werd gekloond in de meervoudige kloon site (MCS) van pYesNTA-kan. kanamycine werd gebruikt voor de selectie in E. coli en uracil dropout werd gebruikt voor de selectie in S. cerevisiae. De uitdrukking van het zijn gelabelde fusie-eiwit werd geverifieerd door Western blotting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: representatieve resultaten van gist toxiciteit. Effector eiwitten van belang werden gekloond in pYesNTA-kan. sequentie-geverifieerde plasmiden werden omgevormd tot S. cerevisiae en transformanten werden op een seriële wijze verdund en gespot op Ura- glucose en galactose agar om de toxiciteit te beoordelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: overzicht van het gist suppressor-scherm. Het beoogde gen van belang werd gekloond tot pYesNTA-kan en plasmiden werden omgevormd tot S. cerevisiae. Transformanten werden sereen verdund en gespot op Ura- glucose en galactose agar om de toxiciteit te beoordelen. Om het pad te identificeren dat is gericht op het toxische Effector-eiwit, werd de gist stam die het toxische eiwit uitdrukt, getransformeerd met een gist genomische bibliotheek. Kolonies werden gepatched op Ura- Leu- galactose agar en gespot om de toxiciteit te beoordelen. Plasmiden werden geïsoleerd van degenen die de toxiciteit van het Effector eiwit onderdrukken. Plasmiden werden heromgevormd tot de giftige gist stam om te bevestigen dat het geïsoleerde plasmide een suppressor is. Plasmiden van onderdrukkers werden gesequentieerd om de aanwezige gist ORFs te identificeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol schetst stapsgewijze procedures voor het identificeren van de gastheer biologische trajecten die zijn gericht door bacteriële Effector eiwitten met behulp van een gemodificeerde gist toxiciteit en suppressor scherm. De gebruikte gist stam, S. cerevisiae W303, is auxotrofische voor zowel uracil als leucine. Uracil auxotrophy van de stam wordt gebruikt om gist te selecteren die het eiwit van belangstelling draagt op de pYesNTA-kan vector, terwijl Leucine auxotrophy wordt gebruikt om te selecteren voor de gist genomische Library vector pYep13. De gist genomische Library plasmiden dragen 3 − 13 ORFS, dus elke ORF moet afzonderlijk worden gekloond in de P415-ADH Vector6 of een soortgelijke vector en hergetransformeerd in de giftige gist om te bepalen welke de echte suppressor is. Het is typerend om verschillende suppressors te identificeren die een gastheer biologisch traject vertegenwoordigen. Suppressors kunnen soms directe bindende partners zijn van het bacteriële eiwit van belang, maar niet altijd.

Het genereren van gist klonen met het bacteriële eiwit van belangstelling op pYesNTA-kan is de eerste belangrijke stap en grote zorg moet worden genomen om de integriteit van deze klonen zo snel mogelijk te behouden, omdat er sterke negatieve selectie voor gist dragen toxische eiwitten, zelfs zonder opzettelijke galactose-inductie, en ze kunnen het plasmide verliezen. Af en toe is er plasmide verlies, zelfs wanneer de gist wordt gehandhaafd onder selectie op dropout media. Een methode is eerder gemeld aan het verminderen van het optreden van plasmide verlies door lineairiseringsschakelingen de vector en integreren in de gist genoom1.

Een groot nadeel van deze technieken is dat het suppressor scherm alleen zinvolle gegevens oplevert als overexpressie van het bacteriële Effector eiwit een waarneembaar en consistent groei defect in gist veroorzaakt. De primaire moeilijkheid bij deze methode is wanneer geen suppressors worden geïdentificeerd. Het is moeilijk om te bepalen of het niet identificeren van suppressors te wijten is aan biologische redenen of technische problemen. Vanuit een biologisch perspectief kunnen er verschillende oorzaken zijn: het eiwit van belang kan zo giftig zijn dat eiwitten uit de genomische bibliotheek niet in staat zijn de toxiciteit significant te onderdrukken, het beoogde traject kan niet in staat zijn om te redden, of talrijke co-uitgedrukte Er kunnen factoren nodig zijn om het toxische effect te overwinnen. Het benaderen van de biologische uitleg is uitdagend, omdat er veel ongedefinieerde variabelen zijn om te dissect. Omdat er een vastgelegd protocol is, is het verkennen van technische uitleg een veel meer Tractable aanpak. Vanuit technisch oogpunt is het niet identificeren van suppressors waarschijnlijk het resultaat van een lage transformatie efficiëntie van de gist genomische bibliotheek. Dit protocol maakt gebruik van de ATCC S. cerevisiae AB320 gedeeltelijk verteerde genomische bibliotheek in pYEp13. Andere bibliotheken kunnen zowel voldoende als andere vectoren zijn, maar dit protocol maakt specifiek gebruik van de ATCC-bibliotheek en er zijn momenteel geen studies gepubliceerd die alternatieve bibliotheek-of vector bronnen rapporteren. Het wordt sterk aanbevolen dat de dekking van het gist genoom ten minste 10x is, of een ondervertegenwoordiging kan de identificatie van suppressors belemmeren. Een lagere transformatie-efficiëntie kan deze getallen onder 1x brengen. Zo kunnen delen van het gist genoom niet in het suppressor scherm worden weergegeven. Lage transformatie efficiëntie kan worden veroorzaakt door vele problemen, met inbegrip van slechte reagentia of slechte bibliotheek voorbereiding. Deze methode houdt zich grotendeels aan de DMSO/LiAc-transformatie methode die eerst door Hill et al.7wordt uiteengezet. Het wordt aanbevolen dat nieuwe DMSO, 50% PEG, en verse haring sperma DNA worden gekocht en voorbereid voor de transformaties en uitsluitend gebruikt voor deze testen te verminderen verontreiniging of afbraak van de kwaliteit van de reagentia. DMSO is zeer hygroscopisch en absorbeert direct water uit de atmosfeer. Daarom wordt het gebruik van veel individuele aliquots aanbevolen om herhaalde opening van de deksel van een container en blootstelling aan de atmosfeer te voorkomen. Hoge kwaliteit haring sperma DNA kan worden opgeslagen bij-20 °C en blijft geschikt voor gebruik voor meerdere jaren, hoewel een verse voorbereiding moet worden bereid uit de voorraad voor elke transformatie. Eenmaal gekookt en gekoeld, de haring sperma DNA mag niet worden hergekookt of hergebruikt, dus het is het beste om alleen te verwijderen wat nodig is en Vermijd het maken van meer dan nodig is voor de huidige transformatie. Aandacht voor detail kan de transformatie-efficiëntie van gist aanzienlijk verbeteren en de kans op het identificeren van een suppressor verbeteren.

Gezien het feit dat de gist pYep13 vector 3 − 13 verschillende gist Orf's draagt, is het verminderen van het aantal vals-positieve plasmiden van het allergrootste belang om suppressors te identificeren. Gist kan nemen en haven van meerdere kopieën van soortgelijke vectoren, overwegende dat de algemene wijsheid geassocieerd met plasmide onverenigbaarheid traditioneel dicleert dat E. coli slechts één type plasmide met dezelfde oorsprong van de replicatie (ori) tegelijk onderhoudt, Hoewel dit niet altijd het geval is. Dit kan een belangrijk probleem worden wanneer je probeert suppressor kandidaten te identificeren. Als suppressor gist klonen worden geïdentificeerd, zullen de plasmiden worden geëxtraheerd en omgevormd tot E. coli voor vermeerdering en opeenvolgende sequentiëren voor identificatie. Zodra de kandidaat-suppressor plasmide is geïsoleerd en omgezet in E. coli, wordt sterk aanbevolen dat ten minste vijf E. coli kolonies worden geplukt voor sequencing, omdat het mogelijk is dat individuele klonen verschillende plasmiden. Aangezien e. coli moet alleen kunnen propageren één plasmide op een tijdstip, als de gist isolatie meerdere plasmiden oplevert, verschillende E. coli klonen op de plaat moet slechts één van hen te dragen op een tijdstip. Daarom moet het plukken van vijf kolonies gebaseerd op normale transformatie-efficiëntie in E. coli laten zien of de klonen dezelfde of verschillende plasmiden dragen. Als er meerdere plasmiden ontstaan na het sequentiëren van de plasmiden uit E. coli, dan moet elk daarvan worden omgevormd tot de giftige gist kloon en worden beoordeeld op redding van het groei defect. Bovendien wordt, zelfs als er slechts één enkele suppressor plasmide wordt geïdentificeerd, voor een strengheid en reproduceerbaarheid hertransformatie van het plasmide in de giftige kloon aangemoedigd.

De gist suppressor assay is een zeer groot experiment en passende tijd en materialen moeten dienovereenkomstig worden gepland. Dit protocol bevat veel details die strikt moeten worden nageleefd en het wordt aanbevolen dat de onderzoeker die deze testen uitvoert, zorgvuldig leest en het protocol volledig bekijkt voordat een test wordt gestart. Dit is een multilaterale samen procedure met zowel bacteriën als gist die bij verschillende temperaturen geteeld moeten worden. Isolatie van plasmiden uit gist kan soms moeilijk zijn vanwege hun robuuste celwand en het gebruik van DMSO helpt een hogere transformatie-efficiëntie te bereiken.

Een van de grootste voordelen van de gist toxiciteit en suppressor scherm is dat de bacteriële Effector niet fysiek hoeft te binden aan de gastheer substraten voor een aanzienlijke hoeveelheid tijd voor het detecteren van de vermoedelijke traject gerichte. Slechts een klein handvol studies hebben gemeld met behulp van deze of een soortgelijke techniek1 – 5. Echter, er zijn meldingen van technieken die host trajecten en vele technieken om het scherm voor bindende partners van bacteriële Effector eiwitten identificeren. Kramer et al. rapporteerde een nieuwe systeembiologie benadering om trajecten te identificeren die zijn gericht op bacteriële Effector eiwitten8. De techniek gebruikt een haploïde verwijdering stam collectie van S. cerevisiae om te schermen voor mutanten gevoelig voor de Shigella Effector Osp4. Met behulp van deze techniek, Osp4 was gekoppeld aan de regulering van MAPK signalering en verzwakking van de aangeboren immuniteit in gastheer cellen. Op array gebaseerde, hoge doorvoer, geautomatiseerde gist-twee hybride schermen kunnen nu snel putterende bacteriële Effector bindende partners identificeren door velen tegelijkertijd te screenen tegen miljoenen host-eiwitten9. Evenzo worden immunoprecipitaties met hoge doorvoer in combinatie met massaspectrometrie gebruikt om putterende bindende partners van hele families van bacteriële Effector eiwitten10te identificeren. Hoewel veel van deze studies het tijdschema van Effector eiwit karakterisatie kunnen versnellen, bieden ze zelden inzicht in wat fysiologische processen worden gemanipuleerd en wat de holistische uitkomst van deze interacties zijn. Technieken zoals de gist toxiciteit en het suppressor scherm zijn dus essentieel voor het verlichten van de cellulaire processen die worden gemanipuleerd door deze Effector eiwitten. Op een bepaald moment, waarnemingen identificeren bindende partners of trajecten gericht door bacteriële Effector eiwitten moeten terugkeren naar cellulaire infectie modellen om te bepalen of deze in vitro bevindingen waar in fysiologisch relevante scenario's. Genetische manipulatie van verplicht intracellulaire pathogenen zoals C. trachomatis is een belangrijke hindernis geweest tot voor kort11 – 15 en het genereren van locatiespecifieke mutanten om Effector eiwitten te bestuderen was niet mogelijk. In de laatste paar jaar echter, een revolutie in het genereren van chlamydiale mutanten, aanvulling op hen, en het overdrukken van doelwit eiwitten heeft plaatsgevonden. Deze recente ontwikkelingen hebben de waarde van de informatie die is afgeleid van studies met behulp van toxiciteit en suppressor schermen aanzienlijk verbeterd, omdat het nu mogelijk is om rechtstreeks van gist naar infectie te gaan om de geldigheid van de resultaten te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

We danken Shelby Andersen, Abby McCullough en Laurel Woods voor hun hulp bij deze technieken. Deze studie werd gefinancierd door opstart fondsen van het departement van de Universiteit van Iowa van microbiologie en immunologie aan Mary M. Weber.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Fisher Scientific BP2641500
Galactose MilliporeSigma G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit ThermoFisher Scientific K0691
GeneJet PCR purification kit ThermoFisher Scientific K0701
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo K0503
Glucose MilliporeSigma G8270-1KG
Herring Sperm DNA Promega D1811
KpnI-HF New England Biolabs R3142S
Lithium acetate dihydrate MilliporeSigma L6883-250G
Peptone Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530
Poly(ethylene glycol) 3350 MilliporeSigma 1546547-1G
pYep13 ATCC 37323
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
Tryptophan MilliporeSigma 470031-1G
XhoI-HF New England Biolabs R0146S
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500
Yeast miniprep kit Zymo D2001
Yeast nitrogen base without amino acids MilliporeSigma Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1501-20G without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1771-20G without uracil, leucine, tryptophan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Tags

Genetica probleem 152 bacteriële Effector eiwit gist suppressor Effector eiwit functie gist schermen Chlamydia trachomatis type III uitgescheiden Effector eiwit pathway identificatie
Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faris, R., Weber, M. M.… More

Faris, R., Weber, M. M. Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens. J. Vis. Exp. (152), e60488, doi:10.3791/60488 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter