Summary
Denne protokol beskriver en eksperimentel proces til fremstilling af infektiøse virale pseudo skrevne partikler (PP) med kuvert glycoproteiner fra to influenza A-stammer, og hvordan deres infektionsevne kan bestemmes. Denne protokol er meget tilpasningsdygtig til at udvikle PPS af enhver anden type kappeklædte vira med forskellige konvolut glycoproteiner.
Abstract
Lejlighedsvis direkte overførsel af højpatogen aviær influenza A-virus H5N1 (HPAI H5N1) og H7N9 til mennesker og deres dødelighed er alvorlige folkesundhedsproblemer og antyder muligheden for en epidemi. Men vores molekylære forståelse af virussen er rudimentær, og det er nødvendigt at studere de biologiske egenskaber af dens konvolut proteiner som terapeutiske mål og udvikle strategier til at kontrollere infektion. Vi udviklede en solid viral pseudo-type partikel (PP)-platform til at studere aviær influenzavirus, herunder den funktionelle analyse af dens hemagglutinin (HA) og neuraminidasetypen (Na) konvolut glycoproteiner, resortiments egenskaberne af HAs og NAs, receptorer, tropismer, neutraliserende antistoffer, diagnose, infektivitet, med henblik på narkotika udvikling og vaccine design. Her beskriver vi en eksperimentel procedure for at etablere PPS med kuvert glycoproteiner (HA, NA) fra to influenza A-stammer (HAPI H5N1 og 2013 aviær H7N9). Deres generation er baseret på kapaciteten af nogle vira, såsom murine leukæmivirus (MLV), at indarbejde kuvert glycoproteiner i en PP. Desuden er vi også detaljeret, hvordan disse PPS er kvantificeret med RT-qPCR, og infektivitet påvisning af indfødte og uoverensstemmende virus PPS afhængigt af oprindelsen af HAs og NAs. Dette system er meget fleksibelt og tilpasningsdygtigt og kan bruges til at etablere virale PPS med kuvert glycoproteiner, der kan inkorporeres i enhver anden form for kappeklædte virus. Således kan denne viral partikel platform bruges til at studere vilde vira i mange forskningsundersøgelser.
Introduction
Missionen af en viral partikel er at transportere sit genom fra en inficeret værtscelle til en ikke-inficeret værtscelle og at levere den til cytoplasmaet eller kernen i en replikeringskompetent formular1. Denne proces er oprindeligt udløst af binding til Host celle receptorer, efterfulgt af fusion af virion og cellulære membraner. For kappeklædte vira, som influenzavirus, er Spike glycoproteiner ansvarlig for receptor binding og fusion1,2. Viral konvolut glycoproteiner (f. eks. pyrogener, antigener), er involveret i mange vigtige egenskaber og begivenheder, såsom virus livscyklus initiering (binding og fusion), viral patogenese, immunogenicitet, Host Cell apoptose og cellulære tropisme, den cellulære endocytic pathway, samt interspecies transmission og resortiments1,3,4,5,6,7. Forskning på viral konvolut glycoproteiner vil hjælpe os med at forstå mange aspekter af den virale infektions proces. Pseudo-skrevne virale partikler (PP), også kaldet pseudovirioner eller pseudopartikler, kan genereres gennem en pseudotyping Technique8,9,10. Denne teknologi er blevet brugt til at udvikle pseudo-skrevne partikler af mange vira, herunder hepatitis C11,12, hepatitis B13, vesikulær stomatitis virus (VSV)14,15og influenzavirus16,17,18,19. Denne teknologi er baseret på gag-pol protein af lentivira eller andre retrovira.
Pseudoskrevne virale partikler kan opnås ved hjælp af et tre-plasmid-system ved at cotransfficerer en viral konvolut glykoprotein ekspression plasmid, en antiretroviral emballage plasmid mangler konvolutten env genet, og en separat reporter plasmid i PP producer celler. Retrovirus er samlet af dens gag protein, og det knopper fra en inficeret celle membran, der udtrykker virus konvolut protein1. Derfor er det muligt at opnå høj titer influenza PPS ved hjælp af retrovirus gag protein til at producere knopper på en cellulær membran, der udtrykker influenza HA og NA. I vores tidligere undersøgelser, har/NAS i alle kombinationer var funktionelle og i stand til at udføre deres tilsvarende funktioner i viral livscyklus16,17,18,20,21. Disse KKS anvendes til at undersøge influenza biologiske egenskaber, herunder hemagglutination, neuraminidaseaktivitet, HA-receptor bindende tropisme og infektivitet. Fordi HA og NA begge er vigtige overflade funktionelle proteiner i den virale livscyklus, har uoverensstemmende og NAs afledt af forskellige stammer af influenza delvist kan demonstrere resortiments mellem dem. Her genererer vi otte typer af influenza PPS ved at kombinere to har og to NAs (afledt af HPAI H5N1 stamme og H7N9 Stain), ved hjælp af en tre-plasmid pseudotyping system. Disse otte typer PPS omfatter to Native PPS, H5N1pp, H7N9pp; to uoverensstemmende KKS (H5 + N9) PP, (H7 + N1) PP; og fire PPS kun harkedeligt en enkelt glykoprotein (ha eller na), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. undersøgelser af influenzavirus, såsom H5N1 og H7N9, er begrænset af biosikkerhedskrav. Alle undersøgelser af vilde influenzavirusstammer bør udføres på et biosikkerhedsniveau 3 (BSL-3) laboratorium. Pseudotyp viral partikel teknologi kan bruges til at pakke en kunstig virion i en biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) indstilling. Derfor er PPS et sikrere og nyttigt redskab til at studere influenzavirus processer afhængigt af dens to store glycoproteiner: hemagglutinin (HA) og neuraminidasetypen (Na).
Denne protokol beskriver genereringen af disse PPS med en tre-plasmid cotransfection strategi (oversete i figur 1), hvordan man kvantificerer PPS, og infektivitet påvisning. PP-produktionen involverer tre typer plasmid'er (figur 1). Gag-pol genet, som koder retrovirus gag-pol protein, blev klonet fra en retrovirus emballage kit og indsat i pcdna 3,1 plasmid og hedder Pcdna-gag-pol. Det forbedrede grønne fluorescerende protein (eGFP)-gen, som koder grønt fluorescerende protein, blev klonet fra pTRE-EGFP-vektor, indsat i pcDNA 3,1 plasmid, og kaldet pcDNA-GFP. Under kloning blev en pakke signal sekvens tilføjet via en primer. HA-og NA-gener blev klonet ind i en pVRC-plasmid, der blev henholdsvis pVRC-HA og pVRC-NA. Det sidste plasmid koder fusions proteinet og kan udskiftes med ethvert andet fusionsprotein af interesse. Vores pseudo Typing platform indeholder to glykoprotein udtryks plasmider: pvrc-ha og pvrc-na. Dette kan forenkle forskningen i omsortimentet mellem forskellige virusstammer i en BSL-2-indstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dag 1: cellekultur og såning
- Dyrke menneskelige embryonale nyrer (HEK) 293T/17 celler i 60 mm retter med Dulbecco's modificerede essentielle medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovin serum (FBS) og 100 U/mL penicillin-streptomycin (DMEM komplet medium, DCM) i en 37 °C, 5% carbondioxid (CO2) inkubator indtil omkring 80% konflydende.
Bemærk: HEK 293T/17 Low passage celler anbefales. - Cellerne vaskes forsigtigt med 5 mL fosfat bufferet saltvand (PBS) 1x.
Bemærk: manuel håndtering af HEK 293T/17 celler skal være meget blid, fordi de nemt løsnes. - PBS fjernes, og cellerne adskilles med 1 mL 0,25% trypsin-ethylendiamin-tetraeddikesyre opløsning. Skålen placeres i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator i højst 5 minutter, indtil cellerne er dissocierede.
- Deaktivér trypsin ved tilsætning af 5 mL DCM. Disperse cellerne i en enkelt cellesuspension ved pipettering op og ned flere gange.
- Celle suspensionerne overføres til et forkølet 15 mL centrifugeglas. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- Decant så meget af supernatanten som muligt. Resuspension celle pellet med 6 mL DCM medium og tælle cellerne. Cellerne fortyndes til 1 x 106 celler/ml med DCM medium.
- Frø cellerne i en 6 brønd plade med 1 mL cellesuspension pr. brønd. Klap pladen forsigtigt for at fordele cellerne jævnt. Inkubér pladen natten over (14 – 16 timer) i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator.
2. dag 2: fire plasmid Cotransfection medieret af Lipofection
- Kontroller cellernes morfologi og tæthed under et inverteret lys mikroskop. Ideelt set bør cellerne være ca. 85% flydende ved transfection. Udskift mediet med 1 mL serumfrit DMEM-medium pr. brønd, og sæt derefter pladen tilbage i inkubatoren.
Bemærk: manuel håndtering af HEK 293T/17 celler skal være meget blid, fordi de nemt løsnes. - For hver brønd af dyrkede celler, der skal transfteres, fortyndes 8 μl af transfektering reagens til et volumen på 150 μl med reduceret serum medium (tube 1). Bland forsigtigt og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur (RT, ca. 20 °C).
Bemærk: for hver transfektering prøve forberedes to 1,5 ml mikrocentrifuge glas, nummereret 1 og 2. - I tube 2 fortyndes 2,5 μg plasmid-DNA til 150 μL reduceret serum medium.
Bemærk: i tube 2 fortyndes hvert plasmid-DNA som vist i tabel 1. En plasmid-kodning vesikulær stomatitis virus (VSV) G glykoprotein (plasmid pLP-vsvg) blev brugt som en positiv kontrol, fordi VSV er i stand til at inficere en bred vifte af celler. Negative kontrol partikler, der mangler influenza konvolut glycoproteiner (Δenv PPS), blev genereret ved hjælp af pcDNA-gag-pol og pcDNA-GFP-plasmider. - Efter en 5 min inkubation kombineres det fortyndede DNA med fortyndet transfektering reagens. Bland forsigtigt og Inkuber i yderligere 15 minutter ved RT.
- Tilsæt DNA-lipid-komplekset til den tilsvarende brønd, der indeholder cellerne og det serum frie medium. Bland forsigtigt ved at Rocking pladen frem og tilbage.
- Efter inkubation i 4 – 6 timer i en 37 °C, 5% CO2 -kuruator, Fjern mediet, og Udskift med 2 ml DMEM. Der inkubates i yderligere 36 – 48 timer i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator.
Bemærk: Udskift med serum-fri og antistof-fri DMEM. I denne protokol kan to og to NAs bruges til at generere otte typer PPS (vist i tabel 1).
3. dag 3: modtagelige celler såning
- For infektionsevne analyse, frø hver type af modtagelige celler på 1 x 104 celler pr brønd i en 96 brønd plade.
Bemærk: Brug to typer målceller til at udføre infektions analysen i denne artikel: en alveolær afledt menneskelig cellelinje (A549 celler) og Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler. MDCK celler er meget udbredt i influenza forskning og kan være en god kontrol. Dette trin er fleksibelt. Alle andre målcelle linjer kan anvendes i overensstemmelse med forsknings kravene. - Inkubér pladen natten over (14 – 16 timer) i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator.
4. dag 4: indsamling, kvantificering og analyse af pseudo-type viral partikel opsamling
- Pseudo-type viral partikel opsamling
- Kontroller farven på mediet. Ideelt set bør det være lys lyserød eller svagt orange. Undersøg cellerne med et inverteret, fluorescerende biologisk mikroskop under 440 – 460 nm.
- Ved 36 – 48 h posttransfection, høst PPS ved passaging gennem en 0,45 μm polyvinyliden fluorid (PVDF) membranfilter til at eliminere cellerester.
- Opdel PPS i små volumen Aliquots.
- Opbevar PPS ved-80 °C.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. Dette fremmes imidlertid ikke, da PPS-infektiviteten vil falde drastisk efter nedfrysning og optøning.
- Pseudo-specificeret viral partikel kvantificering
- 20 μl renset PPS overføres til et 1,5 ml ribonuklease (RNase)-frit mikrocentrifuge glas.
- Tilsæt 1 μL 0,24 U/mL benzonase-nuklease. Inkuber ved 37 °C i 1 time for at eliminere DNA-og RNA-kontaminering.
Bemærk: Target RNA, almindeligt nedreguleret Cytomegalovirus (CMV)-GFP RNA, er pakket i PPS og kan undgå at blive degraderet af benzonase nuclease. - Prøven fastfryses ved-70 °C for at inaktivere benzonasenukleasen.
- Tilsæt 2 μL proteinase K. Inkubér ved 50 °C i 30 min for at fordøje konvolutten proteiner og frigive CMV-GFP RNA. Inaktivér proteinase K ved 100 °C i 3 min.
- Kvantificere PPS ved hjælp af kvantitativ reverse-transkription (qRT)-PCR med et Universal Probe One-Step RT-qPCR kit, ved hjælp af Forward primer 5 '-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3 ', den omvendte primer 5 '-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3 ', og sonden 5 '-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3 ', på en real-time PCR Thermo cycler. Normaliser PPS for RNA-kopi nummer før infektivitet.
- Analyse af infektivitet
- Hver type PPS fortyndes i form af qRT-PCR-data til 4 x 105 kopier/ml (PP-normalisering).
- Tilsæt Tosyl-phenylalanin Chloromethyl-keton (TPCK)-trypsin til en endelig koncentration på 40 μg/mL i KKS, der havnen H7N9 HA. Inkuber ved 37 °C i 1 time for at danne sine funktionelle under enheder HA1 og HA2.
Bemærk: der er ingen grund til at behandle PPS, at havnen H5 med TPCK-trypsin, fordi de har flere arginin og lysin rester på HA1-HA2 spaltning site. Denne multi-grundlæggende spaltning site kan spaltet af allestedsnærværende cellulære proteaser. - Bland normaliserede PPS med DMEM medium (serum-fri) ved en 1:1 ratio (volumen/volumen).
- Placer pladen med modtagelige celler i biosikkerheds kabinettet.
- Aspirer supernatanten, og vask cellerne én gang med 0,1 ml forvarmede PBS.
- Tilsæt 0,1 mL PPS-DMEM-blandingen til en brønd. Trilicerer infektivitetstestene for hver type PPS til en følsom cellelinje (oversete i figur 2).
- Inkubér 96 brønd pladen for 4 – 6 timer i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Du skal aspirere supernatanten og udskifte den med 0,1 mL DCM.
- Inkubér 96 brønd pladen for yderligere 24 – 36 timer i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
5. dag 5 eller 6: påvisning af smitteevne
- Bring 96 brønd pladen til biosikkerhed kabinettet.
- Aspirer supernatanten og vask cellerne 1x med 0,2 ml forvarmede PBS.
- Du fjerner PBS og dissocierer cellerne med 0,1 mL 0,25% trypsin-EDTA-opløsning.
- Skålen placeres i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator i 3 minutter, indtil cellerne er dissocierede.
Bemærk: undgå inkubering i mere end 5 minutter, da dette vil føre til celle sammenklumpning. - Deaktivér trypsin ved tilsætning af 0,4 mL DCM.
- Disperse cellerne i enkelt cellesuspension ved pipettering op og ned flere gange.
- Celle suspensionerne overføres til et kølet 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
- Bestem GFP reporter-positive celler med fluorescens aktiveret celle sortering (FACS).
Bemærk: for at bestemme forholdet mellem GFP reporter-positive målceller, sæt flow flowcytometer Gates ved hjælp af kontrolprøverne (PPS-ubehandlet A549 celler eller MDCK celler), og Tæl derefter GFP reporter-positive celler af 10.000 celler pr. prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afhængigt af den generelle procedure, der er beskrevet ovenfor, har vi genereret 10 typer af PPS kombinere to gruppe har/NAS eller VSV-G glykoprotein eller no-konvolut glycoproteiner (vist i tabel 1). Syv af dem er smitsomme. PPS, at havnen No-konvolut glykoprotein eller kun havn na ikke vise nogen infektivitet her. Produktions proceduren for influenza-PP er oversete i figur 1. Transmissions elektron mikrografer af PPS (f. eks. H5N1pp) er vist i figur 3. Resultaterne af infektivitetsassays af disse KKS er vist i figur 4. Infektiviteten af de syv typer PPS blev evalueret ved et genom-eksemplar pr. celle (GCP) [svarende til multiplicitet af infektion (MOI)] værdi af 20. I PPS-gruppen husly H5 var infektiviteten af H5N1, (H5 + N9) og H5 90,05 ± 4,05%, 17,78 ± 1,58%, 10,15 ± 2,85% for cellelinje A549 og 40,37 ± 4,92%, 5,24 ± 1,32%, 4,88 ± 0,27% for mdck hhv. I PPS-gruppen husly H7 var infektiviteten af H7N9 (H7 + N1) og H7 10,45 ± 2,35%, 6,75 ± 1,37%, 1,23 ± 0,33% for cellelinje A549 og 7,61 ± 1,04%, 4,12 ± 1,29%, 1,08 ± 0,02% for mdck hhv. For infektivitetsassays af PPS, især HApp (H5pp, H7pp), udefrakommende neuraminidasetypen blev ikke tilsat. I denne infektivitetsanalyse blev MDCK-cellerne også brugt som kontrol cellelinje til at teste PPS-infektivitet. Infektiviteten af VSVGpp var 20,9 ± 2,00% for A549 og 16,02 ± 2,41% for MDCK-celler. Delta-konvolut glycoproteiner PP (Δenv PP) viste ingen infektivitet i vores undersøgelse. Disse data viste også, at HAs/NAs fra forskellige virusstammer er i stand til at generere infektiøse virale partikler. Tilsammen kan vores pseudotyping platform udvikle infektiøse pseudoskrevne virale partikler, der anvendes i influenza forskning.
Figur 1: oversigt over produktions proceduren for influenza PP. (A) emballagen plasmid pcdna-gag-pol, reporter plasmid pcdna-gfp, og konvolutten glykoprotein Expression plasmider pvrc-ha og pvrc-na, er cotransfected i PP-producerende hek 293/17 celler. B) i hek 293/17-celler syntetiseres og transporteres gag-pol polyproteinerne af en ukendt mekanisme til cellemembranen. Glycoproteiner HA og NA transporteres og forankres på cellemembranen via sekretoriske pathway. Reporter plasmid pcDNA-GFP transskriberes til det enkelt strengede middel-GFP-genomer-RNA. C) under eller efter transporten rekruterer gag-pol-proteinet det enkelt strengede og gfp-GENOMISKE RNA via PSI-RNA-emballerings signalerne, hvorved de præ-spirende komplekser dannes. D) det samlede gag-Pol-er-RNA-kompleks inducerer membran krumning, hvilket fører til dannelsen af en opløbet. Under spiringen, den virale konvolut glycoproteiner har/NAS er indarbejdet i de spirende partikler. Spirende er afsluttet, da partiklen klemler ud fra cellemembranen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: samlet arrangement i infektivitetsassay. Infektivitetstestene for hver type PPS til en modtagelig cellelinje blev målt i tre eksemplarer. Alveolære afledte humane celler A549 og MDCK anvendes som modtagelige celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: transmissions elektron mikrografer af KKS. Ikke koncentreret (venstre) og koncentreret (højre) supernatant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: infektivitet af normaliserede KKS. Infektivitet præsenteres som middelværdien ± standardafvigelse (SD) i procent af inficerede celler (n = 3). Infektivitet af PPS blev vurderet i to cellelinjer, A549 og MDCK celler. Syv typer af PPS viste forskellige infektivitetsprofiler i to målceller. PPS, at kun havn NA er ikke vist her, da de ikke manifestere nogen infektivitet. KKS, at ikke-kuvert glycoproteiner (Δenv) viste ingen infektivitet i vores undersøgelse. Procentdelen af infektivitet betegner forholdet mellem GFP reporter-positive celler i 10.000 celler pr. prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| plasmid præparater | ||||||||||
| plasmid (μL, 0,1 μg/μL) | H5N1 | (H5 + N9) | H7N9 | (H7 + N1) | H5 | N1 | H7 | N9 | VSVG | Δenv |
| pcDNA-gag-pol | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 12,5 |
| pcDNA-GFP | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 12,5 |
| pVRC-HA | 1,98 | 1,98 | 1,98 | 1,98 | 2,14 | - | 2,14 | - | - | - |
| pVRC-NA | 1,98 | 1,98 | 1,98 | 1,98 | - | 2,14 | - | 2,14 | - | - |
| pcDNA-VSVG | - | - | - | - | - | - | - | - | 2,14 | - |
Tabel 1: kombinationer af ha-og na-proteiner afledt af H5N1 og H7N9 vira og de påkrævede mængder (volumen) af plasmid-DNA til en brønd ombøjning af en 6-brønd plade. Ifølge koncentrationen af plasmid præparater, beregne den nødvendige volumen af hver plasmid DNA. Den totale mængde plasmid DNA til tranfection af en brønd er 2,5 μg. For at opnå den højeste transfektering effektivitet og laveste ikke-specifikke effekter, vi optimeret transfektering betingelser ved varierende plasmid DNA og tranfection reagens koncentrationer. Efter optimering blev forholdet mellem de fire plasmider mængder sat til 16:16:1:1. Volumenet af transfektering reagens, der anvendes i en brønd transfektering af en 6 brønd plade er 8 μl (ikke vist i tabellen). To har og to NAs fra H5N1 og H7N9 vira kan bruges til at generere otte typer af PPS: H5N1pp, (H5 + N9) PP, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 + N1) PP, H7pp og N9pp. De KKS, som ikke har nogen glycoproteiner (Δenv) eller kun havne-NA glycoproteiner, viste ingen infektivitet i vores undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol beskriver vi en metode til fremstilling af pseudo-viruspartikler (PP) i en BSL-2-indstilling. Indberetteren plasmid pcDNA-GFP er indarbejdet i PPS og kan anvendes til at kvantificere KKS ved FACER i en infektivitetsanalyse. Vi valgte to typer af modtagelige cellelinjer, fordi de er meget udbredt i influenza forskning. Mdck celler ville give en god kontrol til de variable udødeliggjort humane celler, der anvendes i disse undersøgelser.
Denne protokol er baseret på retrovirus MLV, som kan indarbejde en GFP reporter og producere knopper på den cellulære membran. Denne teknik er blevet bredt udviklet til emballering af influenzavirus partikler4,22,23,24. Nogle andre systemer er baseret på lentiviral HIV-1 pseudotyping system19,25,26 eller baculovirus-insekt celle ekspressionssystem27,28,29. Mange andre reporter gener er også blevet brugt til pseudopartikel produktion, såsom der (luminescens)30,31,32,33, β-gal/LacZ (ved colorimetry)34,35, og udskillet alkalisk fosfatase36,37. Millet et al. brugte der assay til at kvantificere infektiviteten af coronavirus pseudoskrevne partikler33. Sammenlignet med luciferase, er GFP grønne fluorescens let observeret med en inverteret fluorescerende biologisk mikroskop. Dette er en bekvem måde at kontrollere transfektering og infektion effektivitetsgevinster. Til denne undersøgelse kan infektiviteten bestemmes direkte ved at detektere GFP-positive celler med FACER.
I denne metode har flere trin en kritisk indvirkning på resultaterne. Optimeret celletæthed er en afgørende faktor for vellykket transfection. I denne protokol, en celletæthed i intervallet 80 – 90% flydende blev fundet for at være optimal for influenzavirus PP produktion. Højere eller lavere celletæthed vil resultere i lavere transfektering effektivitet. God fysiologisk status af producent celler er også meget vigtigt for høj partikel produktion. Dette er grunden til lavere celle passage HEK 293T/17 celler anbefales at producere PPS i denne protokol. Desuden kan volumenet af transfektering reagens og forholdet mellem de fire plasmider mængder også påvirke transfektering effektivitet. For at opnå den højeste transfektering effektivitet, anbefales det at optimere disse faktorer ved at variere og teste deres mængde. Vi indstiller forholdet mellem fire plasmider mængder som 16:16:1:1 og volumenet af transfektering reagens som 8 μl for en brønd tranfection i en 6 brønd plade. Et andet problem er håndteringen af cellerne. HEK 293T/17producer cellerne har lav vedhæftning, så manuel håndtering af cellerne skal være meget blid. Lipofection kan føre til en celle permeabilitet stigning, og serum og antistoffer i mediet kan øge cytotoksicitet. Det er bedst at bruge serum-fri og antistof-fri DMEM til kultur post-transfected HEK 293T/17 celler. Desuden er indsamlings tiden vigtig. Ved 36 – 48 h post-transfection, farven på cellen supernatanten skal kontrolleres for at sikre, at det er pink eller orange-pink før PP kollektion. Gul supernatanten indikerer, at mediet er for Sure til at støtte cellevækst og normalt fører til dårlige PP udbytter.
Vi udførte transfektering assay i en 6 brønd plade. For at opnå mere PP volumen kan antallet af transfektering brønde øges og supernatanter, der indeholder de samme PPS kan samles sammen. Alternativt kan en anden slags fartøjer bruges til at øge PP udbytte. For eksempel kan 18 μl transfektering reagens og 5,5 μg plasmid DNA anvendes til at udføre transfektering med 2,2 x 106 celler i 1 60 mm parabol. På samme måde kan en infektivitetsanalyse udføres i en 24-brønd plade.
Succesen med denne teknik kan påvirkes af mange faktorer. Derfor bør proceduren optimeres for partikel emballage af forskellige former for virus.
I denne protokol blev pseudoskrevne virale partikler af HPAI H5N1 og H7N9 samt deres reassortanter genereret. I denne metode anvender vi QRT-PCR af gfp-RNA i infektions analysen på enkelt celleniveau (som genom kopier pr. celle) i stedet for vævskultur infektiøs dosis 50 (TCID50) eller traditionel Moi23,38,39. Metoder til titrering af virus infektivitet er baseret på plaque-analyser eller TCID50-analyser, som både er tidskrævende og arbejdskraftintensive. Begge assays er afhængige af måling af synlige cytopatiske virkninger (CPE) forårsaget af virus infektion i cellelinjer, så det kan være svært at titrere vira med lav infektivitet (dvs., H7pp i dette studie). Vi synes, det er en bekvem, effektiv og hurtig metode til at normalisere PPS med qRT-PCR af GFP RNA indeholdt i influenza PPS.
Taget sammen, vores teknik er sikker og smidig, og kan bruges til at studere kappeklædte vira, herunder deres receptorer, tropismer, konvolut glykoprotein funktion, neutraliserende antistoffer, Antivirus Drug udvikling, diagnose, og vaccine design og Evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Zhejiang Provincial medicin og sundhed videnskab og teknologiplan (Grant numre, 2017KY538), Hangzhou kommunale medicin og sundhed videnskab og teknologiplan (Grant numre, OO20190070), Hangzhou Medical Science og Teknologi nøgleprojekt (tilskuds numre, 2014Z11) og Hangzhou Municipal selvstændigt applikations projekt for social udvikling og videnskabelig forskning (tilskuds numre, 20191203B134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
