Summary
تصف هذه الدراسة طريقة الحقن داخل المفصل لأحادي يودواسيتات في الفئران وتناقش السلوكيات الناتجة المرتبطة بالألم والتغيرات النسيجية المرضية ، والتي توفر مراجع للتطبيقات المستقبلية.
Abstract
يمكن تقسيم النماذج الحيوانية الحالية لالتهاب المفاصل العظمي (OA) إلى نماذج عفوية ونماذج مستحثة ، وكلاهما يهدف إلى محاكاة التغيرات الفيزيولوجية المرضية لالتهاب المفاصل البشري. ومع ذلك ، كعرض رئيسي في المرحلة المتأخرة من هشاشة العظام ، يؤثر الألم على الحياة اليومية للمرضى ، ولا توجد العديد من النماذج المتاحة. النموذج الناجم عن أحادي يودواسيتات (MIA) هو نموذج ألم الزراعة العضوية الأكثر استخداما ، ويستخدم بشكل رئيسي في القوارض. MIA هو مثبط لهيدروجيناز الجلسرينالديهيد -3 فوسفات ، والذي يسبب موت الخلايا الغضروفية ، تنكس الغضروف ، هشاشة العظام ، والتغيرات القابلة للقياس في سلوك الحيوان. إلى جانب ذلك ، يمكن اكتشاف تغيرات التعبير عن مصفوفة ميتالوبروتيناز (MMP) والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات (IL1 β و TNF α) في النموذج الذي يسببه MIA. تتوافق هذه التغييرات مع الظروف الفيزيولوجية المرضية OA في البشر ، مما يشير إلى أن MIA يمكن أن يحفز نموذج ألم OA قابل للقياس وناجح. تهدف هذه الدراسة إلى وصف منهجية الحقن داخل المفصل ل MIA في الفئران ومناقشة السلوكيات الناتجة المرتبطة بالألم والتغيرات النسيجية المرضية.
Introduction
هشاشة العظام (OA) هو مرض المفاصل الأكثر شيوعا في العالم ، حيث يؤثر على ما يقدر بنحو 10-12٪ من السكان لدى البالغين1. المفصل الأكثر مشاركة بشكل عام هو الركبة ، و OA لديه نسبة أعلى في كبار السن ، وخاصة النساء2. كمرض مزمن ، يتطور التهاب المفاصل تدريجيا على مدى عقود إلى فشل المفاصل مع أعراض مثل فقدان الغضروف ، والالتهاب الزليلي ، وهشاشة العظام ، وانخفاض الوظيفة ، والألم المزمن3. وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) ، فإن الزراعة العضوية هي رابع أكثر الأمراض انتشارا بين الإناث وثامن أكثر الأمراض انتشارا عند الذكور. بحلول عام 2020 ، قد يصبح OA رابع أكثر الأمراض إعاقة لدى البشر4. ومع ذلك ، فإن العلاجات المتاحة حاليا من الزراعة العضوية تعالج الأعراض فقط وتمدد الوقت حتى جراحة استبدال المفاصل5.
غالبا ما يستغرق OA التلقائي في المرضى من البشر وقتا طويلا لإنتاج أعراض سريرية مثل الألم المرتبط بالمفاصل6. في المراحل المبكرة من هشاشة العظام ، عادة ما يكون الألم متقطعا ويصبح أكثر تواترا وشدة مع تقدم المرض ، مما يجعله الشكوى السائدة للمرضى7. لذلك ، تم تطوير نماذج حيوانية واسعة النطاق لألم هشاشة العظام على مدى نصف القرن الماضي لتعزيز علاج تخفيف الآلام. تم تقسيم نماذج الزراعة العضوية بشكل كلاسيكي إلى نماذج عفوية ومستحثة. تشمل النماذج التلقائية النماذج التي تحدث بشكل طبيعي والنماذج المعدلة وراثيا ، والتي يمكن أن تحاكي عن كثب مسار الزراعة العضوية الأولية في البشر8. يمكن تقسيم النماذج المستحثة بشكل عام إلى فئتين: 1) الزراعة العضوية بعد الصدمة الناجمة عن الجراحة أو غيرها من الصدمات. أو 2) الحقن داخل المفصل للمواد السامة للغضروف أو المؤيدة للالتهابات3. تضع هذه النماذج أساسا للدراسة الفيزيولوجية المرضية ل OA وتساهم بشكل كبير في تطوير الأدوية لتقليل الألم وزيادة الوظيفة.
في الآونة الأخيرة ، كان المحفز الأكثر استخداما لنمذجة الزراعة العضوية هو أحادي يودواسيتات (MIA). MIA ، مثبط لهيدروجيناز الجلسرينالدهيد -3 فوسفات ، يمكن أن يسبب تغيرات في مصفوفة الغضروف ، والتدهور ، وفقدان الغضروف ، والتهاب الغشاء المفصلي وغيرها من التغييرات ، والتي تشبه التغيرات المرضية لالتهاب المفاصل البشري9. وقد لوحظ أن الحقن داخل المفصل من MIA تسبب في ألم مستمر في 28 يوما بعد إعطاء MIA ، مما يشير إلى أن نموذج MIA قد يكون مفيدا للتحقيق في ألم مسبب للألم المزمن10،11،12. في هذه الدراسة ، تلقى ذكور فئران Sprague-Dawley حقنا داخل المفصل مع 0.5 أو 1.5 أو 3 ملغ من MIA في مفاصل الركبة. تم قياس شدة آلام المفاصل التي يسببها MIA من خلال تقييم الحساسية الميكانيكية والحرارية في 1 و 7 و 14 و 21 و 28 و 35 يوما بعد الحقن. على هذا الأساس ، تم اختيار 1.5 ملغ من MIA كتركيز نهائي لتقييم أنماط المشي والتغيرات النسيجية في 28 يوما بعد الحقن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل لجنة القواعد والأخلاقيات الطبية بجامعة تشجيانغ الطبية الصينية وهي متوافقة مع التشريعات الصينية بشأن استخدام ورعاية المختبر.
1. الحقن داخل المفصل من أحادي يودواسيتات في الركبة
- بعد أسبوع واحد من التأقلم ، قسم عشوائيا ومتساويا 40 من ذكور فئران Sprague-Dawley التي تزن 180-200 جم (4-5 أسابيع) إلى أربع مجموعات (ن = 10 فئران / مجموعة).
ملاحظة: سيتم حقن الفئران في المجموعة الضابطة داخل المفصل ب 50 ميكرولتر من المحلول الملحي ، بينما سيتم التعامل مع الفئران في المجموعات التجريبية ب 0.5 أو 1.5 أو 3 ملغ من MIA المذاب في 50 ميكرولتر من المحلول الملحي ، على التوالي. - في يوم الحقن ، قم بإعداد محلول MIA حديثا في محلول ملحي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم) بتركيز 15 و 30 و 60 مجم / مل و 10٪ محلول بنتوباربيتال في محلول ملحي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم).
تنبيه: MIA له تأثير مدمر للغاية على الغشاء المخاطي والجهاز التنفسي العلوي والعين والجلد والأنسجة الأخرى. لذلك ، يوصى باستخدام القناع والقفازات عند إعداد الحل. - تخدير الفئران عن طريق حقن الكيتامين داخل الصفاق بمعدل 60 ملغم/كغ والزيلازين عند 5 مغ/كغ (كلاهما محضر في محلول ملحي). المشبك بلطف أصابع الفئران مع ملقط لتأكيد التخدير.
- ضع الجرذ مع ظهره متجها لأسفل. احلق الركبة وامسح المنطقة المحيطة بمفصل الركبة بالكحول.
- حافظ على الركبة بزاوية 90 درجة واكشف عن الوتر الرضفي الأبيض أسفل الرضفة. اضغط على الوتر الرضفي بطرف الإصبع لإيجاد الفجوة أسفل الرضفة.
- اختر تقاطع الفجوة والوتر الرضفي الجانبي كموقع للحقن. ثم أدخل إبرة 26 G عموديا في الموقع حوالي 5 مم. لا ينبغي الشعور بأي مقاومة عندما تكون الإبرة في الفضاء المفصلي.
ملاحظة: من المهم إبقاء الإبرة متعامدة مع موقع الحقن. - حقن 50 ميكرولتر من محلول ملحي أو MIA في تجويف المفصل. اسحب الإبرة ببطء ولف قطعة من الشاش حول موقع الحقن لتقليل الارتجاع والتسرب. بعد الشفاء التخدير ، قم بإزالة الشاش.
- اختبر السلوك المرتبط بالألم في 1 و 7 و 14 و 21 و 28 و 35 يوما بعد الحقن كما هو موضح في القسم 2.
2. التقييمات السلوكية
- عتبة السحب الميكانيكي (MWT)
ملاحظة: تم قياس MWT بواسطة اختبار von Frey13 وكان المراقب أعمى عن الحقن التي تلقتها الحيوانات.- ضع فأرا في قفص بلاستيكي مرتفع (17 سم × 11 سم × 13 سم) مع قاعدة شبكة سلكية معلقة 50 سم فوق طاولة. تأكد من أن بيئة الاختبار هادئة وامنح الجرذ 30 دقيقة للتكيف مع البيئة.
- اضغط على إبرة فون فراي بشكل عمودي على السطح الأخمصي لكل مخلب خلفي لكل فئران. قم بزيادة الضغط تدريجيا (حوالي 20 جم / ثانية) وخطيا حتى يحدث رفع المخلب أو لعق المخلب.
- استخدم قوة أقل من العتبة السابقة للتأكد من أن العتبة هي الحد الأدنى لقوة الانسحاب. اختبر كل فأر أكثر من ثلاث مرات ، على الأقل 3-5 دقائق.
- سجل الحد الأدنى من القوة التي تثير منعكس سحب المخلب. متوسط البيانات مثل MWT من الفئران.
- زمن انتقال السحب الحراري (TWL)
ملاحظة: تم قياس TWL باستخدام جهاز الاختبار الأخمصي (جدول المواد) وكان المراقب أعمى عن الحقن التي تلقتها الحيوانات.- ضع صندوقا زجاجيا شبكيا (60 سم × 20 سم × 14 سم ، مقسم إلى 6 مقصورات) على صفيحة زجاجية بسمك 3 مم ، وضع الفئران في الصندوق (واحد في كل حجرة). تأكد من أن البيئة هادئة ودرجة حرارة الغرفة ثابتة.
- امنح الفئران 30 دقيقة للتكيف مع بيئة الاختبار.
- معايرة التحفيز الحراري عبر مقياس الإشعاع بالأشعة تحت الحمراء. اضبط شدة الأشعة تحت الحمراء المطلوبة على 70 وحدة.
- ضع باعث / كاشف الأشعة تحت الحمراء على الحاوية مباشرة تحت مركز المخلب الذي يتم اختباره.
- الضغط على زر START . سيبدأ المؤقت تلقائيا. ستقوم وحدة التحكم تلقائيا بإيقاف تشغيل ضوء الأشعة تحت الحمراء وإيقاف المؤقت تماما بمجرد حدوث حركة المخلب.
- سجل وقت رد الفعل عند ظهور انسحاب مخلب ولعق مخلب.
ملاحظة: تعتبر الاستجابة الإيجابية للاختبار بمثابة انسحاب مخلب ولعق مخلب. إذا حدث انسحاب مخلب فقط ، فيجب اعتباره حركة طوعية للفأر وليس استجابة إيجابية. - كرر الاختبار أكثر من ثلاث مرات. متوسط البيانات مثل TWL من الفئران.
ملاحظة: يجب ألا يتجاوز كل تعرض للحرارة المشعة 20 ثانية. يجب أن تكون محفزات الأشعة تحت الحمراء على نفس المخلب الخلفي على بعد 3-5 دقائق على الأقل.
- تحليلات نمط المشي
ملاحظة: تم قياس تحليلات نمط المشي باستخدام نظام التصوير (جدول المواد) وكان المراقب أعمى عن الحقن التي تلقتها الحيوانات.- اضبط طول حجرة المشي باستخدام المقابض الموجودة على طرفي حجرة المشي بطول مناسب للفئران (على سبيل المثال ، 61 سم).
- ضع فأرا في حجرة المشي وقم بتدريب الفئران للقيام بجولات متواصلة لمدة 5 دورات على الأقل بسرعة 18 سم / ثانية قبل التجربة الرسمية.
ملاحظة: عندما يتم وضع الجرذ لأول مرة في حجرة المشي ، يمكن ضبط السرعة على حوالي 20 سم / ثانية وإغلاقها عند الجري حوالي 2 ثانية. ثم اضبط السرعة على 18 سم / ثانية. اضغط برفق على الجزء الخلفي من الجرذ مع القسم ، إذا توقف الجرذ مؤقتا أو تراجع أثناء المشي. حاول تقليل السرعة تدريجيا من 18 سم / ثانية إلى 10 سم / ثانية. إذا فشل الجرذ في النهاية في إجراء الاختبار ، فمن المقبول اختيار فأر آخر للاختبار. - قم بزيادة سرعة جهاز المشي ببطء حتى تصل إلى السرعة المستهدفة (18 سم / ثانية). التقط ما لا يقل عن 5 ثوان من الفيديو للحركة المستمرة للفأر باستخدام كاميرا الفيديو الرقمية عالية السرعة المثبتة أسفل حزام جهاز المشي الشفاف.
- اختبر كل فأر على بعد 5 دقائق على الأقل للحصول على ثلاثة أشواط متواصلة على الأقل.
- ارسم "مربعا محيطا" لتحديد حدود صورة مشي الحيوان في برنامج التصوير وأدخل سرعة التشغيل لكل فيديو. حدد مقاطع الفيديو كمجموعة وقم بمعالجة مقاطع الفيديو تلقائيا بواسطة البرنامج. بعد معالجة مقاطع الفيديو ، سيقوم البرنامج بإخراج العديد من جداول البيانات للإبلاغ عن مؤشرات المشي ، بما في ذلك الموقف ، والتأرجح ، والكبح ، والدفع ، والإيقاع ، وتسلسل الخطوات ، وما إلى ذلك.
- احسب إجمالي مساحة المخلب (سم2) ، ومتوسط طول الخطوة (سم) ، وتوحيد طول الخطوة.
ملاحظة: إجمالي مساحة المخلب هو متوسط المساحة الإجمالية لأربعة مخالب لكل مجموعة من الفئران ويتم تعريف منطقة المخلب على أنها أقصى مساحة مخلب ملامسة لجهاز المشي خلال مرحلة الوقوف من دورة الخطوة. طول الخطوة هو المسافة بين جهات الاتصال الأولية لنفس المخلب في خطوة واحدة كاملة. طول الخطوة = متوسط طول الخطوة (سم) / طول الجسم (سم).
3. التحاليل النسيجية والكيميائية المناعية
- القتل الرحيم للفئران عن طريق حقن الصوديوم الخماسي داخل الصفاق بمعدل 150 مغ/كغ (محضر في محلول ملحي). استئصال مفاصل الركبة على الفور لإجراء التحليلات النسيجية.
- ثبت المفاصل في 10٪ فورمالين لمدة 24 ساعة ، وقم بإزالة الكلس بنسبة 10٪ EDTA في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 8 أسابيع ، ثم قم بتضمين المفاصل في البارافين.
تنبيه: يمكن أن يسبب الفورمالين تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي. يجب التعامل معها في غطاء محرك السيارة. - قسم وصلات البارافين المدمجة بسمك 3 مم مع ميكروتوم وتطفو في حمام مائي 40 درجة مئوية يحتوي على الماء المقطر.
- نقل الأقسام على شرائح زجاجية. جفف الشرائح طوال الليل وقم بتخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة (RT) لمواصلة التلوين التالي.
- توضع الشرائح في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لإزالة البارافين.
- اغمر الشرائح على التوالي في الزيلين والزيلين والإيثانول 100٪ والإيثانول 100٪ والإيثانول 95٪ والإيثانول 80٪ والإيثانول 75٪ لمدة 5 دقائق على التوالي في RT.
- أقسام البقع مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) ، سافرانين-O (SO) والهيماتوكسيلين الأزرق Alcian (ABH) وكذلك الأجسام المضادة ضد كولاجين الفئران من النوع الثاني (Col2) ، الكولاجين من النوع X (Col10) ومصفوفة ميتالوبروتيناز 13 (MMP13) ، كما هو موضح في الخطوات 3.8-3.12.
- تلطيخ H&E
- اشطف الشرائح باستخدام H2 O منزوع الأيونات لمدة 3 دقائق. وصمة عار الشرائح مع الهيماتوكسيلين لمدة 3-5 دقائق.
- شطف الشرائح مع H2O 3x منزوع الأيونات ، 1 دقيقة لكل منهما ، حتى لا يبقى الهيماتوكسيلين على السطح.
- وصمة عار الشرائح مع eosin لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، اشطف الشرائح باستخدام H2O 3x منزوع الأيونات ، 1 دقيقة لكل منهما ، حتى لا يبقى أي يوزين على السطح.
- اغمر الشرائح في 0.1٪ أمونيا لمدة 10-20 ثانية. ثم ، شطف الشرائح مع H2O 3x منزوع الأيونات ، 1 دقيقة لكل منهما.
- اغمر الشرائح على التوالي في 95٪ إيثانول ، 100٪ إيثانول ، زيلين ، زيلين وزيلين لمدة 1 دقيقة ، على التوالي.
- قم بتغطية الشرائح بواسطة راتنج محايد.
- تلطيخ جدا
- اشطف الشرائح باستخدام H2 O منزوع الأيونات لمدة 3 دقائق. وصمة عار الشرائح مع الهيماتوكسيلين لمدة 3-5 دقائق.
- التفريق بسرعة في 1 ٪ من الكحول الحمضي (حوالي 3 ثوان). بعد ذلك ، اشطف الشرائح باستخدام H2O 3x منزوع الأيونات ، 1 دقيقة لكل منهما ، حتى لا يبقى الهيماتوكسيلين على السطح.
- شرائح البقع بمحلول Fast Green (FCF) لمدة 5 دقائق. ثم ، شطف الشرائح مع H2O 3x منزوع الأيونات ، 1 دقيقة لكل منهما.
- شرائح وصمة عار مع SO لمدة 1-2 دقيقة. ثم ، شطف الشرائح مع H2O 3x منزوع الأيونات ، 1 دقيقة لكل منهما.
- شطف الشرائح مع 1 ٪ حمض الخليك لمدة 1-2 دقيقة لإزالة FCF المتبقية. شطف الشرائح مع H2O منزوع الأيونات لمدة 1 دقيقة.
- اغمر الشرائح على التوالي في 95٪ إيثانول ، 100٪ إيثانول ، زيلين ، زيلين وزيلين لمدة 1 دقيقة ، على التوالي.
- قم بتغطية الشرائح بواسطة راتنج محايد.
- تلطيخ ABH
- اشطف الشرائح باستخدام H2 O منزوع الأيونات لمدة 3 دقائق. اغمر الشرائح في 1٪ كحول حمضي لمدة 30 ثانية وصفيها لفترة وجيزة على منشفة ورقية (لا تشطف).
- اغمر الشرائح في ABH لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، اشطف الشرائح باستخدام H2O 3x منزوع الأيونات ، 1 دقيقة لكل منهما ، حتى لا يبقى ABH على السطح.
- التفريق بسرعة في 1 ٪ من الكحول الحمضي (حوالي 3 ثوان). شطف الشرائح مع منزوع الأيونات H2O 3x ، 1 دقيقة لكل منهما.
- اغمر الشرائح في 0.5٪ ماء الأمونيوم لمدة 15 ثانية. ثم ، شطف الشرائح مع H2O 3x منزوع الأيونات ، 1 دقيقة لكل منهما.
- اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة. اغمر الشرائح في محلول eosin / orange G لمدة 1.5 دقيقة.
- اغمر الشرائح على التوالي في 95٪ إيثانول ، 100٪ إيثانول ، زيلين ، زيلين وزيلين لمدة 1 دقيقة ، على التوالي.
- قم بتغطية الشرائح بواسطة راتنج محايد.
- افحص جميع الشرائح تحت المجهر وصنفها إحصائيا على مقياس من 0 إلى 13 عن طريق الملاحظة مزدوجة التعمية ، وفقا لنظام تسجيل مانكين14.
- الكيمياء الهيستولوجية المناعية
- اشطف الشرائح باستخدام H2 O منزوع الأيونات لمدة 3 دقائق.
- اغمر الشرائح في سترات الصوديوم 0.1 متر وضع الشرائح في فرن 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لاسترداد المستضد.
- اغمر الشرائح في 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق. ثم ، شطف الشرائح مع PBS 2x ، 3 دقائق لكل منهما.
- احتضان أقسام في محلول 3٪ H 2 O2في الميثانولفي RT لمدة 10 دقائق لمنع نشاط البيروكسيديز الداخلي. شطف الشرائح مع PBS 2x ، 3 دقائق لكل منهما.
- احتضان أقسام تحتوي على 5٪ مصل ماعز في PBS لمدة 30 دقيقة في RT لمنع أي ارتباط غير محدد. شطف الشرائح مع PBS 2x ، 3 دقائق لكل منهما.
- احتضان الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة من PBS (1: 1000) ضد كولاجين الفئران من النوع الثاني (Col2) والكولاجين من النوع X (Col10) ومصفوفة ميتالوبروتيناز 13 (MMP13). شطف الشرائح مع PBS 2x ، 3 دقائق لكل منهما.
- احتضان أقسام تحتوي على 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف من PBS (1: 1000) (ثانوي مضاد للفأر أو ثانوي مضاد للفأر من الماعز) لمدة 20 دقيقة في RT. شطف الشرائح مع PBS 2x ، 3 دقائق لكل منهما.
- احتضان الأقسام مع 100 ميكرولتر من حل العمل 3،3′-ديامينوبنزيدين (DAB). راقب التفاعل لأن التفاعل الكروموجيني يحول مواقع الخاتمة إلى اللون البني.
تحذير: DAB مادة مسرطنة. دائما ارتداء القفازات والعمل في غطاء محرك السيارة عند العمل مع DAB.
ملاحظة: قد يختلف وقت تطوير اللون من بضع ثوان إلى 10 دقائق. - بمجرد أن يتطور اللون البني على الأقسام ، اشطف الشرائح باستخدام H2O 2x منزوع الأيونات ، 3 دقائق لكل منهما.
- اغمر الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة 1-2 دقيقة لمواجهة الشرائح. ثم ، شطف الشرائح مع H2O 3x منزوع الأيونات ، 1 دقيقة لكل منهما.
- اغمر الشرائح على التوالي في 95٪ إيثانول ، 100٪ إيثانول ، زيلين ، زيلين وزيلين لمدة 1 دقيقة ، على التوالي.
- قم بتغطية الشرائح بواسطة راتنج محايد.
- راقب لون تلطيخ الأجسام المضادة في الأقسام الموجودة تحت المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذه المنهجية ، أنشأنا نموذجا لألم الزراعة العضوية في الفئران واكتشفنا التغييرات الناتجة. يعكس MWT و TWL الألم الخيفي الميكانيكي وفرط التألم الحراري ، على التوالي. كما هو موضح في الشكل 1 ، فإن MIA الناجم عن ألم خيفي ميكانيكي وفرط التألم الحراري موجود بطريقة تعتمد على الجرعة. ومن اللافت للنظر أن انخفاض MWT وصل إلى ذروته من 21 يوما إلى 28 يوما ، ثم انتعش ، مما يشير إلى أن إصلاح المفاصل قد يحدث في هذه المرحلة ، لكن MWT من مجموعة 3 mg MIA كانت لا تزال عند مستوى منخفض. كان تغيير TWL متسقا تقريبا مع MWT (الشكل 2).
على هذا الأساس ، اخترنا 1.5 ملغ من MIA كجرعة نهائية وقيمنا أنماط المشي والتغيرات النسيجية في 28 يوما بعد الحقن. تعكس معلمات المشي (إجمالي مساحة المخلب وطول خطوة الوحدة) السلوكيات المرتبطة بالألم. انخفضت مستويات معلمات المشي بما في ذلك إجمالي مساحة المخلب (الشكل 3 أ) وطول خطوة الوحدة (الشكل 3 ب) بشكل كبير في مجموعة MIA بعد 28 يوما ، مما يشير إلى أن MIA تسبب في آلام المفاصل المرتبطة بهشاشة العظام في الفئران. مع زيادة درجة مانكين على الشرائح النسيجية المرضية ، شوهد انحطاط الغضروف ، وتعطيل الكولاجين ، وعدم تنظيم المصفوفة بشكل واضح في مجموعة MIA (الشكل 4). كما هو موضح في الشكل 5 ، تسبب 1.5 ملغ من MIA في تنظيم كبير ل MMP13 و Col10 ، وانخفاض كبير في تنظيم Col2.
الشكل 1: تطوير MTW بعد حقن MIA. تم تقييم عتبات السحب الميكانيكي للمخالب الخلفية بعد حقن MIA (0.5 ، 1.5 ، أو 3 مجم / فئران) ومحلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) ، n = 10 فئران / مجموعة. يتم عرض القيم كمتوسط ± SD. ** P < 0.01 مقابل المجموعة المعالجة بالمحلول الملحي ؛ تحليل التباين الأحادي أحادي الاتجاه متبوعا بمقارنة فيشر للفرق الأقل أهمية (LSD). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تطور TWL بعد حقن MIA. تم تقييم كمون السحب الحراري للمخالب الخلفية بعد حقن MIA (0.5 ، 1.5 ، أو 3 مجم / فئران) ومحلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) ، n = 10 فئران / مجموعة. يتم عرض القيم كمتوسط ± SD. ** P < 0.01 مقابل المجموعة المعالجة بالمحلول الملحي (NC) ؛ أحادي الاتجاه ANOVA متبوعا بمقارنة LSD فيشر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحليل المشي بعد 28 يوما من حقن MIA. (أ) إجمالي مساحة المخلب (سم2). إجمالي مساحة المخلب: متوسط المساحة الإجمالية لأربعة مخالب لكل مجموعة من الفئران. (ب) وحدة طول الخطوة. طول الخطوة = متوسط طول الخطوة (سم) / طول الجسم (سم). ن = 10 فئران / مجموعة. يتم تقديم القيم كمتوسط ± SD. ## P < 0.01 مقابل المجموعة المعالجة بالمحلول الملحي (NC) في اليوم 28. تم تعديل هذا الرقم من Yan et al.15. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: الملاحظة النسيجية المرضية (تلطيخ HE، SO، و AHB) وتسجيل مانكين لمفاصل ركبة الفئران في اليوم 28 بعد علاج MIA. ن = 10 فئران / مجموعة. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. يتم تقديم القيم كمتوسط ± SD. # #P < 0.01 مقابل المجموعة المعالجة بالمحلول الملحي (NC). أحادي الاتجاه ANOVA متبوعا بمقارنة LSD فيشر. تم تعديل هذا الرقم من Yan et al.16. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: الملاحظة المناعية الكيميائية لتعبيرات MMP13 و Col2 و Col10 في غضروف الفئران في اليوم 28. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. N = 10 فئران / مجموعة. تم تعديل هذا الرقم من Yan et al.16. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج الفئران من الزراعة العضوية التي يسببها MIA هو نموذج راسخ ومستخدم على نطاق واسع. يسبب الحقن داخل المفصل من MIA في البداية التهابا حادا وحادا ، مما يؤدي إلى المرحلة الأطول والتنكسية من OA17,18. في هذا البحث ، قمنا بقياس حساسية مسبب للألم بواسطة MWT و TWL ، وقمنا بتقييم تغيرات المشي باستخدام نظام التصوير. وجدت التقارير السابقة أن حقن MIA يمكن أن يرفع حساسية ألياف مفصل الركبة الواردة مما يؤدي إلى nociception ، وهو ما ينعكس من فرط التألم الحراري وانخفاض العتبة الميكانيكية19,20. لقد ثبت أن تغيرات المشي كانت مرتبطة بتحسين nociception ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام أنماط المشي لتقييم نماذج الألم21. وفقا لذلك ، تستخدم النماذج التي يسببها MIA بشكل أساسي لتقييم الألم المرتبط بهشاشة العظام وفحص الأدوية الفموية وكذلك أدوية حقن المفاصل 3,6.
على الرغم من مقارنته بنموذج الزراعة العضوية المستحث جراحيا ، إلا أنه من الأسهل والأسرع حقن MIA في تجويف المفصل ، لا تزال هناك نقاط حرجة في النمذجة. بادئ ذي بدء ، فإن التجويف المفصلي للفئران صغير ، ويجب تأكيد موقعه قبل الحقن. ثانيا ، MIA سامة ، وبالتالي يجب اختيار جرعة MIA بعناية. تم الإبلاغ عن أن MIA يمكن أن يؤدي إلى تلف الغضروف المفصلي بطريقة تعتمد على الجرعة والوقت (يتم تقييمها من خلال النتيجة النسيجية OARSI ودرجة Mankin) ، مما يشير إلى أنه يمكن تعديل تطور وشدة الآفات المفصلية من خلال تنظيم تركيز MIA22,23. تم العثور على MIA للحث على الألم وعلامات الإجهاد التأكسدي بجرعات عالية10،18،24. أشارت التقارير السابقة إلى أن جرعة 1.5 ملغ من حقن MIA في الفئران أنتجت عملية التهابية تشبه OA18,25 في ركبة الإنسان. إلى جانب ذلك ، من المهم استخدام نفس المجرب طوال الاختبار السلوكي وتعريف الفئران بالبيئة مسبقا ، لتقليل القلق وتجنب التأثير على النتائج التجريبية.
كما ذكر أعلاه ، تنقسم النماذج الحيوانية OA عادة إلى نماذج عفوية ومستحثة. يستخدم الحقن داخل المفصل من MIA على نطاق واسع بسبب العديد من المزايا: 1) عملية بسيطة. 2) سهولة الحث والتكاثر. 3) جرعة يمكن السيطرة عليها وشدة. 4) وقت النمذجة قصيرة. و 5) ملاءمة للحيوانات الصغيرة وكذلك الحيوانات الكبيرة. ومع ذلك ، مثل النماذج الحيوانية الأخرى ، فإن نماذج الزراعة العضوية التي يسببها MIA لها أيضا العديد من العيوب. موت الخلايا على نطاق واسع وتدمير المفاصل السريع بعد حقن MIA لا تتفق مع الزراعة العضوية التلقائية أو ما بعد الصدمة في البشر26. علاوة على ذلك ، قد يؤثر MIA المتبقي في التجويف المفصلي على تأثيرات العلاجات اللاحقة داخل المفصل ، مما يؤدي إلى نتيجة غير مؤكدة باستخدام نموذج MIA. ما إذا كان يجب غسل التجويف المفصلي قبل الحقن العلاجي في هذا النموذج أم لا يبقى سؤالا بلا إجابة. بشكل عام ، لا يوجد نموذج حيواني واحد يلخص بشكل مثالي جميع جوانب الزراعة العضوية البشرية ، ولكن المجموعة الواسعة من النماذج المتاحة تجعل من الممكن تطبيق نماذج متعددة على معظم الأسئلة ذات الصلة صناعيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة تشجيانغ في الصين (رقم المنحة: LY17H270016) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة: 81774331 و 81873049 و 81673997) ، ومشروع العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة تشجيانغ للطب الصيني التقليدي في الصين (رقم المنحة: 2013ZQ007 و 2016ZZ011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam(UK) | 34712 | Primary antibody for immunohistochemistry (IHC) |
| Anti-Collagen X (Col10) antibody | Abcam(UK) | 49945 | Primary antibody for IHC |
| DigiGait Imaging System | Mouse Specifics (Boston, MA, USA) | Equipment for gait patterns analyses | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| MIA | Sigma-Aldrich | I4386-10G | powder |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks. |
| Plantar Test apparatus | UgoBasile (Italy) | 37370 | Equipment for TWL assay |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China) | RR037A | Extracte total RNA from cultured cells |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections. |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor |
References
- Hunter, D. J., Schofield, D., Callander, E. The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 437-441 (2014).
- Neogi, T. The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 21 (9), 1145-1153 (2013).
- Teeple, E., Jay, G. D., Elsaid, K. A., Fleming, B. C. Animal models of osteoarthritis: challenges of model selection and analysis. AAPS Journal. 15 (2), 438-446 (2013).
- Woolf, A. D., Pfleger, B.
- Bijlsma, J. W., Berenbaum, F., Lafeber, F. P. Osteoarthritis: an update with relevance for clinical practice. Lancet. 377 (9783), 2115-2126 (2011).
- McCoy, A. M. Animal Models of Osteoarthritis: Comparisons and Key Considerations. Veterinary Pathology. 52 (5), 803-818 (2015).
- O'Neill, T. W., Felson, D. T.
- Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, 19 (2016).
- Takahashi, I., Matsuzaki, T., Hoso, M. Long-term histopathological developments in knee-joint components in a rat model of osteoarthritis induced by monosodium iodoacetate. Journal of Physical Therapy Science. 29 (4), 590-597 (2017).
- Liu, P., et al.
- Combe, R., Bramwell, S., Field, M. J. The monosodium iodoacetate model of osteoarthritis: a model of chronic nociceptive pain in rats. Neuroscience Letters. 370 (2-3), 236-240 (2004).
- Pomonis, J. D., et al. Development and pharmacological characterization of a rat model of osteoarthritis pain. Pain. 114 (3), 339-346 (2005).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. 53 (3), 523-537 (1971).
- Yan, L., et al. Chondroprotective effects of platelet lysate towards monoiodoacetate-induced arthritis by suppression of TNF-α-induced activation of NF-ĸB pathway in chondrocytes. Aging. 11 (9), 2797-2811 (2019).
- Yan, B., et al. Intra-Articular Injection of Extract Attenuates Pain Behavior and Cartilage Degeneration in Mono-Iodoacetate Induced Osteoarthritic Rats. Frontiers in Pharmacology. 9, 1360 (2018).
- Wang, C., et al. Agkistrodon ameliorates pain response and prevents cartilage degradation in monosodium iodoacetate-induced osteoarthritic rats by inhibiting chondrocyte hypertrophy and apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 231, 545-554 (2019).
- Yamada, E. F., et al. Evaluation of monosodium iodoacetate dosage to induce knee osteoarthritis: Relation with oxidative stress and pain. International Journal of Rheumatic Diseases. 22 (3), 399-410 (2019).
- Schuelert, N., McDougall, J. J. Electrophysiological evidence that the vasoactive intestinal peptide receptor antagonist VIP6-28 reduces nociception in an animal model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (11), 1155-1162 (2006).
- Lee, S. E. Choline, an alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist, alleviates hyperalgesia in a rat osteoarthritis model. Neuroscience Letters. 548, 291-295 (2013).
- Piesla, M. J., et al. Abnormal gait, due to inflammation but not nerve injury, reflects enhanced nociception in preclinical pain models. Brain Research. 1295, 89-98 (2009).
- Udo, M., et al. Monoiodoacetic acid induces arthritis and synovitis in rats in a dose- and time-dependent manner: proposed model-specific scoring systems. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1284-1291 (2016).
- Guingamp, C., et al. Mono-iodoacetate-induced experimental osteoarthritis: a dose-response study of loss of mobility, morphology, and biochemistry. Arthritis & Rheumatism. 40 (9), 1670-1679 (1997).
- Jeong, J. H., et al. Eupatilin Exerts Antinociceptive and Chondroprotective Properties in a Rat Model of Osteoarthritis by Downregulating Oxidative Damage and Catabolic Activity in Chondrocytes. PLoS ONE. 10 (6), 0130882 (2015).
- Cook, J. L., et al.
- Little, C. B., Zaki, S. What constitutes an "animal model of osteoarthritis"--the need for consensus. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (4), 261-267 (2012).
