Summary
Deze studie beschrijft de methode van intra-articulaire injectie van mono-jodoacetaat bij ratten en bespreekt de resulterende pijngerelateerde gedragingen en histopathologische veranderingen, die referenties bieden voor toekomstige toepassingen.
Abstract
De huidige diermodellen van artrose (OA) kunnen worden onderverdeeld in spontane modellen en geïnduceerde modellen, die beide gericht zijn op het simuleren van de pathofysiologische veranderingen van menselijke artrose. Als het belangrijkste symptoom in het late stadium van artrose beïnvloedt pijn echter het dagelijks leven van de patiënten en er zijn niet veel beschikbare modellen. Het mono-jodoacetaat (MIA)-geïnduceerde model is het meest gebruikte OA-pijnmodel, voornamelijk gebruikt bij knaagdieren. MIA is een remmer van glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase, die chondrocytendood, kraakbeendegeneratie, osteofyt en meetbare veranderingen in het gedrag van dieren veroorzaakt. Bovendien kunnen expressieveranderingen van matrix metalloproteinase (MMP) en pro-inflammatoire cytokines (IL1 β en TNF α) worden gedetecteerd in het MIA-geïnduceerde model. Die veranderingen komen overeen met OA pathofysiologische aandoeningen bij mensen, wat aangeeft dat MIA een meetbaar en succesvol OA-pijnmodel kan induceren. Deze studie heeft tot doel de methodologie van intra-articulaire injectie van MIA bij ratten te beschrijven en de resulterende pijngerelateerde gedragingen en histopathologische veranderingen te bespreken.
Introduction
Artrose (OA) is de meest voorkomende gewrichtsziekte ter wereld en treft naar schatting 10-12% populaties bij volwassenen1. Het meest betrokken gewricht is de knie en artrose heeft een hogere incidentie bij oudere volwassenen, vooral vrouwen2. Als chronische ziekte ontwikkelt artrose zich geleidelijk gedurende tientallen jaren tot gewrichtsfalen met symptomen zoals kraakbeenverlies, synoviale ontsteking, osteofytose, verminderde functie en chronische pijn3. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) is artrose de vierde meest voorkomende ziekte bij vrouwen en de achtste meest voorkomende ziekte bij mannen. Tegen 2020 kan artrose de vierde meest invaliderende ziekte bij mensen worden4. Momenteel beschikbare therapieën van artrose pakken echter alleen de symptomen aan en verlengen de tijd tot gewrichtsvervangende chirurgie5.
De spontane artrose bij menselijke patiënten duurt vaak lang om klinische symptomen te veroorzaken, zoals gewrichtsgerelateerde pijn6. In de vroege stadia van artrose is pijn meestal intermitterend en wordt frequenter en ernstiger naarmate de ziekte vordert, waardoor het de overheersende klacht van patiëntenis 7. Daarom zijn er de afgelopen halve eeuw uitgebreide diermodellen voor artrosepijn ontwikkeld om pijnbestrijdingstherapie te bevorderen. OA-modellen zijn klassiek onderverdeeld in spontane en geïnduceerde modellen. Spontane modellen omvatten natuurlijk voorkomende modellen en genetisch gemodificeerde modellen, die het verloop van primaire artrose bij mensen beter kunnen simuleren8. Geïnduceerde modellen kunnen over het algemeen worden onderverdeeld in twee categorieën: 1) posttraumatische artrose geïnduceerd door chirurgie of ander trauma; of 2) intra-articulaire injectie van chondrotoxische of pro-inflammatoire stoffen3. Deze modellen leggen een basis voor de pathofysiologische studie van artrose en dragen sterk bij aan de ontwikkeling van geneesmiddelen om pijn te verminderen en de functie te verhogen.
Onlangs is de meest gebruikte inductor voor OA-modellering mono-jodoacetaat (MIA). MIA, een remmer van glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase, kan veranderingen in kraakbeenmatrix, afbraak, verlies van kraakbeen, synovitis en andere veranderingen veroorzaken, die vergelijkbaar zijn met de pathologische veranderingen van menselijke artrose9. Er is opgemerkt dat intra-articulaire injectie van MIA aanhoudende pijn veroorzaakte 28 dagen na toediening van MIA, wat aangeeft dat het MIA-model nuttig kan zijn voor het onderzoeken van chronische nociceptieve pijn 10,11,12. In deze studie kregen mannelijke Sprague-Dawley-ratten intra-articulaire injecties met 0,5, 1,5 of 3 mg MIA in de kniegewrichten. De ernst van MIA-geïnduceerde gewrichtspijn werd gemeten door beoordeling van mechanische en thermische gevoeligheid op 1, 7, 14, 21, 28 en 35 dagen na injecties. Op basis hiervan werd 1,5 mg MIA geselecteerd als de uiteindelijke concentratie om looppatronen en histologische veranderingen te evalueren 28 dagen na injecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures met betrekking tot dierlijke proefpersonen zijn goedgekeurd door de Medical Norms and Ethics Committee van Zhejiang Chinese Medical University en zijn in overeenstemming met de Chinese wetgeving inzake het gebruik en de verzorging van proefdieren.
1. Intra-articulaire injectie van mono-jodoacetaat in de knie
- Na een week acclimatisatie, willekeurig en gelijk verdelen 40 mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 180−200 g (4−5 weken oud) in vier groepen (n = 10 ratten /groep).
OPMERKING: Ratten in de controlegroep zullen intra-articulaire injectie worden geïnjecteerd met 50 μL zoutoplossing, terwijl ratten in de experimentele groepen zullen worden behandeld met 0,5, 1,5 of 3 mg MIA opgelost in respectievelijk 50 μL zoutoplossing. - Bereid op de dag van injectie de oplossing van MIA vers in steriele zoutoplossing (0,9% NaCl) bij een concentratie van 15, 30 en 60 mg / ml en 10% pentobarbitale oplossing in steriele zoutoplossing (0,9% NaCl).
LET OP: MIA heeft een extreem destructief effect op het slijmvlies, de bovenste luchtwegen, het oog en de huid en ander weefsel. Daarom worden masker en handschoenen aanbevolen bij het bereiden van een oplossing. - Anesthetine ratten door intraperitoneale injectie van ketamine in 60 mg/kg en xylazine in 5 mg/kg (beide bereid in zoutoplossing). Klem de tenen van de rat voorzichtig vast met een pincet om de anesthesie te bevestigen.
- Plaats de rat met zijn rug naar beneden gericht. Scheer de knie en veeg het gebied rond het kniegewricht af met alcohol.
- Houd de knie in een hoek van 90° en onthul de witte patellapees onder de patella. Druk met de vingertop op de patellapees om de opening onder de patella te vinden.
- Kies de kruising van de opening en de laterale patellapees als injectieplaats. Steek vervolgens de naald van 26 G verticaal in de plaats van ongeveer 5 mm. Er mag geen weerstand worden gevoeld wanneer de naald zich in de gewrichtsruimte bevindt.
OPMERKING: Het is belangrijk om de naald loodrecht op de injectieplaats te houden. - Injecteer 50 μL zoutoplossing of MIA-oplossing in de gewrichtsholte. Trek langzaam de naald eruit en wikkel een stuk gaas rond de injectieplaats om reflux en lekkage te minimaliseren. Verwijder na anesthesieherstel het gaas.
- Test pijngerelateerd gedrag op 1, 7, 14, 21, 28 en 35 dagen na injecties zoals beschreven in rubriek 2.
2. Gedragsbeoordelingen
- Mechanische onttrekkingsdrempel (MWT)
OPMERKING: De MWT werd gemeten door de von Frey-test13 en de waarnemer was blind voor de injecties die de dieren hadden gekregen.- Plaats een rat in een verhoogde plastic kooi (17 cm x 11 cm x 13 cm) met een gaasbasis die 50 cm boven een tafel hangt. Zorg ervoor dat de testomgeving stil is en geef de rat 30 minuten om zich aan te passen aan de omgeving.
- Druk de von Frey naald loodrecht op het plantaire oppervlak van de achterpoot van elke rat. Verhoog de druk geleidelijk (ongeveer 20 g/s) en lineair totdat het poten tillen of likken van de poot optreedt.
- Gebruik een kracht die lager is dan de vorige drempel om ervoor te zorgen dat de drempel de minimale terugtrekkingskracht is. Test elke rat meer dan drie keer, met een tussenpoos van ten minste 3−5 minuten.
- Noteer de minimale kracht die een pootonttrekkingsreflex oproept. Gemiddelde van de gegevens als de MWT van ratten.
- Thermische terugtrekkingslatentie (TWL)
OPMERKING: De TWL werd gemeten met behulp van het plantaire testapparaat (Tabel van Materialen) en de waarnemer was blind voor de injecties die de dieren hadden gekregen.- Plaats een plexiglas doos (60 cm x 20 cm x 14 cm, verdeeld in 6 compartimenten) op een 3 mm dikke glasplaat en plaats ratten in de doos (één in elk compartiment). Zorg ervoor dat de omgeving stil is en de kamertemperatuur constant is.
- Geef ratten 30 minuten de tijd om zich aan te passen aan de testomgeving.
- Kalibreer de thermische stimulus via de infrarood radiometer. Stel de gewenste infraroodintensiteit in op 70 eenheden.
- Plaats de infrarood straler/detector op de container direct onder het midden van de te testen poot.
- Druk op de START-knop . De timer start automatisch. De controller schakelt automatisch het infraroodlicht uit en stopt de timer helemaal zodra er beweging van de poot optreedt.
- Noteer de reactietijd bij het verschijnen van pootonttrekking en poot likken.
OPMERKING: Een positieve reactie op de test wordt beschouwd als het terugtrekken van de poot en het likken van de poot. Als alleen pootonttrekking plaatsvindt, moet dit worden beschouwd als een vrijwillige beweging van de rat in plaats van een positieve reactie. - Herhaal de test meer dan drie keer. Gemiddelde van de gegevens als de TWL van ratten.
OPMERKING: Elke blootstelling aan stralingswarmte mag niet langer zijn dan 20 s. Infraroodstimulaties op dezelfde achterpoot moeten minstens 3−5 minuten uit elkaar liggen.
- Looppatroonanalyses
OPMERKING: De looppatroonanalyses werden gemeten met behulp van een beeldvormingssysteem (Tabel van Materialen) en de waarnemer was blind voor de injecties die de dieren hadden gekregen.- Pas de lengte van het loopcompartiment met behulp van de knoppen aan beide uiteinden van het loopcompartiment aan op een geschikte lengte voor ratten (bijv. 61 cm).
- Plaats een rat in het loopcompartiment en train ratten om ononderbroken runs te maken gedurende ten minste 5 stapcycli met een snelheid van 18 cm / s vóór het formele experiment.
OPMERKING: Wanneer een rat voor het eerst in het loopcompartiment wordt geplaatst, kan de snelheid worden ingesteld op ongeveer 20 cm / s en worden uitgeschakeld bij het rennen rond 2 s. Stel vervolgens de snelheid in op 18 cm/s. Tik zachtjes op de achterkant van de rat met de scheidingswand, als de rat pauzeert of zich terugtrekt tijdens het lopen. Probeer de snelheid geleidelijk te verlagen van 18 cm/s naar 10 cm/s. Als de rat er uiteindelijk niet in slaagt om de test uit te voeren, is het acceptabel om een andere rat voor de test te kiezen. - Verhoog langzaam de snelheid van de loopband totdat deze de doelsnelheid (18 cm / s) bereikt. Leg ten minste 5 s video van continue beweging van de rat vast met de snelle digitale videocamera die onder de transparante loopband is gemonteerd.
- Test elke rat met een tussenpoos van ten minste 5 minuten om ten minste drie ononderbroken runs te verkrijgen.
- Teken een "selectiekader" om de grens van het loopbeeld van het dier in de beeldvormingssoftware te definiëren en voer de loopsnelheid voor elke video in. Selecteer video's als een groep en verwerk video's automatisch door de software. Na het verwerken van video's zal de software verschillende spreadsheets uitvoeren om loopindices te rapporteren, waaronder houding, swing, remmen, voortstuwing, cadans, stappenvolgorde, enz.
- Bereken het totale pootoppervlak (cm2), de gemiddelde paslengte (cm) en de paslengte.
OPMERKING: Het totale pootoppervlak is het gemiddelde van de totale oppervlakte van vier poten van elke groep ratten en het pootgebied wordt gedefinieerd als het maximale pootgebied in contact met de loopband tijdens de standfase van de stapcyclus. Paslengte is de afstand tussen de eerste contacten van dezelfde poot in één volledige pas. Eenheidspaslengte = gemiddelde paslengte (cm)/lichaamslengte (cm).
3. Histopathologische en immunohistochemische analyses
- Euthanasie ratten door intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium in 150 mg/kg (bereid in zoutoplossing). Reseceer de kniegewrichten onmiddellijk voor de histologische analyses.
- Fixeer de gewrichten in 10% formaline gedurende 24 uur, ontkalk met 10% EDTA in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 8 weken en integreer vervolgens gewrichten in paraffine.
LET OP: Formaline kan irritatie van ogen, huid en luchtwegen veroorzaken. Het moet in een kap worden behandeld. - Snijd de paraffine ingebedde verbindingen op 3 mm dikte met een microtoom en drijf in een waterbad van 40 °C met gedestilleerd water.
- Breng secties over op glazen dia's. Droog dia's 's nachts en bewaar dia's bij kamertemperatuur (RT) om de volgende vlekken voort te zetten.
- Plaats de glijden gedurende 4 uur in een oven van 60 °C om te deparaffiniseren.
- Dompel de dia's achtereenvolgens onder in xyleen, xyleen, 100% ethanol, 100% ethanol, 95% ethanol, 80% ethanol en 75% ethanol gedurende respectievelijk 5 minuten bij RT.
- Vleksecties met hematoxyline en eosine (H&E), safranine-O (SO) en Alcian blauwe hematoxyline (ABH) evenals antilichamen tegen ratten type II collageen (Col2), type X collageen (Col10) en matrix metalloproteinase 13 (MMP13), zoals beschreven in stap 3.8−3.12.
- H&E vlekken
- Spoelglaasjes met gedeïoniseerd H2O gedurende 3 min. Beitsglaasjes met hematoxyline gedurende 3−5 min.
- Spoelglaasjes met gedeïoniseerd H2O 3x, elk 1 min, totdat er geen hematoxyline op het oppervlak achterblijft.
- Beitsglaasjes met eosine gedurende 30 s. Spoel vervolgens glaasjes met gedeïoniseerde H2O 3x, elk 1 min, totdat er geen eosine op het oppervlak achterblijft.
- Dompel dia's onder in 0,1% ammoniak gedurende 10−20 s. Spoel vervolgens glaasjes met gedeïoniseerde H2O 3x, elk 1 min.
- Dompel dia's achtereenvolgens onder in 95% ethanol, 100% ethanol, xyleen, xyleen en xyleen gedurende respectievelijk 1 min.
- Bedekt de dia's met neutrale hars.
- SO vlekken
- Spoelglaasjes met gedeïoniseerd H2O gedurende 3 min. Beitsglaasjes met hematoxyline gedurende 3−5 min.
- Differentieer snel in 1% zure alcohol (ongeveer 3 s). Spoel vervolgens glaasjes met gedeïoniseerd H2O 3x, elk 1 min, totdat er geen hematoxyline op het oppervlak achterblijft.
- Beitsglaasjes met Fast Green (FCF) oplossing gedurende 5 min. Spoel vervolgens glaasjes met gedeïoniseerde H2O 3x, elk 1 min.
- Beitsglaasjes met SO gedurende 1−2 min. Spoel vervolgens glaasjes met gedeïoniseerde H2O 3x, elk 1 min.
- Spoel glaasjes met 1% azijnzuur gedurende 1−2 min om de resterende FCF te verwijderen. Spoelglaasjes met gedeïoniseerd H2O gedurende 1 min.
- Dompel dia's achtereenvolgens onder in 95% ethanol, 100% ethanol, xyleen, xyleen en xyleen gedurende respectievelijk 1 min.
- Bedekt de dia's met neutrale hars.
- ABH vlekken
- Spoelglaasjes met gedeïoniseerd H2O gedurende 3 min. Dompel dia's onder in 1% zure alcohol gedurende 30 s en laat kort uitlekken op een papieren handdoek (niet spoelen).
- Dompel dia's onder in ABH gedurende 1 uur. Spoel vervolgens glaasjes met gedeïoniseerde H2O 3x, elk 1 min, totdat er geen ABH op het oppervlak achterblijft.
- Differentieer snel in 1% zure alcohol (ongeveer 3 s). Spoelglaasjes met gedeïoniseerde H2O 3x, elk 1 min.
- Dompel dia's onder in 0,5% ammoniumwater gedurende 15 s. Spoel vervolgens glaasjes met gedeïoniseerde H2O 3x, elk 1 min.
- Dompel dia's onder in 95% ethanol gedurende 1 min. Dompel dia's onder in eosine/oranje G-oplossing gedurende 1,5 min.
- Dompel dia's achtereenvolgens onder in 95% ethanol, 100% ethanol, xyleen, xyleen en xyleen gedurende respectievelijk 1 min.
- Bedekt de dia's met neutrale hars.
- Onderzoek alle dia's onder een microscoop en beoordeel statistisch op een schaal van 0−13 door dubbelblinde observatie, volgens het scoresysteem van Mankin14.
- Immunohistochemie
- Spoelglaasjes met gedeïoniseerd H2O gedurende 3 min.
- Dompel dia's onder in 0,1 M natriumcitraat en plaats dia's gedurende 4 uur in een oven van 60 °C om het antigeen op te halen.
- Dompel dia's onder in 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten. Spoel vervolgens dia's met PBS 2x, elk 3 min.
- Incubeer secties in 3% H2O2-oplossing in methanol bij RT gedurende 10 minuten om endogene peroxidase-activiteit te blokkeren. Spoelglaasjes met PBS 2x, elk 3 min.
- Incubeer secties met 5% geitenserum in PBS gedurende 30 minuten bij RT om elke niet-specifieke binding te blokkeren. Spoelglaasjes met PBS 2x, elk 3 min.
- Incubeer secties 's nachts bij 4 °C met 100 μL PBS-verdunde (1:1.000) primaire antilichamen tegen rattentype II collageen (Col2), type X collageen (Col10) en matrix metalloproteinase 13 (MMP13). Spoelglaasjes met PBS 2x, elk 3 min.
- Incubeer secties met 100 μL PBS-verdund (1:1.000) secundair antilichaam (geiten anti-muis secundair of geiten anti-muis secundair) gedurende 20 minuten bij RT. Spoelglaasjes met PBS 2x, elk 3 minuten.
- Incubeer secties met 100 μL 3,3′-diaminobenzidine (DAB) werkoplossing. Controleer de reactie terwijl de chromogene reactie de epitoopplaatsen bruin maakt.
LET OP: DAB is een carcinogeen. Draag altijd handschoenen en werk in een capuchon wanneer u met DAB werkt.
OPMERKING: De tijd van kleurontwikkeling kan variëren van enkele seconden tot 10 minuten. - Zodra zich een bruine kleur ontwikkelt op de secties, spoelglaasjes met gedeïoniseerde H2O 2x, elk 3 min.
- Dompel dia's onder in hematoxyline gedurende 1−2 min om dia's te counteren. Spoel vervolgens glaasjes met gedeïoniseerde H2O 3x, elk 1 min.
- Dompel dia's achtereenvolgens onder in 95% ethanol, 100% ethanol, xyleen, xyleen en xyleen gedurende respectievelijk 1 min.
- Bedekt de dia's met neutrale hars.
- Observeer de kleur van de antilichaamkleuring in de secties onder een microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met deze methodologie hebben we een OA-pijnmodel bij de rat vastgesteld en de resulterende veranderingen gedetecteerd. MWT en TWL reflecteerden respectievelijk mechanische allodynie en thermische hyperalgesie. Zoals te zien is in figuur 1, induceerde MIA mechanische allodynie en thermische hyperalgesie aanwezig op een dosisafhankelijke manier. Opmerkelijk genoeg bereikte de afname van MWT een piek van 21 dagen tot 28 dagen en herstelde vervolgens, wat suggereert dat gewrichtsherstel in dit stadium kan optreden, maar MWT van 3 mg MIA-groep was nog steeds op een laag niveau. De verandering van TWL was ongeveer consistent met MWT (figuur 2).
Op basis hiervan selecteerden we 1,5 mg MIA als de uiteindelijke dosis en beoordeelden we looppatronen en histologische veranderingen 28 dagen na injectie. Loopparameters (totaal pootoppervlak en paslengte van de eenheid) weerspiegelden pijngerelateerd gedrag. Niveaus van loopparameters, waaronder het totale pootoppervlak (figuur 3A) en de paslengte van de eenheid (figuur 3B), waren na 28 dagen significant verminderd in de MIA-groep, wat suggereert dat MIA artrose-gerelateerde gewrichtspijn bij ratten veroorzaakte. Met verhoogde Mankin's score op de histopathologische dia's, werden degeneratie van kraakbeen, verstoring van collageen en desorganisatie van matrix duidelijk gezien in de MIA-groep (figuur 4). Zoals geïllustreerd in figuur 5, veroorzaakte 1,5 mg MIA een significante upregulatie van MMP13 en Col10 en significante downregulatie van Col2.
Figuur 1: Ontwikkeling van MTW na MIA-injectie. Mechanische onttrekkingsdrempels van achterpoten werden beoordeeld na injectie van MIA (0,5, 1,5 of 3 mg/rat) en zoutoplossing (0,9% NaCl), n = 10 ratten/groep. Waarden worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. **P < 0,01 vs. zoutoplossing behandelde groep; One-way ANOVA gevolgd door Fisher's minst significante verschil (LSD) vergelijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Ontwikkeling van TWL na MIA-injectie. Thermische onttrekkingslatentie van achterpoten werd beoordeeld na injectie van MIA (0,5, 1,5 of 3 mg / rat) en zoutoplossing (0,9% NaCl), n = 10 ratten / groep. Waarden worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. **P < 0,01 vs. zoutoplossing behandelde groep (NC); One-way ANOVA gevolgd door Fisher's LSD-vergelijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ganganalyse 28 dagen na MIA-injectie. (A) Totaal pootoppervlak (cm2). Totaal pootoppervlak: het gemiddelde van de totale oppervlakte van vier poten van elke groep ratten. (B) Paslengte van de eenheid. Eenheidspaslengte = Gemiddelde paslengte (cm)/lichaamslengte (cm). n = 10 ratten/groep. Waarden worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. ##P < 0,01 vs. zoutoplossing behandelde groep (NC) op dag 28. Dit cijfer is aangepast van Yan et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histopathologische observatie (HE, SO en AHB-kleuring) en Mankinʹ's score van rattenkniegewrichten op dag 28 na MIA-behandeling. n = 10 ratten/groep. Schaalbalk = 40 μm. Waarden worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. ##P < 0,01 vs. zoutoplossing behandelde groep (NC). One-way ANOVA gevolgd door Fisher's LSD-vergelijking. Dit cijfer is aangepast van Yan et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Immunohistochemische observatie van de expressies van MMP13, Col2 en Col10 in rattenkraakbeen op dag 28. Schaalbalk = 50 μm. N = 10 ratten/groep. Dit cijfer is aangepast van Yan et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het rattenmodel van OA geïnduceerd door MIA is een gevestigd, veel gebruikt model. Intra-articulaire injectie van MIA veroorzaakt in eerste instantie ernstige en acute ontsteking, die aanleiding geeft tot de langere en degeneratieve fase van OA17,18. In dit onderzoek hebben we nociceptieve gevoeligheid gemeten door MWT en TWL, en loopveranderingen beoordeeld met een beeldvormingssysteem. Eerdere rapporten toonden aan dat de injectie van MIA de gevoeligheid van afferente kniegewrichtvezels kon verhogen, wat leidt tot nociceptie, wat wordt weerspiegeld door thermische hyperalgesie en een verlaagde mechanische drempelvan 19,20. Het is bewezen dat loopveranderingen verband hielden met verbeterde nociceptie, wat suggereert dat looppatronen kunnen worden gebruikt om pijnmodellen te evalueren21. Dienovereenkomstig worden MIA-geïnduceerde modellen voornamelijk gebruikt om OA-gerelateerde pijn te beoordelen en orale geneesmiddelen te screenen, evenals geneesmiddelen voor gewrichtsinjecties 3,6.
Hoewel het in vergelijking met het chirurgisch geïnduceerde OA-model eenvoudiger en sneller is om MIA in de gewrichtsholte te injecteren, zijn er nog steeds kritieke punten in de modellering. Allereerst is de gewrichtsholte van ratten klein en moet de locatie vóór de injectie worden bevestigd. Ten tweede is MIA giftig, dus de dosis MIA moet zorgvuldig worden geselecteerd. Er is gemeld dat MIA gewrichtskraakbeenschade kan veroorzaken op een dosis- en tijdsafhankelijke manier (beoordeeld door de OARSI histologische score en de Mankin-score), wat aangeeft dat de progressie en ernst van gewrichtslaesies kunnen worden gemoduleerd door de concentratie van MIA22,23 te reguleren. MIA bleek pijn- en oxidatieve stressmarkers te induceren bij hoge doses 10,18,24. Eerdere rapporten suggereerden dat een dosis van 1,5 mg MIA-injectie bij ratten een ontstekingsproces produceerde dat vergelijkbaar is met menselijke knie OA18,25. Bovendien is het belangrijk om dezelfde experimentator te gebruiken tijdens de gedragstest en om de ratten van tevoren vertrouwd te maken met de omgeving, om angst te verminderen en te voorkomen dat de experimentele resultaten worden beïnvloed.
Zoals hierboven vermeld, worden OA-diermodellen meestal onderverdeeld in spontane en geïnduceerde modellen. Intra-articulaire injectie van MIA wordt veel gebruikt vanwege verschillende voordelen: 1) eenvoudige bediening; 2) gemak van inductie en reproduceerbaarheid; 3) controleerbare dosis en ernst; 4) korte modelleringstijd; en 5) geschiktheid voor zowel kleine als grote dieren. Net als andere diermodellen hebben MIA-geïnduceerde OA-modellen echter ook verschillende nadelen. Uitgebreide celdood en snelle gewrichtsvernietiging na MIA-injectie zijn inconsistent met spontane of posttraumatische artrose bij mensen26. Bovendien kan resterende MIA in de gewrichtsholte de effecten van daaropvolgende intra-articulaire therapieën beïnvloeden, wat resulteert in een onzekere uitkomst door het MIA-model te gebruiken. Het al dan niet wassen van de gewrichtsholte vóór therapeutische injectie in dit model blijft een onbeantwoorde vraag. Over het algemeen is er geen enkel diermodel dat alle aspecten van menselijke artrose perfect samenvat, maar de grote verscheidenheid aan beschikbare modellen maakt het mogelijk om meerdere modellen synthetisch toe te passen op de meest relevante vragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door de Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No: LY17H270016), de National Natural Science Foundation of China (Grant No: 81774331, 81873049, and 81673997) en het Zhejiang Provincial Science and Technology Project of Traditional Chinese Medicine of China (Grant No: 2013ZQ007 en 2016ZZ011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam(UK) | 34712 | Primary antibody for immunohistochemistry (IHC) |
| Anti-Collagen X (Col10) antibody | Abcam(UK) | 49945 | Primary antibody for IHC |
| DigiGait Imaging System | Mouse Specifics (Boston, MA, USA) | Equipment for gait patterns analyses | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| MIA | Sigma-Aldrich | I4386-10G | powder |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks. |
| Plantar Test apparatus | UgoBasile (Italy) | 37370 | Equipment for TWL assay |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China) | RR037A | Extracte total RNA from cultured cells |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections. |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor |
References
- Hunter, D. J., Schofield, D., Callander, E. The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 437-441 (2014).
- Neogi, T. The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 21 (9), 1145-1153 (2013).
- Teeple, E., Jay, G. D., Elsaid, K. A., Fleming, B. C. Animal models of osteoarthritis: challenges of model selection and analysis. AAPS Journal. 15 (2), 438-446 (2013).
- Woolf, A. D., Pfleger, B.
- Bijlsma, J. W., Berenbaum, F., Lafeber, F. P. Osteoarthritis: an update with relevance for clinical practice. Lancet. 377 (9783), 2115-2126 (2011).
- McCoy, A. M. Animal Models of Osteoarthritis: Comparisons and Key Considerations. Veterinary Pathology. 52 (5), 803-818 (2015).
- O'Neill, T. W., Felson, D. T.
- Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, 19 (2016).
- Takahashi, I., Matsuzaki, T., Hoso, M. Long-term histopathological developments in knee-joint components in a rat model of osteoarthritis induced by monosodium iodoacetate. Journal of Physical Therapy Science. 29 (4), 590-597 (2017).
- Liu, P., et al.
- Combe, R., Bramwell, S., Field, M. J. The monosodium iodoacetate model of osteoarthritis: a model of chronic nociceptive pain in rats. Neuroscience Letters. 370 (2-3), 236-240 (2004).
- Pomonis, J. D., et al. Development and pharmacological characterization of a rat model of osteoarthritis pain. Pain. 114 (3), 339-346 (2005).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. 53 (3), 523-537 (1971).
- Yan, L., et al. Chondroprotective effects of platelet lysate towards monoiodoacetate-induced arthritis by suppression of TNF-α-induced activation of NF-ĸB pathway in chondrocytes. Aging. 11 (9), 2797-2811 (2019).
- Yan, B., et al. Intra-Articular Injection of Extract Attenuates Pain Behavior and Cartilage Degeneration in Mono-Iodoacetate Induced Osteoarthritic Rats. Frontiers in Pharmacology. 9, 1360 (2018).
- Wang, C., et al. Agkistrodon ameliorates pain response and prevents cartilage degradation in monosodium iodoacetate-induced osteoarthritic rats by inhibiting chondrocyte hypertrophy and apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 231, 545-554 (2019).
- Yamada, E. F., et al. Evaluation of monosodium iodoacetate dosage to induce knee osteoarthritis: Relation with oxidative stress and pain. International Journal of Rheumatic Diseases. 22 (3), 399-410 (2019).
- Schuelert, N., McDougall, J. J. Electrophysiological evidence that the vasoactive intestinal peptide receptor antagonist VIP6-28 reduces nociception in an animal model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (11), 1155-1162 (2006).
- Lee, S. E. Choline, an alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist, alleviates hyperalgesia in a rat osteoarthritis model. Neuroscience Letters. 548, 291-295 (2013).
- Piesla, M. J., et al. Abnormal gait, due to inflammation but not nerve injury, reflects enhanced nociception in preclinical pain models. Brain Research. 1295, 89-98 (2009).
- Udo, M., et al. Monoiodoacetic acid induces arthritis and synovitis in rats in a dose- and time-dependent manner: proposed model-specific scoring systems. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1284-1291 (2016).
- Guingamp, C., et al. Mono-iodoacetate-induced experimental osteoarthritis: a dose-response study of loss of mobility, morphology, and biochemistry. Arthritis & Rheumatism. 40 (9), 1670-1679 (1997).
- Jeong, J. H., et al. Eupatilin Exerts Antinociceptive and Chondroprotective Properties in a Rat Model of Osteoarthritis by Downregulating Oxidative Damage and Catabolic Activity in Chondrocytes. PLoS ONE. 10 (6), 0130882 (2015).
- Cook, J. L., et al.
- Little, C. B., Zaki, S. What constitutes an "animal model of osteoarthritis"--the need for consensus. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (4), 261-267 (2012).
