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Genetics

Identification des voies d'accueil ciblées par les protéines d'effetbactérieur à l'aide d'écrans de toxicité et de suppression de levures

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60488
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

Summary

Les agents pathogènes bactériens sécrètent des protéines dans l'hôte qui ciblent des processus biologiques cruciaux. L'identification des voies d'accueil ciblées par les protéines effecteurs bactériens est essentielle pour lutter contre la pathogénie moléculaire. Ici, une méthode utilisant un suppresseur modifié de levure et un écran de toxicité pour élucider des voies d'hôte visées par les protéines bactériennes toxiques d'effecteur est décrite.

Abstract

Les bactéries intracellulaires sécrètent des facteurs de virulence appelés protéines effectrices dans le cytosol hôte qui agissent pour subvertir les protéines hôtes et/ou leurs voies biologiques associées au profit de la bactérie. L'identification des protéines effectrices bactériennes présumées est devenue plus gérable en raison des progrès dans le séquençage du génome bactérien et de l'avènement d'algorithmes qui permettent dans l'identification silico des gènes codant les candidats à la sécrétion et/ou de l'eucaryote Domaines. Cependant, l'identification de ces facteurs importants de virulence n'est qu'une première étape. Naturellement, l'objectif est de déterminer la fonction moléculaire des protéines effectrices et d'élucider la façon dont elles interagissent avec l'hôte. Ces dernières années, des techniques comme l'écran bi-hybride de levure et les immunoprécipitations à grande échelle couplées à la spectrométrie de masse ont aidé à identifier les interactions protéine-protéine. Bien que l'identification d'un partenaire liant hôte soit la première étape cruciale vers l'élucidation de la fonction moléculaire d'une protéine effectrice bactérienne, parfois la protéine hôte présente de multiples fonctions biologiques (p. ex. actine, clathrine, tubuline) ou la protéine bactérienne peut ne pas lier physiquement les protéines de l'hôte, privant le chercheur d'informations cruciales sur la voie précise de l'hôte manipulée. Un écran modifié de toxicité de levure couplé avec un écran de suppresseur a été adapté pour identifier des voies d'hôte impactées par les protéines d'effecteur bactérien. L'écran de toxicité repose sur un effet toxique dans la levure causé par la protéine effecteur interférer avec les voies biologiques de l'hôte, qui se manifeste souvent comme un défaut de croissance. L'expression d'une bibliothèque génomique de levure est employée pour identifier des facteurs d'hôte qui suppriment la toxicité de la protéine d'effecteur bactérien et identifient ainsi des protéines dans la voie que la protéine effectrice cible. Ce protocole contient des instructions détaillées pour les écrans de toxicité et de suppresseur. Ces techniques peuvent être réalisées dans n'importe quel laboratoire capable de clonage moléculaire et la culture de levure et Escherichia coli.

Introduction

Le premier rapport de procédures similaires à ceux présentés ici caractérisait l'effecteur de type IV de Legionella pneumophila SidD, un deAMPylase qui modifie Rab11. Des techniques comparables ont été utilisées pour la caractérisation de plusieurs effecteurs de L. pneumophila 1,2,3. L'assay a été adapté pour caractériser une Coxiella burnetii type IV effector protéine4, et récemment l'utilité de cette technique a été élargie pour la caractérisation des protéines de membrane d'inclusion chlamydia trachomatis 5 .

Ce protocole peut être divisé en deux parties principales : 1) l'écran de toxicité de levure, dans lequel la protéine d'effetur bactérien d'intérêt est exprimée dans la levure et les clones sont examinés pour un phénotype toxique comme démontré par un défaut de croissance, et 2) l'écran de suppression de levure , dans lequel le phénotype toxique est supprimé par l'expression d'une bibliothèque génomique de levure dans la souche toxique. Ainsi, l'écran de toxicité est un écran pour les phénotypes toxiques qui se manifestent comme des défauts de croissance lorsque l'effecteur bactérien d'intérêt est surexprimé. Les clones toxiques, transformés avec succès avec et exprimant l'effecteur bactérien, sont sélectionnés et sauvegardés pour l'étape suivante. La deuxième étape majeure consiste à surexprimer une bibliothèque génomique de levure partiellement digérée dans le clone de levure toxique. Les plasmides constituant la bibliothèque génomique de levure suggérée pour l'utilisation dans ce protocole portent des inserts de 5 à 20 kb, correspondant habituellement à des cadres de lecture ouverts à 3 à 13 levures (ORF) d'une taille moyenne de gène de 1,5 kb sur tous les plasmides, représentant l'ensemble du génome couvert de levures environ 10x. Cette partie de l'assay est appelée l'écran suppresseur, comme le but est de supprimer la toxicité de la protéine effectrice bactérienne. Les plasmides suppresseurs potentiels sont isolés de la levure, séquencés, et les ORF sépilleurs identifiés. La raison d'être de l'écran suppresseur est que la protéine effectrice lie, interagit avec, et / ou submerge les composants de la voie hôte qu'il cible, et que fournir ces protéines hôtes en excès peut sauver l'effet toxique sur la voie et donc, le défaut de croissance. Ainsi, les ORF identifiés qui suppriment la toxicité représentent souvent plusieurs participants d'une voie d'hôte. Des expériences orthogonales sont ensuite effectuées pour vérifier que l'effecteur bactérien interagit en effet avec la voie impliquée. Ceci est particulièrement nécessaire si un partenaire liant tel que la clathrine ou l'actine a été identifié, parce que ces protéines sont impliquées dans une multitude de processus hôtes. D'autres expériences peuvent alors élucider la fonction physiologique de la protéine effectrice pendant l'infection. La toxicité et les écrans suppresseurs sont également de puissants outils pour déchiffrer la fonction physiologique des protéines effectrices bactériennes qui ne lient pas physiquement les protéines hôtes avec des affinités suffisantes pour détecter par immunoprécipitation ou qui interagissent avec le hôte dans les interactions hit-and-run enzymatiques qui peuvent ne pas être détectées par un écran hybride de levure-deux.

Bien que l'écran suppresseur puisse être une méthode puissante pour révéler les interactions physiologiques potentielles entre les protéines d'effecteur bactérien et les voies d'hôte, la protéine d'effecteur bactérien doit induire un défaut de croissance dans la levure, autrement l'utilisant dans le l'écran suppresseur sera de peu d'utilité. En outre, le phénotype toxique doit entraîner au moins un déficit de croissance de 2 à 3 log10, sinon il sera difficile d'identifier les suppresseurs. Si un laboratoire est mis en place pour la culture cellulaire, les protéines effecteurs de dépistage de la toxicité dans les lignées cellulaires communes telles que HeLa peut souvent donner un aperçu de savoir si elle vaut la peine de procéder à l'écran de toxicité de levure. L'expression ectopique de la protéine effectrice dans les cellules HeLa entraîne parfois une toxicité qui est très fortement corrélée avec la toxicité de la souche de levure utilisée pour ces écrans4. Les caractéristiques observables du stress dans les cellules HeLa comprennent la perte de fibres de stress, le détachement cellulaire de la plaque et la condensation nucléaire indiquant l'apoptose. Toute indication visuelle de stress dans les cellules HeLa font de la protéine d'intérêt un bon candidat pour induire un défaut de croissance dans la levure, qui se répliquent beaucoup plus rapidement et sont donc plus sensibles à la perturbation des voies essentielles.

Il convient de noter que l'écran suppresseur n'identifie pas toujours les partenaires liant l'hôte comme des suppresseurs, mais il peut toujours impliquer des composants critiques de la voie hôte (s) ciblée, donnant une vue holistique des processus biologiques détournés par le protéine effecteur bactérienne. À première vue, cela semble contre-intuitif, car on s'attendrait à ce que le fait de fournir le partenaire de liaison de la protéine effecteur en excès sauve le défaut de croissance. Dans les efforts visant à identifier les voies ciblées par la protéine C. trachomatis effector CT229 (CpoS), qui se lie à au moins 10 Rab GTPases différents pendant l'infection5, aucun des partenaires de liaison Rab supprimé la toxicité de CT229. Cependant, de nombreux suppresseurs impliqués dans le trafic de vésicule enduite de clathrine (CCV) ont été identifiés, ce qui a conduit à d'autres travaux démontrant que CT229 subvertit spécifiquement le trafic de CCV dépendant de Rab. De même, lors de l'étude de la protéine effectrice C. burnetii Cbu0041 (CirA) plusieurs Rho GTPases qui ont sauvé le défaut de croissance de levure ont été identifiés, et il a été plus tard constaté que CirA fonctionne comme une protéine d'activation GTPase (GAP) pour RhoA4.

L'utilité de l'écran suppresseur de levure pour élucider des voies d'hôte visées par des protéines d'effecteur bactérienne ne peut pas être surestimée, et d'autres chercheurs essayant de caractériser les protéines d'effecteur bactérien intracellulaire peuvent grandement bénéficier de ces techniques. Ces essais sont de valeur si les immunoprécipitations et/ou les écrans hybrides de levure-deux n'ont pas réussi à trouver un partenaire liant et peuvent élucider quelles voies sont visées par la protéine d'effecteur bactérien. Ici, des protocoles détaillés pour la toxicité et les écrans suppresseurs pour identifier les voies biologiques d'hôte visées par les protéines d'effecteur bactérien intracellulaire sont fournis, aussi bien que quelques-uns des obstacles communs éprouvés en utilisant ces essais et leur solutions correspondantes.

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Protocol

1. Préparation des médias et des réactifs

REMARQUE: Les assiettes doivent être préparées avant le jour de l'assidu et sont bonnes pour 1 mois. Les médias et les réactifs peuvent être faits à tout moment et sont bons pour 1 mois.

  1. Préparer 1 L de la solution de glucose (10 % w/v) en dissolvant 100 g de D-()-glucose dans 800 ml d'eau distillée dans un bécher de 1 000 ml. Ajuster le volume à 1 L avec de l'eau distillée. Filtrer à travers un filtre stérile de 0,2 m dans une bouteille stérile de stockage multimédia de 1 L.
  2. Préparer 1 L de la solution galactose (10% w/v) en dissolvant 100 g de D-(MD)- galactose dans 800 ml d'eau distillée dans un bécher de 1 L. Ajuster le volume à 1 ml à l'aide d'eau distillée et filtrer à travers un filtre stérile de 0,2 m dans une bouteille stérile de stockage multimédia de 1 000 ml.
  3. Préparer 1 L d'extrait de levure peptone dextrose (YPD) agar en dissolvant 10 g d'extrait de levure, 20 g de peptone, 20 g de glucose, et 20 g d'agar dans 1000 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce qu'il soit refroidi. Verser dans des plaques de 100 mm à l'aide d'un support de 20 ml par assiette.
  4. Préparer 1 L de bouillon de YPD en dissolvant 10 g d'extrait de levure, 20 g de peptone et 20 g de glucose dans 1 000 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min.
  5. Préparer l'uracil synthétique (SD) (Ura-) glucose agar. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de base d'azote de levure sans acides aminés, 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil, et 15 g d'agar dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 à 60 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de glucose préparée à l'étape 1.1. Bien mélanger en remuant doucement ou déposer sur une plaque à remuer. Verser dans des plaques de 100 mm à l'aide d'un support de 20 ml par assiette.
  6. Préparer l'uracil synthétique (SD) (Ura-) galactose agar. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de base d'azote de levure sans acides aminés, 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil, et 15 g d'agar dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 à 60 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de galactose préparée à l'étape 1.2. Bien mélanger en remuant doucement ou déposer sur la plaque à remuer. Verser dans des plaques de 100 mm à l'aide d'un support de 20 ml par assiette.
  7. Préparer le bouillon d'uracil synthétique (SD) (Ura-) glucose. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de base d'azote de levure sans acides aminés et 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 à 60 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de glucose préparée à l'étape 1.1.
  8. Préparer l'uracil synthétique (SD) (Ura-) leucine (Leu-) glucose agar. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de la base d'azote de levure sans acides aminés; 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil, leucine, et tryptophane ; 15 g d'agar; et 0,076 g de tryptophane dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 à 60 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de glucose préparée à l'étape 1.1. Verser dans des plaques de 100 mm à l'aide d'un support de 20 ml par assiette.
  9. Préparer l'uracil synthétique (SD) (Ura-) leucine (Leu-) galactose agar. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de base d'azote de levure sans acides aminés; 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil, leucine, et tryptophane ; 15 g d'agar; et 0,076 g de tryptophane dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 à 60 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de galactose préparée à l'étape 1.2. Bien mélanger en remuant doucement ou en les plaçant sur une plaque à remuer. Verser dans des plaques de 100 mm à l'aide d'un support de 20 ml par assiette.
  10. Préparer le bouillon synthétique d'uracil (Ura-) leucine (Leu-) glucose. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de base d'azote de levure sans acides aminés; 1,9 g de supplément de décrochage sans uracil, leucine, tryptophane; et 0,076 g de tryptophane dans 800 ml d'eau distillée. Autoclave pendant 20 min et laisser refroidir dans un bain d'eau de 56 à 60 oC jusqu'à ce que la température soit de 50 oC. À l'aide d'une pipette sérologique de 50 ml ou d'un cylindre gradué stérile, ajoutez 200 ml de la solution de glucose préparée à l'étape 1.1.
  11. Préparer la solution de polyéthylène glycol (PEG). Ajouter 50% w/v de polyéthylène glycol 3350 dans de l'eau distillée. Stériliser en autoclant.
  12. Préparer 1 M d'acétate de lithium (LiAc) en dissolvant 10,2 g de déshydratation d'acétate de lithium dans 200 ml d'eau distillée. Stériliser en autoclant.
  13. Préparer l'ADN du sperme de hareng. Diluer 10 mg/mL d'ADN de sperme de hareng à 2 mg/mL à l'aide d'eau distillée. Chauffer à 100 oC pendant 5 min et placer immédiatement sur la glace pendant 5 min.

2. Clonage du gène d'intérêt dans le plasmique plasmique pYesNTA-Kan

REMARQUE : À l'heure actuelle, il existe une variété de vecteurs de toxicité des levures disponibles à la fois sur le plan commercial et académique. L'écran suppresseur de levure peut être utilisé en conjonction avec un grand nombre de ces vecteurs à condition que le plasmide exprimant la protéine effectrice d'intérêt utilise une sélection de décrocheurs autres que l'uracil et un marqueur antibiotique autre que BlaR. Ce travail a utilisé un vecteur pYesNTA modifié4,5 qui comprend une cassette de résistance à la kanamycine pour faciliter le dépistage des suppresseurs potentiels. Le système de clonage doit permettre à la protéine effecteur d'être dans le cadre avec le promoteur Gal et His-Tag. La protéine de membrane d'inclusion de Chlamydia trachomatis CT229 a été employée comme preuve de principe pour ces essais.

  1. Utilisez PCR pour amplifier cT229 à partir de l'ADN génomique c. trachomatis suivant les instructions du fabricant à l'aide des amorces CT229 no 1 Kpn F (CCGGTACCAATGAGCTTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) et CT229 XhoI R (CCCTCGAGTTTTTTACGACGGGAT. Utilisez les conditions PCR suivantes : (1) 98 oC pour 30 s; (2) 98 oC pour 10 s, 55 oC pour 30 s, 72 oC pour 2 min; (3) répéter l'étape 2 pour un total de 25x; (4) 72 oC pendant 10 min; et (5) 4 oC.
  2. Analyser 5 ll du produit PCR sur un gel agarose de 1 % (Figure 1).
  3. Purifier les 45 l'reste d'ADN à l'aide d'un kit de purification PCR suivant les instructions du fabricant.
  4. Diglesez les 50 OL d'insertion purifiée de PCR et de pYesNTA-Kan (Figure 2) pendant 1 h à 37 oC dans un bain d'eau à l'aide de KpnI-HF et XhoI-HF.
    REMARQUE : Pour le pYesNTA-Kan, digérez 5 g de plasmide à l'aide de 5 l de KpnI-HF, de 5 oL de XhoI-HF et de 6 oL de tampon dans un volume total de 60 l. Pour l'insertion, digérez l'ensemble des 50 L de produit PCR purifié à l'aide de 2 l de KpnI-HF, 2 'L de XhoI-HF, et 6 'L de tampon.
  5. Exécuter l'ensemble du plasmide digérer sur un gel d'agarose 1%. Effectuer la purification du plasmide digéré à l'aide d'un kit d'extraction de gel suivant les instructions du fabricant.
  6. Purifez l'insert PCR digéré à l'aide d'un kit de purification PCR suivant les instructions du fabricant.
  7. Clonez l'insert dans pYesNTA-Kan à l'aide de 2 l de pYesNTA-Kan (étape 2.5), de 2 l de tampon de ligase d'ADN, de 1 l de ligase T4 et de 15 l d'insert (étape 2.6). Incuber à température ambiante pendant 1 h.
  8. Ajoutez toute la réaction de clonage à 50 l de cellules compétentes en E. coli et effectuez la réaction de transformation.
  9. Plaquer toute la réaction de transformation sur une plaque LB contenant 100 g/mL de carbenicilline.
  10. Inoculer 10 ml de LB contenant 100 g/mL de carbenicilline avec trois colonies individuelles. Incuber toute la nuit à 37 oC en secouant à 150 tr/min.
  11. Isolez le plasmide à l'aide d'un kit de miniprep plasmien suivant les instructions du fabricant.
  12. Séquencez les plasmides isolés à l'aide d'amorces spécifiques aux gènes (étape 2.1).

3. Testez la protéine d'intérêt pour la toxicité dans la levure

  1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 sur yPD agar (étape 1.3) pour obtenir des colonies isolées. Incuber à 30 oC pendant 24 h.
  2. Inoculer 10 ml de bouillon de YPD (étape 1.4) avec une seule colonie de la plaque d'agar (étape 3.1). Incuber à 30 oC en secouant à 150 tr/min pendant la nuit.
  3. Ajouter 0,5 ml de la culture de la nuit à 10 ml de bouillon de YPD (étape 1,4) et incuber à 30 oC en secouant à 150 tr/min pendant 4 h.
    1. Pelleter les 10 ml de culture à 3 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
    2. Resuspendre le granule dans 1 ml d'eau stérile, transférer dans le tube de microcentrifuge et granuler à 3 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
    3. Resuspendre la pastille dans 1 ml d'acétate de lithium de 1 mm (LiAc) et la granule à 3 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
    4. Répéter le lavage LiAc 2x.
    5. Retirez le lavage. Resuspendre la pastille dans 2,4 ml de 50% PEG 3350. Ajouter 360 l de 1M LiAc, 500 oL de 2 mg/mL d'ADN de sperme de hareng, et 400 l d'eau stérile.
      REMARQUE : C'est suffisant pour 20 transformations.
    6. Ajouter 180 L du mélange de transformation de l'étape 3.3.5 à un tube de microcentrifuge contenant 5 'L de pYesNTA-Kan CT229 plasmid ADN (100-500 ng) à partir de l'étape 2.12.
    7. Incuber dans un bain d'eau à 30 oC pendant 30 min.
    8. Incuber dans un bain d'eau à 42 oC pendant 30 min.
    9. Pelleter à 3 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
    10. Retirez le mélange de transformation avec la pipette. Resuspendre la pastille dans 100 l'eau stérile. Plaquer la transformation sur SD Ura- agar avec glucose (étape 1.5).
    11. Incuber les assiettes à 30 oC pendant 48 h.
  4. Inoculer 5 ml de SD Ura- bouillon contenant du glucose (étape 1.7) avec une seule colonie de l'assiette. Incuber toute la nuit à 30 oC en secouant à 150 tr/min. Inclure la levure transformée avec le vecteur seul comme un contrôle négatif.
    1. Ajouter 180 l'eau stérile à 5 puits d'une plaque de puits de 96 (A2-A6).
    2. Vortex la culture du jour au lendemain à mélanger.
    3. Ajouter 180 l de levure au premier puits (A1). Diluer en série 1:10 (six échantillons au total, y compris non dilués).
    4. À l'aide d'une pipette multicanal, placez 5 ll de chaque dilution sur SD Ura- glucose (étape 1.5) et Ura- galactose (étape 1.6) plaques d'agar. Incuber à 30 oC pendant 48 h.
  5. Évaluez la toxicité en comparant la croissance de la levure exprimant la protéine effecteur d'intérêt cultivée sur les médias contenant du galactose à la croissance de la levure exprimant le vecteur seul.
  6. Confirmez l'expression de la protéine de fusion His-tag par le ballonnement occidental.

4. Transformez la levure toxique avec la bibliothèque génomique de levure

  1. Inoculer 100 ml de SD Ura- bouillon de glucose (étape 1,7) en utilisant 1 ml du bouillon à partir de l'étape 3.4. Incuber de 16 à 24 h à 30 oC en secouant à 150 tr/min. Placer 900 ml de SD Ura- bouillon de glucose à 30 oC pendant la nuit pour prémouréchauffer les milieux.
  2. Ajouter l'ensemble des 100 ml de la culture de la nuit au flacon préchauffé de 1 L. Incuber de 4 à 5 h à 30 oC en secouant à 150 tr/min.
    1. Pelleter la culture à 6 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
    2. Jetez le supernatant. Resuspendre la pastille dans 250 ml d'eau stérile. Pelleter la culture à 6 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
    3. Jetez le supernatant. Resuspendre la pastille dans 250 ml de 1 mM De LiAc. Pelleter la culture à 6 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
    4. Retirez LiAc et suspendez la pastille dans 9,6 ml de 50% PEG 3350. Ajouter 1,44 ml de 1 M LiAc, 2 ml d'ADN de sperme de hareng de 2 mg/mL, 50 g de la bibliothèque génomique pYep13 (ATCC 37323). Ajuster le volume à 15 ml avec de l'eau stérile. Mélanger délicatement par inversion.
    5. Incuber dans un bain d'eau à 30 oC pendant 30 min.
    6. Ajouter 750 l de sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour améliorer l'efficacité de la transformation. Incuber dans un bain d'eau à 42 oC pendant 30 min. Mélanger par une légère inversion toutes les 10 min.
    7. Pelleter la levure à 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
    8. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 10 ml d'eau stérile. Pelleter à 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
    9. Suspendre la pastille dans 8 ml d'eau stérile.
    10. Pour déterminer l'efficacité de la transformation, diluer 1:10 et la plaque 100 'L de chaque dilution sur SD Ura- Leu- glucose agar (étape 1.8).
    11. Plaque 200 ll de l'échantillon sur les plaques SD Ura- Leu- galactose agar (étape 1.9). Utilisez 50 plaques au total.
    12. Incuber à 30 oC pendant 48 à 96 h ou jusqu'à l'apparition des colonies.
      REMARQUE : Les colonies apparaissent généralement sur les plaques d'agar de glucose à 48-72 h et les plaques d'agar de galactose à 72-96 h.
  3. Patch colonies (sauvetages potentiels) sur SD Ura- Leu- galactose agar (étape 1.9) pour étendre et faire des stocks. Incuber à 30 oC pour 24 à 48 h.
  4. Inoculer 5 ml de SD Ura- Leu- bouillon de glucose (étape 1.10) en utilisant la partie du patch. Incuber toute la nuit à 26 oC en secouant à 150 tr/min.
    1. Ajouter 180 l'eau stérile à 5 puits d'une plaque de puits de 96 (A2-A6).
    2. Vortex la culture du jour au lendemain à mélanger.
    3. Ajouter 180 l de levure au premier puits (A1). Diluer en série 1:10 (six échantillons au total, y compris non dilués).
    4. À l'aide d'une pipette multicanal, repérer 5 'L de chaque dilution sur SD Ura- glucose et SD Ura- plaques d'agar galactose. Inclure l'effecteur toxique seul comme un contrôle.
    5. Incuber à 30 oC pendant 48 h.
  5. Comparez la croissance de la levure exprimant l'effecteur toxique seul à la levure contenant les suppresseurs potentiels. Ne procéder qu'avec les suppresseurs potentiels qui ont diminué la toxicité par rapport à la levure exprimant l'effecteur seul.

5. Identifier et confirmer les suppresseurs

  1. Inoculer 5 ml de SD Ura- Leu- bouillon de glucose (étape 1,10) avec 100 l de levure à partir de l'étape 4.4 et incuber toute la nuit à 30 oC avec des secousses à 150 tr/min.
    1. Pelleter la levure à 3 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Jetez délicatement le supernatant à l'aide d'une pipette.
    2. Isolez le plasmide avec un kit de miniprep plasmique de levure suivant les instructions du fabricant.
  2. Transformez le plasmide isolé en cellules compétentes e. coli et plaquez toute la transformation sur l'agar LB avec 100 g/mL de carbenicilline. Incuber à 37 oC pendant 24 h.
  3. Inoculer 10 ml de bouillon LB contenant 100 g/mL de carbenicilline, avec trois colonies de l'assiette et incuber à 37 oC pendant la nuit en secouant à 150 tr/min.
    1. Cultures de pellets à 3 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Isolez le plasmide à l'aide d'un kit de miniprep suivant les instructions du fabricant.
  4. Retransformez la levure toxique avec les plasmides isolés de l'étape 5.3.1 suivant les étapes de la partie 3 du protocole.
    1. Inoculer 5 ml de SD Ura- Leu- bouillon de glucose avec une colonie de la plaque de transformation. Incuber toute la nuit à 30 oC en secouant à 150 tr/min.
    2. Spot sur Ura- Leu- glucose et galactose agar pour confirmer la suppression de la toxicité.
  5. Séquence utilisant des amorces pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) et pYep13 R (TGATGCCGGCCACGATGC) pour identifier les ORF àlevures.

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Representative Results

Avant que l'écran de suppression de levure réel puisse être exécuté, la protéine d'effeteur d'intérêt doit être examinée pour la toxicité dans la levure. Ceci est accompli en exprimant la protéine d'intérêt pour la levure sous le contrôle d'un promoteur galactose-inductible. La croissance du glucose (conditions non induisantes) doit d'abord être comparée pour s'assurer que la toxicité est spécifiquement due à l'expression de la protéine d'intérêt et n'est pas un défaut général. Comme le montre la figure 3,la toxicité se manifeste par des colonies plus petites et/ou une croissance réduite. Une diminution de 2/3 de notation dans la croissance de levure est idéale pour les écrans de suppresseur de levure.

Comme le montre la figure 4, la toxicité et l'écran suppresseur peuvent être réalisés en huit étapes en utilisant les méthodes décrites dans la section protocole. Le gène d'intérêt est cloné dans un vecteur approprié1, et les constructions résultantes sont transformées en levure pour évaluer la toxicité. Cette étude a utilisé CT229 comme gène d'intérêt et pYesNTA-Kan comme vecteur. En outre, l'expression de la protéine de fusion His-tagged a été confirmée par le ballonnement occidental. Idéalement, il faut observer une réduction de 2 à 3 du nombre de levures cultivées sur des supports contenant du galactose. Si la protéine d'intérêt est toxique pour la levure (Figure 3 et Figure 4), l'écran suppresseur peut être effectué en transformant la souche toxique avec la bibliothèque génomique de levure pYep13. Les transformateurs sont plaqués sur l'agar de glucose pour déterminer l'efficacité de transformation et l'agar de galactose pour identifier les suppresseurs potentiels. Grâce à ce protocole, une efficacité de transformation minimale de 5 x 105 a été atteinte avec un total de 10 à 250 colonies sur l'agar galactose. Patching ces colonies sur SD Ura- Leu- galactose agar (Figure 4) aidé à l'identification de vrais suppresseurs, parce que de nombreux faux positifs ne se développera pas lorsqu'il est patché. Ici, 50 colonies ont été patchées et huit clones qui ont supprimé la toxicité de l'effecteur ont été obtenus (figure 4). Repérer les suppresseurs sur SD Ura- Leu- galactose a été fait pour confirmer la suppression de la toxicité. Comme le montre la figure 4,le pSup1 et le pSup 2 ont supprimé la toxicité de la protéine effecteur, alors que pSup3 ne l'a pas fait. Par conséquent, pSup3 a été jeté. Les plasmides ont ensuite été isolés des suppresseurs et transformés en E. coli pour augmenter le rendement du plasmide. Le plasmide peut alors être retransformé en levure toxique pour confirmer que le plasmide isolé supprime définitivement la toxicité effectrice (Figure 4). Tandis que la plupart des plasmides isolés devraient sauver la toxicité, de temps en temps un plasmide qui ne supprime pas la toxicité une fois reconverti en souche toxique de levure est obtenu. Ces plasmides sont jetés, et seuls ceux qui suppriment la toxicité après la retransformation doivent être séquencés.

Le plasmide isolé contiendra plusieurs ORF de levure4. Pour identifier qui est le véritable suppresseur, chaque ORF peut être individuellement cloné et exprimé dans la souche de levure toxique comme précédemment décrit1,2,3,4.

Figure 1
Figure 1 : Amplification pcR du gène cible. CT229 de Chlamydia trachomatis serovar L2 a été PCR amplifié à partir de l'ADN génomique. Les produits de PCR ont été analysés sur un gel d'agarose de 1% souillé avec le bromure d'ethidium. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : carte pYesNTA-Kan plasmide. Le gène cible d'intérêt a été cloné dans le site de clonage multiple (MCS) de pYesNTA-Kan. Kanamycin a été utilisé pour la sélection dans E. coli et le décrochage uracil a été utilisé pour la sélection dans S. cerevisiae. L'expression de la protéine de fusion his-tagged a été vérifiée par le ballonnement occidental. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Résultats représentatifs de la toxicité des levures. Les protéines effectrices d'intérêt ont été clonées en pYesNTA-Kan. Les plasmides vérifiés par séquence ont été transformés en S. cerevisiae et les transformateurs ont été dilués en série et repérés sur Ura- glucose et agar galactose pour évaluer la toxicité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Aperçu de l'écran suppresseur de levure. Le gène cible d'intérêt a été cloné en pYesNTA-Kan et les plasmides ont été transformés en S. cerevisiae. Les transformateurs ont été dilués en série et repérés sur Ura- glucose et agar galactose pour évaluer la toxicité. Pour identifier la voie visée par la protéine d'effeteur toxique, la souche de levure exprimant la protéine toxique a été transformée avec une bibliothèque génomique de levure. Les colonies ont été patchées sur Ura- Leu- galactose agar et repéré pour évaluer la toxicité. Les plasmides ont été isolés de ceux qui suppriment la toxicité de la protéine effectrice. Les plasmides ont été retransformés en souche de levure toxique pour confirmer que le plasmide isolé est un suppresseur. Des Plasmides des suppresseurs ont été séquencés pour identifier les ORFde de levure présents. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ce protocole décrit les procédures étape par étape pour identifier les voies biologiques hôtes ciblées par les protéines effectrices bactériennes à l'aide d'une toxicité de levure modifiée et d'un écran suppresseur. La souche de levure utilisée, S. cerevisiae W303, est auxotrophique à la fois pour l'uracil et la leucine. Uracil auotrophy de la souche est utilisé pour sélectionner la levure portant la protéine d'intérêt sur le vecteur pYesNTA-Kan tandis que la leucine auotrophy est utilisé pour sélectionner pour la bibliothèque de levure vecteur génomique pYep13. Les plasmides de bibliothèque génomique de levure portent 3-13 ORFs, ainsi chaque ORF devrait être individuellement cloné dans le vecteur p415-ADH6 ou un vecteur semblable et retransformé en levure toxique pour identifier qui est le vrai suppresseur. Il est typique d'identifier plusieurs suppresseurs représentant une voie biologique hôte. Les suppresseurs peuvent parfois être des partenaires de liaison directes de la protéine bactérienne d'intérêt, mais pas toujours.

Générer des clones de levure portant la protéine bactérienne d'intérêt sur pYesNTA-Kan est la première étape majeure et un grand soin doit être pris pour préserver l'intégrité de ces clones dès que possible parce qu'il ya une forte sélection négative pour la levure transportant toxiques protéines, même sans induction intentionnelle de galactose, et ils peuvent perdre le plasmide. De temps en temps il y a perte de plasmide même quand la levure est maintenue sous la sélection sur des médias d'abandon. Une méthode a été précédemment rapportée pour diminuer l'occurrence de la perte de plasmide en linéarisant le vecteur et en l'intégrant dans le génome de levure1.

Un inconvénient majeur de ces techniques est que l'écran suppresseur ne donne des données significatives que si la surexpression de la protéine effectrice bactérienne déclenche un défaut de croissance observable et constant dans la levure. La principale difficulté de cette méthode est lorsqu'aucun suppresseur n'est identifié. Il est difficile de déterminer si l'omission d'identifier les suppresseurs est due à des raisons biologiques ou des problèmes techniques. D'un point de vue biologique, il pourrait y avoir plusieurs causes : la protéine d'intérêt pourrait être si toxique que les protéines de la bibliothèque génomique ne sont pas en mesure de supprimer de manière significative la toxicité, la voie ciblée peut être incapable de sauvetage, ou de nombreux co-exprimés facteurs peuvent être nécessaires pour surmonter l'effet toxique. L'approche de l'explication biologique est difficile, car il existe de nombreuses variables indéfinies à disséquer. Parce qu'il existe un protocole établi, l'exploration des explications techniques est une approche beaucoup plus traitable. D'un point de vue technique, l'incapacité d'identifier les suppresseurs est probablement le résultat d'une faible efficacité de transformation de la bibliothèque génomique de levure. Ce protocole utilise la bibliothèque génomique partiellement digérée ATCC S. cerevisiae AB320 en pYEp13. D'autres bibliothèques peuvent être suffisantes ainsi que d'autres vecteurs, mais ce protocole utilise spécifiquement la bibliothèque ATCC et il n'y a pas d'études actuellement publiées qui signalent d'autres sources de bibliothèque ou vectorielles. Il est fortement recommandé que la couverture du génome de levure devrait être au moins 10x, ou la sous-représentation peut entraver l'identification des suppresseurs. Une diminution de l'efficacité de transformation peut ramener ces nombres sous 1x. Ainsi, certaines parties du génome de la levure peuvent ne pas être représentées dans l'écran suppresseur. Une faible efficacité de transformation peut être due à de nombreux problèmes, y compris de mauvais réactifs ou une mauvaise préparation de la bibliothèque. Cette méthode adhère largement à la méthode de transformation DMSO/LiAc d'abord mise de l'avant par Hill et al.7. Il est recommandé que le nouveau DMSO, 50% PEG, et l'ADN frais de sperme de hareng soient achetés et préparés pour les transformations et utilisés exclusivement pour ces essais pour diminuer la contamination ou la dégradation de la qualité des réactifs. DMSO est très hygroscopique et absorbe l'eau de l'atmosphère facilement. Par conséquent, il est recommandé d'utiliser de nombreux aliquots pour éviter l'ouverture répétée du couvercle d'un contenant et l'exposition à l'atmosphère. L'ADN de sperme de hareng de haute qualité peut être stocké à -20 oC et reste apte à être utilisé pendant plusieurs années, bien qu'une nouvelle préparation doit être préparée à partir du stock pour chaque transformation. Une fois bouilli et refroidi, l'ADN du sperme de hareng ne doit pas être reboiled ou réutilisé, il est donc préférable de seulement enlever ce qui est nécessaire et éviter de faire plus que nécessaire pour la transformation actuelle. L'attention aux détails peut grandement améliorer l'efficacité de transformation de la levure et améliorer les chances d'identifier un suppresseur.

Considérant que le vecteur pYep13 de levure porte 3-13 ORFs différents de levure, réduisant le nombre de plasmides faux-positifs est primordial pour identifier des suppresseurs. La levure peut prendre et héberger plusieurs copies de vecteurs similaires, alors que la sagesse générale associée à l'incompatibilité plasmide dicte traditionnellement que E. coli ne maintient qu'un seul type de plasmide avec la même origine de réplication (ORI) à la fois, même si ce n'est pas toujours le cas. Cela peut devenir un problème majeur lorsque vous tentez d'identifier les candidats suppresseurs. Si des clones de levure suppresseur sont identifiés, les plasmides seront extraits et retransformés en E. coli pour la propagation et le séquençage ultérieur pour identification. Une fois que le plasmide suppresseur candidat a été isolé et transformé en E. coli, il est fortement recommandé qu'au moins cinq colonies d'E. coli soient cueillies pour le séquençage, car il est possible que des clones individuels transportent plasmides différents. Étant donné que la bactérie E. coli ne devrait être en mesure de propager qu'un plasmide à la fois, si l'isolement des levures produit plusieurs plasmides, différents clones d'E. coli sur la plaque ne devraient en transporter qu'un seul à la fois. Par conséquent, la sélection de cinq colonies en fonction de l'efficacité normale de la transformation chez E. coli devrait indiquer si les clones transportent les mêmes plasmides ou différents. Si plusieurs plasmides surgissent après le séquençage des plasmides de E. coli,alors chacun devrait être transformé en clone de levure toxique et évalué pour le sauvetage du défaut de croissance. En outre, même si un seul plasmide suppresseur est identifié, pour la retransformation de rigueur et de reproductibilité du plasmide dans le clone toxique est encouragée.

L'analyse suppresseur de levure est une expérience très grande et le temps approprié et les matériaux devraient être planifiés en conséquence. Ce protocole contient de nombreux détails qui doivent être respectés strictement et il est recommandé que le chercheur effectuant ces essais attentivement lire et regarder le protocole dans son intégralité avant de commencer un analyse. Il s'agit d'une procédure multipartite comprenant à la fois les bactéries et les levures qui doivent être cultivées à des températures différentes. L'isolement des plasmides de levure peut parfois être difficile en raison de leur paroi cellulaire dure et l'utilisation de DMSO aide à atteindre une plus grande efficacité de transformation.

Un des plus grands avantages de la toxicité de levure et de l'écran suppresseur est que l'effecteur bactérien n'a pas besoin de se lier physiquement aux substrats d'hôte pour n'importe quelle quantité appréciable de temps pour détecter la voie putative visée. Seule une petite poignée d'études ont rapporté l'utilisation de cette technique ou d'une technique similaire1 à 5. Cependant, il y a des rapports des techniques qui identifient des voies d'hôte et de nombreuses techniques pour dépister des partenaires de liaison des protéines d'effecteur bactérien. Kramer et coll. ont signalé une nouvelle approche de la biologie des systèmes pour identifier les voies ciblées par les protéines effecteurs bactériens8. La technique a utilisé une collection de souches de suppression héloïde de S. cerevisiae pour dépister les mutants sensibles à l'effecteur Shigella Osp4. Utilisant cette technique, Osp4 a été lié à la régulation de la signalisation MAPK et à l'atténuation de l'immunité innée dans les cellules hôtes. Les écrans hybrides automatisés à base de panneaux, à haut débit et à levures-deux peuvent désormais identifier rapidement les partenaires de liaison des effecteurs bactériens putatifs en examinant en même temps de nombreux ensemble de protéines hôtes9. De même, les immunoprécipitations à haut débit couplées à la spectrométrie de masse sont utilisées pour identifier en masse les partenaires de liaison putatives de familles entières de protéines effecteurs bactériennes10. Bien que bon nombre de ces études puissent accélérer le calendrier de caractérisation des protéines effector, elles donnent rarement un aperçu des processus physiologiques manipulés et des résultats holistiques de ces interactions. Ainsi, des techniques telles que la toxicité de levure et l'écran suppresseur sont essentielles pour éclairer les processus cellulaires manipulés par ces protéines effectrices. À un moment donné, les observations identifiant les partenaires liants ou les voies ciblées par les protéines effecteurs bactériens doivent revenir aux modèles d'infection cellulaire pour déterminer si ces résultats in vitro sont valables dans des scénarios physiologiquement pertinents. La manipulation génétique des pathogènes intracellulaires obligatoires comme C. trachomatis a été un obstacle majeur jusqu'à récemment11-15 et la génération de mutants spécifiques au site pour étudier les protéines effector n'était pas possible. Au cours des dernières années, cependant, une révolution dans la génération de mutants chlamydiales, les compléter, et surexprimer les protéines cibles a eu lieu. Ces progrès récents ont considérablement amélioré la valeur de l'information dérivée des études utilisant la toxicité et les écrans suppresseurs car il est maintenant possible de passer de la levure directement dans l'infection pour sonder la validité des résultats.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions Shelby Andersen, Abby McCullough et Laurel Woods pour leur aide dans ces techniques. Cette étude a été financée par des fonds de démarrage du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de l'Iowa à Mary M. Weber.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Fisher Scientific BP2641500
Galactose MilliporeSigma G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit ThermoFisher Scientific K0691
GeneJet PCR purification kit ThermoFisher Scientific K0701
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo K0503
Glucose MilliporeSigma G8270-1KG
Herring Sperm DNA Promega D1811
KpnI-HF New England Biolabs R3142S
Lithium acetate dihydrate MilliporeSigma L6883-250G
Peptone Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530
Poly(ethylene glycol) 3350 MilliporeSigma 1546547-1G
pYep13 ATCC 37323
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
Tryptophan MilliporeSigma 470031-1G
XhoI-HF New England Biolabs R0146S
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500
Yeast miniprep kit Zymo D2001
Yeast nitrogen base without amino acids MilliporeSigma Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1501-20G without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1771-20G without uracil, leucine, tryptophan

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References

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Génétique Numéro 152 protéine d'effeteur bactérien suppresseur de levure fonction de protéine d'effet écrans de levure Chlamydia trachomatis,protéine d'effeteur sécrétée de type III identification de voie
Identification des voies d'accueil ciblées par les protéines d'effetbactérieur à l'aide d'écrans de toxicité et de suppression de levures
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Faris, R., Weber, M. M. Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens. J. Vis. Exp. (152), e60488, doi:10.3791/60488 (2019).

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