Summary
细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以关键生物过程为目标。识别细菌效应蛋白所针对的宿主通路是解决分子发病机制的关键。这里，描述了一种使用改性酵母抑制剂和毒性筛分的方法，以阐明有毒细菌效应蛋白所针对的宿主通路。
Abstract
细胞内细菌将称为效应蛋白的毒性因子分泌到宿主细胞醇中，这些细胞醇的作用是破坏宿主蛋白和/或其相关的生物途径，以利于细菌。由于细菌基因组测序的进步和算法的出现，使得假定细菌效应蛋白的识别变得更加易于管理，这些算法允许在硅素识别编码分泌候选项和/或真核生物的基因方面进行编码域。然而，确定这些重要的毒力因素只是第一步。自然地，目标是确定效应蛋白的分子功能，并阐明它们如何与宿主相互作用。近年来，酵母双杂交筛和大规模免疫沉淀技术以及质谱仪等技术有助于识别蛋白质-蛋白质相互作用。虽然识别宿主结合性伴侣是阐明细菌效应蛋白的分子功能的关键的第一步，但有时宿主蛋白具有多种生物功能（例如，活性素、克拉辛、土布林），或细菌蛋白可能不会物理结合宿主蛋白，使研究人员失去有关纵的精确宿主通路的关键信息。经过修饰的酵母毒性筛与抑制器屏幕相结合，已调整，以识别受细菌效应蛋白影响的宿主通路。毒性屏幕依赖于由效应蛋白干扰宿主生物通路引起的酵母中的毒性效应，这通常表现为生长缺陷。酵母基因组库的表达用于识别抑制细菌效应蛋白毒性的宿主因子，从而识别效应蛋白靶向通路中的蛋白质。该协议包含毒性和抑制器屏幕的详细说明。这些技术可以在任何能够进行分子克隆和培养酵母和大肠杆菌的实验室中进行。
Introduction
第一次报告的程序类似于这里提出的那些特点军团菌肺炎嗜血杆菌类型IV效应器SidD，一个deAMPylase，修改Rab11。比较技术用于表征几个L.肺炎球菌效应器1，2，3。该测定被调整为Coxiella burnetii型IV效应蛋白4，最近该技术的效用被扩展为衣原体沙眼结合膜蛋白的表征5.
该协议可以分为两个主要部分：1）酵母毒性筛，其中感兴趣的细菌效应蛋白在酵母中表达，克隆被筛选为由生长缺陷证明的有毒表型，2）酵母抑制器屏幕，其中毒性表型被毒菌株中的酵母基因组库表达所抑制。因此，毒性屏幕是有毒表型的屏幕，当感兴趣的细菌效应者过度表达时，这些表型表现为生长缺陷。有毒克隆，成功地转换和表达细菌效应器，选择并保存下一步。第二个主要步骤涉及在有毒酵母克隆中过度表达部分消化的酵母基因组库。在该协议中建议使用酵母基因组库的质粒携带5-20 kb的插入物，通常对应于所有质粒平均基因大小为±1.5 kb的3~13个酵母开放阅读框架（ORF），代表覆盖的整个酵母基因组大约10倍。这部分的测定称为抑制器屏幕，因为目标是抑制细菌效应蛋白的毒性。电势抑制质粒从酵母中分离出来，测序，并识别抑制性ORF。抑制器屏幕的基本原理是，效应蛋白与其目标的宿主通路结合、相互作用和/或压倒其目标，而过量地将这些宿主蛋白提供回可挽救该通路的毒性效应，从而，生长缺陷。因此，抑制毒性的确定ORF通常代表宿主通路的多个参与者。然后进行正交实验，以验证细菌效应器确实与牵连通路相互作用。如果已识别出克扯林或肌蛋白等结合性伙伴，这一点尤为必要，因为这些蛋白质涉及多种宿主过程。进一步的实验可以阐明感染过程中效应蛋白的生理功能。毒性和抑制器屏幕也是破译细菌效应蛋白的生理功能的有力工具，这些蛋白质在物理上不会将宿主蛋白与亲和力结合，其亲和力足以通过免疫沉淀检测或与在酶命中和运行交互中主机，这些交互可能不会被酵母-二混合屏幕检测到。
虽然抑制器屏幕可以是一种强大的方法来揭示细菌效应蛋白和宿主通路之间的潜在生理相互作用，但细菌效应蛋白必须诱导酵母中的生长缺陷，否则在抑制器屏幕将没有什么用。此外，有毒表型必须导致至少 2⁄3 log10增长赤字，否则将难以识别抑制器。如果为细胞培养建立实验室，在HeLa等常见细胞系中筛选毒性效应蛋白通常可以洞察是否值得进行酵母毒性筛查。HeLa细胞中效应蛋白的异位表达有时导致毒性，与用于这些屏幕4的酵母菌株的毒性密切相关。HeLa细胞中可观察到的应力特征包括应力纤维的丧失、细胞脱离板和指示凋亡的核凝结。HeLa细胞中任何压力的视觉指示都使得感兴趣的蛋白质成为诱导酵母生长缺陷的良好候选者，酵母的复制速度要快得多，从而对基本通路的扰动反应更灵敏。
应当指出，抑制器屏幕并不总是将宿主绑定伙伴标识为抑制器，但它仍然可能涉及目标宿主通路的关键组件，从而全面了解被细菌效应蛋白。从表面上看，这似乎是违反直觉的，因为提供过量的效应蛋白的结合伙伴有望挽救生长缺陷。在努力确定C.沙眼效应蛋白CT229（CpoS）所针对的途径时，在感染5期间与至少10种不同的Rab GTPass结合，没有一个拉布结合伙伴抑制了CT229的毒性。然而，查明了参与克拉林涂层囊泡（CCV）贩运的许多抑制者，这导致进一步的工作表明，CT229特别颠覆了依赖Rab的CCV贩运。同样，在调查C.burnetii效应蛋白Cbu0041（CirA）时，发现了几种能挽救酵母生长缺陷的Rho GTPases，后来发现CirA作为RhoA4的GTPase激活蛋白（GAP）的作用。
酵母抑制器屏幕对阐明细菌效应蛋白靶向宿主通路的效用怎么强调也不过分，其他试图描述细胞内细菌效应蛋白的研究人员可以从中获益这些技术。如果免疫沉淀和/或酵母-两个混合屏幕未能找到结合的伙伴，并且可以阐明细菌效应蛋白所针对的通路，这些检测是有价值的。在这里，提供了毒性和抑制器屏幕的详细方案，以识别细胞内细菌效应蛋白所针对的宿主生物通路，以及使用这些测定剂及其相应的解决方案。
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Protocol
1. 培养剂和试剂的制备
注：板材应在测定日之前准备，并好1个月。介质和试剂可随时制成，适合1个月。
- 通过在 1000 mL 烧杯中溶解 800 mL 蒸馏水中的 100 g D-（+）-葡萄糖，制备 1 L 葡萄糖溶液（10% w/v）。用蒸馏水将音量调节到 1 L。通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤到无菌 1 L 介质存储瓶中。
- 在 1 L 烧杯中溶解 100 g D-（+）- 蒸馏水中的 100 g D-（+）- 甘蔗素，制备 1 L 的甘蔗溶液（10% w/v）。使用蒸馏水将体积调节到 1 mL，并通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤到无菌的 1，000 mL 介质储存瓶中。
- 在1000mL蒸馏水中溶解10克酵母提取物、20克肽、20克葡萄糖和20克琼脂，制备1L酵母提取物肽（YPD）琼脂糖。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到冷却。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
- 在1000 mL蒸馏水中溶解10克酵母提取物、20克肽和20克葡萄糖，制备1L的YPD汤。高压灭菌20分钟。
- 准备合成脱液 （SD） 尿素 （ Ura-） 葡萄糖琼脂.对于1L，溶解6.7克不含氨基酸的酵母氮碱，1.9克无尿素的脱脂补充剂，以及15克的琼脂蒸馏水。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，添加步骤 1.1 中制备的 200 mL 葡萄糖溶液。轻轻旋转或放在搅拌板上，搅拌均匀。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
- 准备合成辍学 （SD） 尿素 （ Ura-） 加乳酸琼脂.对于1L，溶解6.7克不含氨基酸的酵母氮碱，1.9克无尿素的脱脂补充剂，以及15克的琼脂蒸馏水。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，添加步骤 1.2 中制备的 200 mL 的乳酸酶溶液。轻轻旋转或放在搅拌板上，将搅拌均匀。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
- 准备合成脱液 （SD） 尿素 （ Ura-） 葡萄糖汤.对于1L，溶解6.7克酵母氮碱，不含氨基酸和1.9克滴液补充剂，在800 mL蒸馏水中不使用尿素。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，加入步骤 1.1 中制备的 200 ml 葡萄糖溶液。
- 准备合成脱液 （SD） 尿素 （ Ura-） 亮氨酸 （ Leu-） 葡萄糖琼脂.对于1L，溶解6.7克的酵母氮碱，不含氨基酸;1.9克的辍学补充剂，不含尿素、亮氨酸和锥形;15克琼脂;和0.076克的锥子醇在800 mL蒸馏水中。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，添加步骤 1.1 中制备的 200 mL 葡萄糖溶液。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
- 准备合成辍学 （SD） 尿素 （ Ura-） 亮氨酸 （ Leu-） 加乳酸琼脂.对于1L，溶解6.7克不含氨基酸的酵母氮碱;1.9克的辍学补充剂，不含尿素、亮氨酸和锥形;15克琼脂;和0.076克的锥子醇在800 mL蒸馏水中。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，添加步骤 1.2 中制备的 200 mL 的乳酸酶溶液。轻轻旋转或放在搅拌板上，将混合均匀。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
- 准备合成脱液 （SD） 尿素 （ Ura-） 亮菌 （ Leu-） 葡萄糖汤.对于1L，溶解6.7克不含氨基酸的酵母氮碱;1.9克的辍学补充剂，无尿素、亮氨酸、锥形;和0.076克的锥子醇在800 mL蒸馏水中。高压灭菌20分钟，在56~60°C水浴中冷却，直到温度为+50°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，添加步骤 1.1 中制备的 200 mL 葡萄糖溶液。
- 制备聚乙烯乙二醇（PEG）溶液。在蒸馏水中加入50%的聚乙烯乙二醇3350。通过高压灭菌进行灭菌。
- 在 200 mL 蒸馏水中溶解 10.2 g 醋酸锂脱水，制备 1 M 醋酸锂 （LiAc）。通过高压灭菌进行灭菌。
- 准备青鱼精子DNA。使用蒸馏水将10mg/mL的青鱼精子DNA稀释至2mg/mL。在100°C加热5分钟，并立即放在冰上5分钟。
2. 将感兴趣的基因克隆到酵母毒性质粒pYesNTA-Kan中
注：目前，有各种酵母毒性载体可用于商业和学术。酵母抑制器屏幕可以与许多这些载体结合使用，只要表达感兴趣的效应蛋白的质粒使用除乌拉西尔以外的辍学选择和BlaR以外的抗生素标记。这项工作使用经过改良的pYesNTA载体4，5，其中包括一个卡那霉素抗卡带，以方便筛选潜在的抑制剂。克隆方案必须允许效应蛋白与Gal启动子和His-Tag结合。衣原体沙眼纳入膜蛋白CT229被用作这些测定的原理证明。
- 使用 PCR 根据制造商的说明，使用 CT229 +1 Kpn F （CCGGTACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGGT） 和 CT229 XhoI R （CCCTCGAGTTTTCGCGAGATATC. 引物，使用 PCR 扩增来自C. 沙眼瘤的基因组DNA。使用以下 PCR 条件： （1） 98 °C 30 s;（2） 98 °C 10 秒，55 °C 30 秒，72°C 2 分钟;（3） 重复步骤 2 共 25 倍;（4） 72 °C 10 分钟;和 （5） 4 °C 保持。
- 在1%的甘蔗凝胶上分析PCR产物的5μL（图1）。
- 按照制造商的说明，使用 PCR 纯化试剂盒纯化剩余的 45 μL DNA。
- 使用KpnI-HF和XhoI-HF在水浴中，在37°C下消化50μL的纯化PCR插入和pYesNTA-Kan（图2）。
注：对于pYesNTA-Kan，使用5μL的KpnI-HF、5μl的XhoI-HF和6μL的缓冲液在60μL的总体积下消化5μg的质粒。对于刀片，使用 2 μL 的 KpnI-HF、2 μL 的 XhoI-HF 和 6 μL 的缓冲液消化整个 50 μL 的纯化 PCR 产物。 - 在1%的甘蔗凝胶上运行整个质粒消化。按照制造商的说明，使用凝胶提取试剂盒对消化的质粒进行纯化。
- 按照制造商的说明，使用 PCR 纯化套件纯化消化的 PCR 插件。
- 使用 2 μL 的 pYesNTA-Kan（步骤 2.5）、2 μL DNA 连带酶缓冲液、1 μL T4 连带酶和 15 μL 的插入（步骤 2.6）将插入物克隆到 pYesNTA-Kan 中。在室温下孵育1小时。
- 将整个克隆反应加入50μL的大肠杆菌能称量细胞，并进行转化反应。
- 在含有100微克/mL的LB板上将整个转化反应板板。
- 接种含有100微克/mL的含有100微克/mL的LB，具有三个单独的菌落。在 37°C 下孵育过夜，在 150 rpm 下摇动。
- 按照制造商的说明，使用质粒小试剂盒分离质粒。
- 使用基因特异性引源对分离的质粒进行测序（步骤2.1）。
3. 测试酵母中感兴趣的蛋白质的毒性
- 在 YPD琼脂上（步骤 1.3）上获取孤立菌落的 Streak Sacchariisae W303。在30°C孵育24小时。
- 用琼脂板中的单个菌落（步骤3.1）接种10 mL的YPD汤（步骤1.4）。在 30°C 下孵育，在 150 rpm 转速下过夜。
- 将0.5 mL的隔夜培养剂加入10 mL的YPD汤（步骤1.4），在30°C下孵育，在150rpm下摇动4小时。
- 在 4°C 下在 3，000 x g下将 10 mL 的培养值颗粒 10 分钟。
- 将颗粒重新悬浮在1 mL无菌水中，转移到微离心管中，在3000 x g下在室温下将颗粒悬浮1分钟。
- 在室温下，将颗粒悬浮在1 mL的1 mM醋酸锂（LiAc）和3，000 x g的颗粒中1分钟。
- 重复 LiAc 洗涤 2 次。
- 拆下洗涤液。在 2.4 mL 的 50% PEG 3350 中重新悬浮颗粒。加入360μL的1M LiAc，500μL的2mg/mL的青鱼精子DNA，和400μL的无菌水。
注： 这足以进行 20 次转换。 - 从步骤3.3.5向含有5μL的pYesNTA-Kan CT229质粒DNA（100~500 ng）的微离心管中加入180μL。
- 在30°C的水浴中孵育30分钟。
- 在42°C的水浴中孵育30分钟。
- 在室温下，在3，000 x g下颗粒1分钟。
- 用移液器拆下变换混合物。将颗粒重新悬浮在100 μL无菌水中。在 SD Ura上板面变换 - 带葡萄糖的琼脂（步骤 1.5）。
- 在30°C孵育板48小时。
- 用单片菌群接种5 mL的SD Ura-含有葡萄糖的肉汤（步骤1.7）。在 30°C 下孵育过夜，在 150 rpm 下摇动。包括酵母与载体单独转换作为阴性对照。
- 在 96 井板 （A2+A6） 的 5 口井中加入 180 μL 无菌水。
- 漩涡通宵文化混合。
- 将180μL的酵母加入第一口井（A1）。连续稀释 1：10（共 6 个样本，包括未稀释）。
- 使用多通道移液器，在 SD Ura-葡萄糖 （步骤 1.5） 和 Ura-加乳糖（步骤 1.6）琼脂糖（步骤 1.6）上，将每个稀释的 5 μL 点。在30°C孵育48小时。
- 通过比较表达在含乳酸酶介质上生长的感兴趣的效应蛋白的酵母的生长与单独表达载体的酵母的生长，评估毒性。
- 通过西方印迹确认他标记融合蛋白的表达。
4. 使用酵母基因组库转化有毒酵母
- 使用步骤 3.4 中的 1 mL 库存接种 100 mL SD Ura-葡萄糖汤（步骤 1.7）。在 30°C 下孵育 16⁄24 小时，在 150 rpm 下摇动。将 900 mL 的 SD Ura-葡萄糖汤放在 30°C 过夜，以预热介质。
- 将整个 100 mL 的隔夜文化添加到预热的 1 L 烧瓶中。在 30°C 下孵育 4⁄5 小时，在 150 rpm 下摇动。
- 在 4°C 下在 6，000 x g下将培养基颗粒 10 分钟。
- 丢弃上清液。在250 mL无菌水中重新悬浮颗粒。在 4°C 下在 6，000 x g下将培养基颗粒 5 分钟。
- 丢弃上清液。在 250 mL 的 1 mM LiAc 中重新悬浮颗粒。在 4°C 下在 6，000 x g下将培养基颗粒 5 分钟。
- 取出 LiAc 并重新悬浮在 9.6 mL 的 50% PEG 3350 中。加入1.44毫升的1M LiAc，2毫升2毫克/毫升的青鱼精子DNA，50μg的pYep13基因组库（ATCC 37323）。使用无菌水将音量调节到 15 mL。通过反转轻轻混合。
- 在30°C的水浴中孵育30分钟。
- 加入750μL二甲基亚硫酸盐（DMSO），以提高转化效率。在42°C的水浴中孵育30分钟，每10分钟通过温和的倒置混合。
- 在室温下，在3，000 x g下将酵母丸5分钟。
- 丢弃上清液，在10 mL无菌水中重新悬浮颗粒。在室温下，在3，000 x g下5分钟。
- 将颗粒重新悬浮在8 mL无菌水中。
- 要确定转化效率，在 SD Ura- Leu-葡萄糖琼脂上稀释 1：10 和板 100 μL 的每次稀释（步骤 1.8）。
- SD Ura- Leu-乳酸琼脂琼脂（步骤1.9）板上样品的板200 μL。总共使用 50 个板。
- 在30°C孵育48~96小时或直到菌落出现。
注：菌落一般出现在葡萄糖琼脂板上，在48-72小时，和加糖琼脂琼脂琼脂片在72-96小时。
- 补丁殖民地（潜在的救援）在SD Ura- Leu-加拉克托塞琼脂（步骤1.9）扩大和使股票。在30°C孵育24~48小时。
- 使用贴片部分接种 5 mL 的 SD Ura- Leu-葡萄糖汤（步骤 1.10）。在 26°C 下孵育过夜，在 150 rpm 下摇动。
- 将 180 μL 的无菌水添加到 96 井板 （A2+A6） 的 5 口井中。
- 漩涡通宵文化混合。
- 将180μL的酵母加入第一口井（A1）。连续稀释 1：10（共 6 个样本，包括未稀释）。
- 使用多通道移液器，在 SD Ura-葡萄糖和 SD Ura-加乳糖琼脂琼脂琼脂琼脂板上，发现每个稀释液的 5 μL。单独将有毒效应器作为控制。
- 在30°C孵育48小时。
- 将单独表达毒性效应器的酵母的生长与含有潜在抑制物的酵母进行比较。只进行与单独表达效应剂的酵母相比毒性降低的潜在抑制剂。
5. 识别和确认抑制器
- 接种 5 mL SD Ura- Leu-葡萄糖汤（步骤 1.10），步骤 4.4 起使用 100 μL 的酵母，在 30°C 下孵育过夜，在 150 rpm 下摇动。
- 在室温下，在3，000 x g下将酵母丸2分钟。使用移液器轻轻丢弃上清液。
- 按照制造商的说明，使用酵母质粒小试剂盒分离质粒。
- 将分离的质粒转化为大肠杆菌的能合细胞，用100μg/mL的卡比西林在LB琼脂体上盘整个转化。在37°C孵育24小时。
- 接种含有100微克/mL的10 mL的LB溴，从板中分泌三个菌落，在37°C孵育过夜，在150rpm下摇动。
- 在室温下，在3，000 x g下培养10分钟。按照制造商的说明，使用微型制备试剂盒分离质粒。
- 按照协议第3部分的步骤，从步骤5.3.1中用分离的质粒重新改造有毒酵母。
- 从转化板中用菌群接种 5 mL 的 SD Ura- Leu-葡萄糖汤。在 30°C 下孵育过夜，在 150 rpm 下摇动。
- 在Ura- Leu-葡萄糖和乳糖琼脂糖上点，以确认毒性抑制。
- 序列使用pYep13F（ACTACGATATATGCGGCGA）和pYep13 R（TGATGCCCCGATGC）引物来识别酵母ORF。
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Representative Results
在实际的酵母抑制器屏幕可以执行之前，必须测试感兴趣的效应蛋白在酵母中的毒性。这是通过在一个可诱导诱导剂的控制下表达对酵母感兴趣的蛋白质来实现的。葡萄糖的生长（非诱导条件）应首先进行比较，以确保毒性是特别由于感兴趣的蛋白质的表达，而不是一般的缺陷。如图3所示，毒性表现为较小的菌落和/或生长减少。酵母生长减少2⁄3对数是酵母抑制器屏幕的理想选择。
如图4所示，使用协议部分中描述的方法，毒性和抑制器屏幕可以分八个步骤完成。感兴趣的基因被克隆成合适的载体1，所得的构造被转化为酵母来评估毒性。本研究以CT229作为感兴趣的基因，以pYesNTA-Kan为载体。此外，西印印证实了他标记的融合蛋白的表达。理想情况下，应观察到在含乳酸酶培养的酵母中减少2⁄3对数。如果感兴趣的蛋白质对酵母有毒（图3和图4），抑制器屏幕可以通过用酵母基因组库pYep13转化毒菌株来进行。转化剂在葡萄糖琼脂上镀，以确定转化效率，并测定潜在的抑制剂。使用该协议，在角质琼脂琼脂上共10~250个菌落，实现了5×105的最低转化效率。在SDUra- Leu-加乳酸琼脂（图4）上修补这些菌落有助于识别真正的抑制物，因为许多假阳性在修补后不会生长。在这里，50个菌落被修补，8个克隆，抑制效应器毒性获得（图4）。在SD Ura- Leu-加乳酸琼酮琼脂酮上发现抑制剂，以确认抑制毒性。如图4所示，pSup1和pSup2抑制了效应蛋白的毒性，而pSup3没有。因此，pSup3 被丢弃。疟原虫随后从抑制器中分离出来，并转化为大肠杆菌，以提高质粒产量。然后，质粒可以重新转化为有毒的酵母，以确认分离的质粒绝对抑制效应毒性（图4）。虽然大多数分离的质粒应挽救毒性，但偶尔获得一种质粒，当重新转化为有毒酵母菌株时，不会抑制毒性。这些质粒被丢弃，只有那些抑制毒性的重转化后，应排序。
分离的质粒将包含多个酵母ORFs4。为了识别哪个是真正的抑制器，每个ORF可以单独克隆，并在毒性酵母菌株中表达，如前所述1，2，3，4。
图1：靶基因PCR扩增。CT229来自衣原体沙眼血清L2被PCR从基因组DNA扩增。PCR产品在沾有溴化铀的1%甘蔗凝胶上进行分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：pYesNTA-Kan质粒图。感兴趣的靶基因被克隆到pYesNTA-Kan的多个克隆位点（MCS）中，Kanamycin用于大肠杆菌的选择，在S.cerevisae中用于选择尿素。西方印迹验证了他标记的融合蛋白的表达。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：代表性酵母毒性结果。感兴趣的效应蛋白被克隆成pYesNTA-Kan。经序列验证的质粒被转化成S.cerevisae，转化剂被连续稀释，并在Ura-葡萄糖和角质糖琼脂上发现，以评估毒性。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：酵母抑制器屏幕概述。感兴趣的靶基因被克隆成pYesNTA-Kan，质粒被转化成S.cerevisae。转化剂被连续稀释，并在Ura-葡萄糖和角糖琼脂糖上发现，以评估毒性。为了识别毒性效应蛋白所针对的通路，表达有毒蛋白质的酵母菌株通过酵母基因组库进行了转化。殖民地被修补在乌拉- 卢- 半乳酸琼脂琼脂，并发现以评估毒性.疟原虫与抑制效应蛋白毒性的疟原虫分离。质粒被改成有毒的酵母菌株，以确认分离的质粒是抑制器。从抑制器的疟原虫被测序，以识别存在的酵母ORF。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议概述了使用改性酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白靶向宿主生物通路的分步程序。使用的酵母菌株，S.cerevisiae W303，是辅助营养的尿素和亮氨酸。该菌株的Uracil辅助营养器用于选择含有pYesNTA-Kan载体上感兴趣的蛋白质的酵母，而亮氨酸辅助营养器用于选择酵母基因组库载体pYep13。酵母基因组库质粒携带3~13个ORF，因此每个ORF应单独克隆到p415-ADH载体6或类似载体中，并重新转化为有毒酵母，以识别谁是真正的抑制者。它是典型的识别代表宿主生物通路的几个抑制器。抑制剂有时可以是感兴趣的细菌蛋白的直接结合伙伴，但并非总是如此。
生产含有pYesNTA-Kan上感兴趣的细菌蛋白的酵母克隆是第一步，应尽快非常小心，以保持这些克隆的完整性，因为携带毒性的酵母有很强的负选择蛋白质，即使没有故意的锥形诱导，它们可能会失去质粒。偶尔有质粒损失，即使酵母在辍学介质的选择下保持。以前曾报道过一种方法，通过线性化载体并将其整合到酵母基因组1中，来减少质粒损失的发生。
这些技术的一个主要缺点是，抑制器屏幕只有在细菌效应蛋白的过度表达触发酵母中可观察到的一致生长缺陷时，才会产生有意义的数据。此方法的主要困难是未识别抑制器。很难确定未能识别抑制物是因生物原因还是技术问题造成的。从生物学的角度来看，可能有几个原因：感兴趣的蛋白质可能毒性如此之大，以至于基因组库中的蛋白质无法显著抑制毒性，靶向途径可能无法挽救，或者大量共同表达克服毒性影响可能需要一些因素。接近生物学解释是具有挑战性的，因为有许多未定义的变量需要剖析。因为有一个既定的协议，探索技术解释是一种更容易处理的方法。从技术角度来看，未能识别抑制物可能是酵母基因组库转化效率低的结果。该协议使用ATCC S.cerevisaeAB320部分消化的基因组库在pYEp13。其他库和其他矢量可能就足够了，但此协议专门使用 ATCC 库，并且当前没有发布的报告备用库或矢量源的研究。强烈建议酵母基因组的覆盖率至少为10倍，否则代表性不足可能会妨碍抑制器的识别。转换效率降低可以使这些数字低于 1 倍。因此，酵母基因组的某些部分可能不会在抑制器屏幕中表示。转化效率低可能是由于许多问题造成的，包括试剂不良或库制备不良。该方法基本上遵循了希尔等人首先提出的DMSO/LiAc变换方法。建议购买新的DMSO、50%PEG和新鲜的青鱼精子DNA，并制备这些转化，并专门用于这些检测，以减少试剂质量的污染或降解。DMSO具有很强的吸湿性，很容易吸收大气中的水。因此，建议对容器进行多次使用等分，以避免容器盖反复打开和暴露于大气中。高质量的青鱼精子DNA可以储存在-20°C，并适合使用几年，虽然应准备从库存为每个转换新鲜准备。一旦煮沸和冷却，青鱼精子DNA不应该重新煮或重复使用，所以最好只去除需要的东西，避免作出超过当前转换所需的更多。注重细节可以大大提高酵母的转化效率，提高识别抑制器的机会。
考虑到酵母pYep13载体携带3~13种不同的酵母ORF，减少假阳性质粒的数量对于识别抑制剂至关重要。酵母可以接收和窝藏类似载体的多个副本，而与质粒不相容相关的一般智慧传统上规定，大肠杆菌一次只维持一种具有相同复制源（ORI）的质粒，虽然这并不总是这样。当尝试识别抑制器候选项时，这可能成为一个主要问题。如果确定了抑制酵母克隆，将提取质粒并重新转化为大肠杆菌进行繁殖和随后的测序以进行鉴定。一旦候选抑制质粒被分离并重新转化为大肠杆菌，强烈建议至少挑选5个大肠杆菌菌落进行测序，因为个别克隆可能携带不同的质粒。由于大肠杆菌一次只能繁殖一个质粒，如果酵母分离产生多个质粒，则板上不同的大肠杆菌克隆应一次只能携带其中一个质粒。因此，根据大肠杆菌的正常转化效率选择五个菌落，应表明克隆人是否携带相同或不同的质粒。如果在大肠杆菌的质粒测序后出现多个质粒，那么每个质粒都应该转化成有毒的酵母克隆，并评估以挽救生长缺陷。此外，即使只确定了单个抑制质粒，也鼓励将质粒重新转化为有毒克隆的严格性和可重复性。
酵母抑制器测定是一项非常大的实验，应相应地规划适当的时间和材料。该协议包含许多必须遵守的细节，建议执行这些测定的研究人员在开始检测之前仔细阅读并完整地观察协议。这是一个多部分程序，包括细菌和酵母，需要在不同的温度下培养。由于细胞壁坚硬，有时很难从酵母中分离质粒，使用DMSO有助于实现更高的转化效率。
酵母毒性和抑制器屏幕的最大优点之一是，细菌效应器不需要物理地与宿主基质结合，以检测目标化的假定通路。只有少数研究报告使用这种或类似的技术1+5。然而，有技术的报告，识别宿主通路和许多技术筛选结合伙伴的细菌效应蛋白。克莱默等人报告了一种新的系统生物学方法，以识别细菌效应蛋白8靶向的途径。该技术使用单倍体删除应变集合S.cerevisiae筛选对志贺氏菌效应器Osp4敏感的突变体。利用这种技术，Osp4与宿主细胞中固有免疫的MAPK信令和衰减的调节有关。基于阵列，高通量，自动化酵母-两个混合屏幕现在可以通过筛选许多同时对数百万宿主蛋白9快速识别假定细菌效应或结合伙伴。同样，高通量免疫沉淀物与质谱学一起被用于大规模识别细菌效应蛋白10的整个家族中的假定结合伙伴。虽然其中许多研究可以加速效应蛋白表征的时间表，但它们很少提供洞察哪些生理过程正在纵，以及这些相互作用的整体结果是什么。因此，酵母毒性和抑制器屏幕等技术对于照亮这些效应蛋白所操纵的细胞过程至关重要。在某个时候，识别结合伙伴或细菌效应蛋白靶向通路的观察需要返回到细胞感染模型，以确定这些体外发现在生理相关情况下是否有效。直到最近11月15日，对C.沙眼等细胞内病原体进行基因操作一直是一个主要障碍，并且不可能生成位点特异性突变体来研究效应蛋白。然而，在过去几年中，在产生衣原体突变体、补充它们和过度表达靶蛋白方面发生了一场革命。这些最近的进步大大提高了使用毒性和抑制器屏幕的研究所获得的信息的价值，因为现在可以从酵母直接进入感染，以探究结果的有效性。
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Disclosures
提交人宣称，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢谢尔比·安德森、艾比·麦卡洛和劳雷尔·伍兹在这些技术方面给予的帮助。这项研究由爱荷华大学微生物学和免疫学系的启动基金资助给玛丽M.韦伯。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
References
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