利用酵母毒性及抑制子筛选鉴定细菌效应蛋白靶向的宿主通路

摘要

细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以靶向关键的生物学过程。确定细菌效应蛋白所靶向的宿主通路，是阐明分子致病机制的关键。本文介绍了一种利用改良的酵母抑制和毒性筛选方法，以揭示有毒细菌效应蛋白所靶向的宿主通路。

摘要

胞内细菌会向宿主细胞质中分泌一类称为效应蛋白的毒力因子，这些效应蛋白可作用于宿主蛋白和（或）其相关的生物学通路，从而有利于细菌的生存。随着细菌基因组测序技术的进步以及能够通过计算机预测分泌候选基因和（或）真核样结构域编码基因的算法的出现，鉴定潜在细菌效应蛋白的工作已变得更加可行。然而，鉴定这些重要的毒力因子仅是研究的第一步。更进一步的目标是确定效应蛋白的分子功能，并阐明其与宿主之间的相互作用机制。近年来，酵母双杂交筛选以及结合质谱分析的大规模免疫共沉淀技术，已帮助研究人员鉴定出许多蛋白质-蛋白质相互作用。尽管发现宿主结合伴侣蛋白是揭示细菌效应蛋白分子功能的关键第一步，但有时这些宿主蛋白本身具有多种生物学功能（例如肌动蛋白、网格蛋白、微管蛋白），或者细菌蛋白可能并不直接与宿主蛋白发生物理结合，这使得研究人员难以获得关于被操控宿主通路的精确信息。为此，一种经过改良的酵母毒性筛选方法结合抑制子筛选已被开发出来，用于鉴定受细菌效应蛋白影响的宿主通路。该毒性筛选依赖于效应蛋白干扰宿主生物学通路而在酵母中引发的毒性效应，这种效应通常表现为生长缺陷。通过表达酵母基因组文库，可鉴定出能够抑制细菌效应蛋白毒性的宿主因子，从而识别出效应蛋白所靶向的通路中的相关蛋白。本实验方案详细描述了毒性筛选和抑制子筛选的具体操作步骤。这些技术可在任何具备分子克隆及酵母和Escherichia coli培养能力的实验室中实施。

引言

最早报道的类似本实验方案的研究描述了嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）IV型效应蛋白SidD，该蛋白是一种能够修饰Rab1的去AMP化酶¹。此后，类似技术被用于表征多种嗜肺军团菌（L. pneumophila）效应蛋白^1,2,3。该检测方法随后被改进，用于分析贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）IV型效应蛋白⁴，最近该技术的应用范围进一步拓展至沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）包涵体膜蛋白的表征研究⁵。

该实验方案可分为两个主要部分：1）酵母毒性筛选，即在酵母中表达目标细菌效应蛋白，并筛选表现出毒性表型（以生长缺陷为特征）的克隆；2）酵母抑制子筛选，即在有毒性表型的菌株中表达酵母基因组文库，以抑制该毒性表型。因此，毒性筛选旨在识别当目标细菌效应蛋白过表达时表现为生长缺陷的毒性表型。成功转化并表达该细菌效应蛋白的毒性克隆将被筛选并保留，用于下一步实验。第二步主要是在有毒性表型的酵母克隆中过表达一个部分酶切的酵母基因组文库。....

方案

1. 培养基与试剂的准备

注意：平板应在检测当天之前制备，可保存1个月。培养基和试剂可随时配制，可保存1个月。

1. 在1,000 mL烧杯中，将100 g D-(+)-葡萄糖溶于800 mL蒸馏水中，配制1 L葡萄糖溶液（10% w/v）。用蒸馏水定容至1 L。经0.2 μm滤膜过滤。 µm 无菌滤器过滤至无菌的 1 L 培养基储存瓶中。
2. 在1 L烧杯中，将100 g D-(+)-半乳糖溶于800 mL蒸馏水中，配制1 L的10% (w/v) 半乳糖溶液。用蒸馏水定容至1 L，经0.2 μm滤膜过滤。 µm 无菌滤器过滤至一个无菌的 1,000 mL 培养基储存瓶中。
3. 通过将 10 g 酵母提取物、20 g 胰蛋白胨、20 g 葡萄糖和 20 g 琼脂溶解于 1,000 mL 蒸馏水中，制备 1 L 酵母提取物胰蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂。121 °C 高压灭菌 20 min，然后在 56 °C 水浴中冷却 ˚将水浴冷却至室温，每块培养皿倒入约 20 mL 培养基，共制备 100 mm 培养皿。
4. 准备 1 L YPD 通过溶解于肉汤 10 g 酵母提取物，20 g 蛋白胨，20 g 葡萄糖溶于 1,000 mL 蒸馏水中。121°C 高压灭菌 20 分钟。
5. 制备合成缺陷型（SD）尿嘧啶（Ura）培养基^-）葡萄....

结果

在进行实际的酵母抑制子筛选之前，必须先检测目标效应蛋白在酵母中的毒性。这可通过在半乳糖诱导型启动子控制下于酵母中表达目标蛋白来实现。应首先比较葡萄糖培养条件（非诱导条件）下的生长情况，以确保毒性确实源于目标蛋白的表达，而非由一般性缺陷引起。如图3所示，毒性表现为菌落较小和/或生长减缓。酵母生长量下降2−3个数量级，是进行酵母抑制子筛选的理想条件。

如图4所示，利用本方案部分所述方法，毒性与抑制子筛选可在八个步骤内完成。将目的基因克隆至合适的载体中¹，并将所得构建体转化入酵母以评估其毒性。本研究以CT229为目的基因，pYesNTA-Kan为载体。此外，通过Western blotting确认了His标签融合蛋白的表达。理想情况下，应在含半乳糖培养基上生长的酵母中观察到2−3个对数级的生长抑制。若目的蛋白对酵母具有毒性（图3和

讨论

本实验方案详细阐述了利用改良的酵母毒性及抑制子筛选方法，鉴定被细菌效应蛋白靶向的宿主生物通路的逐步操作流程。所使用的酵母菌株S. cerevisiae W303对尿嘧啶和亮氨酸均为营养缺陷型。利用该菌株的尿嘧啶营养缺陷特性，筛选携带目标蛋白的pYesNTA-Kan载体；利用其亮氨酸营养缺陷特性，筛选携带酵母基因组文库的pYep13载体。酵母基因组文库质粒包含3−13个开放阅读框（ORF），因此需将每个ORF单独克隆至p415-ADH载体⁶或类似载体中，并重新转化至具有毒性的酵母菌株中，以确定哪一个才是真正的抑制子。通常可鉴定出多个代表宿主生物通路的抑制子。这些抑制子有时可能是目标细菌蛋白的直接结合伴侣，但并非总是如此。 

构建携带目标细菌蛋白的酵母克隆是首要关键步骤，应尽快采取充分措施以保持这些克隆的完整性，因为即使未有意添加半乳糖进行诱导，携带毒性蛋白的酵母也会受到强烈的负向选择压力，可能导致质粒丢失。即使在缺乏营养的选择性培养基上维持培养，偶尔仍会发生质粒丢失现象。已有研究报道一种方法，通过将载体线性化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Fisher Scientific	BP2641500
半乳糖	MilliporeSigma	G0750-1KG
GeneJet 凝胶回收试剂盒	ThermoFisher Scientific	K0691
GeneJet PCR 纯化试剂盒	ThermoFisher Scientific	K0701
GeneJet 质粒小提试剂盒	Thermo	K0503
葡萄糖	MilliporeSigma	G8270-1KG
鲱鱼精子 DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
乙酸锂二水合物	MilliporeSigma	L6883-250G
蛋白胨	Fisher Scientific
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530
聚乙二醇 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202S
色氨酸	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-500
酵母小提试剂盒	Zymo	D2001
无氨基酸酵母氮源基础培养基	MilliporeSigma	Y0626-250G
酵母合成缺陷型培养基补充剂	MilliporeSigma	Y1501-20G	不含尿嘧啶
酵母合成缺陷型培养基补充剂	MilliporeSigma	Y1771-20G	不含尿嘧啶、亮氨酸、色氨酸