Summary
Dit protocol beschrijft een experimenteel proces voor het produceren van hoogtiter infectieuze virale pseudo-getypte deeltjes (PP) met envelop glycoproteïnen uit twee influenza-A-stammen en hoe ze hun infectiviteit kunnen bepalen. Dit protocol is zeer aanpasbaar om PPS te ontwikkelen van elk ander type omhulde virussen met verschillende envelop glycoproteïnen.
Abstract
De occasionele rechtstreekse overdracht van het hoogpathogene aviaire influenza A-virus H5N1 (HPAI H5N1) en H7N9 op de mens en hun letaliteit zijn ernstige volksgezondheidsproblemen en suggereren de mogelijkheid van een epidemie. Echter, ons moleculair begrip van het virus is rudimentair, en het is noodzakelijk om de biologische eigenschappen van haar envelop eiwitten te bestuderen als therapeutische doelen en om strategieën te ontwikkelen om infectie te beheersen. We ontwikkelden een solide virale pseudo getypte deeltje (PP) om het aviaire-influenzavirus te bestuderen, met inbegrip van de functionele analyse van zijn hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) envelop glycoproteïnen, de reassortimentkarakteristieken van de HAs en NAs, receptoren, tropismen, neutraliserende antilichamen, diagnose, infectiviteit, voor de toepassing van de ontwikkeling van geneesmiddelen en vaccin ontwerp. Hier beschrijven we een experimentele procedure om PPS vast te stellen met de envelop glycoproteïnen (HA, NA) van twee influenza A-stammen (HAPI H5N1 en 2013 Avian H7N9). Hun generatie is gebaseerd op de capaciteit van sommige virussen, zoals Murine leukemievirus (MLV), envelop glycoproteïnen in een PP opnemen. Daarnaast wordt ook gedetailleerd beschreven hoe deze PPS worden gekwantificeerd met RT-qPCR, en de infectiviteit detectie van native en niet-overeenkomende virus PPS, afhankelijk van de oorsprong van de HAs en NAs. Dit systeem is zeer flexibel en aanpasbaar en kan worden gebruikt voor het vaststellen van virale PPS met envelop glycoproteïnen die kunnen worden opgenomen in elk ander type omhuld virus. Dus, dit virale deeltjes platform kan worden gebruikt om wilde virussen te bestuderen in veel onderzoek onderzoeken.
Introduction
De missie van een virale deeltje is het vervoer van zijn genoom van een geïnfecteerde gastheer cel naar een niet-geïnfecteerde host cel en om het te leveren in het cytoplasma of de Nucleus in een replicatie-bevoegde vorm1. Dit proces wordt in eerste instantie veroorzaakt door binding aan host cel receptoren, gevolgd door fusie van virion en cellulaire membranen. Voor omhulde virussen, zoals influenzavirussen, zijn de Spike glycoproteïnen verantwoordelijk voor de receptor binding en Fusion1,2. Virale envelop glycoproteïnen (bijv. pyrogenen, antigenen), zijn betrokken bij veel belangrijke eigenschappen en gebeurtenissen, zoals initiatie van de virus levenscyclus (binding en fusie), virale pathogenese, immunogeniciteit, host Cell apoptosis en cellulaire tropisme, het cellulaire endocytische traject, evenals interspecifieke transmissie en reassortiment1,3,4,5,6,7. Onderzoek naar virale envelop glycoproteïnen zal ons helpen veel aspecten van het virale infectie proces te begrijpen. Pseudo-getypte virale deeltjes (PP), ook wel pseudo virionen of pseudopartikelen genoemd, kunnen worden gegenereerd door middel van een pseudo type techniek8,9,10. Deze technologie is gebruikt om pseudo-getypte deeltjes van veel virussen te ontwikkelen, waaronder hepatitis C11,12, hepatitis B13, vesiculaire stomatitis virus (VSV)14,15en influenzavirus16,17,18,19. Deze technologie is gebaseerd op het gag-Pol-eiwit van lentivirussen of andere retrovirussen.
Pseudo-getypte virale deeltjes kunnen worden verkregen met behulp van een drie-plasmide systeem door cotransfecting een virale envelop glycoproteïne expressie plasmide, een retrovirale verpakking plasmide ontbreekt het omhulsel env gen, en een afzonderlijke verslaggever plasmide in PP-producerende cellen. De retrovirus wordt geassembleerd door zijn gag eiwit, en het knoppen van een geïnfecteerde celmembraan dat de virus envelop eiwit1uitdrukt. Daarom is het mogelijk om hoge titer influenza PPS te verkrijgen met behulp van het retrovirus gag Protein om knoppen te produceren op een cellulair membraan dat influenza HA en NA uitdrukt. In onze vorige studies waren/NAs in alle combinaties functioneel en in staat om hun corresponderende functies uit te voeren in de virale levenscyclus16,17,18,20,21. Deze PPS worden gebruikt voor het onderzoeken van de influenza biologische kenmerken, met inbegrip van hemagglutinatie, neuraminidase activiteit, HA-receptor bindend tropisme, en infectiviteit. Omdat HA en NA beide belangrijke oppervlakte functionele eiwitten in de virale levenscyclus zijn, kan niet-overeenkomende heeft en NAs afgeleid van verschillende soorten influenza gedeeltelijk reassortiment tussen hen aantonen. Hier genereren we acht soorten influenza PPS door twee HAs en twee NAs (afgeleid van de HPAI H5N1-stam en de H7N9 Stain) te combineren met behulp van een drieplasmide pseudo type systeem. Deze acht soorten PPS omvatten twee eigen PPS, H5N1pp, H7N9pp; twee niet-overeenkomende PPS, (H5 + N9) pp, (H7 + N1) pp; en vier KKS die slechts één glycoproteïne (HA of NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. onderzoeken naar het influenzavirus, zoals H5N1 en H7N9, worden beperkt door de bioveiligheidsvereisten. Alle onderzoeken naar de stammen van het wild influenzavirus dienen te worden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) laboratorium. Pseudo-getypte virale deeltjes technologie kan worden gebruikt voor het verpakken van een kunstmatige virion in een bioveiligheid Level 2 (BSL-2)-instelling. Daarom vertegenwoordigen PPS een veiliger en nuttig hulpmiddel om de influenzavirus processen te bestuderen, afhankelijk van de twee belangrijkste glycoproteïnen: hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA).
Dit protocol beschrijft het genereren van deze PPS met een drie-plasmide cotransfection-strategie ( overzien in figuur 1), hoe PPS te kwantificeren, en infectiviteit detectie. De PP-productie omvat drie soorten plasmiden (Figuur 1). Het gag-Pol- gen, dat het retrovirus gag-Pol-eiwit codeert, werd gekloond uit een retrovirus pakkingsset en ingebracht in de pcdna 3,1 plasmide en benoemde Pcdna-gag-Pol. Het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP)-gen, dat groene fluorescerende eiwitten codeert, werd gekloond uit pTRE-EGFP-vector, ingebracht in het pcDNA 3,1 plasmide en riep pcDNA-GFP. Tijdens het klonen werd een sequentie van het verpakkings signaal (ψ) toegevoegd via een primer. De genen van HA en NA werden gekloond in een pVRC plasmide, respectievelijk pVRC-HA en pVRC-NA. De laatste plasmide codeert het fusie-eiwit en kan worden vervangen door elke andere fusie-eiwit van belang. Ons pseudo type-platform bevat twee glycoproteïne expressie plasmiden: pVRC-HA en pVRC-NA. Dit kan het onderzoek naar reassortiment tussen verschillende virusstammen in een BSL-2-instelling te vereenvoudigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dag 1: celkweek en seeding
- Cultiveer de menselijke embryonale nier (HEK) 293T/17 cellen in 60 mm gerechten met Dulbecco's gemodificeerde Essential medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U/mL penicillaire-streptomycine (DMEM complete medium, DCM) in a 37 °C, 5% kooldioxide (CO2) incubator tot ongeveer 80% Confluent.
Opmerking: HEK 293T/17 lage passage cellen worden aanbevolen. - Was de cellen voorzichtig met 5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1x.
Let op: handmatige hantering van de HEK 293T/17 cellen moet zeer zacht zijn, omdat ze gemakkelijk los te koppelen. - Verwijder PBS en dissocieren de cellen met 1 mL 0,25% trypsine-ethyleen diamine-tetraazijnzuur (EDTA)-oplossing. Plaats de schaal in een incubator van 37 °C, 5% CO2 voor niet meer dan 5 minuten totdat de cellen zijn losgekoppeld.
- Deactiveer trypsine door 5 mL DCM toe te voegen. Dispergeer de cellen in een eencellige suspensie door meerdere malen op en neer te pipetteren.
- Breng de celsuspensies over naar een voorgekoelde centrifugebuis van 15 mL. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
- Decanen zo veel mogelijk van het supernatant. Respendeer de celpellet met 6 mL DCM medium en Tel de cellen. Verdun de cellen tot 1 x 106 cellen/ml met DCM-medium.
- Zaai de cellen in een 6-put plaat met 1 mL celsuspensie per put. DEP de plaat zachtjes om de cellen gelijkmatig te verdelen. Incuberen de plaat 's nachts (14 – 16 uur) in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .
2. dag 2: vier-plasmide Cotransfection gemedieerd door Lipofection
- Controleer de celmorfologie en dichtheid onder een omgekeerde lichtmicroscoop. Idealiter moeten cellen ongeveer 85% Confluent Health zijn bij transfectie. Vervang het medium met 1 mL serumvrij DMEM-medium per put en plaats de plaat vervolgens weer in de incubator.
Let op: handmatige hantering van de HEK 293T/17 cellen moet zeer zacht zijn, omdat ze gemakkelijk los te koppelen. - Voor elke put van gekweekte cellen die moeten worden getransventeerd, Verdun 8 μL van het transfectiereagens tot een volume van 150 μL met verlaagd serum medium (buis 1). Meng zachtjes en inincuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT, ongeveer 20 °C).
Opmerking: voor elk transfectie monster, bereid twee 1,5 ml micro centrifugebuizen, genummerd 1 en 2. - Verdun in buis 2 2,5 μg plasmide DNA in 150 μL verlaagd serum medium.
NB: Verdun in buis 2 elk plasmide DNA, zoals weergegeven in tabel 1. Een plasmide codering vesiculaire stomatitis virus (VSV) G glycoproteïne (plasmide pLP-VSVG) werd gebruikt als een positieve controle, omdat VSV een breed scala aan cellen kan infecteren. Negatieve controle deeltjes die een gebrek hebben aan influenza-enveloppe glycoproteïnen (Δenv PPS) werden gegenereerd met behulp van pcDNA-gag-Pol en pcDNA-GFP plasmiden. - Na een incubatie van 5 minuten combineert u het verdunde DNA met het verdunde transfectie reagens. Meng zachtjes en inincuberen voor nog eens 15 min bij RT.
- Voeg het DNA-lipide-complex toe aan de overeenkomstige put met de cellen en serumvrij medium. Meng zachtjes door de plaat heen en weer te rocken.
- Na incubatie voor 4 – 6 h in een 37 °C, 5% CO2 incubator, verwijder het medium en vervang het door 2 ml DMEM. Incuberen voor nog eens 36 – 48 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .
Opmerking: Vervang met serum vrije en antilichaam-vrije DMEM. In dit protocol kunnen twee HAs en Two NAs worden gebruikt om acht soorten PPS te genereren (weergegeven in tabel 1).
3. dag 3: gevoelige cellen zaaien
- Voor de infectiviteit Assay, zaad elk type gevoelige cellen op 1 x 104 cellen per put in een 96 goed plaat.
Opmerking: gebruik twee soorten doelcel om de infectiviteit assay in dit artikel uit te voeren: een alveolaire-afgeleide menselijke cellijn (A549 cellen) en de Madin-Darby Canine nier (MDCK) cellen. MDCK-cellen worden veel gebruikt in influenza onderzoek en kunnen een goede controle zijn. Deze stap is flexibel. Alle andere doelcellijnen kunnen worden gebruikt volgens de onderzoeksvereisten. - Incuberen de plaat 's nachts (14 – 16 uur) in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .
4. dag 4: verzameling van pseudo-getypte virale deeltjes, kwantificering en infectiviteit assay
- Pseudo-getypte virale deeltjes collectie
- Controleer de kleur van het medium. Idealiter moet het lichtroze of licht oranje zijn. Onderzoek de cellen met een omgekeerde fluorescerende biologische Microscoop onder 440 – 460 nm.
- Bij 36 – 48 h posttransfectie, oogst de PPS door door te gaan door een 0,45 μm Polyvinylideenfluoride (PVDF) membraanfilter om celresten te elimineren.
- Verdeel de PPS in kleine volume aliquots.
- Bewaar de PPS bij-80 °C.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Dit wordt echter niet aangemoedigd, omdat de infectiviteit van de KKS na bevriezing en ontdooiing sterk zal dalen.
- Pseudo-getypte virale deeltjes kwantificering
- Breng 20 μL gezuiverde PPS over naar een 1,5 mL ribonuclease (RNase)-vrije microcentrifuge buis.
- Voeg 1 μL van 0,24 e/mL benzonase Nuclease toe. Incuberen bij 37 °C gedurende 1 uur om DNA-en RNA-besmetting te elimineren.
Opmerking: target RNA, vaak gedowngereguleerd cytomegalovirus (CMV)-GFP RNA, is verpakt in de PPS en kan voorkomen dat het wordt aangetast door benzonase Nuclease. - Vries het monster bij-70 °C in om de benzonase Nuclease te deactiveren.
- Voeg 2 μL proteïnase K. inincuberen bij 50 °c gedurende 30 minuten om de envelop eiwitten te verteren en het CMV-GFP-RNA vrij te geven. Inactiveren van de proteïnase K bij 100 °c gedurende 3 min.
- Kwantificeer de PPS door real-time kwantitatieve reverse-transcriptie (qRT)-PCR met een Universal probe One-Step RT-qPCR Kit, met behulp van de voorwaartse primer 5 '-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3 ', de omgekeerde primer 5 '-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3 ', en de sonde 5 '-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3 ', op een real-time PCR-Thermo cycler. Normaliseer de PPS voor RNA-kopie nummer vóór infectiviteit.
- Infectiviteit assay
- Verdun elk type PPS in termen van de qRT-PCR-gegevens tot 4 x 105 kopieën/ml (PP-normalisatie).
- Voeg Tosyl-fenylalanine Chlooromethyl-keton (TPCK)-trypsine toe aan een eindconcentratie van 40 μg/mL in PPS die haven H7N9 HA. Incuberen bij 37 °C gedurende 1 uur om de functionele subeenheden HA1 en HA2 te vormen.
Opmerking: er is geen noodzaak om de PPS die Harbor H5 met TPCK-trypsine behandelen, omdat ze hebben meerdere arginine en lysine residuen op de HA1-HA2 decolleté site. Deze multi-Basic decolleté site kan worden gesplitst door alomtegenwoordige cellulaire proteasen. - Meng genormaliseerde PPS met DMEM medium (serumvrij) bij een verhouding van 1:1 (volume/volume).
- Breng de plaat met gevoelige cellen in de bioveiligheidskast.
- Aspireren de supernatant en was de cellen één keer met 0,1 mL voorverwarmde PBS.
- Voeg 0,1 mL PPS-DMEM mengsel toe aan één put. Drie keer de infectiviteit testen van elk type PPS naar één vatbare cellijn ( overzien in figuur 2).
- Incuberen de 96 goed plaat voor 4 – 6 h in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .
- Aspireren de supernatant en vervang met 0,1 mL DCM.
- Incuberen de 96 goed plaat voor nog eens 24 – 36 h in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .
5. dag 5 of 6: infectiviteit detectie
- Breng de 96 well plate naar de bioveiligheid Cabinet.
- Aspireren de supernatant en was de cellen 1x met 0,2 mL voorverwarmde PBS.
- Verwijder PBS en dissocieren de cellen met 0,1 mL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing.
- Plaats de schaal in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 3 minuten totdat de cellen zijn losgekoppeld.
Opmerking: Vermijd incuberen gedurende meer dan 5 min, omdat dit zal leiden tot het klonteren van de cel. - Deactiveer trypsine door toevoeging van 0,4 mL DCM.
- Dispergeer de cellen in eencellige suspensie door meerdere malen op en neer te pipetteren.
- Breng de celsuspensies over in een gekoelde micro centrifugebuis van 1,5 mL.
- Bepaal de GFP reporter-positieve cellen met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS).
Opmerking: om de ratio van GFP reporter-positieve doelcellen te bepalen, stelt u flow cytometer-Gates in met behulp van de controlemonsters (PPS-onbehandelde A549 cellen of MDCK-cellen) en telt u vervolgens de GFP reporter-positieve cellen van 10.000 cellen per monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afhankelijk van de hierboven beschreven algemene procedure, hebben we 10 soorten PPS gegenereerd die twee groep HAs/NAs of VSV-G glycoproteïne of no-Envelope glycoproteïnen (weergegeven in tabel 1) combineren. Zeven van hen zijn besmettelijk. De PPS die de haven van no-Envelope glycoproteïne of enige haven NA geen infectiviteit hier vertonen. De productieprocedure voor influenza PP wordt in Figuur 1weergegeven. Transmissie elektronen micrografen van PPS (bijv. H5N1pp) worden weergegeven in Figuur 3. De resultaten van infectiviteits testen van deze KKS worden weergegeven in Figuur 4. De infectiviteit van de zeven soorten PPS werd geëvalueerd op een genoom kopieën per cel (GCP) [vergelijkbaar met multipliciteit van infectie (MOI)] waarde van 20. In de PPS-groep harkotteren H5, de infectiviteit van H5N1, (H5 + N9) en H5 was 90,05 ± 4,05%, 17,78 ± 1,58%, 10,15 ± 2,85% voor cellijn A549 en 40,37 ± 4,92%, 5,24 ± 1,32%, 4,88 ± 0,27% voor MDCK, respectievelijk. In de PPS-groep harkotteren H7 was de infectiviteit van H7N9, (H7 + N1) en H7 10,45 ± 2,35%, 6,75 ± 1,37%, 1,23 ± 0,33% voor cellijn A549 en 7,61 ± 1,04%, 4,12 ± 1,29%, 1,08 ± 0,02% voor MDCK, respectievelijk. Voor de infectiviteit assays van de PPS, vooral HApp (H5pp, H7pp), exogene neuraminidase werd niet toegevoegd. In deze infectiviteits test werden de MDCK-cellen ook gebruikt als de controle cellijn om PPS-infectiviteit te testen. De infectiviteit van VSVGpp was 20,9 ± 2,00% voor A549 en 16,02 ± 2,41% voor MDCK-cellen. De Delta-Envelope glycoproteïnen PP (Δenv PP) toonden geen infectiviteit in onze studie. Deze gegevens toonden ook aan dat HAs/NAs van diverse virusstammen in staat zijn om met succes infectieuze virale deeltjes te genereren. Samen kunnen ons pseudo type-platform infectieuze pseudo-getypte virale deeltjes ontwikkelen die worden gebruikt in influenza onderzoek.
Figuur 1: overzicht van de productieprocedure voor influenza pp. A) de verpakking plasmide Pcdna-gag-Pol, de verslaggever plasmide PCDNA-GFP, en de envelop glycoproteïne, plasmiden PVRC-ha en PVRC-na, worden samengevoegd tot PP-producerende HEK 293/17-cellen. B) In HEK 293/17 cellen worden de gag-Pol-poly eiwitten gesynthetiseerd en vervoerd door een onbekend mechanisme naar het celmembraan. Glycoproteïnen HA en NA worden via het secretoire traject op het celmembraan getransporteerd en verankerd. Reporter plasmide pcDNA-GFP wordt getranscribeerd in het enkel-streng ψ-GFP genomische RNA. (C) tijdens of na het transport Rekrueert het gag-Pol-eiwit het enkelvoudig gestrande ψ-GFP GENOMISCHE RNA via de psi-RNA-verpakkings signalen, waardoor de pre-ontluikende complexen worden gevormd. D) het geassembleerde gag-Pol-ψ-RNA complex induceert membraan kromming, wat leidt tot de vorming van een kiem. Tijdens de ontluikende, de virale envelop glycoproteïnen heeft/NAs zijn opgenomen in de ontluidende deeltjes. Het ontluiken wordt voltooid naarmate het deeltje uit het celmembraan afprikken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: algemene regeling in de infectiviteits test. De infectiviteits tests van elk type PPS naar één vatbare cellijn werden gemeten in drievand. Alveolaire-afgeleide menselijke cellen A549 en MDCK worden gebruikt als gevoelige cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: transmissie elektronen micrografen van PPS. Ongeconcentreerd (links) en geconcentreerd (rechts) supernatant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: infectiviteit van genormaliseerde PPS. Infectiviteit wordt gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardafwijking (SD) percentage van geïnfecteerde cellen (n = 3). Infectiviteit van PPS werd beoordeeld in twee cellijnen, A549 en MDCK cellen. Zeven soorten PPS weergegeven verschillende infectiviteit profielen in twee doelcellen. PPS die alleen Harbor NA worden hier niet weergegeven omdat ze geen infectiviteit manifesteren. PPS die geen-envelop glycoproteïnen haven (Δenv) toonde ook geen infectiviteit in onze studie. Het percentage van infectiviteit aangegeven de verhouding van GFP reporter-positieve cellen in 10.000 cellen per monster. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| plasmide preparaten | ||||||||||
| plasmide (μL, 0,1 μg/μL) | H5N1 | (H5 + N9) | H7N9 | (H7 + N1) | H5 | N1 | H7 | N9 | VSVG | Δenv |
| pcDNA-gag-Pol | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 12,5 |
| pcDNA-GFP | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 10,53 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 11,43 | 12,5 |
| pVRC-HA | 1,98 | 1,98 | 1,98 | 1,98 | 2,14 | - | 2,14 | - | - | - |
| pVRC-NA | 1,98 | 1,98 | 1,98 | 1,98 | - | 2,14 | - | 2,14 | - | - |
| pcDNA-VSVG | - | - | - | - | - | - | - | - | 2,14 | - |
Tabel 1: combinaties van ha-en na-eiwitten afkomstig van H5N1 en H7N9 virussen en de vereiste hoeveelheden (volume) van plasmide DNA voor één goed trans fectie van een 6-goed plaat. Bereken volgens de concentratie van plasmide preparaten het vereiste volume van elk plasmide DNA. De totale hoeveelheid plasmide DNA voor tranfectie van een put is 2,5 μg. Om de hoogste transfectie-efficiëntie en de laagste niet-specifieke effecten te verkrijgen, hebben we de transfectie condities geoptimaliseerd door verschillende plasmide DNA-en tranfection-reagens concentraties. Na het optimaliseren werd de verhouding van de vier plasmiden hoeveelheden ingesteld als 16:16:1:1. Het volume van het transfectiereagens dat wordt gebruikt in één goed transfectie van een 6-put plaat is 8 μL (niet in de tabel). Twee HAs en twee NAs-bestanden van H5N1 en H7N9 virussen kunnen worden gebruikt voor het genereren van acht soorten PPS: H5N1pp, (H5 + N9) pp, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 + N1) pp, H7pp en N9pp. De PPS die geen-envelop glycoproteïnen (Δenv) of enige haven NA glycoproteïnen haven toonde geen infectiviteit in onze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we een methode om influenzavirus pseudo-getypte deeltjes (PP) in een BSL-2-instelling te produceren. De verslaggever plasmide pcDNA-GFP is opgenomen in de PPS en kan worden gebruikt om PPS te kwantificeren door FACS in een infectiviteit assay. We kozen voor twee soorten gevoelige cellijnen omdat ze op grote schaal worden gebruikt in influenza onderzoek. MDCK-cellen zouden een goede controle geven op de variabele vereeuwigd menselijke cellen die in deze studies worden gebruikt.
Dit protocol is gebaseerd op het retrovirus MLV, dat een GFP reporter kan opnemen en knoppen op het cellulaire membraan produceren. Deze techniek is op grote schaal ontwikkeld voor het verpakken van influenzavirus deeltjes4,22,23,24. Sommige andere systemen zijn gebaseerd op het lentivirale HIV-1 pseudo type systeem19,25,26 of het Baculovirus-insect Cell expressie systeem27,28,29. Veel andere reporter genen zijn ook gebruikt voor de productie van pseudoparticle, zoals plaats (luminescentie)30,31,32,33, β-gal/lacz (door colorimetrie)34,35, en uitgescheiden alkalische fosfatase36,37. Millet et al. gebruikte de plaats-test om de infectiviteit van Corona pseudogetypte deeltjes33te kwantificeren. Vergeleken met Luciferase wordt de groene fluorescentie van GFP gemakkelijk waargenomen met een omgekeerde fluorescerende biologische Microscoop. Dit is een handige manier om transfectie en infectie efficiëntie te controleren. Voor deze studie, de infectiviteit kan direct worden bepaald door het detecteren van de GFP-positieve cellen met FACS.
Bij deze methode hebben verschillende stappen een kritische invloed op de resultaten. Geoptimaliseerde celdichtheid is een cruciale factor voor een succesvolle trans fectie. In dit protocol bleek een celdichtheid in het bereik van 80 – 90% Confluent Health optimaal te zijn voor de productie van influenzavirus pp. Hogere of lagere celdichtheid zal resulteren in een lagere transfectie-efficiëntie. Een goede fysiologische status van producenten cellen is ook erg belangrijk voor de productie van hoge deeltjes. Dit is de reden waarom lagere cel passage HEK 293T/17 cellen worden aanbevolen om PPS te produceren in dit protocol. Ook kan het volume van transfectie reagens en de verhouding van de vier plasmiden hoeveelheden ook de transfectie-efficiëntie beïnvloeden. Om de hoogste transfectie-efficiëntie te verkrijgen, is het aanbevolen om deze factoren te optimaliseren door hun hoeveelheid te variëren en te testen. We zetten de ratio van vier plasmiden aantallen als 16:16:1:1 en het volume van transfectie reagens als 8 μL voor één goed tranfection in een 6 goed plaat. Een ander probleem is de omgang met de cellen. De HEK 293T/17producerende cellen zijn laag adhesie, dus handmatige behandeling van de cellen moet zeer zacht zijn. Lipofection kan leiden tot een verhoging van de permeabiliteit van de cel, en serum en antilichamen in het medium kunnen verhogen cytotoxiciteit. Het is het beste om serum vrije en antilichaam-vrije DMEM te gebruiken voor cultuur post-getransffecteerde HEK 293T/17 cellen. Bovendien is de afhaaltijd belangrijk. Bij 36 – 48 h post-transfectie, de kleur van de cel supernatant moet worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat het roze of oranje-roze vóór PP collectie. Gele supernatant geeft aan dat het medium te zuur is om celgroei te ondersteunen en meestal leidt tot slechte PP-opbrengsten.
We hebben de transfectie assay uitgevoerd in een 6 goed bord. Om meer PP volume te verkrijgen kan het aantal transfectie putten worden verhoogd en kunnen supernatanten die dezelfde PPS bevatten, samen worden samengevoegd. Als alternatief kunnen sommige andere soorten schepen worden gebruikt om de PP-opbrengst te verhogen. Zo kan bijvoorbeeld 18 μL transfectie reagens en 5,5 μg plasmide DNA worden gebruikt om trans fectie uit te voeren met 2,2 x 106 cellen in 1 60 mm schaal. Evenzo kan een infectiviteit test worden uitgevoerd in een 24-put.
Het succes van deze techniek kan door vele factoren worden beïnvloed. Daarom moet de procedure worden geoptimaliseerd voor deeltjes verpakkingen van verschillende soorten virussen.
In dit protocol werden pseudo-getypte virale deeltjes van HPAI H5N1 en H7N9, evenals hun reassortanten, gegenereerd. Bij deze methode gebruiken we QRT-PCR van het GFP-RNA in de infectiviteits test op het eencellige niveau (als genoom kopieën per cel) in plaats van weefselcultuur infectieuze dosis 50 (TCID50) of traditionele Moi23,38,39. Virus infectiviteit titratiemethoden zijn gebaseerd op plaque-assays of TCID50 testen, die zowel tijdrovend en arbeidsintensieve zijn. Beide testen zijn afhankelijk van de meting van zichtbare cytopathische effecten (CPE) veroorzaakt door virus infectie in cellijnen, dus het kan moeilijk zijn om virussen met een lage infectiviteit te titreren (d.w.z. H7pp in deze studie). We denken dat het een handige, effectieve en snelle methode is om PPS te normaliseren met qRT-PCR van het GFP-RNA dat in influenza PPS is opgenomen.
Samen, onze techniek is veilig en aanpasbaar, en kan worden gebruikt om omhulde virussen te bestuderen, met inbegrip van hun receptoren, tropismen, envelop glycoproteïne functie, neutraliserende antilichamen, antivirus Geneesmiddelenontwikkeling, diagnose, en vaccin ontwerp en Evaluatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van Zhejiang Provincial Medicine en Health Science and Technology Plan (subsidie nummers, 2017KY538), Hangzhou gemeentelijke geneeskunde en Gezondheidswetenschappen en technologie plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science en Technologisch sleutel project (subsidie nummers, 2014Z11) en gemeentelijk autonome toepassings project van Hangzhou voor sociale ontwikkeling en wetenschappelijk onderzoek (subsidie nummers 20191203B134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
