Summary
Detta protokoll beskriver en experimentell process för att producera hög titer infektiösa virala pseudotypiserade partiklar (PP) med kuvert glykoproteiner från två influensa A stammar och hur man bestämmer deras smittsamhet. Detta protokoll är mycket anpassningsbar för att utveckla PPS av någon annan typ av höljeförsedda virus med olika kuvert glykoproteiner.
Abstract
Tillfällig direkt överföring av högpatogen aviär influensa A-virus H5N1 (HPAI H5N1) och H7N9 till människor och deras dödlighet är allvarliga folkhälsofrågor och tyder på en möjlighet till en epidemi. Men, vår molekylära förståelse av viruset är rudimentär, och det är nödvändigt att studera de biologiska egenskaperna hos dess kuvert proteiner som terapeutiska mål och att utveckla strategier för att kontrollera infektion. Vi utvecklade en solid viral pseudotypifierad partikel (PP) plattform för att studera aviär influensavirus, inklusive funktionell analys av dess hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) kuvert glykoproteiner, omsortimenten egenskaperna hos har och NAs, receptorer, tropismer, neutraliserande antikroppar, diagnos, smittsamhet, för läkemedelsutveckling och vaccin design. Här beskriver vi ett experimentellt förfarande för att upprätta PPS med kuvertet glykoproteiner (HA, NA) från två influensa A-stammar (HAPI H5N1 och 2013 avian H7N9). Deras generation är baserad på kapaciteten hos vissa virus, såsom murina leukemi virus (MLV), att införliva kuvert glykoproteiner i en PP. Dessutom, vi detalj också hur dessa PPS kvantifieras med RT-qPCR, och smittsamhet upptäckt av infödda och inkompatibla virus PPS beroende på ursprunget av har och NAs. Detta system är mycket flexibelt och anpassningsbart och kan användas för att etablera viral PPS med kuvert glykoproteiner som kan införlivas i någon annan typ av höljeförsedda virus. Sålunda, denna viral partikel plattform kan användas för att studera vilda virus i många forsknings utredningar.
Introduction
Uppdraget för en viral partikel är att transportera dess arvsmassa från en infekterad värd cell till en icke-infekterad värd cell och att leverera den till cytoplasman eller kärnan i en replikation-kompetent form1. Denna process utlöses initialt genom bindning till värd cellreceptorer, följt av fusion av spjälkat virus och cellulära membran. För höljeförsedda virus, som influensavirus, Spike glykoproteiner är ansvariga för receptorbindning och fusion1,2. Virala kuvert glykoproteiner (t. ex. pyrogener, antigener), är involverade i många viktiga egenskaper och händelser, såsom virus livscykel initiering (bindning och fusion), viral patogenes, immunogenicitet, värd Cell apoptos och cellulära tropism, den cellulära rutt vägen, liksom mellan arter överföring och omsortiments1,3,4,5,6,7. Forskning om viral kuvert glykoproteiner kommer att hjälpa oss att förstå många aspekter av viral Infection process. Pseudotypifierade viruspartiklar (PP), även kallade pseudovirioner eller pseudopartiklar, kan genereras genom en pseudotypteknik8,9,10. Denna teknik har använts för att utveckla pseudotypifierade partiklar av många virus, inklusive hepatitC 11,12, hepatit B13, vesikulär stomatit virus (VSV) 14,15, och influensavirus16,17,18,19. Denna teknik är baserad på gag-pol protein av lentivirus eller andra retrovirus.
Pseudotypifierade virala partiklar kan erhållas med hjälp av ett tre-plasmid-system genom att cotransfecting en viral kuvert glykoprotein uttryck plasmid, en antiretrovirala förpackning plasmid saknas kuvert ENV genen, och en separat reporter plasmid i PP producent celler. Den retrovirus monteras av dess gag protein, och det knoppar från en infekterad cellmembran som uttrycker viruset kuvert protein1. Därför är det möjligt att få hög titer influensa PPS med retrovirus gag protein för att producera knoppar på ett cellulärt membran som uttrycker influensa HA och NA. I våra tidigare studier, har/NAS i alla kombinationer funktionella och kunna utföra sina motsvarande funktioner i viral livscykel16,17,18,20,21. Dessa PPS används för att undersöka influensaliknande biologiska egenskaper, inklusive hemagglutination, neuraminidastyp aktivitet, ha-receptorbindning tropism, och smittsamhet. Eftersom HA och NA är både viktiga ytfunktionella proteiner i den virala livscykeln, har avvikande och NAs som härrör från olika stammar av influensa delvis kan visa resortimenten mellan dem. Här genererar vi åtta typer av influensa PPS genom att kombinera två har och två NAs (härrör från HPAI H5N1 stam och H7N9 fläcken), med hjälp av ett tre-plasmid pseudotyping system. Dessa åtta typer av PPS inkluderar två infödda PPS, H5N1pp, H7N9pp; två inkompatibla PPS, (H5 + N9) PP, (H7 + N1) PP; och fyra PPS bara hyser en enda glykoprotein (ha eller na), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. studier av influensavirus, såsom H5N1 och H7N9, begränsas av biosäkerhets krav. Alla studier av stammar av vilda influensavirus bör utföras i ett laboratorium för biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3). Pseudotypifierad viral partikel teknik kan användas för att paketera en konstgjord spjälkat virus i en inställning för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). PPS utgör därför ett säkrare och användbart verktyg för att studera influensavirus processer beroende på dess två stora glykoproteiner: hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA).
Detta protokoll beskriver generering av dessa PPS med en tre-plasmid cotransfection strategi (översedd i figur 1), hur man kvantifiera PPS, och smittsamhet upptäckt. PP-produktionen omfattar tre typer av plasmider (figur 1). Den gag-pol genen, som kodar retrovirus gag-pol protein, klonas från en retrovirus förpackning kit och införas i pcdna 3,1 plasmid och heter Pcdna-gag-pol. Den förbättrade gröna fluorescerande protein (eGFP) genen, som kodar grönt fluorescerande protein, klonas från pTRE-EGFP vektor, in i pcDNA 3,1 plasmid, och kallas pcDNA-GFP. Under kloningen tillkom en förpackning signal (ψ) sekvens via en primer. HA och NA gener var klonade i en pVRC plasmid, heter pVRC-HA och pVRC-NA, respektive. Den sista plasmiden kodar fusionsproteinet och kan ersättas med något annat fusionsprotein av intresse. Vår pseudotyping plattform innehåller två glykoproteinuttryck plasmider: pVRC-HA och pVRC-NA. Detta kan förenkla forskningen om omsortiment mellan olika virusstammar i en BSL-2-inställning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dag 1: cell kultur och seedning
- Odla mänskliga embryonala njure (HEK) 293T/17 celler i 60 mm rätter med Dulbecco modifierade essentiella mediet (DMEM) kompletteras med 10% foster bovin serum (FBS) och 100 U/mL penicillin-streptomycin (DMEM komplett medium, DCM) i en 37 ° c, 5% koldioxid (CO2) inkubator fram till ca 80% confluent.
Obs: HEK 293T/17 låg passage celler rekommenderas. - Tvätta noggrant cellerna med 5 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 1x.
Obs: manuell hantering av HEK 293T/17 celler måste vara mycket skonsam, eftersom de lätt lossnar. - Ta bort PBS och separera cellerna med 1 mL 0,25% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning. Placera skålen i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator för högst 5 min tills cellerna separeras.
- Inaktivera trypsin genom att lägga till 5 mL DCM. Skingra cellerna i en encellig suspension genom att Pipettera upp och ner flera gånger.
- Överför cell upphängningarna till ett förkyld 15 mL centrifugeringsrör. Samla in cellerna genom centrifugering vid 250 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Dekanera så mycket av supernatanten som möjligt. Omsuspendera cellpelleten med 6 mL DCM-medium och räkna cellerna. Späd ut cellerna till 1 x 106 celler/ml med DCM-medium.
- Frö cellerna till en 6 brunn tallrik med 1 mL cellsuspension per brunn. Klappa försiktigt plattan för att jämnt fördela cellerna. Inkubera plattan över natten (14 – 16 h) i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
2. dag 2: fyra-plasmid Cotransfektion medierad av Lipofection
- Kontrollera cellens morfologi och densitet under ett inverterat ljusmikroskop. Helst bör cellerna vara cirka 85% konfluenta vid transfektion. Byt ut mediet med 1 mL serumfritt DMEM-medium per brunn, och sätt sedan tillbaka plattan i inkubatorn.
Obs: manuell hantering av HEK 293T/17 celler måste vara mycket skonsam, eftersom de lätt lossnar. - För varje brunn av odlade celler som ska transfected, späd 8 μL av transfektionsreagens till en volym av 150 μL med reducerat serum medium (tub 1). Blanda försiktigt och inkubera i 5 min vid rumstemperatur (RT, ca 20 ° c).
Anmärkning: Bered två 1,5 mL mikrocentrifugrör, numrerade 1 och 2, för varje transfektionsprov. - I tub 2, späd 2,5 μg plasmid-DNA till 150 μL reducerat serum medium.
Anmärkning: i tub 2, späd varje plasmid-DNA som visas i tabell 1. En Plasmid kodning vesikulär stomatit virus (VSV) G glykoprotein (plasmid pLP-VSVG) användes som en positiv kontroll, eftersom VSV kan infektera ett brett spektrum av celler. Negativa kontroll partiklar som saknar influensa kuvert glykoproteiner (Δenv PPS) genererades med hjälp av pcDNA-gag-pol och pcDNA-GFP-plasmider. - Efter en 5 min inkubation, kombinera det utspädda DNA med utspädd transfektionsreagens. Blanda försiktigt och inkubera i ytterligare 15 minuter vid RT.
- Tillsätt DNA-lipidkomplexet till motsvarande brunn som innehåller cellerna och det serum fria mediet. Blanda försiktigt genom att skaka plattan fram och tillbaka.
- Efter inkubering i 4 – 6 timmar i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator, ta bort mediet och Ersätt med 2 ml DMEM. Inkubera i ytterligare 36 – 48 timmar i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
Anmärkning: Ersätt med serum fri och antikropps fri DMEM. I detta protokoll har två och två NAs kan användas för att generera åtta typer av PPS (visas i tabell 1).
3. dag 3: mottagliga celler seedning
- För smittsamhet assay, utsäde varje typ av mottagliga celler vid 1 x 104 celler per brunn i en 96 väl tallrik.
Anmärkning: Använd två typer av mål cell för att utföra smittsamhet assay i denna artikel: en alveolär härledda mänskliga cellinjer (A549 celler) och Madin-Darby Hundarnas njure (MDCK) celler. MDCK celler används ofta i influensaforskning och kan vara en bra kontroll. Detta steg är flexibelt. Alla andra mål cells linjer kan användas i enlighet med forsknings kraven. - Inkubera plattan över natten (14 – 16 h) i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
4. dag 4: Pseudotypifierad viral partikel insamling, kvantifiering och smittsamhet analys
- Pseudotypifierad viral partikel samling
- Kontrollera färgen på mediet. Helst bör det vara ljust rosa eller något orange. Undersök cellerna med ett inverterat fluorescerande biologiskt Mikroskop under 440 – 460 Nm.
- Vid 36-48 h posttransfection, skörda PPS genom passaging genom en 0,45 μm av polyvinylidenklorid fluorid (PVDF) membranfilter för att eliminera cell skräp.
- Dela PPS i små volym alikvoter.
- Förvara PPS vid-80 ° c.
Obs: protokollet kan pausas här. Detta är dock inte uppmuntras, eftersom smittsamhet av PPS kommer att kraftigt minska efter frysning och upptinning.
- Pseudotypad viral partikel kvantifiering
- Överför 20 μl renat PPS till ett 1,5 ml ribonukleas (RNase)-gratis microcentrifug tub.
- Tillsätt 1 μl 0,24 U/ml bensonas-nukleas. Inkubera vid 37 ° c i 1 h för att eliminera all DNA-och RNA-kontaminering.
Anmärkning: Target RNA, vanligen nedreglerade cytomegalovirus (CMV)-GFP RNA, är förpackad i PPS och kan undvika att brytas ned av bensonas Nuclease. - Frys provet vid-70 ° c för att inaktivera bensonas Nuclease.
- Tillsätt 2 μl proteinas K. Inkubera vid 50 ° c i 30 min för att smälta kuvertet proteiner och släpp CMV-GFP RNA. Inaktivera proteinas K vid 100 ° c i 3 min.
- Kvantifiera PPS genom realtid kvantitativ omvänd Transkription (qRT)-PCR med en universell sond One-Step RT-qPCR Kit, med hjälp av Forward primer 5 '-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3 ', den omvända primer 5 '-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3 ', och sonden 5 '-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3 ', på en realtids-PCR ThermoCycler. Normalisera PPS för RNA-kopieringsnummer före smittsamhet.
- Smittsamhet analys
- Späd varje typ av PPS i termer av qRT-PCR data till 4 x 105 kopior/ml (PP normalisering).
- Tillsätt Tosyl-fenylalanin Chloromethyl-keton (TPCK)-trypsin till en slutlig koncentration på 40 μg/mL i PPS som Harbor H7N9 HA. Inkubera vid 37 ° c i 1 h för att bilda dess funktionella subenheter HA1 och HA2.
Obs: det finns ingen anledning att behandla PPS som Harbor H5 med TPCK-trypsin, eftersom de har flera arginin och lysin rester på HA1-HA2 klyvning webbplats. Denna multi-Basic klyvning webbplats kan klyvs av allestädes närvarande cellulära proteaser. - Blanda normaliserade PPS med DMEM medium (serum-Free) vid en 1:1 ratio (volym/volym).
- Placera plattan som innehåller mottagliga celler i biosäkerhets skåpet.
- Aspirera supernatanten och tvätta cellerna en gång med 0,1 ml föruppvärmd PBS.
- Tillsätt 0,1 mL av PPS-DMEM-blandningen till en brunn. Triplicera infektivitetstester av varje typ av PPS till en mottaglig cellinje (översedd i figur 2).
- Inkubera 96 brunn plattan för 4 – 6 h i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
- Aspirera på supernatanten och Ersätt med 0,1 mL DCM.
- Inkubera 96 väl plattan för ytterligare 24 – 36 h i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
5. dag 5 eller 6: upptäckt av smittsamhet
- Ta 96 väl plattan till biosäkerhets skåpet.
- Aspirera på supernatanten och tvätta cellerna 1x med 0,2 ml föruppvärmd PBS.
- Ta bort PBS och separera cellerna med 0,1 mL av 0,25% trypsin-EDTA lösning.
- Placera skålen i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator för 3 min tills cellerna dissocieras.
Obs: Undvik inkuberande i mer än 5 min, eftersom detta kommer att leda till cell clumping. - Inaktivera trypsin genom att lägga till 0,4 mL DCM.
- Skingra cellerna i encellig suspension genom att Pipettera upp och ner flera gånger.
- Överför cellsuspensionen till ett kylt 1,5 mL microcentrifugerör.
- Bestäm GFP reporter-positiva celler med Fluorescence aktiverad cell sortering (FACS).
Notera: för att bestämma förhållandet mellan GFP reporter-positiva målceller, ange flödescytometern med hjälp av kontrollproverna (PPS-obehandlade A549-celler eller MDCK-celler) och räkna sedan GFP reporter-positiva cellerna i 10 000 celler per prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beroende på den allmänna proceduren som beskrivs ovan, har vi genererat 10 typer av PPS som kombinerar två grupp har/NAs eller VSV-G glykoprotein eller No-kuvert glykoproteiner (visas i tabell 1). Sju av dem är smittsamma. PPS som Harbor No-kuvert glykoprotein eller bara Harbor NA visade inte någon smittsamhet här. Den influensa PP produktionsprocessen är översedd i figur 1. Transmissionselektronmikrografer av PPS (t. ex. H5N1pp) visas i figur 3. Resultaten av smittsamhets analyser av dessa PPS visas i figur 4. Smittsamheten hos de sju typerna av PPS utvärderades i en arvsmassa kopior per cell (GCP) [liknar mångfalden av infektion (MOI)] värdet 20. I PPS-gruppen hyser H5 var smittsamheten av H5N1 (H5 + N9) och H5 90,05 ± 4,05%, 17,78 ± 1,58%, 10,15 ± 2,85% för cellinjer A549 och 40,37 ± 4,92%, 5,24 ± 1,32%, 4,88 ± 0,27% för MDCK, respektive. I PPS-koncernen hyser H7 var smittsamheten hos H7N9, (H7 + N1) och H7 10,45 ± 2,35%, 6,75 ± 1,37%, 1,23 ± 0,33% för cellinjer A549 och 7,61 ± 1,04%, 4,12 ± 1,29%, 1,08 ± 0,02% för MDCK, respektive. För smittsamhet analyser av PPS, särskilt Happ (H5pp, H7pp), exogent neuraminidastyp lades inte. I denna infektivitetsanalys användes även MDCK-cellerna som kontroll cells linje för att testa PPS-smittsamhet. Smittsamheten hos VSVGpp var 20,9 ± 2,00% för A549 och 16,02 ± 2,41% för MDCK-celler. Delta-kuvertet glykoproteiner PP (Δenv PP) visade ingen smittsamhet i vår studie. Dessa data visade också att har/NAs från olika virusstammar kan framgångsrikt generera infektiösa viruspartiklar. Sammantaget kan vår pseudotyping plattform utveckla infektiösa pseudotypifierade viruspartiklar som används i influensaforskning.
Figur 1: översikt över produktions proceduren för influensa-PP. Aförpackningen plasmid Pcdna-gag-pol, rapportören plasmid PCDNA-GFP, och kuvertet glykoproteinuttrycket plasmider PVRC-ha och PVRC-na, är cotransfected till PP-producerande hek 293/17 celler. Bi hek 293/17-celler syntetiseras gag-pol-polyproteinerna och transporteras av en okänd mekanism till cellmembranet. Glykoproteiner HA och NA transporteras och förankras på cellmembranet via den sekretoriska vägen. Reportern plasmid pcdna-GFP transkriberas till det enkelsträngade ψ-GFP genomisk RNA. (C) under eller efter transporten rekryterar gag-pol protein det enkelsträngade ψ-GFP genomisk RNA via PSI-RNA-förpackningssignalerna och bildar därmed pre-spirande komplex. Ddet sammansatta gag-pol-ψ-RNA-komplexet inducerar membran krökning, vilket leder till bildandet av en knopp. Under spirande har det virala kuvertet glykoproteiner/NAs inkorporeras i de begynnande partiklarna. Spirande är klar som partikel klämmer bort från cellmembranet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: övergripande arrangemang i smittsamhets analys. Infektivitetstesterna av varje typ av PPS till en mottaglig cellinje mättes i tre exemplar. Alveolära-härledda humana celler A549 och MDCK används som mottagliga celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: transmissionselektronmikrografer av PPS. Okoncentrerad (vänster) och koncentrerad (höger) supernatant. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: smittsamhet av normaliserade PPS. Smittsamhet presenteras som medelvärdet ± standardavvikelsen (SD) i procent av de infekterade cellerna (n = 3). Smittsamhet av PPS bedömdes i två cellinjer, A549 och MDCK-celler. Sju typer av PPS visade olika smittsamhet profiler i två målceller. PPS att endast Harbor NA inte visas här eftersom de inte manifesteras någon smittsamhet. PPS som Harbor No-kuvert glykoproteiner (Δenv) visade också ingen smittsamhet i vår studie. Procent av smittsamhet betecknade förhållandet mellan GFP reporter-positiva celler i 10 000 celler per prov. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| plasmid preparat | ||||||||||
| plasmid (μL, 0,1 μg/μL) | H5N1 | (H5 + N9) | H7N9 | (H7 + N1) | H5 | N1 | H7 | N9 | VSVG | Δenv |
| pcDNA-gag-pol | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 12,5 |
| pcDNA-GFP | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 12,5 |
| pVRC-HA | 1,98 | 1,98 | 1,98 | 1,98 | 2,14 | - | 2,14 | - | - | - |
| pVRC-NA | 1,98 | 1,98 | 1,98 | 1,98 | - | 2,14 | - | 2,14 | - | - |
| pcDNA-VSVG | - | - | - | - | - | - | - | - | 2,14 | - |
Tabell 1: kombinationer av ha-och na-proteiner som härrör från H5N1-och H7N9-virus och de begärda kvantiteterna (volym) av plasmid-DNA för en väl transfektion av en 6-vält platta. Enligt koncentrationen av plasmid preparat, beräkna erforderlig volym av varje plasmid DNA. Den totala mängden plasmid-DNA för tranfektion av en brunn är 2,5 μg. För att få den högsta transfektionseffektiviteten och de lägsta icke-specifika effekterna har vi optimerat transfektionförhållandena genom varierande plasmid-DNA och tranfektionreagenskoncentrationer. Efter optimeringen har förhållandet mellan de fyra plasmiderna fastställts till 16:16:1:1. Volymen av transfektionsreagens som används i en väl transfektion av en 6-välsplattan är 8 μL (visas inte i tabellen). Två har och två NAs från H5N1 och H7N9 virus kan användas för att generera åtta typer av PPS: H5N1pp, (H5 + N9) PP, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 + N1) PP, H7pp och N9pp. PPS som Harbor No-kuvert glykoproteiner (Δenv) eller endast Harbor NA glykoproteiner visade ingen smittsamhet i vår studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi en metod för framställning av pseudotypade influensavirus partiklar (PP) i en BSL-2-miljö. Reportern plasmid pcDNA-GFP införlivas i PPS och kan användas för att kvantifiera PPS med FACS i en smittsamhet assay. Vi valde två typer av mottagliga cellinjer eftersom de används ofta i influensaforskning. MDCK celler skulle ge en god kontroll till variabeln förevigade mänskliga celler som används i dessa studier.
Detta protokoll är baserat på retrovirus MLV, som kan införliva en GFP reporter och producera knoppar på cellmembranet. Denna teknik har utvecklats i stor utsträckning för förpackningar influensavirus partiklar4,22,23,24. Vissa andra system är baserade på lentiviral hiv-1 pseudotyping system19,25,26 eller Baculovirus-insekt cell Expression system27,28,29. Många andra reporter gener har också använts för pseudoparticle produktion, såsom luciferas (luminescence)30,31,32,33, β-gal/lacz (med kolorimetri)34,35, och utsöndras alkaliska fosfatas36,37. Hirs et al. använde luciferas-analysen för att kvantifiera smittsamheten hos coronavirus pseudotypade partiklar33. Jämfört med luciferase, är GFP: s gröna fluorescens lätt observeras med en inverterad fluorescerande biologiskt Mikroskop. Detta är ett bekvämt sätt att kontrollera transfektion och infektions effektivitet. För denna studie kan smittsamheten bestämmas direkt genom att detektera de GFP-positiva cellerna med FACS.
I den här metoden påverkar flera steg kritiskt resultaten. Optimerad celltäthet är en kritisk faktor för framgångsrik transfektion. I detta protokoll konstaterades att en celltäthet i intervallet 80 – 90% var optimal för PP-produktion av influensavirus. Högre eller lägre celltäthet kommer att resultera i lägre transfektion effektivitet. God fysiologisk status hos producent celler är också mycket viktigt för hög partikel produktion. Det är därför lägre cell passage HEK 293T/17 celler rekommenderas att producera PPS i detta protokoll. Dessutom kan volymen av transfektionsreagens och förhållandet mellan de fyra plasmiderna mängderna också påverka transfektionseffekten. För att få den högsta transfektion effektivitet, rekommenderas att optimera dessa faktorer genom att variera och testa deras belopp. Vi satte kvoten av fyra plasmider kvantiteter som 16:16:1:1 och volymen av transfektion reagens som 8 μL för en väl tranfektion i en 6 väl tallrik. En annan fråga är hanteringen av cellerna. De HEK 293T/17producerande cellerna är låg friktion, så manuell hantering av cellerna måste vara mycket skonsam. Lipofektion kan leda till en cell permeabilitet ökar, och serum och antikroppar i mediet kan öka cytotoxicitet. Det är bäst att använda serum-fri och antikropp-fri DMEM till kultur post-transfected HEK 293T/17 celler. Dessutom är insamlingstiden viktig. Vid 36-48 h post-transfektion, färgen på cellen supernatanten måste kontrolleras för att se till att det är rosa eller orange-rosa innan PP samling. Gul supernatanten indikerar att mediet är för surt för att stödja celltillväxt och oftast leder till dålig PP avkastning.
Vi utförde transfektionstest i en 6 brunn tallrik. För att få mer PP volym kan antalet transfektion brunnar ökas och samman supernatanterna som innehåller samma PPS kan slås samman. Alternativt kan någon annan typ av fartyg användas för att öka PP avkastning. Till exempel kan 18 μL transfektionsreagens och 5,5 μg plasmid-DNA användas för att utföra transfektion med 2,2 x 106 celler i 1 60 mm maträtt. På samma sätt kan en smittsamhet analys utföras i en 24 brunn plattan.
Framgången för denna teknik kan påverkas av många faktorer. Därför bör förfarandet optimeras för partikel förpackning av olika typer av virus.
I detta protokoll genererades pseudotypade viruspartiklar av HPAI H5N1 och H7N9, liksom deras resortianter. I den här metoden använder vi QRT-PCR av GFP-RNA i infektivitetsanalysen på encellig nivå (som arvsmassa kopior per cell) i stället för vävnadskulturer infektiös dos 50 (TCID50) eller traditionell Moi23,38,39. Virussmittsamhet titreringsmetoder är baserade på plack analyser eller TCID50 analyser, som är både tidskrävande och arbetsintensiva. Båda analyserna förlitar sig på mätning av synliga cytopatiska effekter (CPE) orsakad av virusinfektion i cellinjer, så det kan vara svårt att titrera virus med låg smittsamhet (dvs H7pp i denna studie). Vi tycker att det är en bekväm, effektiv och snabb metod för att normalisera PPS med qRT-PCR i GFP-RNA som finns i influensa PPS.
Sammantaget är vår teknik säker och anpassningsbar, och kan användas för att studera höljeförsedda virus, inklusive deras receptorer, tropismer, glykoproteinfunktion, neutraliserande antikroppar, antivirus läkemedelsutveckling, diagnos, och vaccin design och Utvärdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Zhejiang Provincial medicin och hälsovetenskap och teknikplan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou kommunal medicin och hälsovetenskap och teknikplan (Grant nummer, OO20190070), Hangzhou Medical Science och Teknik nyckelprojekt (Grant Numbers, 2014Z11) och Hangzhou kommunala autonoma ansöknings projekt för social utveckling och vetenskaplig forskning (Grant Numbers, 20191203B134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
